專利名稱：二羥酸脫水酶基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及二羥酸脫水酶基因及其用途，特別涉及制造香味良好的酒 精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料、以及制造所述飲料的方法等。更具體地說，本發明涉及通過提高酵母中編碼二羥酸脫水酶IIv3p的 ILV3基因、特別是啤酒酵母的特征基因nonScILV3的表達量，使導致產品 異味的二酮類、特別是雙乙酰的生產量降低的酵母，以及涉及使用該酵母 的酒精飲料的制造方法等。
背景技術：
在酒精飲料的氣味成分中，雙乙酰(以下稱"DA")氣味是啤酒、清酒 以及葡萄酒等釀造酒精飲料中的代表性異味之一。DA氣味(啤酒中表現為 餿飯味或黃油味，清酒中表現為酸臭味)是由于以DA為主的連二酮類(以 下稱"VDK")在產品中超過一定的閾值后而產生的。據報道其在啤酒中的 閾值是0.1ppm (Journal of the Institute of Brewing 、 76、 486 (1970))。酒精飲料中的VDK大致分為DA和2， 3-戊二酮(以下稱PD)， DA 和PD分別是以纈氨酸和異亮氨酸生物合成體系中間產物的ot-乙酰乳酸和 a-乙酰羥基丁酸作為前體，通過無酵母參與的非酶促反應而生成的。由上述可知，VDK (DA和PD)及其前軀體a-乙酰羥酸類(a-乙酰乳 酸和a-乙酰羥基丁酸)等被認為是能夠使產品產生DA氣味的化合物。因 此，使這些化合物穩定降低的酵母的育種，不僅能夠使酒精飲料的制造管 理變得容易，而且能夠擴大新產品開發的可能性。在清酒制造過程中，例如日本特開2001-204457公報報道了通過使用含 有低濃度丙酮酸的米-麥芽酵母培養物抑制DA生成的方法，其中所述的丙 酮酸為乙酰羥酸類的前體。對于啤酒制造，在Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99 (1973)中也報道了在纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸營養缺陷型酵母中VDK生成量降低的現象。但是，營養缺陷型菌 株容易發生增殖、發酵遲緩現象，所以這種酵母還未實現實用化。在曰本特開2002-291465號公報中，公開了取得對于上述支鏈氨基酸類似物具有敏 感性的突變株，從其中選取DA低蓄積的菌株的方法。在Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84 (1987)中報道了源自實驗室 酵母且其ILV5基因的表達量受到調節的基因工程酵母，此外，在European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560 (1987)中也同樣報道了ILV3基因的表達量受到調節的基因工程酵母。此 時ILV5基因編碼的乙酰羥酸還原異構酶的酶活性增加5-7倍，VDK生成量 減少到40%左右。此外，ILV3基因編碼的二羥酸脫水酶的酶活性增加5-6倍，VDK生成 量沒有明顯減少。但是上述2個報告中都使用了合成培養基，且都沒有對 實際啤酒釀造的影響進行分析。另一方面，Villa等在Journal of American Society of Brewing Chemists,53: 49-53 (1995)中報道，通過使ILV5基因、 ILV3基因以及串連的這兩者進行高表達，在使用麥汁的發酵試驗中VDK 生成量分別減少70%、 40%和60%。Dulieu等在European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460 (1997)中提出如下技術方案,即通過使用a-乙 酰乳酸脫羧酶，將DA的前體即a-乙酰乳酸迅速轉化為3-羥基丁酮。但是， 日本稅務制度不允許在發酵中的酒醪中添加酶。日本特開平2-265488號公 報和日本特開平7-171號公報中，均報道了使用編碼a-乙酰乳酸脫羧酶的 DNA鏈的基因工程酵母。發明內容鑒于上述狀況，期望開發出其中VDK (連二酮類)，特別是DA (雙乙 酰)的生成得到減少的酒精飲料的制造方法。本發明者為了解決上述課題進行了精心研究，結果從啤酒酵母中成功 鑒定、分離出編碼二羥酸脫水酶的基因。即本發明涉及啤酒酵母中特征 性存在的新型二羥酸脫水酶基因、該基因編碼的蛋白質、該基因的表達受到調控的轉化酵母、通過使用該基因的表達受到調控的酵母從而控制產品中的VDK濃度、特別是DA濃度的方法等。更具體地，本發明具體提供下 述多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導入該載體的轉化酵母、使用該轉 化酵母的酒精飲料的制造方法等。(1) 選自由下述(a) (f)組成的組中的多核苷酸，(a) 多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號 2的氨基酸序列組成；(c) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由在序列 號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨 基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶活性；(d) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序 列號2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有二羥酸脫水 酶活性；(e) 多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴謹條件下與 由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且 編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質；以及(f) 多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴謹條件下與 由編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列互補 的核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的 蛋白質。(2) 如上述(1)所述的多核苷酸，其選自由下述(g) (i)組成的組(g) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號 2的氨基酸序列或在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加l 10個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶活性；(h) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序 列號2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有二羥酸脫水 酶活性；以及(i)多核苷酸，其在嚴謹條件下與序列號1或序列號1的核苷酸序列 的互補核苷酸序列進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質。(3) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組 成的多核苷酸。(4) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸 序列組成的蛋白質的多核苷酸。(5) 如上述(1) (4)中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。(6) 蛋白質，其是由上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸編碼 的蛋白質。(7) 載體，其含有上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸。 (7a)上述(7)所述的載體，其包括含有下述(x) (z)的構成要素的表達盒(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子，(y)在該啟動子的正義或反義方向上連接的上述(1) (5)中任一 項所述的多核苷酸，以及(z)涉及RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化作用，在酵母內起作用 的信號。(8) 酵母，其中導入了上述(7)所述的載體。(9) 如上述(8)所述的酵母，其中通過導入上述(7)所述的載體， 總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力降低。(10) 如上述(8)所述的酵母，其中通過增加上述(6)所述的蛋白 質的表達量而使酵母的總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力降低。(11) 酒精飲料的制造方法，其使用上述(8) (10)中任一項所述 的酵母。(12) 如上述(11)所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精 飲料是麥芽飲料。(13) 如上述(11)所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精 飲料是葡萄酒。(14) 酒精飲料，其為采用上述(11) (13)中任一項所述的方法制造的酒精飲料。(15) 酵母的評價方法，其為使用根據具有序列號1的核苷酸序列的 二羥酸脫水酶基因的核苷酸序列設計的引物或探針，對被測酵母的總連二 酮生產能力或總雙乙酰生產能力進行評價的方法。(15a)酵母的選擇方法，其利用上述(15)所述的方法，選擇總連二 酮生產能力或總雙乙酰生產能力降低的酵母。(15b)使用根據上述(15a)所述的方法選取的酵母來制造酒精飲料 (如啤酒)的方法。(16) 評價被測酵母的總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力的方法， 其包括培養被測酵母；以及測定具有序列號1的核苷酸序列的二羥酸脫 水酶基因的表達量。(16a)選取總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力降低的酵母的方 法，其包括利用上述(16)所述的方法，評價被測酵母；以及選取二羥酸脫水酶基因的表達量高的酵母。(16b)使用根據上述(16a)所述方法選取的酵母來制造酒精飲料(如 啤酒)的方法。(17) 酵母的選擇方法，其包括培養被測酵母；對上述(6)所述的 蛋白質進行定量或測定具有序列號1的核苷酸序列的二羥酸脫水酶基因的 表達量；以及選擇所述蛋白質的量或所述基因表達量與總連二酮或總雙乙 酰的目標生產能力相應的被測酵母。(17a)酵母的選擇方法，其包括培養被測酵母；定量分析總連二酮 生產能力或總雙乙酰生產能力或二羥酸脫水酶的活性；以及選擇總連二酮 或總雙乙酰的生產能力為目標能力或二羥酸脫水酶的活性為目標活性的被 測酵母。(18) 如上述(17)所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母 和被測酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列的二羥酸脫水酶基因在各酵 母中的表達量；以及選擇其中該基因的表達高于標準酵母的被測酵母。(19) 如上述(17)所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母 和被測酵母；對各酵母中的上述(6)所述的蛋白質進行定量；以及選擇其中該蛋白質的量多于標準酵母的被測酵母。(20)酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(8) (10)中任一項所述的酵母或使用根據上述(17) (19)任一項所述的方法選擇的 酵母中的任一種酵母，進行制造酒精飲料的發酵；以及使總連二酮生產量 或總雙乙酰生產量降低。
圖1表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經時變化，橫軸表示發酵時間， 縱軸表示0D660值(660nm時的光密度)。圖2表示啤酒釀造試驗中浸出物消耗量的經時變化，橫軸表示發酵時 間，縱軸表示浸出物的表觀濃度(w/wy。)。圖3表示啤酒釀造試驗中的酵母中nonScILV3基因的表達行為，橫軸 表示發酵時間，縱軸表示檢測出的信號輝度。圖4表示使用ILV3破壞株的nonScILV3的互補試驗結果。a)表示因 ILV3破壞，形成纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸營養缺陷型。將親株和ILV3 破壞株在SC (-Leu,Ile，Val)平板培養基上30。C培養3天。b)表示通過將 nonScILV3導入ILV3破壞株，形成非營養缺陷型。將親株和ILV3基因破 壞株X2180-lA(ilv3::natl )在含有300mg/L遺傳霉素(Geneticin)和50 mg/L 諾爾絲菌素(nourseothricin)的SC (-Leu，Ile,Val)平板培養基上30。C培養 3天。
具體實施方式
本發明者根據利用日本特開2004-283169公開的方法解讀的啤酒酵母 基因組的信息，分離、鑒定出啤酒酵母特有的編碼二羥酸脫水酶的基因 nonScILV3。該基因的核苷酸序列用序列號1表示，此外由該基因編碼的蛋 白質的氨基酸序列用序列號2表示。 1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供(a)多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列 組成的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。作為本發明的對象的多核苷酸，并不限定于上述來自啤酒酵母的編碼 二羥酸脫水酶的多核苷酸，而且還包括編碼與該蛋白質具有同等功能的蛋 白質的其他多核苷酸。作為具有同等功能的蛋白質，例如可以為(c)蛋白 質，其由在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加l個或多 個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶活性。此類蛋白質可以為由在序列號2的氨基酸序列中如缺失、取代、插 入及/或添加1 100個、1 90個、1 80個、1 70個、1 60個、1 50 個、1 40個、1 39個、1 38個、卜37個、1 36個、1 35個、l 34個、1 33個、1 32個、1 31個、1 30個、1 29個、1 28個、l 27個、1 26個、1 25個、1 24個、1 23個、1 22個、1 21個、l 20個、卜19個、1 18個、1 17個、1 16個、1 15個、卜14個、l 13個、1 12個、1 11個、1 10個、l 9個、1 8個、1 7個、1 6 個(1 數個)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、l個氨基酸殘基后的 氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質。上述氨基酸殘基缺 失、取代、插入及/或添加的數量， 一般越小越好。并且此類蛋白質還可以 為(d)蛋白質，其具有與序列號2的氨基酸序列有約60%以上、約70%以 上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77% 以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82°/。以上、83%以上、 84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以 上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97% 以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4 % 以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7°/。以上、99.8%以上、99.9%以上同一 性的氨基酸序列，且具有二羥酸脫水酶活性。上述同源性的數值一般越大 越好。此外，二羥酸脫水酶的活性，例如可根據Kiritani等的方法(Methods Enzymol" 17:755-764 (1970))進行測定。本發明還包括(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，即該多核苷酸在嚴謹條件下，與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質；以及(f)多核苷 酸，其含有如下多核苷酸，即該多核苷酸在嚴謹條件下，與由編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列的互補核苷酸序列組 成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質。 這里所述的"在嚴謹條件下雜交的多核苷酸"，是指將序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸、或編碼序列號2的氨基酸序列的 多核苷酸的全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法、或 Southern雜交法等得到的多核苷酸序列(例如DNA)。雜交方法可以利用如 Molecular Cloning 3rd Ed.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons 1987-1997等記載的方法。本說明書所述的"嚴謹條件"，可以為低嚴謹條件、中嚴謹條件和高嚴謹 條件中的任一種。"低嚴謹條件"，如為5xSSC、 5xDenhardt液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、32。C的條件；此外，"中嚴謹條件"，如為5xSSC、 5xDenhardt 液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、42°。的條件；"高嚴謹條件"，如為5xSSC、 5xDenhardt液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、50。C的條件。在這些條件中，認為 溫度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸(例如DNA)。當然， 一般認 為影響雜交嚴謹度的因素有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、 鹽濃度等多種要素，同領域技術人員通過適當選擇這些要素可以實現相同 的嚴謹度。使用市售的試劑盒進行雜交時，如可以使用Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制造)。這種情況下，按照試劑盒中附帶 的說明書，與已標記的探針保溫過夜后，在55'C的條件下用含有 0.1%(w/v)SDS的1次洗滌緩沖液將膜洗滌后，從而檢測雜交的多核苷酸(例 如DNA)。除此之外，作為可雜交的多核苷酸，可以為通過FASTA、 BLAST等同 源性檢索軟件用默認參數進行計算時，與編碼序列號2的氨基酸序列的多 核苷酸有約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74% 以上、75°/。以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、 81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、 95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1以上％、 99.2 以上％、 99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8% 以上、或99.9%以上同一性的多核苷酸。氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的 BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268， 1990;Proc.Nat1. Acad.Sci.USA 90:5873,1993)來確定。開發了基于BLAST算法的被稱為 BLASTN、 BLASTX的程序(Altschul SF，et al:J. Mol. Biol. 215:403, 1990)。用BLASTN分析核苷酸序列時，使參數為如score=100 、 wordlength=12;此外，用BLASTX分析氨基酸序列時，使參數為如score=50、 wordlength=3;使用BLAST和Gapped BLAST程序時，采用各程序的默認 參數。2.本發明的蛋白質本發明還提供由上述(a) (i)中任一種多核苷酸所編碼的蛋白質。 本發明的一種優選蛋白質為由在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、 插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水 酶活性的蛋白質。此類蛋白質可以為由在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/ 或添加上述數量的氨基酸殘基后的氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶 活性的蛋白質。此外，此類蛋白質還可以如上所述為具有與序列號2的氨 基酸序列有約60%以上，優選約70°/。以上，更優選約80%以上，進一步優 選約90%以上，或最優選約95%以上的同源性的氨基酸序列，且具有二羥 酸脫水酶活性的蛋白質。此類蛋白質可通過使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc, Acids. Res" 10, 6487 (1982)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)"、 "Gene, 34, 315 (1985)"、 "Nuc. Acids. Res" 13， 4431 (1985)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)"等記載的定點誘變 法獲得。本發明中，在蛋白質的氨基酸序列中1個以上的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中的任意1個或多個氨基酸序列的位 置上的1個或多個氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加，并且可同時發 生缺失、取代、插入及添加中的兩種以上。下面列舉可互相取代的氨基酸殘基，同一組中包含的氨基酸殘基可互 相取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨 酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、 精氨酸、鳥氨酸、2， 4-二氨基丁酸、2， 3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯 丙氨酸、酪氨酸。本發明的蛋白質也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧 羰基法)等化學合成法合成。并且也可以利用Advanced ChemTech公司、鉑 金埃爾累犬(Perkin Elmer)、 Pharmacia公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、島津制作等所制造的肽合成 儀進行化學合成。3.本發明的載體及用該載體轉化的酵母本發明提供含有上述多核苷酸的載體，本發明的載體含有上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(例如DNA)。并且，本發明的載體通常包 括表達盒，該表達盒含有的結構要素為(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動 子；(y)在該啟動子的正義或反義方向上連接的上述(a) (O任一項記 載的多核苷酸(例如DNA);以及(z)涉及RNA分子的轉錄終止及多聚 腺苷化作用，在酵母內起作用的信號。向酵母內導入時使用的載體，可為多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp 型)、或染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如作為YEp型載體，已知 有YEp24 (J. R. Broach et al.， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983)，作為YCp型載體，已知有YCp50 (M. D.Rose etal.， gene， 60， 237， 1987),作為YIp型載體，已知有YIp5 (K. Struhl etal.， Proc. Natl. Acad, Sci. USP， 76， 1035， 1979)，且容易獲得。可以任意組合加入用于調節酵母內基因表達的啟動子/終止子，只要其 在釀造用酵母中發揮作用的同時，不影響酒醪中的氨基酸和浸出物等組成物的濃度。例如可使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷 酸甘油酸激酶基因(PGK1 )的啟動子等。這些基因均己克隆，如在M. R Tuite etal.， EMBOJ.， 1， 603 (1982)中有詳細記載，通過已知的方法能夠容易獲 得。作為轉化時使用的選擇性標記，因釀造用酵母不能利用營養缺陷型標 記，可利用遺傳霉素抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUP1) (Marinetal.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81, 337 1984)、淺藍菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分別在豬腰淳嗣等，生物化學，64， 660， 1992; Hussain et al.， gene， 101， 149， 1991。日語原文「豬腰淳嗣、生化學，64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149， 1991」)等。 將上述構建的載體導入宿主酵母內。作為宿主酵母，其可以為可在釀造中使用的任何酵母，如用于釀造啤酒、葡萄 酒、清酒等的酵母等。具體可以為如酵母屬(5^"/^ram;^")等酵母，在 本發明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(&cc/^ramyc&s poston'am^) W34〃0等、fecc/zaraw^c^ ca^^ergm^ NCYC453、 NCYC456等、或 Sac血ram戸s ce固'w'"e NBRC 1951 、NBRC 1952、NBRC 1953 、或NBRC 1954 等。還可使用葡萄酒酵母(如日本釀造協會的1號、3號、和4號等的葡萄 酒酵母)、清酒酵母(如日本釀造協會的7號和9號等的清酒酵母)，但并 不限于這些酵母。在本發明中，優選使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(&cc/zara，ces /70 to"'awi^ )。酵母的轉化方法可利用一般使用的公知方法。如可利用電穿孔法"Meth. Enzym.， 194， p182 (1990)"、原生質球法(Spheroplast) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p 1929(1978)"、乙酸鋰法"J. Bacteriology, 153， pl63(1983)"、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p1929 (1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等記載的方法實施， 但并不限于這些方法。更具體地說，將宿主酵母在標準酵母營養培養基(如YEPD培養基"Genetic Engineering. Vol.1 ， Plenum Press, New York, 117(1979)"等)中培 養至OD600nm值為1 6。將該培養酵母離心分離并收集，洗凈，用濃度 約為1M 2M的堿金屬離子優選鋰離子進行前處理。上述細胞在約30。C 下靜置約60分鐘后，與導入的DNA (約l嗎 20嗎)同時在約3(TC下靜 置約60分鐘。添加聚乙二醇，優選約4， 000道爾頓的聚乙二醇，使最終 濃度約為20% 50%。約3(TC下靜置約30分鐘后，將該細胞在約42"C下 加熱處理約5分鐘。優選用標準酵母營養培養基將上述細胞懸浮液洗凈， 加入到規定量的新鮮標準酵母營養培養基中，然后在約3(TC下靜置約60分 鐘。然后，將其移植到含有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培 養基上，獲得轉化體。此外，對于通常的克隆技術，可參照《Molecular Cloning 3》、"Methods in Yeast Genetics 、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, NY)"等。4. 本發明的酒精飲料的制造方法以及根據該方法得到的酒精飲料將上述本發明的載體導入適于釀造目標酒精飲料的酵母中，通過使用 該酵母，能夠制造期望的使酒精飲料中VDK、特別是DA的濃度降低，香 味提高的酒精飲料。此外，同樣也可以使用根據本發明的酵母的評價方法 選擇出的酵母。目標酒精飲料可以為啤酒、諸如啤酒味飲料的發泡酒、葡 萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于這些。制造上述酒精飲料時，除使用本發明得到的釀造酵母代替親株之外， 使用的是公知的方法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往方法 完全相同，并不會因制造使VDK、特別是DA的濃度降低的酒精飲料而增 加成本。BP,根據本發明，能夠使用已有的設備制造香味等良好的酒精飲 料而不會增加成本。5. 本發明的酵母的評價方法本發明涉及評價方法，該評價方法使用根據具有序列號1的核苷酸序 列的二羥酸脫水酶基因的核苷酸序列設計的引物或探針，評價被測酵母的 總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力。上述評價方法的一般方法是公知 的，例如在WO01/040514號公報、日本特開平8-205900號公報等中有記載。下面，對該評價方法進行簡單說明。首先，制備被測酵母的基因組。制備方法可采用Hereford法、乙酸鉀 法等任何一種公知方法(如Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130(1990))。以得到的基因組為對象，使用根據二羥酸 脫水酶基因的核苷酸序列(優選ORF序列)設計的引物或探針，檢測被測 酵母的基因組中是否存在該基因或該基因的特異序列。引物或探針的設計 可采用公知的方法進行。基因或特異序列的檢測可采用公知的方法實施。例如，將含有特異序 列的一部分或全部的多核苷酸或者含有該核苷酸序列的互補核苷酸序列的 多核苷酸作為一個引物，另一個引物使用含有該序列的上游或下游序列的 一部分或全部的多核苷酸或者含有該核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核 苷酸，通過PCR法擴增酵母的核酸，測定擴增產物的有無、擴增產物分子 量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數通常為10bp以上，優選15bp 25bp。此外，引物之間的堿基數通常以300bp 2000bp為宜。PCR法的反應條件無特別限定，如可采用變性溫度90°C 95°C，退 火溫度40°C 60°C,延伸溫度60°C 75°C,循環數10次以上等的條 件。得到的反應生成物通過用瓊脂糖凝膠等的電泳法等得到分離，以測定 擴增產物的分子量。通過該方法，根據擴增產物的分子量是否是含有特異 部分的DNA分子的大小，預測、評價該酵母的總連二酮生產能力或總雙乙 酰生產能力。并且通過分析擴增物的核苷酸序列，可以更準確地預測、評 價上述能力。在本發明中，通過培養被測酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列的 二羥酸脫水酶基因的表達量，也能夠評價被測酵母的總連二酮生產能力或 總雙乙酰生產能力。對此，二羥酸脫水酶基因的表達量的測定，可通過培 養被測酵母，對二羥酸脫水酶基因的產物mRNA或蛋白質進行定量來進行。 mRNA或蛋白質的定量可采用公知的方法進行。mRNA的定量例如可通過 Northern雜交法、定量RT-PCR進行，蛋白質的定量例如可通過Western印 跡法進行 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。培養被測酵母，通過測定具有序列號1的核苷酸序列的本發明基因的 表達量，選擇與目標總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力相應的上述基 因表達量的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料的酵母。此外，也 可以培養標準酵母及被測酵母，測定各酵母中上述基因的表達量，比較標 準酵母和被測酵母中上述基因的表達量，從而選擇所期望的酵母。具體來 說，例如培養標準酵母及一種或多種被測酵母，測定具有序列號1的核苷 酸序列的二羥酸脫水酶基因在各酵母中的表達量，通過選擇與標準酵母相 比該基因為高表達的被測酵母，能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料的酵 母。或者，培養被測酵母，通過選擇總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能 力較低低、或二羥酸脫水酶活性較高的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望 酒精飲料的被測酵母。這種情況下，作為被測酵母或標準酵母，例如可以使用導入上述本發 明載體的酵母、上述本發明的基因的表達增加的酵母、上述本發明的蛋白 質的表達增加的酵母、實施突變處理的酵母、或發生自然突變的酵母等。總連二酮量的定量可通過Drews et al.， Mon. fUr Brau., 34, 1966記載的方法 進行。總雙乙酰的定量例如可通過J Agric Food Chem. 50(13):3647-53, 2002 記載的方法進行。二羥酸脫水酶的活性例如可根據Kiritani等的方法 (Methods Enzymol.， 17: 755-764 (1970))進行測定。對于突變處理，例如 可以使用紫外線照射、放射線照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等試劑處理的化學方法等的任一方法(如參照大嶋泰治編 著、生物化學實驗39酵母分子遺傳學實驗、p67-75、學會出版中心等。日 語原文「大嶋泰治編著、生物化學実験法39酵母分子遺伝學実験法、P 67-75、學會出版七 >夕一」)。能夠作為標準酵母或被測酵母使用的酵母，可以為可在釀造中使用的 任何一種酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體可以為酵 母屬 (Sacc/wframyces) 等酵母(例如《S. / ostoW"m^s、 S.cerev^/ae禾口 1S".carZy6e7^em7、)。在本發明中，可以使用啤酒酵母，如5^cc/wraw少ces / oyton'flw W34/70等；Sacc/wfra附j^s cw/Ae，m7i NCYC453或NCYC456es cewv/w'ae NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、或 NBRC1954等。并且，也可使用諸如5Wcc/wrawycas cwev/w'ae NCYC90威 士忌酵母、諸如日本釀造協會的l號、3號、和4號等的葡萄酒酵母、諸如 日本釀造協會的7號和9號清酒酵母等，但并不限于這些酵母。在本發明 中，優選使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。標準 酵母、被測酵母也可以從上述酵母中任意組合選擇。實施例以下根據實施例對本發明詳細描述，但本發明不限于以下實施例。 實施例1: 二羥酸脫水酶基因(nonScILV3)的克隆利用日本特開2004-283169記載的比較數據庫進行檢索，結果發現了啤 酒酵母特有的新型二羥酸脫水酶基因nonScILV3 (序列號1)。根據獲得的 核苷酸序列信息，分別設計用于擴增全長基因的引物nonScILV3—F (序列號 3) / nonScILV3—R (序列號4)，通過以基因組解讀株&cc/^raA^ces Weihenstepan 34/70株的染色體DNA為模板的PCR，獲得含有 nonScILV3的全長基因的DNA片段。將上述得到的nonScILV3基因片段，通過TA克隆插入pCR2.1-TOPO 載體(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(R Sanger, Science, 214， 1215， 1981)分析并確定nonScILV3基因的核苷酸序列。實施例2:啤酒試釀中的nonScILV3基因表達分析使用啤酒酵母^cc/zflra，c&s / oston'(3"M1 Weihenstepan W34/70株進行 試釀，從發酵中的啤酒酵母菌體提取的mRNA通過酵母DNA微陣列進行 檢測。麥芽汁浸出物濃度 12.69% 麥芽汁體積 70L 麥芽汁中溶解氧濃度 8.6ppm 發酵溫度 15°C 酵母添加量 12.8xl(^細胞/mL對發酵液進行經時采樣，觀察酵母增殖量(圖1)、浸出物表觀濃度(圖2)的經時變化。與此同時對酵母菌體進行采樣，制備的mRNA用生物素進 行標記，使其與日本特開2004-283169中記載的啤酒酵母DNA微陣列進行 雜交。用GeneChip Operating System (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0， Affymetrix公司制造)進行信號檢測，nonScILV3基因的表達模式如圖 3所示。該結果證明在通常的啤酒發酵中nonScILV3基因進行表達。實施例3:使用實驗室酵母株的nonScILV3基因的互補試驗利用內源性基因ILV3已破壞的實驗室株，證明nonScILV3基因產物具 有二羥酸脫水酶的功能。根據文獻(Goldstein etal.，yeast. 15 1541 (1999))的方法，通過以含有 耐藥性標記的質粒(pAG25(nat1))作為模板的PCR，制作用于破壞ILV3 基因的片段。使用引物的序列用序列號5、 6表示。使用該片段，利用日本 特開平07-303475記載的方法轉化& cerev/Wae X2180-1A株，用含有50 mg/L諾爾絲菌素的YPD平板培養基(1%酵母浸膏，2%多聚蛋白胨，2% 葡萄糖，2%瓊脂)進行選擇。將得到的ILV3破壞株接種于SC平板培養基(0.67%無氨基酸的酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids)、 0.2%氨基酸混合物、2%葡萄糖、2%瓊脂)以及不含纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸的SC平板培養基(0.67%無氨基酸的酵母氮源、0.2%氨基酸混合物(去 除纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)、2%葡萄糖、2%瓊脂)上，在30。C培養3天 分析生長繁殖情況。如圖4及表1所示，可以證明ILV3破壞株在不含纈氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸的SC平板培養基上不生長繁殖，是支鏈氨基酸缺陷 型。接著，用限制酶Sacl和Notl酶解實施例1記載的 nonScILV3/pCR2.1-TOPO，制備包括蛋白質編碼區域全長的DNA片段。使 該片段與用限制酶Sacl和Notl處理的pYCGPYNot連接，構建nonScILV3 組成型表達載體nonScILV3/pYCGPYNot。 pYCGPYNot是YCp型的酵母表 達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子進行組成型表達。 酵母內的選擇性標記含有Geneticin抗性基因G418、此外，大腸菌內的選擇性標記含有氨芐青霉素抗性基因Amp:將制作的表達載體導入ILV3破壞株(X2180-1A ilv3::natl)內，通過 RT-PCR證明nonScILV3進行高表達。作為對照，制作不含插入片段的 pYCGPYNot導入株。將這些菌株用不含纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的SC 平板培養基進行同樣評價的結果(圖4-b、表l)，發現導入nonScILV3的 菌株在培養基上生長繁殖，證明通過導入nonScILV3后菌株變為非支鏈氨 基酸缺陷型，即nonScILV3基因產物具有二羥酸脫水酶的功能。表1菌株 Sc(-Leu,Ile,Val)平板培養基上的生長蘩殖親株(X2180-1"ILV3破壞株0t2180-1A ilv3::nat)ILV3被壞抹(X2180-ilv3::nat)+pTCGPYUotU無插入片段) ILV3被壞株(X2180-1A ilv3: :nat)+加nScILV3/pTCGPYUotl生長蘩殖不生長繁殖不生長繁殖生長1SS實施例4: nonScILV3基因的組成型表達使用實施例3制作的組成型表達載體，利用日本特開平07-303475記載 的方法，轉化tSacc/^w附yces / astonVwz^ Weihenstepan 34/70株。用含有 300mg/L遺傳霉素的YPD平板培養基(1%酵母浸膏，2%多聚蛋白胨，2% 葡萄糖，2%瓊脂)選擇轉化體。實施例5:啤酒釀造試驗試驗中VDK生成量的分析使用親株和實施例4獲得的nonScILV3高表達株的發酵試驗在以下條 件下進行。麥芽汁浸出物濃度 12%麥芽汁體積 1L麥芽汁中溶解氧濃度 約8ppm發酵溫度 15°C，恒定酵母添加量 5g濕酵母菌體/L麥芽汁對發酵酒醪進行經時采樣，分析酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量 的經時變化。酒醪的總VDK的定量，通過下述方法進行，g卩使VDK(DA和PD)和羥基胺反應，使生成的乙二肟衍生物和2價鐵離子反應，測定生 成的絡合物的吸光度(Drews et al.， Mon. for Brau., 34, 1966)。將前體a-乙 酰乳酸和a-乙酰羥基丁酸分別轉化為DA、 PD，這樣就可以求出含有這些 物質的總VDK量。工業實用性根據本發明的酒精飲料制造方法，能夠容易地制造使產品中作為異味 的VDK、特別是DA生產量降低，香味良好的酒精飲料。
權利要求
1. 選自由下述(a)～(f)組成的組中的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號2的氨基酸序列組成；(c)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶活性；(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有二羥酸脫水酶活性；(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴謹條件下與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質；以及(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴謹條件下與由編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質。
2、 如權利要求1所述的多核苷酸，其選自由下述(g) (i)組成的組(g) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號 2的氨基酸序列或在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加l 10個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有二羥酸脫水酶活性；(h) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序 列號2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有二羥酸脫水 酶活性；以及(i) 多核苷酸，其在嚴謹條件下與序列號1或序列號1的核苷酸序列 的互補核苷酸序列進行雜交，且編碼具有二羥酸脫水酶活性的蛋白質。
3、 如權利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成 的多核苷酸。
4、 如權利要求1所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序 列組成的蛋白質的多核苷酸。
5、 如權利要求1 4中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。
6、 蛋白質，其是由權利要求1 5中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋 白質。
7、 載體，其含有權利要求1 5中任一項所述的多核苷酸。
8、 酵母，其中含有權利要求7所述的載體。
9、 如權利要求8所述的酵母，其中通過導入權利要求7所述的載體使 總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力降低。
10、 如權利要求8所述的酵母，其中通過增加權利要求6所述的蛋白 質的表達量而使酵母的總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力降低。
11、 酒精飲料的制造方法，其包括培養權利要求8 10中任一項所述 的酵母。
12、 如權利要求ll所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲 料是麥芽飲料。
13、 如權利要求ll所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲 料是葡萄酒。
14、 酒精飲料，其為采用權利要求11 13中任一項所述的方法制造的 酒精飲料。
15、 酵母的評價方法，其為使用根據具有序列號1的核苷酸序列的二 羥酸脫水酶基因的核苷酸序列設計的引物或探針，對被測酵母的總連二酮 生產能力或總雙乙酰生產能力進行評價的方法。
16、 評價被測酵母的總連二酮生產能力或總雙乙酰生產能力的方法， 其包括培養被測酵母；以及測定具有序列號1的核苷酸序列的二羥酸脫 水酶基因的表達量。
17、 酵母的選擇方法，其包括培養被測酵母；對權利要求6所述的 蛋白質進行定量或測定具有序列號1的核苷酸序列的二羥酸脫水酶基因的表達量；以及選擇所述蛋白質的量或所述基因表達量與總連二酮或總雙乙 酰的目標生產能力相應的被測酵母。
18、 如權利要求17所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和 被測酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列的二羥酸脫水酶基因在各酵母 中的表達量；以及選擇其中該基因的表達高于標準酵母的被測酵母。
19、 如權利要求17所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和 被測酵母；對各酵母中的權利要求6所述的蛋白質進行定量；以及選擇其 中該蛋白質的量多于標準酵母的被測酵母。
20、 酒精飲料的制造方法，其包括使用權利要求8 10中任一項所 述的酵母或使用根據權利要求17 19任一項所述的方法選擇的酵母中的任 一種酵母，進行制造酒精飲料的發酵；以及使總連二酮生產量或總雙乙酰 生產量降低。
全文摘要
本發明涉及二羥酸脫水酶基因及其用途，特別涉及制造香味良好的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料、以及所述飲料的制造方法等。更具體地說，本發明涉及通過提高酵母的編碼二羥酸脫水酶IIv3p的ILV3基因、特別是啤酒酵母的特征基因nonScILV3的表達量，使成為產品的異味的二酮類、特別是雙乙酰的生產量降低的酵母，以及涉及使用該酵母的酒精飲料的制造方法等。
文檔編號C07K14/435GK101238147SQ200680029069
公開日2008年8月6日 申請日期2006年8月11日 優先權日2005年8月12日
發明者下永朋子, 中尾嘉宏, 兒玉由紀子 申請人:三得利株式會社