N-端修飾的胰高血糖素樣肽-1受體調節劑的制作方法

專利名稱：N-端修飾的胰高血糖素樣肽-1受體調節劑的制作方法
專利說明N-端修飾的胰高血糖素樣肽-1受體調節劑 本申請要求于2005年5月26日申請的美國臨時專利申請順序號60/684,805的優先權，所述申請通過引用全部結合到本文中。
發明領域
本文所公開和要求保護的主題提供新的人胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)肽受體調節劑、激動劑或部分激動劑，其表現出優于天然肽GLP-1的生物特性，并且與GLP-1天然序列相比較，對蛋白酶剪切的穩定性增加，因此可用來改善糖尿病。

背景技術：

GLP-1是在葡萄糖代謝和胃腸道分泌與代謝中具有調節功能的重要腸道激素。人GLP-1是一種30個氨基酸的肽，起源于前胰高血糖素原(preproglucagon)，在例如遠端回腸中的L-細胞中、在胰和腦中合成。由前胰高血糖素原產生GLP-1(7-36)酰胺和GLP-2的加工主要發生在L-細胞中。GLP-1通常在響應食物攝取時分泌，特別是碳水化合物和脂質刺激GLP-1分泌。已經確認GLP-1是極其強力而有效的胰島素釋放的刺激劑。GLP-1降低血漿胰高血糖素的濃度，減緩胃排空，刺激胰島素生物合成并促進胰島素敏感性(Nauck，1997，Horm.Metab.Res.471253-1258)。在葡萄糖耐量異常的患者中，GLP-1也提高B-細胞對葡萄糖的敏感和反應能力(Byrne，Eur.J.Clin.Invest.，2872-78，1998)。GLP-1在人體內促胰島素作用，增加了葡萄糖代謝率，其中一部分是因為胰島素水平升高，另一部分則是因為胰島素敏感性提高(D’Alessio，Eur.J.Clin.Invest.，2872-78，1994)。上述GLP-1的藥理學特性使其成為治療II型糖尿病極為想要的治療藥。

此外，最近的研究已經顯示，在正常受試者中稍高于GLP-1生理量的輸液明顯提高了安全性并降低了食物攝取(Flint，A.，Raben，A.，Astrup，A.和Holst，J.J.，J.Clin.Invest，101515-520，1998；Gutswiller，J.P.，Goke，B.，Drewe，J.，Hildebrand，P.，Ketterer，S.，Handschin，D.，Winterhaider，R.，Conen，D和Beglinger，C.Gut 4481-86，1999)。也已報道在肥胖受試者中維持對食物攝取和安全性的影響(Naslund，E.，Barkeling，B.，King，N.，Gutniak，M.，Blundell，J.E.，Holst，J.J.，Rossner，S.和Hellstrom，P.M.，Int.J.Obes，Relat.Metab.Disord.，23304-311，1999)。

在以上引用的研究中，也懷疑GLP-1會對胃排空具有顯著影響。胃排空導致餐后的葡萄糖移動。也已知道除了刺激胰島素分泌之外，GLP-1還刺激轉錄因子即胰島-十二指腸同源框-1(IDX-1)的表達，同時刺激B-細胞新生，因而可作為糖尿病的有效治療藥和/或預防藥(Stoffers，D.A.，Kieffer，T.J.Hussain，M.A.，Drucker，D.J.，Bonner-Weir，S.，Habener，J.F.和Egan，J.M.Diabetes，40741-748，2000)。也已知道GLP-1抑制胃酸分泌(Wettergren，A.，Schjoldager，B.，Mortensen，P.E.，Myhre，J.，Christiansen，J.，Holst，J.J.，Dig.Dis.Sci.，38665-673，1993)，這可提供抗胃潰瘍的保護作用。

GLP-1是腸降血糖素激素，例如促進進餐誘導的胰島素分泌的腸激素(Holst，J.J.，Curr.Med.Chem.，61005-1017，1999)。它是編碼胰高血糖素原(proglucagon)的胰高血糖素基因的產物。該基因不僅在胰臟A-細胞中表達，而且在腸粘膜內分泌L-細胞中表達。胰高血糖素原是一種含有160個氨基酸的肽(蛋白質)。胰高血糖素原的進一步加工導致產生a)胰高血糖素，b)N-端(推測失活)片段，和c)大C-端片段，通常稱為“主要胰高血糖素原片段”。認為該片段無生物活性。即使該片段存在于胰臟和腸道L-細胞中，但在腸道內僅見“主要的胰高血糖素原片段”的分解產物，產生兩種高度同源肽，通常稱為GLP-1和GLP-2。這兩種肽都具有重要的生物活性。同樣，L-細胞中存在的GLP-1的氨基酸序列與胰高血糖素原的78-107部分相同。

目前，涉及使用GLP-1型分子的療法有明顯問題，因為這類肽的血清半衰期相當短。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期不到5分鐘。因此，迫切需要具有生物活性和延時藥效學特性的GLP-1受體調節劑、激動劑或拮抗劑。本文所公開并要求保護的主題正是涉及該項需求及其它需求。

本文所公開的新型肽，可作為GLP-1受體調節劑、激動劑或部分激動劑，并顯示出類似或優于天然肽GLP-1的生物特性，因此可用于改善糖尿病及相關疾病。
發明概述
本文所述的合成分離的肽能調節GLP-1受體，最好是作為GLP-1受體的激動劑或部分激動劑。這些合成肽相對于GLP-1來說，表現出優越的體內功效和藥代動力學特性，包括餐后血漿葡萄糖降低，并伴隨血漿胰島素水平升高，這使其成為用于皮下、肺部、鼻腔、口腔或持續釋放制劑的理想候選治療藥。

在本文所述主題的第一實施方案中是包含下式I序列的分離的多肽 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11 其中， Xaa1為天然或非天然存在的氨基酸，包含咪唑環或噻唑環，例如組氨酸或噻唑基丙氨酸；其中所述氨基酸的任何碳原子任選被氫或一個或多個烷基、或一個或多個鹵素取代；其中所述氨基酸的游離氨基可被羥基取代或者可任選被以下基團取代氫、烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基(例如甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基； 并且其中Xaa1的氨基任選不存在，使得Xaa1是組氨酸或噻唑基丙氨酸的脫氨基酸，其中任何碳原子任選被烷基、鹵素或羥基取代； Xaa2為天然或非天然存在的氨基酸，選自α-氨基-異丁酸(Aib)；(D)-丙氨酸、(L)-丙氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、(L)-脯氨酸、(S)-α-甲基-脯氨酸、(L)-氮雜環丁烷(Azt)、(S)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)、(L)-纈氨酸、(R)-異纈氨酸和(S)-異纈氨酸，并且其中所述氨基酸的碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa3為天然或非天然存在的氨基酸，包含含有羧酸的氨基酸側鏈，例如天冬氨酸或谷氨酸；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa4為甘氨酸； Xaa5為天然或非天然存在的氨基酸，選自(L)-蘇氨酸、(L)-別蘇氨酸、(L)-絲氨酸、(L)-正纈氨酸、(L)-正亮氨酸；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa6為天然或非天然存在的氨基酸，包含二取代的α-碳；其中所述氨基酸的側鏈之一含有芳環或雜芳環，例如α-甲基-苯丙氨酸、α-甲基-2-氟苯丙氨酸和α-甲基-2，6-二氟苯丙氨酸，其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基取代；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個鹵素取代； Xaa7為天然或非天然存在的氨基酸，包含被羥基取代的氨基酸側鏈，例如L-蘇氨酸或L-別蘇氨酸；其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa8為天然或非天然存在的氨基酸，選自L-絲氨酸、L-組氨酸和L-天冬酰胺；其中所述氨基酸的一個或多個碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa9為天然或非天然存在的氨基酸，包含含有羧酸的氨基酸側鏈，例如L-天冬氨酸或L-谷氨酸；其中所述氨基酸的一個或多個碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa10為下式II、III或IV的天然或非天然存在的氨基酸
式II 式III
式IV 其中R3、R4和R6各自選自氫、烷基(例如甲基、乙基)、芳基、雜環基、雜芳基、鹵素、羥基、羥基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基(例如甲氧基)、芳氧基、甲酰胺、取代甲酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基和芳基磺酰基； 和 其中X1、X2、X3、X4和X5各自為C或N，前提條件是X1、X2、X3、X4和X5中的至少一個為N； Xaa11為下式IIa、IIIa或IVa的天然或非天然存在的氨基酸
式IIa式IIIa
式IVa 其中所述氨基酸的C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(carboxamide，NH2)、烷基甲酰胺(alkyl carboxamide，NHR1)或二烷基甲酰胺(dialkylcarboxamide，NR1R2)； 其中R1和R2各自為烷基或芳烷基； 其中R3a、R4a和R6a各自選自氫、烷基(例如甲基、乙基)、芳基、雜環基、雜芳基、鹵素、羥基、羥基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基、甲酰胺、取代甲酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基和芳基磺酰基； 其中R7選自氫、甲基和乙基；和 其中X1、X2、X3、X4和X5各自為C或N，前提條件是X1、X2、X3、X4和X5中的至少一個為N； 其中當Xaa10為式II氨基酸時，Xaa11不為式IIa氨基酸。

式II的天然或非天然存在的氨基酸還可包含不止一個R3、R4或R6基團。式III的天然或非天然存在的氨基酸還可包含不止一個R3、R4或R6基團。式IV的天然或非天然存在的氨基酸還可包含不止一個R3、R4或R6基團。式V的天然或非天然存在的氨基酸還可包含一個或多個R4或R5基團。

式IIa的天然或非天然存在的氨基酸還可包含不止一個R3a、R4a或R6a基團。式IIIa的天然或非天然存在的氨基酸還可包含不止一個R3a、R4a或R6a基團。式IVa的天然或非天然存在的氨基酸還可包含不止一個R3a、R4a或R6a基團。

式I的第一個實施方案的Xaa10也可以為下式VI的化合物
其中，R3選自烷基(例如甲基、乙基)和鹵素(例如氟、氯)，R6選自羥基和甲氧基。

式I的第一個實施方案的Xaa11也可以為下式VIa的化合物
式VIa 其中，R3a選自甲基、乙基和氟；其中R7選自氫和甲基。

式I的第一個實施方案的Xaa11也可以為下式VIIa的化合物
式VIIa 其中R3a為甲氧基；其中R7選自氫和甲基。

在另一個實施方案中， Xaa1選自L-His、D-His、L-N-甲基-His、D-N-甲基-His、L-4-噻唑基Ala、D-4-噻唑基Ala、脫氨基-His、脫氨基-噻唑基Ala、3-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙酰基、(S)-3-(1H-咪唑-4-基)-2-羥基丙酰基(L-β-咪唑乳酰基)，和 其中如果末端氨基存在的話，所述末端氨基任選被以下基團取代氫、烷基、二烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基(例如甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基。

Xaa2選自L-Ala、D-Ala、N-甲基-L-Ala、N-甲基-D-Ala、L-Pro、(S)-α-甲基-L-Pro、(L)-氮雜環丁烷(Azt)、(S)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)和α-氨基異丁酸(Aib)。

Xaa3選自L-Glu、L-Asp和L-Gla。

Xaa4為Gly。

Xaa5選自L-Thr、L-Nle、L-Nva、L-Aoc和L-別Thr。

Xaa6選自L-α-Me-Phe、L-α-Et-Phe、L-α-Me-2-氟Phe、L-α-Me-3-氟Phe、L-α-Me-2，3-二氟Phe、L-α-Me-2，6-二氟Phe、L-α-Me-Phe(五氟)，和 Xaa7為L-Thr或L-別蘇氨酸。

Xaa8選自L-Ser、L-His和L-Asn。

Xaa9為L-Asp。

Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸。

式II的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)-苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-乙氧基-2’-乙基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-乙氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸；4-[(3’，4’-二甲氧基)苯基]苯丙氨酸；4-[(2’-乙基-4’-羥基)苯基]苯丙氨酸； Xaa10為式III的天然或非天然存在的氨基酸。

式III的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]-4-苯丙氨酸；4-[2’-(6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(3’，5’-二甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(2’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；和4-[3’-(6’-甲基)吡啶基)苯丙氨酸； Xaa10為式IV的天然或非天然存在的氨基酸。

式IV的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；和4-[(2’-乙基-4’-羥基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸； Xaa11為式IIa的天然或非天然存在的氨基酸。

式IIa的天然或非天然存在的氨基酸選自4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-氟苯基)苯丙氨酸；和4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸； Xaa11為式IIIa的天然或非天然存在的氨基酸。

式IIIa的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[(6’-甲基)-2’-吡啶基]苯丙氨酸；4-[(6’-甲基)-3’-吡啶基]苯丙氨酸；4-[(6’-乙基)-2’-吡啶基)]苯丙氨酸；和4-[(6’-乙基)-3’-吡啶基)]苯丙氨酸； Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸。

式IVa的天然或非天然存在的氨基酸選自4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-氟苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(4’-三氟甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；和4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸， 和 其中所述氨基酸的C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)，其中R1和R2各自為烷基或芳烷基。

另一方面，Xaa1為選自以下的氨基酸L-His、D-His、L-N-甲基-His、D-N-甲基-His、L-4-噻唑基Ala、D-4-噻唑基Ala、脫氨基-His、脫氨基-噻唑基Ala、3-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙酰基、(S)-3-(1H-咪唑-4-基)-2-羥基丙酰基(L-β-咪唑乳酰基)； 其中如果末端氨基存在，則所述末端氨基任選被以下基團取代氫、烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基(例如甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基； Xaa2為選自以下的氨基酸L-丙氨酸、D-丙氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、L-脯氨酸、(S)-α-甲基-脯氨酸、(L)-氮雜環丁烷(Azt)、(S)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)和α-氨基異丁酸(Aib)； Xaa3為選自以下的氨基酸L-Glu、L-Asp和L-Gla； Xaa4為選自以下的氨基酸Gly； Xaa5為選自以下的氨基酸L-Thr、L-Nle、L-Nva、L-Aoc和L-別Thr； Xaa6為選自以下的氨基酸L-α-Me-Phe、L-α-Et-Phe、L-α-Me-2-氟Phe、L-α-Me-3-氟Phe、L-α-Me-2，3-二氟Phe、L-α-Me-2，6-二氟Phe和L-α-Me-Phe(五氟)； Xaa7為選自以下的氨基酸L-Thr和L-別蘇氨酸； Xaa8為選自以下的氨基酸L-Ser、L-His和L-Asn； Xaa9為L-Asp； Xaa10為選自式II、III、IV和V氨基酸的天然或非天然存在的氨基酸； 其中式II為選自以下的氨基酸4-[(2’-乙基-4’-羥基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸；和4-[(3’，4’-二甲氧基)苯基]苯丙氨酸； 其中式III為選自以下的氨基酸4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]-4-苯丙氨酸；4-[2’-(6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(3’，5’-二甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(2’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；和4-[3’-(6’-甲基)吡啶基)苯丙氨酸； 其中式IV為選自以下的氨基酸4-[(2’-乙基-4’-羥基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；和4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸； 和 Xaa11為選自式IIa、IIIa和IVa氨基酸的天然或非天然存在的氨基酸； 其中式IIa為選自以下的氨基酸4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-氟苯基)苯丙氨酸；和4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸； 其中式IIIa為選自以下的氨基酸4-[2’-(6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；和4-[3’-(6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸； 其中式IVa為選自以下的氨基酸4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-氟苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(4’-三氟甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；和4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸； 其中當Xaa10為式II氨基酸時，Xaa11不為式IIa氨基酸； 其中C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)，其中R1和R2各自為烷基或芳烷基；和其中Xaa10和Xaa11不同時為式II氨基酸。

其它實施方案為選自以下的分離的多肽
其它實施方案包括具有下列結構的分離的多肽


另一實施方案是包含上述任何分離多肽的藥物組合物。

另一實施方案涉及包含上述任何分離的多肽和至少一種選自以下的治療藥的聯合藥物抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、抗高血壓藥、抗動脈粥樣硬化藥和降血脂藥。

另一實施方案涉及上述聯合藥物，其中抗糖尿病藥選自雙胍、磺酰脲、葡萄糖苷酶抑制劑、PPARγ激動劑、PPARα/γ雙重激動劑、aP2抑制劑、DPP4抑制劑、胰島素增敏劑、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰島素和美格列奈。

另一實施方案涉及上述聯合藥物，其中抗糖尿病藥選自二甲雙胍、格列本脲、格列美脲、格列派瑞(glipyride)、格列吡嗪、氯磺丙脲、格列齊特、阿卡波糖、米格列醇、吡格列酮、曲格列酮、羅格列酮、莫格他唑(muraglitazar)、胰島素、G1-262570、伊格列酮(isaglitazone)、JTT-501、NN-2344、L895645、YM-440、R-119702、AJ9677、瑞格列奈、那格列奈、KAD1129、AR-HO39242、GW-409544、KRP297、AC2993、LY315902和NVP-DPP-728A。

另一實施方案涉及上述聯合藥物，其中抗肥胖癥藥選自β3腎上腺素能激動劑、脂肪酶抑制劑、5-羥色胺(和多巴胺)重攝取抑制劑、甲狀腺受體β化合物和食欲抑制藥。

另一實施方案涉及上述聯合藥物，其中抗肥胖癥藥選自奧利司他、ATL-962、AJ9677、L750355、CP331648、西布曲明、托吡酯、阿索開(axokine)、右苯丙胺、芬特明、苯丙醇胺和馬吲哚。

另一實施方案涉及上述聯合藥物，其中降血脂藥選自MTP抑制劑、膽固醇酯轉移蛋白、HMG CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成酶抑制劑、貝酸(fibric acid)衍生物、LDL受體活性上調劑、脂氧合酶抑制劑和ACAT抑制劑。

另一實施方案涉及上述聯合藥物，其中降血脂藥選自普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、尼伐他汀(nisvastatin)、菲沙他汀(visastatin)、非諾貝特、吉非貝齊、氯貝丁酯、阿伐麥布、TS-962、MD-700、CP-529414和LY295427。

另一實施方案涉及治療或延遲以下疾病的發展或發作的方法糖尿病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病性腎病、傷口愈合、胰島素抵抗、高血糖癥、高胰島素血癥、X綜合征、糖尿病并發癥、血中游離脂肪酸或甘油水平升高、高血脂癥、肥胖癥、高甘油三酯血癥、動脈粥樣硬化或高血壓；所述方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的任何上述分離的多肽。

另一實施方案涉及這樣的治療或延遲的方法，所述方法還包括同時或序貫給予治療有效量的一種或多種選自以下的治療藥抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、抗高血壓藥和抗動脈粥樣硬化藥和降血脂藥。

另一實施方案涉及治療或延遲以下疾病的發展或發作的方法糖尿病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病性腎病、傷口愈合、胰島素抵抗、高血糖癥、高胰島素血癥、X綜合征、糖尿病并發癥、血中游離脂肪酸或甘油水平升高、高血脂癥、肥胖癥、高甘油三酯血癥、動脈粥樣硬化或高血壓；所述方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的任何上述聯合藥物。
附圖簡述


圖1說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射化合物I對血漿葡萄糖的作用。

圖2說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射化合物I對血漿胰島素的作用。

圖3說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO9化合物對血漿葡萄糖的作用。

圖4說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO9化合物對血漿胰島素的作用。

圖5說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO118化合物對血漿葡萄糖的作用。

圖6說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO151化合物對血漿葡萄糖的作用。

圖7說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO151化合物對血漿胰島素的作用。

圖8說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO158化合物對血漿葡萄糖的作用。

圖9說明在ipGTT中給ob/ob小鼠皮下注射SEQ ID NO158化合物對血漿胰島素的作用。
發明詳述
本文所述的合成分離的肽能調節GLP-1受體，最好是作為GLP-1受體的激動劑或部分激動劑。這些合成肽相對于GLP-1來說，顯示出優越的體內功效和藥代動力學特性，包括餐后血漿葡萄糖降低，并伴隨血漿胰島素水平升高，這使其成為用于皮下、肺部、鼻腔、口腔或持續釋放的理想候選治療藥。

本文所述并要求保護的主題包括包含下式I序列的分離的多肽 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11 式I 其中， Xaa1為天然或非天然存在的氨基酸，包含咪唑環或噻唑環，例如組氨酸或噻唑基丙氨酸；其中所述氨基酸的任何碳原子任選被氫、一個或多個烷基、或一個或多個鹵素取代；其中所述氨基酸的游離氨基任選被以下基團取代氫、羥基、烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基(例如甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基； 并且其中Xaa1的氨基任選不存在，使得Xaa1是組氨酸或噻唑基丙氨酸的脫氨基酸，其中任何碳原子任選被烷基、鹵素或羥基取代； Xaa2為天然或非天然存在的氨基酸，選自α-氨基-異丁酸；L-丙氨酸、D-丙氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、L-脯氨酸、(S)-α-甲基-脯氨酸、L-氮雜環丁烷(Azt)、(L)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)、L-纈氨酸、(R)-異纈氨酸和(S)-異纈氨酸，并且其中所述氨基酸的碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa3為天然或非天然存在的氨基酸，包含含有羧酸的氨基酸側鏈，例如天冬氨酸或谷氨酸；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa4為甘氨酸； Xaa5為天然或非天然存在的氨基酸，選自L-蘇氨酸、L-別蘇氨酸、L-絲氨酸、L-正纈氨酸、L-正亮氨酸；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa6為天然或非天然存在的氨基酸，包含二取代的α-碳；其中所述氨基酸的側鏈之一含有芳環或雜芳環，例如α-甲基-苯丙氨酸、α-甲基-2-氟苯丙氨酸、α-甲基-2，6-二氟苯丙氨酸，其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基取代；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個鹵素取代； Xaa7為天然或非天然存在的氨基酸，包含被羥基取代的氨基酸側鏈，例如L-蘇氨酸或L-別蘇氨酸；其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa8為天然或非天然存在的氨基酸，選自L-絲氨酸、L-組氨酸和L-天冬酰胺；其中所述氨基酸的一個或多個碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa9為天然或非天然存在的氨基酸，包含含有羧酸的氨基酸側鏈，例如L-天冬氨酸或L-谷氨酸；其中所述氨基酸的一個或多個碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代； Xaa10為下式II、III或IV的天然或非天然存在的氨基酸
式II式III
式IV 其中R3、R4和R6各自選自氫、烷基、芳基、雜環基、雜芳基、鹵素、羥基、羥基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、烷氧基、芳氧基、羧基、羧基烷基、甲酰胺、取代甲酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基和芳基磺酰基； 和 其中X1、X2、X3、X4和X5各自為C或N，前提條件是X1、X2、X3、X4和X5中的一個為N； Xaa11為下式IIa、IIIa或IVa的天然或非天然存在的氨基酸
式IIa 式IIIa
式IVa 其中所述氨基酸的C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)； 其中R1和R2各自為烷基或芳烷基； 其中R3a、R4a和R6a各自選自氫、烷基、芳基、雜環基、雜芳基、鹵素、羥基、羥基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、烷氧基、芳氧基、羧基、羧基烷基、甲酰胺、取代甲酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基和芳基磺酰基； 其中R7選自氫、甲基和乙基；和 其中X1、X2、X3、X4和X5各自為C或N，前提條件是X1、X2、X3、X4和X5中的一個為N； 其中當Xaa10為式II氨基酸時，Xaa11不為式IIa氨基酸。

本文所提供的定義適用于但不限于本說明書中使用的術語，除非在具體情況下另有限定。

氨基酸和肽化學領域普通技術人員知道，氨基酸包括由如下通式結構所表示的化合物
L-或S-α-氨基酸 D-或R-α-氨基酸 (如果R＝H) (如果R＝H) 其中R和R’如同在本文所討論的。

除非另有說明，否則術語“氨基酸”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于與同一碳原子連接的氨基和羧基，稱為“α”碳原子，其中R和/或R’可以是天然或非天然側鏈，包括氫。在“α”碳原子的絕對“S”構型通常稱為“L”或“天然”構型。在“R”和“R”’(prime)取代基都等于氫的情況下，氨基酸為甘氨酸且不是手性的。

除非另有說明，否則術語“氨基醇”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于天然或非天然氨基酸，其中羧基被取代(還原)成甲基醇，例如纈氨醇、甘氨醇、丙氨醇、芳基丙氨醇、雜芳基丙氨醇。

除非另有說明，否則術語“烷基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于在正鏈中含有1-40個碳原子、優選1-20個碳原子、更優選1-8個碳原子的直鏈和支鏈烴基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基，其各種支鏈異構體等。此外，本文所定義的烷基可在任何可用的碳原子上被通常連接在該鏈上的一個或多個官能團任選取代而構成例如三氟甲基、3-羥己基、2-羧丙基、2-氟乙基、羧甲基、氰基丁基等烷基，所述官能團例如但不限于烷基、芳基、烯基、炔基、羥基、芳烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基、芳基烷氧基、雜芳氧基、雜芳基烷氧基、烷酰基、鹵素、羥基、硫代(基)、硝基、氰基、羧基、羰基

甲酰胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、烷基氨基、芳基酰氨基、雜芳基酰氨基、疊氮基、胍基、脒基、膦酸基、次膦酸基、磺酸基、亞磺酰氨基、鹵代芳基、CF3、OCF2、OCF3、芳氧基、雜芳基、環烷基烷氧基烷基、環雜烷基等。

除非另有說明，否則術語“烯基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于在正鏈中含有2-40個碳原子并具有一個或多個雙鍵、優選含有2-20個碳原子并具有1-3個雙鍵、更優選含有2-8個碳原子并具有1-2個雙鍵的直鏈和支鏈烴基，使得任何碳原子都可象上述“烷基”那樣被任選取代。

除非另有說明，否則術語“炔基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于在正鏈中含有2-40個碳原子并具有一個或多個三鍵、優選含有2-20個碳原子并具有1-3個三鍵、更優選含有2-8個碳原子并具有1-2個三鍵的直鏈和支鏈烴基，使得任何碳原子都可象上述“烷基”那樣被任選取代。

除非另有說明，否則術語“環烷基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于飽和或部分不飽和(含1或2個雙鍵)的環狀烴基，其含有1-3個附加環或稠環，包括單環烷基、雙環烷基和三環烷基，總共含有形成環的3-20個碳原子，優選每個環由4-7個碳原子構成；并且可與1個如芳基所述的芳環稠合，包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二烷基、環己烯基、
這些基團中任一個通過任何可用的碳原子被一個或多個選自以下的基團任選取代氫、鹵素、鹵代烷基、烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、烯基、三氟甲基、三氟甲氧基、炔基、環烷基烷基、芴基、雜環基烷基、雜環基烷基烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、芳氧基、芳氧基烷基、芳基烷氧基、芳硫基、芳基偶氮基、雜芳烷基、雜芳基烯基、雜芳基雜芳基、雜芳氧基、羥基、硝基、氧代、氰基、羧基、羰基

甲酰胺基、氨基、取代氨基(其中氨基包括1或2個取代基，例如烷基、芳基或定義中提到的任何其它芳基化合物)、酰氨基、疊氮基、胍基、脒基、膦酸基、次膦酸基、磺酸基、亞磺酰氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、雜芳硫基、芳基硫代烷基、烷氧基芳硫基、烷基羰基、芳基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基亞磺酰基、芳基亞磺酰基烷基、芳基磺酰基氨基或芳基磺酰胺基羰基、或任何上述烷基取代基。

術語“芳基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于在環部分含6-10個碳原子的單環和雙環芳基(例如苯基或萘基)，并且任選包括1-3個與“芳基”(例如芳基、環烷基、雜芳基或雜環基烷基環)稠合的額外環，并且通過任何可用的碳原子被一個或多個選自以下的基團任選取代氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、烯基、三氟甲基、三氟甲氧基、炔基、環烷基烷基、芴基、雜環基烷基、雜環基烷基烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、芳氧基、芳氧基烷基、芳基烷氧基、芳硫基、芳基偶氮基、雜芳烷基、雜芳基烯基、雜芳氧基、雜芳基烷氧基、雜芳基烷氧基烷基、羥基、硝基、氧代、氰基、氨基、取代氨基(其中氨基包括1或2個取代基，例如烷基、環烷基、雜環基烷基、雜芳基或芳基或定義中提到的任何其它芳基化合物)、巰基、烷硫基、芳硫基、雜芳硫基、芳硫基烷基、烷氧基芳硫基、烷基羰基、芳基羰基、烷基氨基羰基、環烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基、雜芳烷基氨基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基亞磺酰基、芳基亞磺酰基烷基、芳基磺酰基氨基或芳基磺酰胺基羰基、或上述任何烷基取代基。

術語“芳烷基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于具有芳基取代基(例如芐基、苯乙基或萘基丙基)的上述烷基，其中所述芳基和/或烷基可如上所述被任選取代。

術語“烷氧基”、“芳氧基”、“雜芳氧基”、“芳基烷氧基”、“雜芳基烷氧基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于如上所述的烷基或芳基通過氧原子連接。

本文所用的術語“雜環基”或“雜環”代表但不限于未取代或取代的穩定4-、5-、6-或7-元單環飽和或不飽和環系，并且由碳原子和1-4個選自以下的雜原子組成氮、硫、氧和/或SO或SO2基團，其中氮和硫雜原子可任選被氧化，而且氮雜原子可任選被季銨化。雜環可在任何雜原子或碳原子上連接，結果產生穩定結構。這類雜環基團的實例包括但不限于四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧代吡咯烷基、氧代哌嗪基、氧代哌啶基和噁二唑基。任選雜環基可被一個或多個官能團取代，例如“烷基”或“芳基”所述的那些官能團。

術語“雜環基烷基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于具有雜環基烷基取代基的如上定義的烷基，其中所述“雜環基”和/或烷基可如上所述被任選取代。

本文所用的術語“雜芳基”是指但不限于5-、6-或7-元芳族雜環，其中含有一個或多個選自以下的雜原子氮、硫、氧和/或SO或SO2基團。這類環可與另一芳基或雜芳基環稠合，并且包括可能的N氧化物；這類雜芳基基團的實例包括但不限于呋喃、吡咯、噻吩、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、異噁唑、噁唑、咪唑等。任選雜芳基可被一個或多個通常與所述鏈連接的官能團取代，例如“烷基”或“芳基”所述的那些官能團。

術語“雜芳烷基”在本文中單獨或作為其它基團組成部分來使用時，包括但不限于具有雜芳基取代基的如上定義的烷基，其中所述雜芳基和/或烷基可如上所述被任選取代。

術語“受體調節劑”是指在GLP-1受體上起作用以改變其對下游信號轉導事件的調節能力的化合物。受體調節劑的實例包括激動劑、拮抗劑、部分激動劑、反向激動劑、變構拮抗劑和變構增強劑，正如標準藥理學教科書所定義的(例如E.M.Ross和T.P.Kenakin載于Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版(2001)McGraw Hill，第2章，第31-43頁)。

本領域普通技術人員容易理解本案和本領域提供的這些術語的含義。

術語“糖尿病和相關疾病或相關病癥”是指但不限于II型糖尿病、I型糖尿病、葡萄糖耐量異常、肥胖癥、高血糖癥、X綜合征、代謝障礙綜合征、糖尿病并發癥和高胰島素血癥。

本文所用的術語“脂質-調節”藥或“降血脂”藥是指但不限于降低LDL和/或升高HDL和/或降低甘油三酯和/或降低總膽固醇和/或用于治療性治療脂質紊亂的其它已知機制的藥物。

本文所述的給予治療藥包括但不限于給予治療有效量的治療藥。本文所用的術語“治療有效量”是指但不限于治療或預防通過給予本文所述GLP-1受體調節劑的組合物而能治療的疾病的治療藥的量。該量是足以顯示出可檢測的治療或預防或改善效果的量。其效果可包括例如但不限于治療或預防本文所列舉的疾病。對患者的準確有效量將取決于患者體重和健康狀況、待治療疾病的性質和程度、臨床醫師的建議和給藥所選的治療藥或治療藥組合。因此，無法預先確定精確的有效量。

在葡萄糖降低的功效模型(ob/ob小鼠模型)中，在同樣的暴露下，本文所公開并要求保護的肽顯示出優越的功效，以及優越的藥代動力學(經狗的皮下注射而測定)，正如所提供的表和圖中顯示的那樣。

化合物I

表I *化合物I和化合物SEQ ID NO118溶于丙二醇/pH 7.4磷酸緩沖液(1∶1)后用藥；化合物SEQ ID No9、151和158溶于0.2M Tris緩沖液(pH 8.0)后用藥。
表II *AUC＝曲線下面積。在各動物個體中使用禁食血漿葡萄糖值為基線計算出AUC值。在相同的研究中，相對于溶媒-處理組的AUC而言，計算出AUC的變化百分比。在Fisher的事后檢驗后，通過運用方差分析(ANOVA)與溶媒-處理組進行比較，得出p值，**NS＝無統計學顯著性。***給予溶媒丙二醇/pH7.4磷酸緩沖液(1∶1)。

本文所述的肽及其類似物可通過化學合成、使用不同固相技術制得，例如參見G.Barany和R.B.Merrifield，“The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology”；第2卷-“Special Methods in PeptideSynthesis，第A部分”，第3-284頁，E.Gross和J.Meienhofer編著，Academic Press，New York，1980；和J.M.Stewart和J.D.Young，“Solid-Phase Peptide Synthesis”，第2版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984。所需策略基于用Fmoc(9-芴基甲基甲基-氧基羰基)基團暫時保護α-氨基，并用叔丁基暫時保護氨基酸側鏈(參見例如E.Atherton和R.C.Sheppard，“The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino ProtectingGroup”，載于“The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology”；第9卷-“Special Methods in Peptide Synthesis，第C部分”，第1-38頁，S.Undenfriend和J.Meienhofer編著，Academic Press，San Diego，1987。

可在不溶性聚合物載體(也稱為“樹脂”)上，從肽的C-端開始逐步合成肽。通過形成酰胺鍵或酯鍵，將肽的C-端氨基酸附加在樹脂上，開始合成。這允許最后分別以C-端酰胺或羧酸形式，釋放所得肽。或者，在存在C-端氨基醇的情況下，可按本文所述方法，將C-端殘基連接到2-甲氧基-4-烷氧基苯甲醇樹脂(SASRINTM，BachemBioscience，Inc.，King of Prussia，PA)上，并在完成肽序列組裝之后，用LiBH4/THF釋放所得肽醇(參見J.M.Stewart和J.D.Young，出處同上，第92頁)。

合成所用的C-端氨基酸和所有其它的氨基酸必須具有其α-氨基和以不同方式受到保護的側鏈官能團(如果有的話)，使得在合成期間可選擇性除去α-氨基保護基。通過將氨基酸的羧基活化成活性酯，并使其與附加在樹脂上的N-端氨基酸的未封閉α-氨基反應，完成氨基酸的偶聯。重復α-氨基脫保護和偶聯的過程，直到組裝成完整肽序列為止。然后利用伴隨的側鏈官能團脫保護，從樹脂中釋放肽，通常是在適當清除劑存在下，以便限制副反應。最后通過反相HPLC純化所得肽。

合成最終肽的前體所需的肽酰基-樹脂是采用市售的交聯聚苯乙烯聚合物樹脂(Novabiochem，San Diego，CA；AppliedBiosystems，Foster City，CA)。對C-端甲酰胺的優選固相載體是4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧乙酰基-對甲基二苯甲胺樹脂(Rink酰胺MBHA樹脂)；9-Fmoc-氨基-呫噸-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber酰胺樹脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3，5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield樹脂(PAL樹脂)。可使用分別從DIC/HOBT、HBTU/HOBT、BOP、PyBOP或從DIC/HOAT、HATU/HOAT產生的HOBT或HOAT活性酯，完成第一個和后續氨基酸的偶聯。對已被保護的肽片段的優選固相載體是2-氯三苯甲基氯樹脂和9-Fmoc-氨基-呫噸-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber酰胺樹脂)。最好通過使被Fmoc保護的氨基酸與樹脂在二氯甲烷和DIEA中反應，將第一個氨基酸裝載到2-氯三苯甲基氯樹脂上。必要時，可加入少量DMF以促進氨基酸的溶解。

可通過使用Advanced Chemtech Multiple PeptideSynthesizer(MPS396)或Applied Biosystems Inc.肽合成儀(ABI 433a)等肽合成儀，進行本文所述的11聚體肽類似物的合成。如果使用MPS396，則同時合成多達96個肽。如果使用ABI 433a合成儀，則序貫合成單個肽。在這兩種情況下，使用本文所述的Fmoc/叔丁基保護策略，逐步完成固相肽合成。

采用兩種方法中的一種，將位置Xaa10和位置Xaa11存在的非天然非市售氨基酸摻入肽鏈中。在第一種方法中，使用適當的有機合成方法，在溶液中制備Boc-或Fmoc-保護的非天然氨基酸。所得衍生物隨后用于肽的逐步合成。或者，直接使用合成有機化學方法，將所需的非天然氨基酸建立在樹脂上。當需要將非天然非市售氨基酸摻入到位置Xaa6或任何其它Xaa位置時，在溶液中合成所需Fmoc-保護的非天然氨基酸。這類衍生物隨后用于逐步固相肽合成。

有用的Fmoc氨基酸衍生物如下所示 用于固相合成的正交保護的氨基酸的實例
用于固相合成的被保護的氨基酸

可使用任何標準方法，將各肽的肽酰基-樹脂前體裂解并脫保護(參見例如D.S.King等，Int.J.Peptide Protein Res.36，1990，255-266)。所需方法是在作為清除劑的水和TIS的存在下使用TFA。通常，在室溫下，將肽酰基-樹脂在TFA/水/TIS(94∶3∶3，體積∶體積∶體積；1ml/100mg肽酰基樹脂)中攪拌2-6小時。然后濾掉用過的樹脂，TFA溶液經減壓濃縮或干燥。所得粗制肽經沉淀后用Et2O洗滌，或直接重新溶于DMSO或50％乙酸水溶液中，用于制備型HPLC純化。

可以使用制備型HPLC進行純化(例如在Waters 4000型或Shimadzu LC-8A型液相色譜上)，從而獲得具有所需純度的肽。將粗制肽溶液注入YMC S5ODS(20×100mm)柱中，用MeCN/水的線性梯度進行洗脫，這兩者都用0.1％TFA緩沖，使用的流速為14-20ml/min，并通過在220nm處的紫外吸收監測流出液。可通過電噴霧MS分析證實純化肽的結構。

下列縮略語用于實施例和本文的其它地方 Ph＝苯基 Bn＝芐基 i-Bu＝異丁基 i-Pr＝異丙基 Me＝甲基 Et＝乙基 Pr＝正丙基 Bu＝正丁基 t-Bu＝叔丁基 Trt＝三苯甲基 TMS＝三甲基甲硅烷基 TIS＝三異丙基硅烷 Et2O＝乙醚 HOAc或AcOH＝乙酸 MeCN或AcCN＝乙腈 DMF＝N，N-二甲基甲酰胺 EtOAc＝乙酸乙酯 THF＝四氫呋喃 TFA＝三氟乙酸 TFE＝α，α，α-三氟乙醇 Et2NH＝二乙胺 NMM＝N-甲基嗎啉 NMP＝N-甲基吡咯烷酮 DCM＝二氯甲烷 n-BuLi＝正丁基鋰 Pd/C＝披鈀碳 PtO2＝氧化鉑 TEA＝三乙胺 min＝分鐘 h或hr＝小時 L＝升 mL或ml＝毫升 μL＝微升 g＝克 mg＝毫克 mol＝摩爾 mmol＝毫摩爾 meq＝毫當量 rt或RT＝室溫 sat或sat’d＝飽和 aq.＝水溶液 mp＝熔點 Bip＝聯苯基丙氨酸 LiBH4＝硼氫化鋰 Mg＝鎂 BOP試劑＝六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)鏻(Castro試劑) PyBOP試劑＝六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷-1-基鏻 HBTU＝六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓 HATU＝六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓 HCTU＝六氟磷酸2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲 鎓 DMAP＝4-(二甲氨基)吡啶 DIEA＝二異丙基乙胺 EDAC＝3-乙基-3’-(二甲氨基)丙基-碳二亞胺鹽酸鹽(或1-[(3-(二甲基)氨基)丙基])-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽) Fmoc或FMOC＝芴基甲氧羰基 Boc或BOC＝叔丁氧羰基 Cbz＝芐氧羰基 HOBT或HOBT·H2O＝1-羥基苯并三唑水合物 Cl-HOBt＝6-氯-苯并三唑 HOAT＝1-羥基-7-氮雜苯并三唑 TLC＝薄層色譜 HPLC＝高效液相色譜 LC/MS＝高效液相色譜/質譜 MS或Mass Spec＝質譜 NMR＝核磁共振 Sc或SC＝皮下 IP或ip＝腹膜內 GTT＝葡萄糖耐量試驗
肽化學領域技術人員知道，氨基酸以D型和L型異構體形式存在，而本文所公開和要求保護的主題包括使用這兩種異構體的任一種或其混合物，用于在合成本文所述的肽時摻入氨基酸。
式IVa氨基酸的通用合成方法
可通過若干方法制備被保護的式IVa氨基酸。例如(流程A)，可用標準文獻方法，通過鈀介導的催化作用，將碘溴-雜環i(其中X3＝N)與硼酸偶聯，得到芳基雜環溴化物ii，再通過鋰化反應和與酰化劑(例如二甲基甲酰胺)反應，得到醛iii。通過硼氫化鈉或類似試劑，將該醛還原成醇iv，并通過在48％氫溴酸中長期回流iv，制備相應溴化物v。在O′Donnell方法(Tetrahedron Letters 398775(1998))之后，使用手性催化劑，用v使2-(二苯亞甲氨基)乙酸叔丁酯烷基化，得到手性酯vi，在利用非水強酸將vi脫保護之后，用Fmoc-Cl處理，得到一種主要手性形式的Fmoc叔丁酯vii。在常用有機溶劑中使vii重結晶，得到viii，其對映體過量＞95％。使用非水強酸除去酯，得到式IVa化合物。

或者，可通過甲基雜環ix的自由基引發的溴化作用，得到溴甲基雜環x，而制得式IVa化合物(流程B)。通過上述O′Donnell方法使x烷基化，并按類似方式重結晶，得到高對映體過量的手性酯xiii。按照流程A所述進行硼酸偶聯反應，得到式IVa化合物。
流程A
a)R3R6C6H3B(OH)2，Pd(Ph3P)4，甲苯/10％Na2CO3；b)s-BuLi，DMF/甲苯；c)NaBH4/MeOH；d)48％HBr、回流；e)PhC＝NCH2CO2tBu，手性催化劑，2-叔丁基亞氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-1，3-二氮雜-2-磷雜環己烷/THF；f)i.15％檸檬酸，ii.FmocCl，Na2CO3/THF-H2O；g)重結晶；h)TFA 流程B
a)NBS，AIBN/CCl4；b)PhC＝NCH2CO2tBu，手性催化劑，2-叔丁基亞氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-1，3-二氮雜-2-磷雜環己烷/THF；c)i.15％檸檬酸，ii.FmocCl，Na2CO3/THF-H2O；d)重結晶；e)R3R6H3B(OH)2，Pd(Ph3P)4/甲苯-10％Na2CO3；f)TFA
可通過用磷酰溴(三溴氧化磷)處理，自羥基雜環xiv制備化合物ix (流程C)。
流程C

中間體ix的替代合成方法是通過鋅-銅偶聯，并使用xv即3-碘-丙氨酸甲酯(methyl-3-iodo-alanate)和i(流程D)。
流程D

可以自芳基腈xv制備芳基嘧啶基甲基溴xxiii(X2、X3＝N，X1、X4＝CR4a)(流程E)。
流程E

用羥胺鹽酸鹽處理腈，自xv制備羥基嘧啶xvi。嘧啶xvii來自xvi的氫化。xvii與烯醇亞甲基丙二酸酯(enolmethylene malonate)xviii縮合，得到嘧啶xix，再用磷酰氯進行氯化，得到xx。通過催化性氫化的脫鹵素作用，得到xxi，用DiBAl還原，得到醇xxii。所得醇用磷酰溴處理，得到不穩定的溴化物xxiii，其必須象流程A中那樣立刻使用，得到氨基酸vi。

通過Kapadia，J.Org.Chem.66 1903(2001)的方法，自噁唑烷xxiv制備式IVa化合物(R7＝Me)(流程F)。因此，xxiv用v烷基化時使用六甲基二硅疊氮化鉀或其它強堿，得到xxv。在保護胺(用Fmoc-Cl或Fmoc-OSu等進行保護)之后，用強酸水解xxv，得到式IVa型化合物。
流程F
實施例1 11聚體肽的同時固相肽合成
在使用自動化同時合成方案、在MPS-396肽合成器上連續延伸肽鏈之前，先使用下列手工方法，分批制備在位置Xaa10和Xaa11含有氨基酸的二肽酰基樹脂。以上通用實驗和實施例10-19中描述了在手工偶聯中使用N-α-Fmoc-保護的聯苯基丙氨酸或苯基-雜芳基-丙氨酸衍生物的合成。

9-Fmoc-氨基呫噸-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber酰胺樹脂；裝載0.5-0.7mmol/g)通過用DMF洗滌(4×10ml/g，5分鐘)而溶脹，其中Sieber酰胺樹脂的用量足以合成若干11聚體類似物。再用20％哌啶/DMF(10ml/g)處理兩次，分別為5分鐘和15分鐘，除去Fmoc基團。用DMF(4×10ml/g)和NMP(4×10ml/g)洗滌樹脂。將0.5MFmoc-L-4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸-OH(HCl鹽)(1.1當量)、(或任何其它由式IVa所表示的氨基酸)、PyBOP(1.1當量)和DIEA(3.3當量)的NMP溶液加入到樹脂中。然后將樹脂震蕩或渦旋16-24小時。使用定性茚三酮試驗監測偶聯的完成情況。將樹脂排干，用NMP(3×10ml/g)和DMF(3×10ml/g)洗滌，用10％乙酸酐/DCM(10ml/g)處理90分鐘。DCM洗滌(4×10ml/g)后，再進行用DIC/HOAT介導的第二次手工偶聯循環，從使用20％哌啶/DMF除去Fmoc基團開始，在偶聯步驟中使用式II所表示的Fmoc-保護的聯苯基丙氨酸類似物。該合成流程得到所需Fmoc-保護的二肽酰基-Sieber酰胺樹脂。

然后按照以下方式，在每輪高達96個肽的自動化MPS合成中，使用這類合成一組設計好的類似物所需的二肽酰基-樹脂。以每個反應器孔中相當于0.01-0.025mmol(20-50mg)樹脂的體積，將二肽酰基-樹脂的二氯甲烷/DMF(60∶40)懸浮液裝入Advanced ChemTechMPS 396合成儀的96孔反應器中。將反應器放入儀器中并排干。然后用DMF(0.5-1.0ml，3×2min)洗滌各孔，并按照預定程序化的序列合成表的規定，進行組裝各種肽序列所需次數的自動化偶聯循環。

用于同時合成96個化合物的典型0.0250.025mmol/孔的詳細逐步合成方案描述如下。該方案適用于在每一輪同時合成范圍為12-96個類似物陣列。通用合成方案見流程1。
流程1 GLP-1受體調節劑肽類似物的自動化合成

在開始合成之前，先制備以下試劑溶液并按需要放在儀器上1.5M (15％)哌啶/DMF；0.5M DIEA/NMP；0.36M DIC/NMP；1M(10％)乙酸酐/DMF。將所需Fmoc-保護的氨基酸用0.36MHOAt/NMP配制成0.36M溶液，置于32位氨基酸架的合適位置上。

通過用20％哌啶/DMF(1.0ml；1×5分鐘；1×15分鐘)處理，使如上制備的Fmoc-保護的二肽酰基-樹脂脫保護。再將樹脂用NMP(8×1.0ml)洗滌。

通過在所有孔中手工加入合適Fmoc-氨基酸(0.075mmol，3.0當量)、HCTU(0.075mmol，3.0當量)和DIEA(0.15mmol，6.0當量)的NMP(1ml)溶液，進行下一個氨基酸的偶聯，通常是Fmoc-Asp(OtBu)-OH或其它的Fmoc-氨基酸，如有必要用適當正交保護。偶聯進行3小時。在通過氮氣壓(3-5psi)排空反應器之后，用NMP(4×1.0ml)洗滌各孔。

如上所述，通過除去Fmoc基團開始下一個偶聯循環，并按照在該位置所需的序列取代的需求，包括Fmoc-Ser(tBu)-OH或不同Fmoc-氨基酸的偶聯。按照Fmoc-Asp(OtBu)-OH所述相同的方式進行偶聯。按相同方式進行下一個偶聯步驟，視需要將Fmoc-Thr(tBu)-OH或任何其它所選Fmoc-氨基酸摻入到該序列位置。

下一個Fmoc-氨基酸(例如Fmoc-α-甲基-Phe-OH或其類似物)如下偶聯在用常規方式脫去Fmoc保護之后，手工加入Fmoc-氨基酸(1-5當量)、HOAt(1-5當量)和DIC(1-5當量)的NMP(1.0ml)溶液，偶聯進行16-24小時。在此情況下不重復偶聯。在常規偶聯后洗滌之后，按本文所述方法用乙酸酐封閉肽酰基-樹脂。

下一個偶聯步驟，按照該位置的序列置換的需求，包括Fmoc-Thr(tBu)-OH或取代類似物。按照最初Fmoc-Asp(OtBu)-OH及其類似物的MPS偶聯的描述進行偶聯，只是使用10當量Fmoc-Thr(tBu)-OH或取代類似物并偶聯16小時，且所用偶聯試劑為DIC/HOAt的NMP。在常規偶聯后洗滌之后，肽酰基-樹脂用10％乙酸酐/DCM(1×1ml×60min.)封閉。

對于下三個氨基酸殘基，重復使用與偶聯Fmoc-Asp(OtBu)-OH 相同的偶聯方案。按照上段對Fmoc-Thr(tBu)-OH殘基的描述，偶聯Fmoc-His(Trt)-OH，以便完成所需11聚體肽類似物的序列組裝。對于在某些序列位置上需要偶聯市售和非市售非天然氨基酸而言，使用類似于上述在位置6的新氨基酸(Xaa6)的單一偶聯方案。

最后，如上所述，用20％哌啶/DMF除去Fmoc基團，肽酰基-樹脂用DMF(4×1.0ml)和DCM(4×1.0ml)洗滌，然后在反應器部件上，通過施加恒定氮氣壓(5psi)10-15分鐘，使其干燥。
裂解/脫保護
如下所述，通過用TFA裂解混合物進行處理，將所需肽從其各自肽酰基-樹脂中裂解/脫保護。將TFA/DCM/三異丙基硅烷(70∶28∶2)溶液(1.0ml)加入到反應器部件的各孔內，然后渦旋攪拌10分鐘。該步驟重復兩次以上，通過正壓將各孔的TFA溶液收集到位于反應器底部的匹配的96小瓶中。將小瓶蓋好，然后再溫和渦旋攪拌90分鐘。打開瓶蓋，在SpeedVacTM(Savant)中濃縮至體積約0.2ml。再通過加入二異丙基醚(3ml)并渦旋攪拌片刻，使粗制肽沉淀。沉淀物經離心沉淀，輕輕倒出上清液。小瓶放在SpeedVacTM(Savant)中干燥，得到粗制肽，通常收率＞100％(20-40mg)。將粗制肽直接溶于2ml 0.6％氫氧化銨中，用于下面的制備型HPLC純化。
粗制肽的制備型HPLC純化
在Waters 4000型或Shimadzu LC-8A型液相色譜儀上進行制備型HPLC。將每種粗制肽溶液注入YMC S5ODS(20×100mm)柱內，使用MeCN/水(兩者都用0.1％TFA緩沖)的線性梯度洗脫。所用的典型梯度為20％→50％0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水，在15分鐘內，流速為14ml/分鐘，在220nm處對流出物進行紫外檢測。通常在10-11分鐘之后，洗脫下來的所需產物與雜質完全分開，通常在流分收集器上收集單個10-15ml流分。將HPLC流分凍干，得到所需肽，為非晶形白色粉末。
純化肽的HPLC分析
按上述方法進行制備型HPLC純化之后，在ShimadzuLC-10AD或LC-10AT分析型HPLC系統上，通過分析型RP-HPLC分析每種肽，該系統由以下部分組成SCL-10A系統控制器、SIL-10A自動注射器、SPD10AV或SPD-M6A UV/VIS檢測器或SPD-M10A二極管陣列檢測器。使用YMC ODS S3(4.6×50mm)柱，用以下梯度之一進行洗脫10→70％B/A，8min，2.5ml/min.(方法A)；5-80％B/A，8min，2.5ml/min.(方法B)；5→70％B/A，8min.，2.5ml/min.(方法C)；25→75％B/A，8min，2.5ml/min.(方法D)；20→75％B/A，8min，2.5ml/min.(方法E)；15→70％B/A，8min，2.5ml/min.(方法F)；10→90％B/A，8min，2.5ml/min.(方法G)；20-65％B/A，8min，2.5ml/min.(方法H)；5→90％B/A，8min.，2.0ml/min.(方法I)；5→90％B/A，8min.，2.5ml/min.(方法J)；20→80％B/A，8min.，2.5ml/min.(方法K)；10→100％B/A，8min.，2.5ml/min.(方法L)；10→75％B/A，8min.，2.5ml/min.(方法M)。流動相A0.1％TFA/水；流動相B0.1％TFA/乙腈。純度通常＞90％。
通過質譜進行表征
以流動注入或LC/MS模式，通過電噴霧質譜(ES-MS)表征每種肽。在所有分析中以正和負電噴霧模式使用Finnigan SSQ7000單四極質譜分析儀(ThermoFinnigan，San Jose，CA)。在300-2200amu的質量范圍內獲得所有掃描數據，掃描時間為1.0秒。在單位分辨率操作四極管。對流動注入分析，將質譜儀與Waters 616HPLC泵(WatersCorp.，Milford，MA)連接，并裝有HTS PAL自動進樣器(CTC Analytics，Zwingen，Switzerland)。將樣品注入含有50∶50的水∶乙腈并含有0.1％氫氧化銨的流動相內。用于分析的流速為0.42ml/分鐘，注入體積為6μl。使用ThermoSeparations Constametric 3500液相色譜儀(ThermoSeparation Products，San Jose，CA)和HTS PAL自動進樣器進行LC/MS分析。使用Luna C18，5微米柱，2×30mm(Phenomenex，Torrance，CA)進行色譜分離。用于分析的流速為1.0ml/分鐘，分配柱流出物，使流入電噴霧界面的速度為400μl/min。在4分鐘內運行0％→100％B/A的線性梯度，在流動相A為98∶2的水∶乙腈，含10mM乙酸銨，而流動相B為10∶90的水∶乙腈，含10mM乙酸銨。在220nm處監測紫外反應。將樣品溶于200μl 50∶50的H2O∶MeCN(0.05％TFA)中。注入體積為5μl。

在所有情況下，實驗測得的分子量是在計算的單一同位素分子量的0.5道爾頓之內。
實施例2 A.N-酰化11聚體肽類似物的通用合成方法(流程2)
從按照本文所述而制備的受保護的11聚體肽酰基-樹脂中間體(1)(0.015mmol)開始，合成N-酰化11聚體肽類似物(見流程2)。使用本文所述方法除去Fmoc基團，再用本文所述通用方法中的偶聯方案，使所得樹脂中間體2與相關Fmoc-保護的氨基酸或羧酸偶聯。在可利用適當酸酐的情況下，用5當量酸酐/NMP進行N-酰化反應。將所得N-酰化11聚體類似物(3)裂解/脫保護，并通過本文所述的通用方法用制備型HPLC進行純化。
流程2 殘基#1取代/衍生的11聚體肽類似物的合成
B.11聚體肽類似物的N-氨基甲酸酯衍生物的通用合成方法
從按照本文所述而制備的受保護的11聚體肽酰基-樹脂中間體(1)(0.015mmol)開始，合成11聚體肽類似物的N-氨基甲酸酯衍生物。使用本文所述方法除去Fmoc基團，使所得樹脂中間體2在合適的堿(例如叔胺)存在下與相關氯甲酸烷基酯/氯甲酸芳基酯發生反應，或與活化碳酸酯(例如對硝基苯基琥珀酰亞胺基碳酸酯或苯基琥珀酰亞胺基碳酸酯或羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯)發生反應。
C.11聚體肽類似物的N-脲衍生物的通用合成方法
從按照本文所述而制備的受保護的11聚體肽酰基-樹脂中間體(1)(0.025mmol)開始，合成11聚體肽類似物的N-脲衍生物。使用本文所述方法除去Fmoc基團，使所得樹脂中間體2與按照例如K.Burgess等，J.Am.Chem.Soc.1997，119，1556-1564所述方法而制備的相關異氰酸酯發生反應；或者該樹脂中間體2與相關氨甲酰氯發生反應。同樣，可從受保護的10聚體肽酰基-樹脂中間體開始，除去Fmoc，并使所得肽酰基-樹脂中間體與相關異氰酸酯或氨甲酰氯發生反應，制備10聚體肽類似物的N-脲衍生物。
D.11聚體肽類似物的N-磺酰胺的通用合成方法
可從按照本文所述而制備的受保護的11聚體肽酰基-樹脂中間體(1)(0.025mmol)開始，合成11聚體肽類似物的N-磺酰胺衍生物。使用本文所述方法除去Fmoc基團，使所得樹脂中間體2與相關磺酰氯發生反應。同樣，可從受保護的10聚體肽酰基-樹脂中間體開始，除去Fmoc，使所得肽酰基-樹脂中間體與相關磺酰氯反應，制備10聚體肽類似物的N-磺酰胺。
E.11聚體肽類似物的N-磺酰脲衍生物的通用合成方法
可從按照本文所述而制備的受保護的11聚體肽酰基-樹脂中間體(1)(0.025mmol)開始，合成11聚體肽類似物的N-磺酰脲衍生物。使用本文所述方法除去Fmoc基團，使所得樹脂中間體2與相關氨磺酰氯R4R5N-SO2-Cl反應，得到磺酰脲中間體(參見例如P.Davem等，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.2，1994(2)，381-387)。同樣，可從受保護的10聚體肽酰基-樹脂中間體開始，除去Fmoc，使所得肽酰基-樹脂中間體與相關氨磺酰氯R4R5N-SO2-Cl反應，制備10聚體肽類似物的N-磺酰脲衍生物。
實施例3 用Applied Biosystems 433A型肽合成儀進行11聚體肽類似物的固相合成
依據典型的11聚體肽類似物的通用固相合成描述，使用升級版Applied Biosystems 433A型肽合成儀。合成儀升級版硬件和軟件能夠利用偶聯的反饋控制，對Fmoc脫保護步驟進行電導監測。該方案允許合成規模的范圍為0.05-1.0mmol。

對于11聚體類似物的同時合成，上文已描述兩個非天然C-端氨基酸的摻入。該ABI合成中使用了這類Fmoc-保護的二肽酰基-樹脂。將Fmoc-保護的二肽酰基-樹脂(0.1mmol)放入儀器上適當尺寸的容器中，用NMP洗滌6次，用22％哌啶/NMP處理兩次(分別為2分鐘和8分鐘)脫保護。進行一步或兩步額外的受監測的脫保護步驟，直到滿足監測條件為止(在最后兩個基于電導的脫保護峰值間的差異＜10％)。總脫保護時間為10-12分鐘。脫保護的二肽酰基-樹脂用NMP洗滌6次，再與下一個氨基酸偶聯。該方法通過用于下一步驟的實施例予以說明。

因此，接下來使用以下方法偶聯Fmoc-Asp(OtBu)-OH將Fmoc-Asp(OtBu)-OH(1mmol，10當量)溶于2ml NMP中，隨后添加0.45M HBTU/HOBt的DMF(2.2ml)和2M DIEA/NMP(1ml)進行活化。再將活化的Fmoc-保護的氨基酸溶液移至反應容器中，偶聯30-60分鐘，這取決于脫保護步驟的反饋。然后樹脂用NMP洗滌6次，再按上述方法進行8次額外的脫保護/偶聯循環，以便完成所需序列的組裝。依次使用的Fmoc-氨基酸是Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-α-甲基-Phe(2-氟)-OH或其類似物、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Fmoc-His(Trt)-OH。最后，按上述方法用22％哌啶/NMP除去Fmoc基團，肽酰基-樹脂再用NMP和DCM洗滌6次并真空干燥。

或者，采用改進的偶聯方案，其中通過隨后添加0.5MHOAt的DMF(0.52ml)和DIC(40μL)活化Fmoc-保護的氨基酸(0.26mmol)，手工移至反應容器中，偶聯14-18小時。
裂解/脫保護
將所需肽用TFA/水/三異丙基硅烷(96∶2∶2)溶液(3.0ml)處理2小時，而從其各自的肽酰基-樹脂裂解/脫保護。濾出樹脂，用TFA(1.0ml)洗滌，合并的TFA濾液加入到35ml Et2O中。所得沉淀通過離心收集，最后干燥，得到232mg粗制肽產物，為白色固體。如本文所述方法，通過制備型HPLC進行純化。在40分鐘內，所用梯度為15％→45％0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水。合并含純產物的流分并凍干，得到28.4mg(回收率18％)的純產物。
實施例4 在位置Xaa10和位置Xaa11由式II-IV和IIa-IVa所表示的聯苯基丙氨酸類似物的合成
對于位置Xaa10和位置Xaa11殘基為由式II-IV和IIa-IVa所表示的取代氨基酸類似物的類似物(即聯苯基丙氨酸類似物(Bip類似物)或雜-聯苯基丙氨酸類似物)而言，按照下述兩種方法之一將其摻入肽鏈內。
方法A固相Suzuki縮合
在方法A中，進行固相Suzuki縮合，以適合進行后續固相肽合成的方式，制備所需的修飾聯苯基丙氨酸或雜-聯苯基丙氨酸殘基，獲得目標肽。當目標肽中位置Xaa11的氨基酸由修飾聯苯基丙氨酸或雜-聯苯基丙氨酸殘基表示時，按照流程3所示來制備。在除去Bocα-胺保護基之后，按照以上部分所述方法，使用多重肽合成繼續進行鏈的延伸，獲得所需11聚體肽或其衍生物。當在目標肽的位置Xaa10中是修飾的聯苯基丙氨酸或雜-聯苯基丙氨酸類似物時，使用在固相支持物上的適合二肽來制備所需氨基酸，如流程4所示。

然后使用所得二肽酰基區段(含有所需的修飾聯苯基丙氨酸或雜-聯苯基丙氨酸衍生物)，進行目標11聚體肽或其衍生物的合成。當位置Xaa10和位置Xaa11都需要新的聯苯基丙氨酸或雜-聯苯基丙氨酸殘基時，如以下流程6所示，進行兩個連續的固相Suzuki反應。在位置-Xaa11含有由式II-IV和IIa-IVa所表示的氨基酸的SynPhaseTM燈形載體(lantern)的通用制備方法(Suzuki偶聯) 流程3
通用方法A
SynPhaseTM燈形載體(A-系列(0.075mmol/燈形載體(lantern)))或D-系列((0.035mmol/燈形載體)，得自Mimotopes)利用直接通過Knorr鍵(Boc-氨基酸-樹脂)或通過氨基酸-Knorr鍵(Boc-二肽-樹脂)連接的N-α-Boc-4-碘苯丙氨酸殘基衍生化后，置入帶螺帽的13×100mm玻璃培養管內。(以下方法用于D-系列的燈形載體。類似反應劑比例也用于涉及A-系列燈形載體的反應)。將芳基-硼酸或雜芳基-硼酸(0.140mmol，4當量)溶于0.30ml N，N-二甲基乙酰胺。

將磷酸鉀(0.280mmol，8當量，0.14ml的2M水溶液)加入到芳基-硼酸或雜芳基-硼酸溶液中，再加入0.10ml含有4.0mg四(三苯基膦)合鈀(0)催化劑(約10mol％，0.0035mmol)的N，N-二甲基乙酰胺溶液。所得混合物用氮氣流覆蓋，將反應容器蓋緊，在80℃維持17-20小時，同時放在定軌振蕩器上。燈形載體用3×1ml N，N-二甲基乙酰胺和3×1ml二氯甲烷(最少3分鐘/洗滌循環)洗滌，然后裂解Boc基團(參見以下通用方法)。
通用方法B
按照通用方法A進行反應，只是使用不同的催化劑。對于本方法，所用催化劑是二氯化雙(三苯基膦)合鈀(II)。對于D-系列燈形載體規模化反應，使用約10mol％(0.0035mol)催化劑。
Boc基團的裂解方法 方法A
(下列方法適用于D-系列的燈形載體，0.035mmol/燈形載體。同樣，A-系列燈形載體使用適當調整過的方法，0.075mmol/燈形載體)。按照通用方法A或B制備的Boc-保護的燈形載體，用0.5ml由三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、2，6-二甲基吡啶和二氯甲烷組成的試劑溶液(1∶1∶3，體積比)處理。在2次這樣的試劑處理1小時并分別進行溫和攪拌之后，樹脂用4×1.0ml二氯甲烷、3×1.0ml N，N-二甲基甲酰胺和3×1.0ml二氯甲烷洗滌。然后對燈形載體進行肽合成順序中的下一個酰化反應(偶聯反應)。
方法B
按照通用方法A或B制備的Boc-保護的燈形載體，用0.5ml 1N HCl的無水1，4-二噁烷在室溫下處理1小時，同時進行溫和攪拌。燈形載體用2×1.0ml 1，4-二噁烷、2×1.0ml 10％N，N-二異丙基乙胺的N，N-二甲基乙酰胺(體積比)、3×1.0ml N，N-二甲基乙酰胺和3×1.0ml二氯甲烷洗滌，得到游離氨基-燈形載體，為下一個酰化反應(偶聯反應)步驟作準備。
實施例6 在位置Xaa10含修飾的聯苯基丙氨酸殘基的燈形載體的通用制備方法
上述Suzuki偶聯的通用方法(A或B)用于獲得在位置-Xaa10含有修飾Phe的所需二肽酰基燈形載體，從氨基酸(在位置Xaa11)與SynPhaseTM燈形載體結合開始，如流程4所示。
流程4
實施例7 在位置Xaa10和Xaa11含有由式II-IV和IIA-IVa所表示的氨基酸的燈形載體的通用制備方法
利用位置Xaa11的修飾類似物的上述方法(流程1)，連續兩次進行Suzuki偶聯程序，得到在位置Xaa10和Xaa11含有修飾苯丙氨酸殘基的二肽酰基燈形載體，如下流程6所示。
實施例8 在SynphaseTM燈形載體上酰化/延伸肽的通用方法 Fmoc-脫保護方法
將D-系列SynPhaseTM燈形載體(0.035mmol/燈形載體裝載)加入到0.5ml的8∶2N，N-二甲基甲酰胺/哌啶(體積比)中。溫和攪拌。1小時后，燈形載體用3×1.0ml N，N-二甲基甲酰胺和3×1.0ml二氯甲烷洗滌，讓燈形載體浸泡至少3分鐘/洗滌。
酰化/氨基酸偶聯的方法(流程5)
將側鏈和α-胺保護的氨基酸(0.105mmol)溶于0.5ml 1∶1的N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷中。向該溶液加入N-羥基苯并三唑(0.105mmol)、N，N-二異丙基乙胺(0.315mmol)和N，N′-二異丙基碳二亞胺(0.105mmol)。讓該氨基酸溶液靜置10分鐘，然后將含有α-胺脫保護的肽的D-系列燈形載體(0.035mmol/燈形載體)加入到該溶液中。將小瓶蓋好并溫和攪拌16-20小時。然后燈形載體用3×1.0ml N，N-二甲基甲酰胺和3×1.0ml二氯甲烷洗滌，讓燈形載體浸泡3-5分鐘/洗滌循環。
流程5
流程6
實施例9 通過片段縮合制備肽的通用方法
在方法A中，進行固相Suzuki縮合，制備所需氨基酸，其在位置Xaa10和Xaa11由式II-IV和IIa-IVa表示，如實施例7所述。在從位置Xaa10氨基酸中除去Boc α-胺保護基之后，從載體上切下二肽。再將二肽偶聯至側鏈-完全保護的9氨基酸肽(參見上文)。側鏈經后續脫保護和純化，得到所需11聚體肽產物。在上述方法的改動中，可在固相載體上將摻入位置Xaa10和Xaa11氨基酸的二肽偶聯至側鏈-完全保護的9氨基酸肽上，如流程10B所述。
方法A溶液相片段縮合
在方法A中，進行固相Suzuki縮合和酰化(如實施例7所述)，利用Boc-保護或Fmoc-保護的N-端α-胺，制備與SynPhaseTM燈形載體結合的所需二肽。在酸性條件下，從燈形載體(Lantern support)上切下二肽。在Boc-保護的N-端α-胺的情況下，酸性裂解同時使α-胺脫保護，如流程7所示，這些經純化或直接成為片段偶聯序列。

在酸性條件下裂解含有Fmoc-保護的N-端α-胺的二肽，并在溶液中使該N-端α-胺脫保護，如流程8所示。這些二肽經純化后，成為片段偶聯序列。
從SynphaseTM Lantern載體中裂解二肽的方法 方法A(Boc-保護的二肽；參見流程7)
將D-系列SynPhaseTM Lantern載體放在1英錢玻璃小瓶中。將1∶1的三氟乙酸/二氯甲烷溶液(0.5ml)加入到小瓶中。將小瓶蓋好，并在定軌振蕩器上溫和攪拌(100rpm)2小時。將裂解液移至新的小瓶中，再將0.5ml 1∶1的三氟乙酸/二氯甲烷加入燈形載體中。再次蓋好小瓶，在定軌振蕩器上溫和攪拌(100rpm)2小時。將第二個裂解溶液加入到第一個裂解液中，Lantern載體用二氯甲烷漂洗。將漂洗液加至裂解液中，蒸發掉溶劑，得到二肽，為α-胺的三氟乙酸鹽。
流程7
方法B(Fmoc-保護的二肽；參見流程8)
按照上述在方法A中的，從SynPhaseTM Lantern載體上裂解Fmoc-保護的二肽。Lantern載體用二氯甲烷漂洗，從合并的漂洗液/裂解液中蒸發掉溶劑。向所得殘余物(在1英錢小瓶中)加入0.40ml 8∶2的二甲基甲酰胺/哌啶(體積比)。將小瓶蓋好，反應45分鐘。蒸發掉殘余溶劑，所得產物通過HPLC純化，使用C-18柱和CH3CN/H2O/TFA溶劑系統，得到(在蒸發掉溶劑后)二肽，為α-胺的三氟乙酸鹽。
流程8
側鏈受保護的九聚體肽C端羧酸的固相合成方法(流程9A)
將Fmoc-(L)-Ser(tBu)-OH(5當量)、0.5M HOAt/DMF(5當量)和DIC(5當量)的NMP(5ml)溶液與(L)-Asp(OtBu)-2-氯-氯三苯甲基樹脂(3.0g，2.16mmol)在室溫下渦旋攪拌18小時。用NMP洗滌數次之后，通過用1.5M哌啶/DMF處理兩次(5分鐘和10分鐘)，除去Fmoc基團。將這些偶聯和脫保護步驟重復七次，組裝所需序列，只是將1.1當量和1.5當量的Fmoc-α-Me-Phe(2-R-6-R″)-OH和Boc-(L)-His(Trt)-OH分別用于偶聯，并且使用HATU/HOAt和DIEA(4當量)將Fmoc-Thr(tBu)-OH偶聯到(S)-α-Me-Phe(2-R-6-R″)-肽酰基-樹脂上。

當組裝完成時，肽酰基-樹脂用DCM洗滌，然后在室溫下用DCM/AcOH/TFE(8∶1∶1，體積比)處理1小時，從樹脂上釋放出受保護的九聚體肽C-端羧酸。濾掉樹脂，將濾液蒸發至干，重新溶于AcCN/水(2∶1)中并凍干兩次，得到2.777g(純度81％)的產物，其可用于后續片段偶聯步驟，無需進一步純化。
流程9A
側鏈受保護的N-甲氧羰基九聚體肽C-端羧酸的固相合成方法(流程9B)
如上所述(流程9A)制備N-Fmoc側鏈受保護的八聚體肽酰基-(鄰Cl)-三苯甲基樹脂(3.5mmol)。除去Fmoc并用DMF洗滌后，肽酰基-樹脂(3.5mmol)用N-α-甲氧羰基-N-α-三苯甲基-L-組氨酸(2.4g，5.33mmol)的0.546M HOAt/DMF(9.8ml，5.33mmol)處理，再加入DMF(10ml)和DIC(0.633ml，5.33mmol)。攪拌72小時后，N-衍生化九聚體肽酰基-樹脂用DMF(4×50ml)和DCM(2×50ml)洗滌，通過在室溫下用DCM/AcOH/TFE(8∶1∶1，體積比)處理3小時，從樹脂上釋放出受保護的九聚體肽C-端羧酸。濾掉樹脂，將濾液蒸發至干，重新溶于AcCN/水(1∶1.4)中并凍干兩次，得到4.05g(純度71％)的產物，其可用于后續片段偶聯步驟中，無需進一步純化。
流程9B
溶液相片段偶聯反應的方法
在1英錢小瓶中以單一化合物形式、并在2ml 96孔板中以平行陣列化合物的形式，進行這些反應。以下描述(見流程10)適用于單一化合物的情況，但與在96孔板中進行的反應是完全類似的。

在1.5ml玻璃小瓶中，將二肽的TFA鹽(0.01mmol)溶于含有0.5％N，N-二異丙基乙胺的0.25ml THF中。將大孔碳酸酯樹脂(MP-碳酸酯，0.03mmol，Argonaut Technologies)加入到小瓶中。將小瓶蓋好并在室溫下攪拌2小時。過濾溶液，蒸發除去過量溶劑。

將含有側鏈受保護的九聚體肽C-端羧酸(0.008mmol)和N-羥基苯并三唑(HOBt，0.008mmol)的0.15ml 9∶1氯仿/N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到裝有二肽胺的小瓶中。將二異丙基碳二亞胺(DIC，0.08mmol)加入到0.05ml 9∶1的氯仿/N，N-二甲基甲酰胺溶液中。將小瓶蓋好，反應物在室溫下在定軌振蕩器上攪拌16小時。從小瓶中蒸發剩下的溶劑。

用0.40ml 97.5∶2.5的三氟乙酸/三異丙基硅烷(TFA/TIS)將11聚體肽側鏈和N-端α-胺脫保護1小時。蒸發掉剩下的溶劑，再通過HPLC純化11聚體肽產物，用CH3CN/H2O/TFA溶劑系統，通過檢測所需產物質量，開始收集流出物。
流程10A
流程10B
方法B在溶液中使用Suzuki偶聯，合成由式II-IV和IIa-IVa所表示的Fmoc-氨基酸類似物
以下實施例說明幾個由式II-IV和IIa-IVa所表示的Fmoc-氨基酸類似物的合成方法，然后將它們用于如本文所述的11聚體和其它肽類似物的固相合成。
實施例10 Fmoc-(S)-2’-乙基-4’-甲氧基-聯苯基丙氨酸 [Fmoc-(S)-Bip(2’-Et-4’-OMe)]的合成
流程11描述了Fmoc-(S)-2’-乙基-4’-甲氧基-聯苯基丙氨酸的合成。
流程11
Boc-L-酪氨酸-O-三氟甲磺酸鹽
在30分鐘內，向保持在-40℃、氮氣氛下的25g(85mmol)Boc-L-酪氨酸甲酯和36.25g(339mmol，4當量)2，6-二甲基吡啶的200ml無水DCM溶液中，緩慢加入47.74mg(169.5mmol，2當量)三氟甲磺酸酐的DCM(100ml)。再將溶液于-40℃攪拌2小時。HPLC分析表明反應已完成。再加入20ml水，猝滅反應物。分離各層，有機層用3×200ml 1N HCl、200ml飽和Na2CO3、200ml水和200ml鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂干燥，過濾并真空干燥，得到紅色油狀粗產物，將其進行硅膠快速色譜(300g硅膠，0→50％EtOAc/己烷梯度)。含有產物的流分進行真空濃縮，得到所需化合物(27g，收率75％，白色固體)。
2-乙基-4-甲氧基-苯基硼酸 方法A
向甲基三苯基溴化鏻(199.5g，0.465mol)的無水THF(800ml)懸浮液吹掃10分鐘，然后冷卻至10℃。在30分鐘內緩慢加入正丁基鋰(169ml，0.465mol，2.75M溶液)并攪拌1小時。在30分鐘內，緩慢加入2-溴-5-甲氧基苯甲醛(100g，0.465mol)的無水THF(300ml)。加入后，將反應混合物攪拌1小時。加入石油醚(2L)，將反應混合物再攪拌30分鐘。反應混合物在硅膠墊上過濾。硅膠墊用乙醚洗滌。合并的有機洗滌液在30℃以下濃縮，通過60-120硅膠色譜純化粗產物，使用100％石油醚作為洗脫液。產量92g，90％，為淡黃色液體。

將2，2’-聯吡啶(24.3g，0.15mol)和2-溴-5-甲氧基苯乙烯(65g，0.31mol)的乙酸乙酯(650ml)冷卻至0℃。吹掃該溶液，在氮氣流下加入10％披鈀碳(16.25g，25％)。在帕爾振蕩器(Parr shaker)中，在氫氣氛下，在2kg壓力下攪拌反應混合物3天。通過HPLC監測反應進程。反應混合物通過硅藻土過濾，濾液用5％硫酸氫鉀溶液洗滌，經硫酸鈉干燥，在30℃以下濃縮，產量60g，91％，為淡黃色液體。

將4-溴-3-乙基茴香醚(94g，0.437mol)的THF(900ml)溶液冷卻至-78℃。在同一溫度下，滴加正丁基鋰(249ml，0.55mol)。在-78℃繼續攪拌1小時。在-78℃下緩慢加入硼酸三正丁酯(177ml，0.655mol)。移開冰浴，讓反應混合物升溫至0℃，在0℃下用1.5N鹽酸鹽猝滅。分離有機層。水層用乙酸乙酯萃取，合并的有機層用鹽水洗滌并濃縮。所得殘余物在石油醚中攪拌30分鐘。所得固體經過濾并真空干燥。產量65g，82％，為白色固體。
方法B(參見流程12)
向3-乙基苯酚(50g，0.4mol，純度98％，Fluka)和K2CO3(283g，2.05mol)的無水丙酮(500ml)混合物中加入甲基碘(290g，2.05mol)。將反應混合物轉移至高壓滅菌器中，在70℃回流過夜。反應混合物通過硅藻土墊過濾。該墊用丙酮洗滌，濃縮合并的濾液和洗滌液。將產物溶于DCM，過濾并蒸發至干。產量50g，90％，為棕色液體。

在室溫下，在避光處將3-乙基茴香醚(50g，0.3676mol)和N-溴代琥珀酰亞胺(72g，0.4mol)的乙腈(1L)攪拌8小時。反應混合物在40℃以下濃縮，所得殘余物重新溶于CCl4并過濾。濃縮濾液，產物通過分級分離純化。產量35g，43％，為淡黃色液體。

按照方法A所述，將4-溴-3-乙基茴香醚轉化成相應硼酸。

為了放大反應規模，可使用格氏(Grignard)方法完成4-溴-3-乙基茴香醚向2-乙基-4-甲氧基硼酸的轉化。該方法包括生成格氏試劑，即按照方法A將4-溴-3-乙基茴香醚與Mg(1.1當量)的THF反應，再將所得格氏中間體與硼酸三正丁酯或硼酸三甲酯反應，生成格氏試劑。
流程12
Fmoc-(S)-2’-乙基-4’-甲氧基-聯苯基丙氨酸
Boc-L-酪氨酸-O-三氟甲磺酸酯(81g，0.19mol)的無水甲苯(600ml)用氮氣吹掃10分鐘。加入K2CO3(36g，0.26mol)的200ml水，再加入2-乙基-4-甲氧基-苯基硼酸(36g，0.2mol)，反應混合物用氮氣吹掃10分鐘。加入Pd(PPh3)4(16.18g，0.014mol)、乙醇(200ml)和THF(400ml)，將反應混合物加熱至100℃，攪拌4小時。反應混合物經真空濃縮，殘余物溶于DCM(1.0L)中。有機層用10％氫氧化鈉溶液、15％檸檬酸溶液洗滌，經硫酸鈉干燥并濃縮。粗產物通過60-120目硅膠柱色譜(用10％乙酸乙酯/石油醚)純化。產量50g，65％，為黃色液體。

向Boc-(S)-2’-乙基-4’-甲氧基-聯苯基丙氨酸甲酯(60g，0.146mol)的THF(450ml)和甲醇(85ml)混合物中加入氫氧化鈉(24g，0.58mol)的85ml水。反應混合物在室溫下攪拌過夜，濃縮，殘余物溶于水(100ml)，用乙醚洗滌。水層用20％檸檬酸酸化至pH 1，用乙酸乙酯萃取。萃取液用鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥并蒸發至干。產量55g，94％，為無色液體。

將Boc-(S)-2′-乙基-4′-甲氧基-聯苯基丙氨酸(55g，0.138mol)溶于無水DCM(1L)中，在室溫下用無水HCl氣體吹掃6小時。所得固體產物經過濾并真空干燥。產量46g，100％。

向游離氨基酸鹽酸鹽(30g，0.089mol)的THF(700ml)中加入NaHCO3(29g，0.358mol)的水(240ml)。在30分鐘內，分批加入Fmoc-OSu(30g，0.089mol)。反應混合物在室溫下攪拌過夜。真空除去THF并加入水(2.0L)。澄清溶液用乙醚萃取，除去任何雜質。水溶液酸化至pH 1并用乙酸乙酯萃取。有機層用水和鹽水洗滌并蒸發至干。產量37g，80％。
實施例11 Fmoc-(S)-2’-乙基-4’-羥基-聯苯基丙氨酸 [Fmoc-(S)-Bip(2’-Et-4’-OH)]的合成
以下流程13描述Fmoc-(S)-2’-乙基-4’-羥基-聯苯基丙氨酸[Fmoc-(S)-Bip(2′-Et-4′-OH)]的合成 流程13

在-12℃、氬氣氛下，在20分鐘內，將21.4ml 1M三溴化硼的二氯甲烷(21.2mmol)溶液加入到4.46g(8.55mmol)(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(2′-乙基-4′-甲氧基聯苯-4-基)丙酸[Fmoc-Bip(2’-Et-4’-OMe)-OH]的二氯甲烷(34ml)的攪拌溶液中。攪拌反應混合物，讓其升至室溫，原位形成灰色漿液。3小時后，在室溫下，將反應混合物緩慢加入到300ml快速攪拌的水中。1小時后，反應混合物用二氯甲烷(每份100ml)萃取兩次。有機萃取液合并在一起，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發，得到4.65g黃褐色泡沫狀物。所需產物通過反相HPLC純化(Luna 5μC1830×100mm柱，50％→100％梯度(10分鐘)(900∶100∶1→100∶900∶1的水/乙腈/TFA)作為洗脫液；流速40ml/分鐘，在220nm處進行UV檢測)。合并流分進行部分蒸發，得到膠狀物，將其中的剩余溶液輕輕倒出，用水洗滌，重新溶于二氯甲烷中，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發，得到白色非晶形固體產物，3.50g，收率81％。HPLC/MS保留時間＝5.52分鐘[Zorbax SB C18(4.6×75mm)柱；0％→100％梯度(8分鐘)(90∶10∶0.1→10∶90∶0.1的水/AcCN/TFA作為洗脫液)。流速2.5ml/分鐘，在220nm處進行UV檢測]；[M+H]+＝508。1H NMR(DMSO-d6)δ12.77(br s，1H)，9.29(s，1H)，7.86(d，J＝7.7Hz，1H)，7.78(d，J＝8.8Hz，1H)，7.65(t，J＝7.1Hz，2H)，7.38(m，2H)，7.28(m，4H)，7.11(d，J＝7.7Hz，2H)，6.85(d，J＝8.2Hz，1H)，6.65(d，J＝2.2Hz，1H)，6.57(dd，J＝2.2，8.3Hz，1H)，4.20(m，5H)，3.32(br s，1H)，3.10(dd，J＝4.4，13.8Hz，1H)，2.90(dd，J＝10.5，13.2Hz，1H)，2.37(q，J＝7.7Hz，2H)，0.91(t，J＝7.7Hz，3H)。

2.28g上述產物通過手性HPLC進一步純化(

AD，10μm，50×500mm柱，等度洗脫(正庚烷/乙腈/甲醇/TFA，839∶80∶80∶1)；流速60ml/分鐘，在217nm處進行UV檢測)。蒸發合并流分，再用氯仿重蒸發(3×20ml)，得到灰白色非晶形固體，2.17g，收率95％。反相HPLC保留時間＝21.42分鐘[YMC ODS-A C183微米(4.6×150mm)柱；10％→100％B梯度(30分鐘)(緩沖液A0.1％三氟乙酸/水，緩沖液B0.1％三氟乙酸/乙腈)。流速1ml/分鐘，在217nm處進行UV檢測]。MS分析[M+NH3]+525.3和[M-H]-＝506.2。手性HPLC分析＞99％對映體過量，保留時間＝12.17分鐘[

AD，10μm，4.6×250mm柱；等度洗脫(正庚烷/乙腈/甲醇/TFA，799∶100∶100∶1)；流速1ml/分鐘，在217nm處進行UV檢測]。[α]25D＝-12.6(c＝1.0在DMF中)。
實施例12 (2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽[Fmoc-(S)-4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸鹽酸鹽]的合成
以下流程14描述(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽的合成 流程14
5-溴-2-鄰甲苯基吡啶
向經氬氣吹掃并抽空的910mg(3.21mmol)5-溴-2-碘吡啶和436mg(3.21mmol，1.0當量)2-鄰甲苯基硼酸的8ml甲苯和3.2ml 2M碳酸鈉水溶液的漿料中，加入36mg(0.032mmol，0.01當量)四(三苯基膦)合鈀。反應混合物經氬氣吹掃并抽空兩次以上，然后設定在氬氣下回流15小時。反應物經冷卻后，在水與EtOAc之間分配。分離各層，水層用EtOAc萃取一次以上。合并有機萃取液，經硫酸鎂干燥，過濾，濃縮并真空干燥，得到橙黃色油狀的粗產物。通過硅膠色譜純化(7∶3CH2Cl2/己烷)，得到黃色油狀的標題化合物，666mg，收率84％。
6-鄰甲苯基煙堿醛
在5分鐘內，在氬氣下，在-74℃，向125mg以上化合物(0.50mmol)的THF(2.0ml)的攪拌溶液中加入220μL nBuLi/己烷溶液(2.5M，0.55mmol，1.1當量)，不讓溫度升至-71℃以上。形成淡綠色溶液，30分鐘后變成深綠色。45分鐘后，加入49.4μL(0.61mmol，1.2當量)的DMF，讓反應物升溫至-40℃。14小時后，形成鮮橙色溶液。反應物用10％檸檬酸猝滅，混合物在室溫下快速攪拌20分鐘。所得嫩黃色溶液用EtOAc萃取兩次。合并有機萃取液，經MgSO4干燥，過濾并濃縮，得到黃色油狀物。由此獲得的粗制混合物通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶24)作為洗脫液，(2.5×10cm柱)，得到白色固體，熔點82-84℃，90.3mg，收率91％。
(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)甲醇
在0-5℃，向1.070g(5.43mmol)6-鄰甲苯基煙堿醛的19ml乙醇溶液中，加入287mg(7.5mmol，1.4當量)硼氫化鈉。2小時后，反應混合物用飽和碳酸氫鈉溶液猝滅，30分鐘后，在二氯甲烷和鹽水之間分配。有機萃取液經硫酸鎂干燥并濃縮，得到指定產物，為無色油狀物，1.08g，收率100％。
5-(溴甲基)-2-鄰甲苯基吡啶氫溴酸鹽
將4.49g(22.5mmol)(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)甲醇的75ml48％氫溴酸溶液加熱回流64小時。反應混合物部分冷卻，通過真空蒸餾(110℃@2托(Torr))除去過量氫溴酸，直到燒瓶中剩下棕褐色固體殘余物為止。使用放置在蒸餾器與真空泵之間的KOH大顆粒分水器進行蒸餾。固體殘余物用乙醚制成漿液，過濾并在氮氣流下干燥，得到7.38g產物，收率95％。
(2S)-2-(二苯基亞甲基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
在5分鐘內，在-78℃，在氬氣下，向800mg(2.33mmol)的5-(溴甲基)-2-鄰甲苯基吡啶氫溴酸鹽、689mg(2.33mmol，1.0當量)2-(二苯基亞甲基氨基)乙酸叔丁酯和141mg(0.233mmol，0.1當量)溴化O-烯丙基-N-(9-蒽基甲基)辛可尼錠(cinchonidinium)的14ml二氯甲烷的攪拌混合物中，加入1.687ml(5.83mmol，2.5當量)2-叔丁基亞氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-1，3-二氮雜-2-磷雜環己烷。反應混合物在-78℃攪拌10小時，再讓其原位升至室溫。混合物通過硅膠色譜直接純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶4)作為洗脫液(5×10cm柱)，得到黃褐色油狀物，1.10g，收率100％。
(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
在室溫、氬氣下，向1.10g(2.33mmol)(2S)-2-(二苯基亞甲基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的9ml THF攪拌溶液中，加入2.795g(14.54mmol，6.5當量)檸檬酸與9ml水的溶液。20小時后，反應混合物用水(5ml)稀釋，用乙醚(10ml)洗滌兩次。水相用固體碳酸鈉調節至pH 9，用二氯甲烷萃取兩次。

合并二氯甲烷萃取液，經硫酸鈉干燥并濃縮。所得油狀物溶于10ml THF，在室溫下用7.2ml 10％碳酸鈉溶液處理，再用703mg(2.56mmol，1.1當量)9-芴基甲氧基羰基氯處理。14小時后，反應混合物用二氯甲烷萃取兩次，經硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，然后通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶19)作為洗脫液(2.5×10cm柱)，得到無色油狀物，1.082g，收率91％。從20ml 7∶1己烷∶二氯甲烷中重結晶，得到287mg白色固體。濃縮母液，得到標題化合物的非晶形白色固體，779mg，收率63％。手性HPLC分析(4.6×250mm AD柱，38∶1∶1的庚烷∶甲醇∶乙醇作為洗脫液，流速1ml/分鐘)表明98％對映體過量。
(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽
將因填充氯化鈣的干燥管而隔絕空氣的1.75g(3.19mmol)(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-鄰甲苯基吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的TFA(5.0ml)溶液，在室溫下攪拌2小時。反應混合物在40℃以下真空濃縮，所得橙色油狀物溶于10ml乙醚，向其中加入5ml1M HCl/乙醚溶液。過濾所得白色固體，用乙醚洗滌，得到白色粉末狀的所需化合物，1.65g，收率100％。
實施例13 (2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(6-溴吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽的合成
以下流程15描述3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽的合成 流程15
2-溴-5-(溴甲基)吡啶
向10.320g(60.0mmol)5-甲基-2-溴吡啶和5.339g(30.0mmol，0.5當量)重結晶N-溴代琥珀酰亞胺的150ml四氯化碳攪拌漿液中，加入200mg AIBN。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后設定在氬氣下回流。90分鐘后，將反應混合物冷卻至室溫，過濾并濃縮濾液，得到黃色油狀物。質子NMR表明混合物含有53％(mol)未反應的5-甲基-2-溴吡啶、43％的標題化合物和4％2-溴-5-(二溴甲基)吡啶。該混合物可直接用于后續步驟，無需進一步純化。
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
在5分鐘內，在-78℃、氬氣下，向2-溴-5-(溴甲基)吡啶(標稱為26.4mmol)、7.798g(26.4mmol，1.0當量s)2-(二苯基亞甲基氨基)乙酸叔丁酯和1.60g(2.64mmol，0.1當量)溴化O-烯丙基-N-(9-蒽基甲基)辛可尼錠的100ml二氯甲烷攪拌混合物中，加入11.46ml(39.6mmol，1.5當量)2-叔丁基亞氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-1，3-二氮雜-2-磷雜環己烷。反應混合物在-78℃下攪拌7小時，然后讓其原位升至室溫。濃縮反應混合物，重新溶于75ml THF中，用檸檬酸(22g)與75ml水的溶液處理。劇烈攪拌7小時后，混合物用乙醚(75ml)萃取兩次。合并有機萃取液，用水(25ml)洗滌一次。合并含水萃取液，用固體碳酸鈉調節至pH 8。該水溶液可用于下步反應，無需進一步處理。
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
在室溫下，將上述水溶液加入到7.545g(27.5mmol，1.04當量)9-芴基甲氧羰基氯與75ml THF的溶液中。14小時后，反應混合物用乙酸乙酯萃取兩次，經硫酸鎂干燥，過濾，濃縮并通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶24)作為洗脫液(12×25cm柱)，得到無色油狀物，7.25g，收率91％。從120ml 5∶1己烷/二氯甲烷中重結晶，得到少量白色固體，將其濾掉。濃縮母液，得到標題化合物的非晶形白色固體，4.96g，收率62％。手性HPLC分析(4.6×250mm AD柱，庚烷∶甲醇∶乙醇(38∶1∶1)作為洗脫液，流速1ml/分鐘)表明97.2％對映體過量。
2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽
將因填充氯化鈣的干燥管而隔絕空氣的1.02g(1.95mmol)(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的TFA(3.0ml)溶液，在室溫下攪拌2小時。反應混合物在35℃以下真空濃縮，所得橙色油狀物溶于3ml二氯甲烷中，向其中加入6ml 1MHCl/乙醚溶液。所得白色固體經過濾后，用乙醚洗滌，得到白色粉末狀標題化合物，845mg，收率86％。
實施例14 (2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽[Fmoc-(S)-4-(2′-乙苯基)-吡啶基丙氨酸]的合成
以下流程16描述(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽的合成 流程16
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
向1.75g(3.35mmol)(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴-吡啶-3-基)丙酸叔丁酯和1.005g(6.70mmol，2當量)2-乙基苯基硼酸的50ml 1∶1異丙醇/甲苯攪拌漿液中，加入25.0ml 2M碳酸鈉水溶液。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后加入124mg(0.167mmol，0.05當量)二氯化雙(三環己基膦)合鈀(II)，混合物再次用氬氣吹掃并抽空。在氬氣下，將快速攪拌的混合物加熱至80℃。20小時后，將反應混合物冷卻至室溫，經部分濃縮除去異丙醇。使殘余物在乙酸乙酯和水之間分配，水相再用乙酸乙酯萃取一次。合并有機萃取液，經硫酸鎂干燥，過濾并濃縮，得到棕色油狀物。通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶9)作為洗脫液(5×15cm柱)，得到無色油狀所需化合物，1.25g，收率77％。
(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽
將因填充氯化鈣的干燥管而隔絕空氣的1.53g(2.79mmol)(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(6-(2-乙基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的TFA(5.0ml)溶液，在室溫下攪拌2小時。反應混合物在35℃以下真空濃縮，所得橙色油狀物溶于乙醚，向其中加入6ml 1MHCl/乙醚溶液。所得白色固體經過濾，用乙醚洗滌，得到白色粉末狀所需產物，1.38g，收率93％。
實施例15 (2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基-4-甲氧基)苯基)吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽[Fmoc-(S)-4-[2′-乙基-4′-甲氧基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸]的合成
以下流程17描述(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基-4-甲氧基)苯基)吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽的合成 流程17
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基-4-甲氧基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
向613mg(1.17mmol)(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴-吡啶-3-基)丙酸叔丁酯和422mg(2.34mmol，2當量)2-乙基苯基硼酸的20ml 1∶1異丙醇/甲苯攪拌漿液中，加入10.0ml 2M碳酸鈉水溶液。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后加入43.2mg(0.059mmol，0.05當量)二氯化雙(三環己基膦)合鈀(II)，混合物再次用氬氣吹掃并抽空。快速攪拌的混合物在氬氣下加熱至80℃。9小時后，將反應混合物冷卻至室溫，部分濃縮除去異丙醇。使殘余物在乙酸乙酯和水之間分配，水相再用乙酸乙酯萃取一次。合并有機萃取液，經硫酸鎂干燥，過濾并濃縮，得到棕色油狀物。通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(3∶17)作為洗脫液(5×15cm柱)，得到無色油狀預期化合物，401mg，收率59％。
(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基-4-甲氧基苯基)吡啶-3-基)丙酸鹽酸鹽
將因填充氯化鈣的干燥管而隔絕空氣的401mg(0.69mmol)(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基-4-甲氧基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的TFA(2.0ml)溶液，在室溫下攪拌2小時。反應混合物在30℃以下真空濃縮，將所得橙色油狀物溶于乙醚，向其中加入2ml 1M HCl/乙醚溶液。所得白色固體經過濾，用乙醚洗滌，得到白色粉末狀所需產物，336mg，收率84％。
實施例16 (S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-甲基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的替代合成
以下流程18描述(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-甲基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯的替代合成 流程18
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-甲基苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
向1.75g(3.35mmol)(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴-吡啶-3-基)丙酸叔丁酯和913mg(6.70mmol，2當量)2-甲基苯基硼酸的50ml 1∶1異丙醇/甲苯攪拌漿液中，加入25.0ml 2M碳酸鈉水溶液。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后加入124mg(0.167mmol，0.05當量)二氯化雙(三環己基膦)合鈀(II)，混合物再次用氬氣吹掃并抽空。

快速攪拌的混合物設定在氬氣下在80℃加熱。20小時后，將反應混合物冷卻至室溫，部分濃縮除去異丙醇。使殘余物在乙酸乙酯和水之間分配，水相再用乙酸乙酯萃取一次。合并有機萃取液，經硫酸鎂干燥，過濾并濃縮，得到棕色油狀物。通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶9)作為洗脫液(5×15cm柱)，得到無色油狀所需化合物，1.81g，收率90％。
實施例17 (2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)噠嗪-3-基)丙酸叔丁酯[Fmoc-(S)-4-(2′-乙苯基)-2，3-噠嗪基丙氨酸]的合成
以下流程19描述(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)噠嗪-3-基)丙酸叔丁酯的合成 流程19
3-溴-6-甲基噠嗪
將2.20g 3-甲基-6-吡嗪醇(20.0mmol)和13.06g磷酰溴(45.6mmol，2.3當量)混合物進行攪拌，并加熱至130℃(預熱油浴)50分鐘。固體反應混合物在冰浴中冷卻，并加入約20g碎冰。所得溶液在冰浴中冷卻，并加入50％KOH中和。收集所得固體，用水洗滌并風干15小時。通過硅膠色譜純化，使用乙醚/二氯甲烷(3∶17)作為洗脫液(5×15cm柱)，得到淡黃色固體的標題化合物，1.37g，收率39％。3-溴-6-(溴甲基)噠嗪
將95mg AIBN加入到1.00g(5.78mmol)3-溴-6-甲基噠嗪和1.03g(5.79mmol，1.0當量)重結晶N-溴代琥珀酰亞胺的20ml四氯化碳溶液中。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后設定在氬氣下回流。3小時后，將反應混合物冷卻至室溫，過濾并濃縮濾液，得到黃色油狀物。混合物通過硅膠柱色譜直接純化，使用己烷/二氯甲烷(1∶9)作為洗脫液(5×12cm柱)，得到無色油狀物，444mg，收率30％。
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴噠嗪-3-基)丙酸叔丁酯
在5分鐘內，在-78℃、氬氣下，向374mg(1.48mmol)3-溴-6-(溴甲基)噠嗪、439mg(1.48mmol，1.0當量)2-(二苯基亞甲基氨基)乙酸叔丁酯和112mg(0.186mmol，0.12當量)溴化O-烯丙基-N-(9-蒽基甲基)辛可尼錠的4ml二氯甲烷攪拌混合物中，加入0.645ml(2.23mmol，1.5當量)2-叔丁基亞氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-1，3-二氮雜-2-磷雜環己烷。反應混合物在-78℃下攪拌1小時，讓其在原位升溫至-40℃。16小時后，混合物通過硅膠柱色譜直接純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶9)作為洗脫液(5×10cm柱)，得到黃色油狀物，540mg，收率78％。

在室溫、氬氣下，向以上產物的10ml THF攪拌溶液中，加入10ml 15％檸檬酸水溶液。16小時后，反應混合物用水(5ml)稀釋，用乙醚(10ml)洗滌兩次。

水相再用固體碳酸鈉調節至pH 9，用二氯甲烷萃取兩次。將二氯甲烷萃取液合并，經硫酸鈉干燥并濃縮。將所得油狀物溶于5mlTHF，然后在室溫下用5ml 10％碳酸鈉溶液處理，再用480mg(1.86mmol，1.3當量)9-芴基甲氧基羰基氯處理。6小時后，反應混合物用二氯甲烷萃取兩次，經硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶5)作為洗脫液(5×15cm柱)，得到無色油狀物，507mg，收率65％。手性HPLC分析(4.6×250mm AD柱，庚烷∶甲醇∶乙醇(38∶1∶1)作為洗脫液，流速1ml/分鐘)表明40％對映體過量。
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-(2-乙基苯基)噠嗪-3-基)丙酸叔丁酯
向507mg(0.967mmol)(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-溴噠嗪-3-基)丙酸叔丁酯和290mg(1.93mmol，2當量)2-乙基苯基硼酸的16ml 1∶1異丙醇/甲苯攪拌漿液中，加入8.0ml 2M碳酸鈉水溶液。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后加入35.7mg(0.048mmol，0.05當量)二氯化雙(三環己基膦)合鈀(II)，混合物再次用氬氣吹掃并抽空。在氬氣下，將快速攪拌的混合物在90℃加熱。

8小時后，將反應混合物冷卻至室溫，并部分濃縮除去異丙醇。殘余物在乙酸乙酯和水之間分配，水相再用乙酸乙酯萃取一次。合并有機萃取液，濃縮，將殘余物重新溶于2ml THF。在該溶液中加入300mg(1.17mmol)氯甲酸9-芴基甲基酯和100μL三乙胺。21小時后，反應混合物用乙酸乙酯稀釋，用鹽水洗滌一次。有機相經硫酸鎂干燥，過濾并濃縮。通過硅膠色譜純化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶2)作為洗脫液(2.5×15cm柱)，得到無色油狀所需化合物，428mg，收率81％。
實施例18 (2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(5-鄰甲苯基吡啶-2-基)丙酸[Boc-(S)-4-(2’-甲基苯基)-2-吡啶基丙氨酸)]的合成
以下流程20描述(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(5-鄰甲苯基吡啶-2-基)丙酸的合成 流程20
(S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(5-溴吡啶-2-基)丙酸甲酯
將經過氬氣吹掃并抽空的210mg鋅銅偶(按照OrganicSynthesis Collective第5卷，第855頁制備)和580mg(1.76mmol)3-碘丙氨酸漿液溶于7ml苯，向其中加入0.5ml N，N-二甲基乙酰胺。漿液在密封燒瓶中超聲處理40分鐘，再加入500mg(1.76mmol，1.0當量)5-溴-2-碘吡啶和82mg(0.11mmol，0.06當量)二氯化雙(三苯基膦)合鈀。

反應混合物再次用氬氣吹掃兩次并抽空，然后在氬氣下在70℃加熱15小時。將反應物冷卻后，在水和EtOAc之間分配。分離各層，水層再用EtOAc萃取一次。合并有機萃取液，經硫酸鎂干燥，過濾，濃縮并真空干燥，得到黃色油狀粗產物。通過硅膠色譜法純化，用CH2Cl2/己烷(3∶1)作為洗脫液(2.5×15cm柱)，得到黃色油狀預期化合物，288mg，收率46％。
(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(5-鄰甲苯基吡啶-2-基)丙酸
向285mg(0.79mmol)(S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(5-溴吡啶-2-基)丙酸甲酯和162mg(1.19mmol，1.5當量)2-甲基苯基硼酸的7ml 1，2-二甲氧基乙烷的攪拌漿液中，加入168mg(1.59mmol，2.0當量)碳酸鈉和0.5ml水。反應混合物用氬氣吹掃兩次并抽空，然后加入29mg(0.040mmol，0.05當量)二氯化雙(三環己基膦)合鈀(II)，混合物再次用氬氣吹掃并抽空。在氬氣下，將該快速攪拌的混合物在80℃加熱。

14小時后，將反應混合物冷卻至室溫，加入4ml 1N氫氧化鈉溶液。將反應混合物加熱至70℃1小時。冷卻至室溫后，混合物用乙醚萃取一次。水相用10％硫酸氫鈉溶液酸化至pH 3，然后用DCM萃取兩次。合并DCM萃取液，經硫酸鎂干燥，過濾并濃縮，得到黃色半固體。通過制備型反相HPLC純化(YMC ODS S530×100mm柱，10％→90％乙腈/水梯度[10分鐘]，0.1％TFA)，得到(濃縮后)白色非晶形固體狀所需產物，46.5mg，收率17％。
實施例19
以下流程21描述(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-苯基)吡啶-3-基)丙酸類似物的通用合成方法 流程21
(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-[(3-氯-4-氟)苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯
向圓底燒瓶中加入300mg Fmoc-L-溴-3-吡啶基丙氨酸(0.573mmol)、200mg 3-氯-4-氟苯基硼酸(1.145mmol，2當量)、1.145ml 2M碳酸鈉溶液(2.29mmol，4當量)、5ml甲苯、5ml異丙醇和42mg PdCl2(PCy)3)2(0.0573mmol，0.1當量)。反應液用氬氣吹掃，然后使其達到80℃5小時。將反應冷卻至室溫，用50ml EtOAc稀釋。溶液用水(30ml)和鹽水(20ml)洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾并濃縮。粗制油狀物通過硅膠色譜(12g硅膠，0→40％EtOAc/己烷梯度)，得到245mg油狀所需化合物(收率75％)。
(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-[(3-氯-4-氟)苯基)吡啶-3-基)丙酸
向(2S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(6-[(3-氯-4-氟)苯基)吡啶-3-基)丙酸叔丁酯(240mg，0.429mmol)和3ml二氯甲烷溶液中，加入TFA(3ml)。反應物在室溫下攪拌5小時。溶劑蒸發至干，殘余物通過制備型HPLC(甲醇-水梯度，0.1％TFA)。濃縮含有產物的流分，得到200mg(收率93％)所需化合物，為TFA鹽。
實施例20 從位置10和11含有非天然非市售氨基酸的二肽酰基-樹脂開始的11聚體肽的通用合成方法
按照以下程序，在Advanced Chemtech ACT 90合成儀上，以分批方式制備在位置10和11處含有非天然非市售氨基酸的二肽酰基樹脂，然后在MPS-396肽合成儀上，利用自動化同時合成方案繼續延伸肽鏈。

將9-Fmoc-氨基呫噸-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber酰胺樹脂；裝載0.5mmol/g；Novabiochem)通過用DMF(2×10ml/g，1分鐘)洗滌而溶脹，其中Sieber酰胺樹脂的用量足以合成若干11聚體類似物。然后使用兩種處理，分別為5分鐘和15分鐘，用20％哌啶的DMF(10ml/g)，除去Fmoc基團。樹脂用DMF 2×10ml/g)和NMP(4×10ml/g)洗滌。向樹脂中加入Fmoc-(S)-4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸-OH(HCl鹽)(1.2當量)或其類似物、PyBOP(1.07當量)、HOBt(1.07當量)和DIEA(3.6當量)的NMP溶液。然后將樹脂搖動或渦旋攪拌18小時。使用定性茚三酮試驗監測偶聯的完成。將樹脂排干，用NMP(3×10ml/g)和DCM(3×10ml/g)洗滌，再用2.6％乙酸酐、2.4％DIEA/DCM(體積比)封閉任何未反應的胺達30分鐘。DMF洗滌(3×10ml/g)后，用10％乙酸酐、2％DIEA/DCM(體積比)重復封閉方案30分鐘。定量Fmoc判定方法表明有0.39mmol/g的取代。

如上所述，再進行第二個手工偶聯循環，從利用20％哌啶的DMF除去Fmoc基團開始，在幾次DMF洗滌后，向脫保護的樹脂中加入Fmoc-L-(2’-乙基-4’-甲氧基)聯苯基丙氨酸-OH(1.27當量)或其類似物和HOBt(1.29當量)與NMP(4ml)的溶液，渦旋攪拌5分鐘。再將DIC(1.27當量)加入到樹脂漿液中，將樹脂搖動或渦旋攪拌15小時。將樹脂排干，用NMP(3×10ml/g)和DCM(3×10ml/g)洗滌，再用5.0％乙酸酐、1.0％DIEA(10ml)的DCM封閉30分鐘。最后，樹脂再用DCM(3×10ml/g)洗滌。該合成流程得到所需的Fmoc-保護的二肽酰基-Sieber酰胺樹脂。

按上述方法除去Fmoc基團。將Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(3當量)和HOBt(3當量)的NMP(2ml)溶液渦旋攪拌5分鐘，再加入DIC(3當量)。將所得溶液加入到樹脂中。再將樹脂搖動或渦旋攪拌2小時。將樹脂排干，用NMP(3×10ml/g)和DCM(3×10ml/g)洗滌。使用定性茚三酮試驗監測偶聯的完成。

如上所述，該樹脂進行2次額外的脫保護/偶聯循環，以便在樹脂上組裝從Xaa7到Xaa11的所需序列。后續使用的Fmoc-氨基酸是Fmoc-L-Ser(tBu)-OH和Fmoc-L-Thr(tBu)-OH。用以下方案偶聯Fmoc-[(S)-2-氟-α-Me-Phe]-OH。將Fmoc-[(S)-2-氟-α-Me-Phe]-OH(1.5當量)、PyBOP(1.5當量)、HOBt(1.5當量)和DIEA(3.0當量)的NMP(2ml)溶液加入到樹脂中。將樹脂搖動或渦旋攪拌2小時。將樹脂排干，用NMP(3×10ml/g)和DCM(3×10ml/g)洗滌。

為了偶聯殘基Xaa5，按上述方法除去Fmoc基團。短時渦旋攪拌Fmoc-The(tBu)-OH(5當量)和2-Cl-HOBt(5當量)和DIC(5當量)的NMP(4ml)溶液，再加入到樹脂中。樹脂搖動或渦旋攪拌18小時。將樹脂排干，用NMP(3×10ml/g)和DCM(3×10ml/g)洗滌。樹脂用10.0％乙酸酐的DCM(10ml/g)封閉30分鐘。在DCM(3×10ml/g)洗滌后，按上述方法除去Fmoc基團，并按照Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH所述方法，將Fmoc-Gly-OH殘基Xaa4偶聯/脫保護。所得Xaa4-Xaa11肽酰基-樹脂用于合成以下不同的11聚體肽類似物。
SEQ ID NO118化合物的合成
將上述Xaa4-Xaa11肽酰基-樹脂樣品(0.067mmol)，與預先渦旋攪拌5分鐘的Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(5當量)、殘基Xaa3和0.5MHOAt(5當量)的DMF溶液一起，渦旋攪拌18小時。將樹脂排干，用DMF(4×3ml/g)洗滌。按照先前對殘基Xaa3的描述，將與肽結合的樹脂(0.034mmol)脫保護并與Fmoc-[(S)-α-Me-Pro]-OH(5當量)偶聯，得到與Fmoc-[Xaa2-Xaa11]-肽結合的樹脂。

按照對殘基Xaa2的描述，將樹脂(0.017mmol)脫保護并與Boc-L-His(Trt)-OH(5當量)偶聯。通過用TFA/水/三異丙基硅烷(94∶3∶3)溶液(5.0ml)處理3小時，從相應的肽酰基-樹脂中，將所需肽裂解/脫保護。濾掉樹脂，用TFA(1.0ml)洗滌，蒸發合并的TFA濾液，得到39mg粗制肽產物，為油狀固體。通過制備型HPLC純化，使用0.1％TFA/AcCN的0.1％TFA/水，梯度5％→65％，20分鐘。收集含有純產物的流分并凍干，得到5.4mg(回收率18.9％)的SEQ ID NO118化合物。
SEQ ID NO119化合物的合成
將先前合成方法所述的Fmoc-[Xaa3-Xaa11]-肽酰基-Sieber樹脂樣品(0.015mmol)，與預先渦旋攪拌5分鐘的Fmoc-[N-甲基-(D)-Ala]-OH(5當量)和0.5M HOAt(5當量)的DMF溶液、以及DIC(5當量)一起渦旋攪拌4小時。將樹脂排干，用DMF(4×3ml/g)洗滌。用20％哌啶的DMF(3ml)分別處理5分鐘和15分鐘，以除去Fmoc基團。樹脂用DMF(8×3ml)洗滌，再按照先前所述合成方法，與Boc-L-His(Trt)-OH(5當量)偶聯。用TFA/水/三異丙基硅烷(94∶3∶3)溶液(5.0ml)處理3小時，從相應的肽酰基-樹脂中，將所需肽裂解/脫保護。濾掉樹脂，用TFA(1.0ml)洗滌，蒸發合并的TFA濾液。將所得油狀固體溶于(1∶1)乙腈/水(2ml)中，通過制備型HPLC純化，使用0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水，梯度為5％→65％，20分鐘。合并含有純產物的流分并凍干，得到5.2mg(回收率18.5％)SEQ ID NO119化合物。
SEQ ID NO133化合物的合成
將先前合成所述的Fmoc-脫保護的[Xaa2-Xaa11]-肽酰基-Sieber樹脂樣品(0.017mmol)與脫氨基-His(Trt)-OH(5當量)和HATU(5當量)的0.5HOAt的DMF(5當量)溶液、以及2M DIEA的NMP(5當量)溶液一起渦旋攪拌18小時。將樹脂排干，用DMF(6×2ml/g)和DCM(3×2ml/g)洗滌。通過用TFA/水/三異丙基硅烷(94∶3∶3)溶液(5.0ml)處理3小時，從相應的肽酰基-樹脂中，將所需肽裂解/脫保護。濾掉樹脂，用TFA(1.0ml)洗滌，蒸發合并的TFA濾液。將所得油狀固體(32mg)溶于(1∶1)乙腈/水(2ml)中，通過制備型HPLC純化，使用0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水，梯度為5％→65％，20分鐘。收集含有純產物的流分并凍干，得到7.4mg(回收率24.6％)的SEQ ID NO133化合物。
SEQ ID NO120化合物的合成
按照實施例3所述方法，使用Applied Biosystems 433a肽合成儀的FastMocTM方案，讓上述制備的Fmoc-脫保護的[Xaa10-Xaa11]-二肽酰基-Sieber樹脂樣品(0.05mmol)進行9次額外偶聯循環。

將Fmoc-保護的二肽酰基-樹脂(0.05mmol)放在設備上適當尺寸的容器內，用NMP洗滌6次，用20％哌啶/NMP處理兩次(分別為2分鐘和8分鐘)，將其脫保護。在監測之下進行額外的脫保護步驟，直到滿足監測條件為止。總脫保護時間10-12分鐘。脫保護的二肽酰基-樹脂用NMP洗滌6次，再與下一個氨基酸偶聯。通過下一步驟所用的實施例說明該方法。

接下來使用以下方法偶聯Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH將Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1mmol，20當量)溶于2ml NMP中，通過后續加入0.45M HBTU/HOBt的DMF(2.2ml)和2M DIEA/NMP(1ml)將其活化。然后將活化的Fmoc-保護的氨基酸溶液移至反應容器中，偶聯30-60分鐘，這取決于脫保護步驟的反饋。樹脂再用NMP洗滌6次，重復偶聯方案。如上所述，使其接受5次額外的脫保護/偶聯循環，以完成所需Xaa4-Xaa11序列的組裝。隨后偶聯的Fmoc-氨基酸是Fmoc-(L)-His(Trt)-OH、Fmoc-(L)-Thr(tBu)-OH、Fmoc-(S)-2-氟-α-Me-Phe-OH、Fmoc-(L)-Thr(tBu)-OH和Fmoc-Gly-OH。最后，肽酰基-樹脂用NMP和DCM洗滌6次。將Fmoc-保護的二肽酰基-樹脂(0.025mmol)的N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(55∶45)漿液加入到ACT396多重肽合成儀。樹脂用DMF洗滌2次，如實施例1所述方法，用1.5M哌啶/DMF處理兩次將其脫保護。通過隨后加入0.5M HOAt的DMF(4.0當量)和DIC(4.0當量)，活化Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(4當量)，手工轉移至反應容器中，偶聯2小時。樹脂用NMP(4×0.5ml)洗滌，渦旋攪拌1分鐘。按照先前偶聯所述使Fmoc基團脫保護后，Fmoc-[(S)-α-Me-Pro]-OH的偶聯如下通過隨后加入0.5M HOAt的DMF(2.4當量)活化Fmoc-[(S)-α-Me-Pro]-OH(2.4當量)，用NMP(0.12ml)和DIC(2.4當量)稀釋。手工將該溶液移至反應容器中，偶聯18小時。樹脂用NMP洗滌樹脂。Fmoc基團脫保護后，通過手工加入氨基酸(4當量)的0.5M HOAt的DMF(4當量)溶液，用NMP(0.2ml)和DIC(4當量)稀釋，加入到反應容器中，使Fmoc-(L)-His(Trt)-OH偶聯。讓偶聯反應進行18小時偶聯。樹脂用NMP洗滌。按照上述偶聯所述方法，除去Fmoc基團。如實施例1所述方法，進行肽的TFA裂解/脫保護。通過制備型HPLC純化，使用0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水，梯度為10％→60％，20分鐘。合并含有純產物的流分并凍干，得到21.7mg(回收率42％)的SEQ ID NO120化合物。
實施例21 SEQ ID NO151化合物的合成
在Advanced ChemTech 90型合成儀上50ml反應器中，用2.67g(0.56mmol/g，1.5mmol)Sieber酰胺樹脂開始合成。逐步組裝所用的通用脫保護/偶聯重復循環如下 1.DMF洗滌1×20ml×1分鐘 2.20％哌啶的DMF 1×20ml×5分鐘 3.20％哌啶的DMF 1×20ml×15分鐘 4.DMF洗滌3×20ml×1分鐘 5.NMP洗滌4×20ml×1分鐘 6.偶聯步驟(見下文) 7.DMF洗滌4×15ml×1分鐘 8.Kaiser茚三酮試驗或用HPLC和質譜分析裂解/脫保護
使用以上步驟1-5，從Sieber酰胺樹脂上除去Fmoc基團。將N-α-Fmoc-4-(2′-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸(0.73g，1.50mmol)、PyBOP(0.78g，1.50mmol)和HOBt(0.39g，1.50mmol)溶于NMP(5ml)中，然后將該溶液加入到樹脂中，再加入DIEA(0.39g，3.05mmol)。將偶聯混合物渦旋攪拌16小時。樹脂用10％乙酸酐的DCM (1×50ml×60分鐘)處理，用DCM(4×50ml ×1分鐘)洗滌并真空干燥過夜。Fmoc判定試驗表明有0.456mmol/克的取代。用3.11g(1.42mmol)樹脂繼續合成。樹脂脫保護后，將N-α-Fmoc-(L)-Bip(2’-Et-4’-OMe)-OH(0.98g，1.9mmol)、HCTU(0.78g，1.9mmol)的NMP(5ml)溶液加入到樹脂中，再加入DIEA(0.48g，3.80mmol)，將混合物渦旋攪拌16小時。用NMP洗滌后，Kaiser茚三酮試驗為陰性。樹脂脫保護后，使用HCTU(1.03g，2.49mmol)和DIEA(0.65g，5.03mmol)的NMP(10ml)，將N-α-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯(0.6487g，1.24mmol)偶聯48小時。樹脂脫保護后，使用0.546M HOAt的DMF(11.5ml，6.3mmol)和DIC(0.96ml，6.3mmol)，將N-α-Fmoc-N-im-三苯甲基-L-組氨酸(3.85g，6.25mmol)偶聯16小時。重復該方案，將N-α-Fmoc-O叔丁基-L-蘇氨酸(2.5g，6.30mmol)偶聯到樹脂上。樹脂脫保護之后，將N-α-Fmoc-α-甲基-2-氟-L-苯丙氨酸(0.78g，1.86mmol)的0.546M HOAt的DMF(3.4ml，1.87mmol)加入到樹脂中，再加入DIC(0.24g，1.87mmol)的DMF(3.5ml)，讓偶聯進行4小時。樹脂脫保護之后，利用0.546M HOAt的DMF(25ml，12.50mmol)和DIC(1.58g，12.52mmol)溶液，將N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸(4.97g，12.50mmol)偶聯16小時。樹脂用10％乙酸酐的DMF(20ml)封閉1小時，再用DMF(4×20mL)洗滌。按照先前關于N-α-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯偶聯步驟的描述，除去Fmoc基團，將N-Fmoc-甘氨酸(1.11g，3.75mmol)偶聯90分鐘，再用相同方式偶聯N-α-Fmoc-L-谷氨酸γ-叔丁酯(1.60g，3.75mmol)。將部分肽酰基-樹脂(0.030mmol)脫保護，并使用0.546M HOAt的DMF(0.110ml，0.83mmol)和DIC(7.6mg，0.06mmol)的DMF(0.1ml)，將N-α-Fmoc-α-甲基-L-脯氨酸(21.2mg，0.06mmol)偶聯16小時。最后，將L-β-(N-1-三苯甲基)咪唑乳酸(39.8mg，0.10mmol)和HATU(38mg，0.10mmol)的NMP(0.9ml)加入到部分肽酰基-樹脂(0.01mmol)中，再加入DIEA(17.4ml，0.10mmol)。渦旋攪拌1小時并用NMP洗滌之后，按上述方法重復偶聯，讓其進行48小時。與肽結合的樹脂用TFA/TIS/水(94∶3∶3)(2ml)處理2.5小時，再用TFA/TIS/水(94∶3∶3)洗滌兩次(2次各1ml)。真空濃縮合并的濾液，得到18.1mg(92％)粗制肽。將其溶于2ml(1∶1)乙腈/水中，并將該溶液上樣到Luna[C18(2)，5μm]Phenomenex柱，250×21.2mm I.D.。該柱用15％→55％溶劑B/溶劑A梯度洗脫50分鐘，流速為15ml/min。溶劑A0.1％TFA/水。溶劑B0.1％TFA/AcCN。合并含有純產物的流分并凍干，得到4.2mg的SEQID NO151化合物。
實施例22 (S)-3-(N-1-三苯甲基-咪唑-4-基)-2-羥基丙酸 (L-β-(N-1-三苯甲基)咪唑乳酸)的合成
以下流程22描述(S)-3-(N-1-三苯甲基-咪唑-4-基)-2-羥基丙酸的合成 流程22

將(S)-3-(1H-咪唑-4-基)-2-羥基丙酸(0.5265g，3.0mmol)和三苯甲基氯(1.2991g，4.7mmol)裝入100ml燒瓶中。邊攪拌邊加入吡啶/乙腈1∶1(20ml)。燒瓶在50-55℃油浴中加熱4小時。溶劑在旋轉蒸發器上蒸發至近干。向殘余物中加入等體積的水和乙酸乙酯(各30ml)。混合物攪拌約20分鐘。所得固體經過濾收集，先用水(2×10ml)、再用乙酸乙酯(2×10ml)洗滌，并真空干燥。產量0.6953g(58％)。
實施例23 (S)-3-(N-1-(2，4-二硝基苯基)咪唑-4-基)-2-羥基丙酸(L-β-(N-1-(2，4-二硝基苯基)咪唑乳酸)的合成
以下流程23描述(S)-3-(N-1-(2，4-二硝基苯基)咪唑-4-基)-2-羥基丙酸的合成 流程23

將(S)-3-(1H-咪唑-4-基)-2-羥基丙酸一水合物(0.8971g，5.2mmol)、乙腈(60ml)、DIEA(1.3438g，10.4mmol)和1-氟-2，4-二硝基苯(0.9564g，5.1mmol)裝入圓底燒瓶中，覆蓋鋁箔并攪拌過夜。過濾該反應混合物，減壓除去溶劑。油狀殘余物用二異丙基醚(2×20ml)研磨，然后溶于氯仿(20ml)中，并再次從氯仿和AcCN中蒸發。加入DCM(60ml)，得到沉淀物，加入更多DCM(30ml)后，在室溫下攪拌。收集固體產物，用DCM(2×10ml)洗滌并真空干燥過夜。產量1.37g(83％)。
實施例24 SEQ ID NO158化合物的合成 方法A.片段偶聯(流程10A和10B)
在8ml反應器中進行手工合成，從0.1896g(0.56mmol/g，0.11mmol)Sieber酰胺樹脂開始。采用以下循環，從樹脂上除去Fmoc基團 1.DMF洗滌1×2ml ×5分鐘 2.20％哌啶的DMF 1×2ml ×5分鐘 3.20％哌啶的DMF 1×2ml ×15分鐘 4.DMF洗滌8×2ml ×1分鐘
將N-α-Fmoc-4-(2′-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸HCl鹽(0.0549g，0.11mmol)和PyBOP(0.0667g，0.13mmol)溶于DMF(1ml)中。將該溶液加入到脫保護的樹脂中，再加入DIEA(0.0423g，0.33mmol)的DMF(1ml)。樹脂經渦旋攪拌3.5小時，用DMF和DCM(4×2ml×1分鐘)洗滌。樹脂用10％乙酸酐的DCM(2ml)處理過夜，用DCM(6×2ml×1分鐘)洗滌，并真空干燥1小時。產量0.2508g。Fmoc判定試驗表明有0.35mmol/g的取代。0.083g(0.029mmol)樹脂用于下一步驟。

使用上述循環1-4將樹脂脫保護之后，將N-α-Fmoc-(L)-Bip(2’-Et-4’-OH)-OH(0.0251g，0.049mmol)、HOBt(0.0084g，0.055mmol)和DIC(0.0067g，0.053mmol)的DMF(1ml)溶液加入到樹脂中。渦旋攪拌16小時后，肽酰基-樹脂先用DMF、再用DCM(4×1ml×1分鐘)洗滌。使用上述步驟1-3除去Fmoc基團，接著先用DMF、再用DCM洗滌(4×1ml×1分鐘)。

肽-樹脂用三氟乙酸/三異丙基硅烷/水96∶2∶2(2×1ml×10分鐘)處理。收集濾液并真空濃縮，殘余物用二異丙基醚研磨并離心，得到固體產物。用二異丙基醚洗滌并真空干燥，得到0.0244g二肽。將二肽溶于0.2％DIEA的THF(1ml)，用大孔三乙銨甲基聚苯乙烯碳酸酯樹脂(0.0682g，0.211mmol，Argonaut Technologies)處理2小時。除去樹脂珠，用0.2％DIEA的THF(2×1ml)洗滌。真空干燥合并濾液和洗液。向所得殘余物中加入側鏈受保護的N-甲氧羰基Xaa1-Xaa9九聚體肽(55.8mg，0.035mmol)、HOBt(5.47mg，0.036mmol)和DIC(6μL，0.035mmol)的CHCl3/DMF(9∶1)(1ml)溶液。所得溶液經渦旋攪拌過夜。真空除去溶劑之后，所得殘余物用2％三異丙基硅烷的三氟乙酸(1ml)處理90分鐘，隨后加入二異丙基醚(20ml)。將沉淀固體干燥并溶于2ml1.5％氫氧化銨中。pH值用乙酸調至約9.5。將該溶液上樣到Luna[C18(2)，5μm]Phenomenex柱，250×21.2mm I.D.。該柱用20％→50％溶劑B的梯度洗脫60分鐘，流速為15ml/min。溶劑A0.1％TFA/水。溶劑B0.1％TFA/AcCN。合并含有純產物的流分并凍干，得到5.5mg SEQ ID NO158化合物。

合成SEQ ID NO158化合物的不同片段偶聯程序，是按照流程10B所述方法。在8ml反應器中進行手工合成，從按照本實施例前述方法制備的0.1182g(0.47mmol/g，0.056mmol)N-α-Fmoc-4-(2′-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酰-Sieber酰胺樹脂開始。用于從樹脂上除去Fmoc基團的循環與上述相同。按上述方法將N-α-Fmoc-(L)-Bip(2’-Et-4’-OH)-OH(0.0419g，0.083mmol)偶聯到樹脂上。用10％乙酸酐的DCM(2ml)處理樹脂30分鐘之后，用DCM(6×2ml×1分鐘)洗滌，除去Fmoc基團，將側鏈受保護的N-甲氧羰基Xaa1-Xaa9九聚體肽(0.1347g，0.084mmol)、HOBt(0.0130g，0.085mmol)和DIC(0.0118g，0.94mmol)的DCM(0.1ml)溶液和DMF(0.45ml)加入到脫保護的二肽酰基-樹脂中，所得混合物經渦旋攪拌4.5小時。樹脂用DMF和DCM(4×2ml×1分鐘)洗滌，然后用2％三異丙基硅烷、2％水的三氟乙酸(5×1ml×3min.)處理；收集濾液并讓其靜置75分鐘。真空除去溶劑，所得殘余物用二異丙基醚(20ml)研磨，得到固體的粗制肽(0.0818g)。按上述方法將其純化，除了所用梯度為25％→35％溶劑B的溶劑A，120分鐘，流速15ml/min以外。溶劑A0.1％TFA/水。溶劑B0.1％TFA/AcCN。合并含有純產物的流分并凍干，得到19mg SEQ ID NO158化合物。
方法B.逐步延伸(流程1)
在Advanced ChemTech 90型合成儀上50ml反應器中進行合成，從1.46g(0.72mmol/g，1.05mmol)Sieber酰胺樹脂開始。逐步組裝所用的通用脫保護/偶聯重復循環如下 1.DMF洗滌1×15ml×1分鐘 2.20％哌啶的DMF 1×15ml×5分鐘 3.20％哌啶的DMF 1×15ml×15分鐘 4.DMF洗滌4×15ml×1分鐘 5.NMP洗滌4×15ml×1分鐘 6.偶聯步驟(見下文) 7.DMF洗滌4×15ml×1分鐘 8.DCM洗滌4×15ml×1分鐘 9.Kaiser茚三酮試驗或用HPLC和質譜分析裂解/脫保護。

使用上述步驟1-5，從Sieber酰胺樹脂中除去Fmoc基團。將N-α-Fmoc-4-(2-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸HCl鹽(1.0977g，2.13mmol)、PyBOP(1.0972mmol，2.11mmol)和HOBt一水合物(0.3228g，2.11mmol)溶于DMF(8ml)中。將DIEA(0.8052g，6.23mmol)加入到該溶液中，然后將其加入到樹脂中。偶聯混合物經渦旋攪拌16小時。樹脂用10％乙酸酐的DCM(1×15ml ×60min.)處理，用DCM(6×15ml ×1min.)洗滌并真空干燥6小時。產量1.6816g。Fmoc判定試驗表明有0.48mmol/g的取代。利用0.8602g(0.41mmol)樹脂繼續合成。樹脂脫保護之后，將N-α-Fmoc-(L)-Bip(2’-Et-4’-OH)-OH(0.2660g，0.524mmol)、HOBt(0.0796g，0.520mmol)和DIC(0.0647g，0.513mmol)的DMF(8ml)溶液加入到樹脂中，混合物經渦旋攪拌16小時。用DMF和DCM洗滌后，Kaiser茚三酮試驗為陰性。樹脂脫保護之后，使用HOBt(0.1893g，1.24mmol)和DIC(0.1566g，1.24mmol)的DMF/DCM(1∶1)(6ml)。將N-α-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯(0.6487g，1.24mmol)偶聯45分鐘。用N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-絲氨酸(0.4750g，1.24mmol)和N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸(0.4924g，1.24mmol)重復相同的偶聯循環。樹脂脫保護之后，用HOBt(0.1271g，0.830mmol)和DIC(0.1044g，0.827mmol)的DMF/DCM(1∶1)(6ml)，將N-α-Fmoc-α-甲基-2-氟-L-苯丙氨酸(0.3497g，0.834mmol)偶聯1小時。樹脂脫保護之后，使用0.5MHOAt的DMF(8.3ml，4.15mmol)和DIC(0.5240g，4.15mmol)溶液，將N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸(1.6413g，4.14mmol)偶聯16小時。用DMF和DCM洗滌之后，3mg濕樹脂用1ml TFA/TIS/水(96∶2∶2)處理1.5小時。濾掉樹脂，并在高速真空下除去溶劑。將殘余物溶于2ml水/乙腈(1∶1)。HPLC和MS分析顯示沒有未偶聯的肽。除去Fmoc基團，并按照先前對N-α-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯偶聯步驟的描述，將N-Fmoc-甘氨酸(0.3691g，1.24mmol)偶聯1小時，接著以相同方式偶聯N-α-Fmoc-L-谷氨酸γ-叔丁酯(0.5297g，1.24mmol)。然后使用HOBt(0.1271g，0.83mmol)和DIC(0.1042g，0.83mmol)的DMF/DCM 1∶1(6ml)，將N-α-Fmoc-α-甲基-L-脯氨酸(0.2902g，0.83mmol)偶聯3.5小時。最后，按照關于N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸與N-α-Fmoc-α-甲基-2-氟-L-苯丙氨酸偶聯的描述，將N-α-Fmoc-N-im-三苯甲基-L-組氨酸(2.5564g，4.13mmol)偶聯12小時。按上述方法從肽酰基-樹脂中釋放出脫保護的肽樣品，經MS顯示有些未偶聯的肽。手工除去Fmoc基團，在DMF和DCM洗滌之后，加入N-(甲氧基羰氧基)琥珀酰亞胺(0.2163g，1.25mmol)的DCM(6ml)溶液，將混合物渦旋攪拌16小時。肽-樹脂用DCM洗滌(4×10ml ×1分鐘)。Kaiser茚三酮試驗為陰性。N-甲氧羰基-衍生的肽酰基-樹脂用TFA/TIS/水(96∶2∶2)(10ml)處理10分鐘，再額外處理兩次，每次各5ml。留下合并濾液，在室溫下再靜置2小時。真空濃縮至大約4ml之后，將該溶液滴加到乙醚(50ml)中，同時進行攪拌。過濾收集所得固體，用乙醚(2×5ml)洗滌并真空干燥，得到0.691g(92％)粗制肽。通過制備型HPLC純化，使用本實施例的方法A所述程序。
實施例25 N-(甲氧基羰氧基)琥珀酰亞胺[2，5-(二氧代吡咯烷-1-基)碳酸甲酯]的合成
以下流程24描述N-(甲氧基羰氧基)琥珀酰亞胺[2，5-(二氧代吡咯烷-1-基)碳酸甲酯的合成 流程24

在-5℃，在氬氣下，向64.61g(0.561mol)N-羥基琥珀酰亞胺和58.95g(0.624mol)氯甲酸甲酯的THF(900ml)攪拌溶液中，加入82.6ml(0.593mol)三乙胺，其加入速度使得溫度保持在+3℃以下。攪拌該反應混合物，讓其升至室溫。15小時后，過濾所得漿液，固體用THF (100ml)洗滌。濾液經減壓蒸發，得到白色固體。從EtOAc/己烷(2∶1，150ml)中重結晶，得到白色晶體的所需產物，熔點84-86℃，79.4g，收率82％。
實施例26 (R，S)-3-(1-(2，4-二硝基苯基)-咪唑-4-基)-2-甲基丙酸[α-甲基-β-[1-(2，4-二硝基苯基)-咪唑-4-基]丙酸，Imp]的合成 1-甲苯磺酰基-4(5)-羥甲基咪唑
以下程序改編自Agr.Biol.Chem.，38(5)，1097-1099，1974。向Na2CO3(8.4g，0.08mol)的水(40ml)溶液中加入4-(羥甲基)咪唑鹽酸鹽(2.7g，0.02mol)。完全溶解后，在5分鐘內滴加對甲苯磺酰氯(4.58g，0.024mol)的乙酸乙酯(30ml)溶液。讓反應混合物攪拌5小時。分離各層，加入更多乙酸乙酯(20ml)。有機相依次用0.1M Na2CO3(2×20ml)、水(1×20ml)、飽和NaCl(1×20ml)洗滌。乙酸乙酯用2gMgSO4和1g活性碳處理10分鐘。固體通過硅藻土墊過濾除去，在旋轉蒸發器上除去溶劑。殘余物開始結晶。加入新鮮乙酸乙酯(10ml)，用加熱槍加熱該溶液，使固體重新溶解。產物在室溫下結晶過夜。收集晶體物，用乙酸乙酯(5ml)洗滌，再用乙醚(10ml)洗滌并真空干燥至恒重3.59g。
1-甲苯磺酰基-4(5)-乙酰氧基甲基咪唑
將1-甲苯磺酰基-4(5)-羥甲基咪唑(2.52g，10mmol)溶于氯仿(10ml)中。在室溫下，向其中滴加三乙胺(2.02g，20mmol)，接著在15分鐘內滴加乙酸酐(1.33g，13mmol)。混合物在室溫下攪拌并通過LC/MS監測4天。減壓除去氯仿，將殘余物溶于乙酸乙酯(60ml)中。有機相依次用0.1M碳酸氫鈉、水、飽和氯化鈉洗滌，每次都為1×40ml。有機層同時用活性碳和硫酸鎂處理，然后通過硅藻土墊過濾。減壓除去溶劑，所得殘余物溶于熱的乙酸乙酯(10ml)中。向溶液中緩慢加入20ml乙醚。讓溶液在室溫下結晶過夜。收集晶體，用乙醚(2×10ml)洗滌并真空干燥過夜，得到1.55g。
α-甲氧羰基-α-甲基-β-4-(1-甲苯磺酰基咪唑)-丙酸甲酯
以下程序改編自Synthetic Communications，19(7&8)，1157-1165，1989。將1-甲苯磺酰基-4(5)-乙酰氧基甲基咪唑(0.3516g，1.2mmol)和甲基丙二酸二甲酯(0.1485g，1.0mmol)的乙腈(2ml)溶液，加入到粉末狀KOH(0.1694g，3.0mmol)和四丁基溴化銨(0.0496g，0.15mmol)的乙腈(1ml)攪拌懸浮液中。40分鐘后通過HPLC分析判定該反應已完成。將反應混合物倒入乙醚(100ml)中，通過硅藻土墊過濾，減壓蒸發除去溶劑。將殘余油狀物溶于30ml乙酸乙酯中，并用0.1MNaHCO3(1×15ml)、飽和NaCl(1×15ml)洗滌，再經MgSO4干燥。減壓除去溶劑，所得油狀物留在真空干燥器中3天，得到0.207g。
α-甲基-β-4-咪唑丙酸
將α-甲氧羰基-α-甲基-β-4-(1-甲苯磺酰基咪唑)-丙酸甲酯(0.186g，0.5mmol)溶于2ml甲醇中。向其中加入1.5ml 1.0N NaOH，讓反應物攪拌過夜。經制備型HPLC純化后，將凍干所獲的產物(0.1366g)溶于5ml 1.0N NaOH中，在PTFE內襯螺帽密封的16×100mm螺帽試管中，在100℃加熱2小時，再加入2ml濃HCl，并在145℃加熱6小時。形成所需脫羧基產物。過濾全部溶液，上樣到YMCG-340-10P ODS 50×20mm的制備型HPLC柱中。產物用0％→60％0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水梯度洗脫60分鐘。合并在梯度中相當于11-13分鐘的流分，冷凍并凍干，得到32mg產物。
α-甲基-β-[1-(2，4-二硝基苯基)-咪唑-4-基]丙酸
向α-甲基-β-4-咪唑丙酸(0.0305g，0.114mmol)和碳酸氫鈉(0.0617g，0.734mmol)水(1ml)溶液(pH 8.04)中，加入2，4-二硝基氟苯(0.0323g，0.174mmol)的MeCN(1.0ml)溶液。反應混合物經渦旋攪拌過夜。減壓除去MeCN，將殘余物重新溶于2ml水中，過濾并分成1.5ml和0.5ml兩份，上樣到Phenomenex Luna C18(2)5μm 100×21.2mm制備型HPLC柱中。產物用0％→80％0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水梯度洗脫40分鐘。合并在梯度中相當于12.5-14.5分鐘的流分，并在Savant SpeedVacTM中干燥過夜。通過將不溶于水的粗產物溶于DMSO中，再按上述方法進行制備型HPLC，回收額外的產物。凍干后，由合并流分得到31mg純產物。
實施例27 SEQ ID NO137和138化合物的合成.
如下所述，將(R，S)-3-(1-(2，4-二硝基苯基)-咪唑-4-基)-2-甲基丙酸與相關Xaa2-Xaa11-肽酰基-Sieber樹脂偶聯。

向(R，S)-3-(1-(2，4-二硝基苯基)-咪唑-4-基)-2-甲基丙酸(0.0267g，0.083mmol)、6-Cl-HOBt(0.0151g，0.089mmol)和HCTU(0.0360g，0.087mmol)的1ml NMP/DCM(3∶1)溶液中，加入DIEA(0.0315g，0.244mmol)；短時渦旋攪拌該溶液，然后加入到如實施例19所述而制備的相關Fmoc保護的Xaa2-Xaa11-肽酰基-Sieber樹脂中。讓偶聯進行16小時。肽酰基-樹脂用NMP洗滌，再用DCM(3×1.5ml×1分鐘)洗滌，然后用10％乙酸酐的DCM處理(1×2ml×90分鐘)，接著先用DCM、再用DMF洗滌(3×1.5ml×1分鐘)。肽酰基-樹脂用10％苯硫酚的DMF(1.5ml)處理1小時，再用DMF和DCM(4×1.5ml×1min)洗滌。肽酰基-樹脂再用TFA/DCM/TIS(3∶1.9∶0.1)(1ml)處理10分鐘，然后過濾。收集濾液，再輕輕渦旋攪拌1小時。在高速真空中將TFA混合物濃縮至大約0.5ml，然后加入4ml MTBE。1小時后，離心收集沉淀產物，洗滌并干燥，得到0.0841g粗產物。如下進行制備型HPLC純化將粗制肽溶解并注入Phenomenex Luna C18(2)(5μm，250×30mm)柱內，用20％→50％0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水線性梯度洗脫40分鐘，流速為15ml/min，流出液在217nm處進行紫外檢測。合并含有所需產物的流分并凍干，得到26.7mg 97.5％純肽。
肽的制備型手性HPLC純化
將非對映體的肽混合物(10mg)溶于MeCN/MeOH中。將該溶液上樣到Chirobiotic V 2.2×50cm，5μm柱中，用MeCN/MeOH/N(CH2CH3)3/CH3COOH65/35/0.5/0.5、以20ml/min流速洗脫。在29-35分鐘之間收集異構體A。在36-44分鐘之間收集異構體B。按上述方法進行第二輪。合并含有異構體A的流分，濃縮至大約5ml，用水/MeCN(4∶1)稀釋，再將溶液凍干。按照相同方式處理異構體B。所得殘余物通過制備型HPLC轉變為TFA鹽。將各種肽注入Phenomenex Luna C18(2)5μm 100×21.2mm柱中，用20％→50％0.1％TFA/MeCN的0.1％TFA/水的線性梯度洗脫40分鐘，流速為10ml/min，流出液在217nm處進行紫外檢測。合并含有所需產物的流分，冷凍并凍干，得到6.0mg純化肽異構體A和4.9mg純化肽異構體B。
實施例28
示例性的11聚體肽見表3。
表3 氨基酸縮寫和結構




氨基酸和肽化學領域技術人員知道，在4位或對位帶有苯基取代基的苯丙氨酸也可稱為4-(苯基)苯丙氨酸或4，4’-聯苯基丙氨酸，因此可縮寫為“Bip”。為了在“氨基酸縮寫和結構”小節以及本文的表格所示的縮寫，聯苯基丙氨酸可縮寫為例如“Bip(2’-Me)”，代表在其4位被2’-甲基苯基取代的苯丙氨酸，其中2’-甲基對苯環連接點而言是鄰位。
實施例29 環AMP的測定
GLP-1受體是G-蛋白偶聯受體。GLP-1(7-36)-酰胺是生物活性形式，與GLP-1受體結合，并通過信號轉導引起腺苷酸環化酶活化，并增加胞內cAMP濃度。為了監測肽在刺激GLP-1受體中的激動作用，通過測定胞內cAMP含量來監測腺苷酸環化酶活性。確立了在CHO-K1細胞和克隆系中穩定表達的全長人胰高血糖素肽1受體。篩選出在響應GLP-1飽和劑量時cAMP含量增加最大的克隆，并選出了克隆CHO-GLP1R-19。

將細胞培養在Ham氏F12營養培養基(Gibco#11765-054)、10％FBS、1x L-谷胺酰胺、1x青霉素/鏈霉素和0.4mg/mlG418中。將CHO-GLP-1R-19細胞(100μl培養基中20,000個)接種在96孔組織培養微量滴定板的各孔中，并在5％CO2氣氛/37℃下培養過夜。測定當天，細胞用100μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌一次。在開始測定之前，先用Biomek 2000連續稀釋所有肽。用100％DMSO進行連續稀釋。在開始測定之前，使用Platemate Plus得到肽培養板；將1.5μL化合物轉移到V型底的培養板中，將補充有100μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(非選擇性磷酸二酯酶抑制劑)的150μL測定緩沖液加入到培養板中，得到1∶100稀釋度和1％終濃度的DMSO。

為了繪制cAMP標準曲線，用裂解試劑1(AmershamcAMP SPA試劑盒)制備范圍0.2-25.6pmol/孔的cAMP連續稀釋液。手工加入cAMP標準物各50μl，并使用多重分液器(multidrop)加入70μl混合試劑(Amersham cAMP SPA試劑盒)。然后密封培養板，15小時后在Trilux計數器上計數。用該標準曲線將CPM換算成cAMP的pmol。
在Platemate Plus上進行的cAMP測定方案
將細胞培養板和肽培養板裝在Platemate上。從各孔中吸出培養基并棄去。然后加入得自肽培養板的100μL/孔的肽/緩沖液混合物，開始測定。培養30分鐘后，除去肽/緩沖液，并在每孔中加入50μL裂解試劑1溶液。將培養板在室溫下保持1小時，或冷藏密封過夜。使用多重分液器加入70μL cAMP檢測試劑(預先混合的125I-cAMP類似物、抗cAMP抗體和與SPA珠綴合的抗兔抗體，所有這些都來自Amersham cAMP SPA試劑盒)，將這些培養板密封。15小時后，將培養板放在Trilux計數器上計數。

按半對數濃度測定化合物的劑量依賴性，一式兩份。在每個96孔培養板中，按7個半對數劑量測定GLP-1(對照組)和5種化合物(一式兩份)。將10nM GLP-1加入到10個額外孔內，作為測定最大活性的參考標準。用已知量的環AMP確定標準曲線。根據環AMP標準曲線，測定由處理過的細胞合成的cAMP量，并計算最大GLP-1刺激活性的百分比，然后針對對數化合物濃度作圖。通過非線性回歸曲線擬合(4參數S形劑量-反應曲線)對進行數據分析，求出化合物的EC50。作為實例，本文所述肽的EC50值范圍為0.0005nM-10nM，更優選范圍為0.0005nM-0.200nM。

或者，將表達GLP-1受體的CHO細胞以10,000細胞/孔接種到384孔板中，按上述方法在37℃/5％CO2培養過夜。用肽酰基GLP-1受體激動劑處理之后，用HithunterTM XS cAMP試劑盒

，按照制造商的方案測定cAMP胞內水平。
實施例30 體內研究
將肽溶于合適溶媒中，濃度為相當于給予小鼠的nmol/ml劑量，使得各小鼠將接受相同的體積/重量的劑量溶液。根據喂食血漿葡萄糖和體重，將雄性C57BL/6J-ob/ob小鼠(10周齡)隨機分成每組6只小鼠。在過夜禁食之后，給小鼠稱重，并放在實驗室內。在環境中放置30分鐘后，在-30分鐘通過尾尖給小鼠放血，并立刻經皮下注射(sc)溶媒或溶于溶媒的肽(0.1ml溶液/100g體重)。在零時給小鼠放血，然后經腹膜內注射50％葡萄糖(2g/kg)，開始腹膜內葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，ipGTT)。在葡萄糖注射后30、60、120和180分鐘給對小鼠放血。將血樣注入EDTA鉀中，在研究期間放在冰上，接著在4℃以3000rpm離心10分鐘。將血漿樣品稀釋11倍，在Cobas系統中進行葡萄糖分析。將另一份5μL血漿樣品用20μL樣品稀釋劑(胰島素ELISA測定試劑盒，Crystal Chem Inc.)稀釋5倍，貯存在-20℃，用于采用超敏小鼠胰島素ELISA試劑盒(Ultra SensitiveMouse Insulin ELISA kit)(Crystal Chem Inc.)進行后續分析。

下文描述在ob/ob小鼠(胰島素抵抗的小鼠模型)中，化合物I和化合物SEQ ID NO9、118、151和158在體內使葡萄糖降低的特性。皮下給予化合物I，在腹膜內葡萄糖耐量試驗(ipGTT)中餐后葡萄糖移動曲線衰減，在0-180分鐘之間，以劑量依賴性方式，減少了血漿葡萄糖的曲線下面積(AUC)(圖1)。測得化合物I的ED50為50nmol/kg。在這些動物中，在餐后血漿胰島素水平上伴有統計學顯著性的劑量依賴性增加(圖2)。在用化合物I處理過的動物中，在血漿葡萄糖與胰島素間的變化關系(圖1和圖2)表明，葡萄糖降低效應是由該化合物刺激胰島素釋放而介導的。

更為重要的是，意想不到ob/ob小鼠在皮下給藥之后，化合物SEQ ID NO9、118、151和158在餐后血漿葡萄糖上產生了時間依賴性(在0-180或210分鐘之間)的統計學顯著性降低(圖3、5、6和7)。SEQ ID NO9化合物對餐后葡萄糖的影響，在1-100nmol/kg之間是劑量依賴性的，在100nmol/kg劑量時減少血漿葡萄糖AUC85.8％(圖3)。測得SEQ ID NO9化合物的ED50是5nmol/kg。在這些動物中，SEQ ID NO9化合物對血漿葡萄糖的影響也伴隨著餐后胰島素的顯著增加(圖4)。對胰島素的影響看來是劑量依賴性的，在30nmol/kg劑量時，AUC的最大增加為187.7％(圖4)。

SEQ ID NO118化合物對餐后葡萄糖的影響，在1-30nmol/kg之間是劑量依賴性的，在30nmol/kg劑量時，血漿葡萄糖AUC減少81％(圖5)。測得SEQ ID NO118化合物的ED50是2.5nmol/kg。

SEQ ID NO151化合物對餐后葡萄糖的影響，在0.03-3nmol/kg之間是劑量依賴性的，在3nmol/kg劑量時，血漿葡萄糖AUC減少67％(圖6)。測得SEQ ID NO151化合物的ED50是1nmol/kg。

SEQ ID NO158化合物對餐后葡萄糖的影響，在0.1-10nmol/kg之間是劑量依賴性的，在10nmol/kg劑量時，血漿葡萄糖AUC減少66％(圖7)。測得SEQ ID NO158化合物的ED50是2nmol/kg。
實施例31 狗的藥代動力學研究
在雄性小獵犬(n＝4，14±1kg)中，測定了SEQ ID NO9、118、151和158化合物的藥代動力學參數。在過夜禁食之后，每只動物通過股靜脈進行靜脈內推注(67μg/kg)或在靠近肩胛骨部位皮下注射(67μg/kg)，接受化合物SEQ ID NO9、118、151和158。每只接受靜脈內和皮下給藥的動物，在依據交叉設計的劑量之間停止一周。兩種給藥途徑的給藥媒劑是丙二醇∶pH 7.4磷酸緩沖液(50∶50)或0.2M Tris(pH 8.0)。在給藥前、靜脈內給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、24和30小時；在給藥前、皮下給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、24和30小時，將一系列血樣收集在裝有EDTA的微量離心管中。每個時間點收集大約0.3ml的血液。血樣立刻在4℃下離心。所得血漿用干冰冷凍并貯存于-20℃。使用下述LC-MS/MS測定，檢測血漿藥物水平。
通過LC-MS/MS定量SEQ ID NO9化合物
通過用兩份體積的含有內標的乙腈使血漿蛋白沉淀，制備得自狗體內研究的血漿樣品，用于分析。樣品經渦旋攪拌混合，離心除去沉淀蛋白。將所得上清液移入96孔板，注入10μL進行分析。用Packard Multiprobe II和Quadra 96Liquid Handling System制備樣品。

HPLC系統由兩個Shimadzu LC 10AD泵(Columbia，MD)、CTC PAL自動進樣器(Leap Technologies，Switzerland)組成。所用的柱子是YMC Hydrosphere C 18(2.0×50mm，3μm)(YMC Inc.，Milford，MA)。柱溫維持在50℃，流速為0.3ml/分鐘。流動相A由10mM甲酸銨和0.1％甲酸的水組成，流動相B由0.1％甲酸的乙腈組成。最初的流動相組成為5％B，并維持5％B一分鐘，使柱平衡。在2分鐘內使組成上升至95％B，并再維持1分鐘。然后在1分鐘內使流動相回到最初條件。總分析時間為5分鐘。使用轉換閥。將在0-1分鐘之間的洗脫液轉向至廢液槽。

HPLC與Sciex API 4000質譜儀(Applied Biosystems，Foster City，CA)連接，并裝備有TurboIonspray離子源。使用超高純度氮作為霧化和渦輪氣體。將渦輪氣體的溫度設定在300℃，并將界面加熱器設定在60℃。利用選擇反應監測(SRM)獲得數據。在Q1中選擇代表SEQ ID NO9化合物的(M+2H)2+、以及BMS-501143(IS)的(M+2H)2+的離子，并在3.5×10-3托(torr)的壓力下，用高純度氮進行碰撞解離，形成特殊產物離子，然后通過Q3對其進行監測。躍遷和電壓概述于表2。
表4 SEQ ID NO9化合物和內標的MS/MS分析參數
范圍為1-1000nM和4-5000nM的標準曲線濃度分別用于從低劑量和高劑量獲得的體內樣品。通過濃度倒數加權的二次回歸(1/X2)來擬合曲線。一式兩份分析標準。也在每個分析組中分析質量控制(QC)樣品，它是用與標準相同的濃度在空白介質中制備的。對于SEQ ID NO9化合物，超過80％的QC的計算濃度是在20％標稱濃度內，表明可接受的測定效力。
數據分析
通過非房室(noncompartmental)方法，使用KINETICATM軟件程序，分析SEQ ID NO9化合物的血漿濃度對時間的數據。直接從實驗觀察中記錄Cmax和Tmax值。使用線性和對數梯形總和的組合求得AUC0-n和AUCtot值。在動脈內和靜脈內給藥后，計算總血漿清除率(CLP)、最終半衰期(t1/2)、平均停留時間(MRT)和穩態分布體積(Vss)。使用總血漿清除率和血液對血漿濃度的比例，計算總血液清除率(CLB)。將CLB和Vss值分別與文獻中報道的標準肝血流和總體水分值相比較。通過取得在SEQ ID NO9化合物皮下給藥后的劑量-標準化AUC值與靜脈內給藥后的比例，建立絕對皮下生物利用度(用％表示)。
狗的藥代動力學結果
在雄性小獵犬中，化合物SEQ ID NO9、151和158在靜脈內(IV)和皮下(SC)給藥后，其藥代動力學參數分別概述于表5A、5B和5C。

SEQ ID NO9化合物顯示出低系統清除率(1.4±0.4ml/min/kg)。穩態分布體積(Vss)為0.21±0.07L/kg，表明有限的血管外分布。估計清除半壽期為7.1±2.1小時，平均停留時間為2.4±0.5小時。皮下給予67μg/kg后，達到峰濃度的時間(Tmax)發生在1.1±0.6小時。皮下給藥后的最大血漿濃度(Cmax)為116±34nM。SEQ ID NO9化合物在狗中的皮下生物利用度為93±22％。
表5A SEQ ID NO9化合物在狗中的藥代動力學參數(給藥溶媒0.2M Tris，pH 8.0) 表5B SEQ ID NO151化合物在狗中的藥代動力學參數 表5C SEQ ID NO158化合物在狗中的藥代動力學參數 實施例32 胃腸外給藥途徑
如下所述制備具有以下組成的肺部/吸入或鼻腔給藥用液體制劑。

在優化pH值時，將已稱重的11聚體肽溶于一部分水中。將Captisol加入到藥物溶液中，攪拌約5分鐘。加入NaOH和HCl調整pH值至所需值(介于5-8)。加入純凈水，使終體積達到1ml。在調pH值之前，可視需要加入其它無活性成分，例如防腐劑、抗氧化劑、緩沖鹽類和助溶劑。加水至所需目標體積。

可以細噴霧的形式，利用注射器微量噴霧器(syringemicrosprayer)或空氣噴射或超音霧化器，將上述溶液制劑給予肺部。可利用計量鼻腔噴霧泵或注射器微量噴霧器，將上述溶液劑給予鼻腔。

如下所述制備具有以下組成的肺部/吸入或鼻腔給藥用干粉制劑。

在

混合器中，將已稱重的11聚體肽(優選質量中位數空氣動力學直徑(MMAD)小于5微米)與吸入級的乳糖30-100μm(Respitose，DMV International)混合5分鐘。可通過粉末吹入器或干粉吸入器，將上述干粉混合物遞送至肺部。

如下所述制備具有以下組成的肺部/吸入或鼻腔給藥用混懸制劑。

將微粒化的11聚體肽均勻懸浮于卵磷脂和拋射氣體，例如氫氟碳化合物(HFA)的混合物中。將懸浮液移至加壓計量給藥的吸入器中。
大鼠從溶液制劑吸收11聚體肽
將11聚體肽的溶液劑(同上)給予經腹膜內注射戊巴比妥而麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠。利用注射器微量噴霧器，將藥物導入氣管，評估肺部遞送，或者對于鼻內遞送而言，用吸移管滴入每個鼻孔內。在4小時之內，采集插有導管的頸動脈的血樣，收集到經肝素處理的真空采血管(vaccutainer)內。將血樣離心，分離血漿貯存在-80℃，直到進行LC/MS分析為止。根據血漿-時間濃度曲線得出藥代動力學參數，報告見附表。每種給藥途徑用3只大鼠。數據用平均值±標準差來表示，并報告Tmax的中位值。
用途和聯合藥物 A.用途
本文所述的主題提供了新的11聚體肽，其具有優越特性并作為GLP-1受體調節劑，例如使得這類11聚體肽具有GLP-1受體的激動劑活性。此外，與GLP-1天然序列相比，本文所述的11聚體肽顯示出對蛋白酶剪切的穩定性增加。

因此，可將本文所述的化合物給予哺乳動物，優選人，用于治療各種疾病和障礙，包括但不限于治療或延遲以下疾病的發展或發作糖尿病(優選II型糖尿病、葡萄糖耐量異常、胰島素抵抗和糖尿病并發癥，如腎病、視網膜病、神經病和白內障)、高血糖癥、高胰島素血癥、高膽固醇血癥、血中游離脂肪酸或甘油水平升高、高血脂癥、高甘油三酯血癥、肥胖癥、傷口愈合、組織局部缺血、動脈粥樣硬化、高血壓、愛滋病(AIDS)、腸道疾病(如壞死性腸炎、微絨毛包含體疾病(microvillus inclusion disease)或乳糜瀉)、炎性腸道綜合征、化療引起的腸黏膜萎縮或損傷、神經性厭食癥、骨質疏松癥、代謝障礙綜合征，以及炎性腸病(例如節段性回腸炎(Crohn’s disease)和潰瘍性結腸炎)。本文所述的化合物也可用于提高血中的高密度脂蛋白(HDL)水平。

另外，統稱為“X綜合征(Syndrome X)”或代謝綜合征的病癥和疾病(詳見Johannsson J.Clin.Endocrinol.Metab.，82，727-34(1997))，可用本文所述的化合物進行治療。
B.聯合藥物
本文所述并要求保護的主題包括藥物組合物，包含作為活性成分的治療有效量的至少一種式I化合物，單獨或與藥物載體或稀釋劑聯用。任選本文所述的化合物可單獨使用，或與其它本文所述的化合物聯用，或與一或多種其它治療藥聯用，例如抗糖尿病藥或其它藥學活性物質。

本文所述的化合物，可與其它CLP-1受體調節劑(例如激動劑或部分激動劑，如肽激動劑)或其它用來治療上述疾病的合適治療藥聯用，所述治療藥包括抗糖尿病藥；抗高血糖藥；降血脂藥；抗肥胖癥藥(包括食欲抑制藥/調節藥)；和抗高血壓藥。另外，本文所述的化合物也可與一或多種下列治療藥聯用不孕癥藥、治療多囊卵巢綜合征的藥物、治療生長障礙的藥物、治療虛弱的藥物、治療關節炎的藥物、在移植時預防同種移植排斥的藥物、治療自體免疫疾病的藥物、抗AIDS藥、抗骨質疏松藥、治療免疫調節性疾病的藥物、抗血栓藥、治療心血管疾病的藥物、抗生素藥物、抗精神病藥、治療慢性炎性腸病或綜合征的藥物，和/或治療神經性厭食癥的藥物。

適合與本文所述的化合物聯用的抗糖尿病藥的實例包括雙胍類(例如二甲雙胍或苯乙雙胍)、糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖或米格列醇)、胰島素(包括胰島素促分泌素或胰島素增敏劑)、美格列奈(例如瑞格列奈)、磺酰脲類(例如格列美脲、格列本脲、格列齊特、氯磺丙脲和格列吡嗪)、雙胍/格列本脲組合(例如

)、噻唑烷二酮類(例如曲格列酮、羅格列酮和吡格列酮)、PPAR-α激動劑、PPAR-γ激動劑、PPARα/γ雙重激動劑、糖原磷酸化酶抑制劑、脂肪酸結合蛋白(aP2)抑制劑、DPP-IV抑制劑和SGLT2抑制劑。

其它合適噻唑烷二酮類包括Mitsubishi公司的MCC-555(公開于美國專利5,594,016)、Glaxo-Wellcome公司的GL-262570、恩格列酮(CP-68722，Pfizer)或達格列酮(CP-86325，Pfizer)、伊格列酮(isaglitazone)(MIT/J&J)、JTT-501(JPNT/P&U)、L-895645(Merck)、R-119702(Sankyo/WL)、NN-2344(Dr.Reddy/NN)或YM-440(Yamanouchi)。

合適PPARα/γ雙重激動劑包括莫格他唑(Bristol-MyersSquibb)、AR-H039242(Astra/Zeneca)、GW-409544(Glaxo-Wellcome)、KRP297(Kyorin Merck)，以及以下文獻中公開的那些PPARα/γ雙重激動劑Murakami等”A Novel Insulin Sensitizer Acts Asa Coligand for Peroxisome Proliferation-Actived Receptor Alpha(PPARalpha)and PPAR gamma.Effect on PPAR alpha Activation on AbnormalLipid Metabolism in Liver of Zucker Fatty Rats(新的胰島素增敏劑作為過氧化物酶體增殖一激活受體α(PPARα)和PPARγ的輔配體)。PPARα激活作用對Zucker肥胖大鼠肝臟中脂質代謝異常的影響)”，Diabetes47，1841-1847(1998)，以及于2000年9月18日申請的美國專利申請順序號09/644,598中公開的那些激動劑，所述文獻的公開內容通過引用結合到本文中，使用其中提出的劑量，其中指定為優選的化合物優選用于本文中。

合適aP2抑制劑包括以下文獻中公開的那些aP2抑制劑1999年9月7日申請的美國專利申請順序號09/391,053、2000年3月6日申請的美國專利申請川頁序號09/519,079，使用其中所給出的劑量。

與本文所述的化合物聯用的合適DPP4抑制劑包括在以下文獻中公開的那些DPP4抑制劑WO 99/38501、WO 99/46272、WO 99/67279(PROBIODRUG)、WO 99/67278(PROBIODRUG)、WO99/61431(PROBIODRUG)，以及NVP-DPP728A(1-[[[2-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯烷)(Novartis)(由Hughes等，Biochemistry，38(36)，11597-11603，1999公開)、LAF237、saxagliptin、MK0431、TSL-225(色氨酰-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸)(由Yamada等，Bioorg.&Med.Chem.Lett.8(1998)1537-1540公開)、2-氰基pyrrolidides和4-氰基pyrrolidides(由Ashworth等，Bioorg.&Med.Chem.Lett.，第6卷，第22期，第1163-1166和2745-2748頁(1996)公開)，使用在以上參考文獻中給出的劑量。

合適的美格列奈包括那格列奈(Novartis)或KAD1229(PF/Kissei)。

與本文所述GLP-1受體調節劑(例如激動劑或部分激動劑)聯用的其它合適胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)化合物的實例，包括GLP-1(1-36)酰胺、GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)(公開于Habener的美國專利5,614,492)，以及AC2993(胰島淀粉樣多肽)、LY-315902(Lilly)和NN2211(Novo Nordisk)。

與本文所述的化合物聯用的合適降血脂藥的實例包括一或多種MTP抑制劑、HMG CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成酶抑制劑、貝酸衍生物、ACAT抑制劑、脂氧合酶抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、回腸Na+/膽汁酸共同轉運蛋白抑制劑、LDL受體活性上調劑、膽汁酸多價螯合劑、膽固醇酯轉移蛋白抑制劑(例如CP-529414(Pfizer))和/或煙酸及其衍生物。

可如上所述使用的MTP抑制劑包括在以下文獻中公開的那些MTP抑制劑美國專利5,595,872、美國專利5,739,135、美國專利5,712,279、美國專利5,760,246、美國專利5,827,875、美國專利5,885,983和美國專利5,962,440，所述文獻全都通過引用結合到本文中。

可與一種或多種式I化合物聯用的HMG CoA還原酶抑制劑包括美伐他汀和相關化合物(公開于美國專利3,983,140)，洛伐他汀和相關化合物(公開于美國專利4,231,938)，普伐他汀和相關化合物(公開于美國專利4,346,227)，辛伐他汀和相關化合物(公開于美國專利4,448,784和4,450,171)。可用于本文的其它HMG CoA還原酶抑制劑包括但不限于氟伐他汀(公開于美國專利5,354,772)，西立伐他汀(公開于美國專利5,006,530和5,177,080)，阿托伐他汀(公開于美國專利4,681,893、5,273,995、5,385,929和5,686,104)，阿塔伐他汀(atavastatin)(Nissan/Sankyo的尼伐他汀(NK-104))(公開于美國專利5,011,930)，菲沙他汀(Shionogi-Astra/Zeneca(ZD-4522))(公開于美國專利5,260,440)以及相關他汀化合物(公開于美國專利5,753,675)，甲基二羥戊酸內酯(mevalonolactone)衍生物的吡唑類似物(公開于美國專利4,613,610)，甲基二羥戊酸內酯衍生物的茚類似物(公開于PCT申請WO 86/03488)，6-[2-(取代吡咯-1-基)-烷基)吡喃-2-酮及其衍生物(公開于美國專利4,647,576)，Searle公司的SC-45355(3-取代戊烷二酸衍生物)二氯乙酸鹽，甲基二羥戊酸內酯的咪唑類似物(公開于PCT申請WO 86/07054)，3-羧基-2-羥基-丙烷-膦酸衍生物(公開于法國專利2,596,393)，2，3-二取代吡咯、呋喃和噻吩衍生物(公開于歐洲專利申請0221025)，甲基二羥戊酸內酯的萘基類似物(公開于美國專利4,686,237)，八氫化萘(例如公開于美國專利4,499,289)，洛伐他汀的酮類似物(公開于歐洲專利申請0142146A2)，以及喹啉和吡啶衍生物(公開于美國專利5,506,219和5,691,322)。

所需降血脂藥是普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、阿塔伐他汀和ZD-4522。

另外，用于抑制HMG CoA還原酶的次膦酸化合物，例如公開于GB 2205837中的那些化合物，也適用于與本文所述的化合物聯用。

適于本文使用的角鯊烯合成酶抑制劑包括但不限于α-膦酰基-磺酸鹽(公開于美國專利5,712,396)，由Biller等，J.Med.Chem.，1988，第31卷，第10期，第1869-1871頁公開的那些角鯊烯合成酶抑制劑，包括類異戊二烯(氧膦基-甲基)膦酸鹽，以及其它已知角鯊烯合成酶抑制劑(例如公開于美國專利4,871,721和4,924,024，以及Biller，S.A.，Neuenschwander，K.，Ponpipom，M.M.和Poulter，C.D.，Current Pharmaceutical Design，2，1-40(1996))。

另外，適于本文使用的其它角鯊烯合成酶抑制劑包括萜類焦磷酸鹽(公開于P.Ortiz de Montellano等，J.Med.Chem.，1977，20，243-249)，二磷酸法呢酯類似物A和前角鯊烯焦磷酸鹽(PSQ-PP)類似物(公開于Corey和Volante，J.Am.Chem.Soc.，1976，98，1291-1293)，氧膦基膦酸鹽(有關報道參見McClard，R.W.等，J.A.C.S.，1987，109，5544)，以及環丙烷(有關報道參見Capson，T.L.，PhD dissertation，June，1987，Dept.Med.Chem.U of Utah，摘要，Table of Contents，第16，17，40-43，48-51頁，綜述)。

可與一種或多種式I化合物聯用的貝酸衍生物包括非諾貝特、吉非貝齊、氯貝丁酯、苯扎貝特、環丙貝特、克利貝特等、普羅布考和相關化合物(公開于美國專利3,674,836，普羅布考和吉非貝齊是優選的)、膽汁酸多價螯合劑(例如考來烯胺)、考來替泊和DEAE-Sephadex(


)，以及利波特比(lipostabil)(Rhone-Poulenc)、Eisai E-5050(N-取代的乙醇胺衍生物)、伊馬昔爾(HOE-402)、賽尼可(tetrahydrolipstatin)(THL)、依斯替磷酸膽堿(istigmastanylphos-phorylcholine)(SPC，Roche)、氨基環糊精(TanabeSeiyoku)、Ajinomoto AJ-814(薁衍生物)、亞油甲芐胺(Sumitomo)、Sandoz 58-035、American Cyanamid CL-227,082和CL-283,546(二取代的脲衍生物)、煙酸、阿西莫司、阿昔呋喃、新霉素、對氨基水楊酸、阿司匹林、聚(二烯丙基甲胺)衍生物(例如公開于美國專利4,759,923)、季銨聚(氯化二烯丙基二甲基銨)和紫羅烯類(例如公開于美國專利4,027,009)，以及其它已知降低血清膽固醇的藥物。

可與一種或多種式I化合物聯用的ACAT抑制劑包括以下文獻中公開的那些ACAT抑制劑Drugs of the Future 24，9-15(1999)，(阿伐麥布)；″The ACAT inhibitor，C1-1011 is effective in theprevention and regression of aortic fatty streak area in hamsters(ACAT抑制劑C1-1011在倉鼠中有效預防主動脈脂紋消退并使主動脈脂紋消退)″，Nicolosi等，Atherosclerosis(Shannon，Irel).(1998)，137(1)，77-85；″The pharmacological profile of FCE 27677a novel ACAT inhibitor withpotent hypolipidemic activity mediated by selective suppression of thehepatic secretion of ApoB 100-containing lipoprotein(FCE 27677的藥理學特性具有強效降血脂活性的新型ACAT抑制劑，通過選擇性抑制肝分泌含有ApoB100的脂蛋白來介導)″，Ghiselli，Giancarlo，Cardiovasc.Drug Rev.(1998)，16(1)，16-30；″RP73163a bioavailablealkylsulfinyl-diphenylimidazole ACAT inhibitor(RP 73163生物可利用的烷基亞磺酰基-二苯基咪唑ACAT抑制劑)″，Smith，C.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1996)，6(1)，47-50；″ACAT inhibitorsphysiologicmechanisms for hypolipidemic and anti-atherosclerotic activities inexperiment animals(ACAT抑制劑在實驗動物中降低血脂和抗動脈粥樣硬化活性的生理學機制)″，Krause等編著Ruffolo，Robert R.，Jr.；Hollinger，Mannfred A.，InflammationMediators Pathways(1995)，173-98，出版商CRC，Boca Raton，Fla.；″ACAT inhibitorspotentialanti-atherosclerotic agents(ACAT抑制劑潛在的抗動脈粥樣硬化藥)″，Sliskovic等，Curr.Med.Chem.(1994)，1(3)，204-25；″Inhibitors ofacyl-CoAcholesterol O-acyl transferase(ACAT)as hypocholesterolemicagents.6.The first water-soluble ACAT inhibitor with lipid regulatingactivity.Inhibitors of acyl-CoAcholesterol acyltransferase(ACAT).7.Development of a series of substitutedN-phenyl-N′-[(1-phenylcyclopentyl)methyl]urea with enhancedhypocholesterolemic activity(酰基-CoA抑制劑膽固醇O-酰基轉移酶(ACAT)作為降血膽固醇藥。6.具有調節血脂活性的第一種水溶性ACAT抑制劑。酰基-CoA抑制劑膽固醇酰基轉移酶(ACAT)。7.一系列具有降血膽固醇活性提高的取代N-苯基-N′-[(1-苯基環戊基)甲基]脲的開發)″，Stout等，ChemtractsOrg.Chem.(1995)，8(6)，359-62或TS-962(Taisho Pharmaceutical Co.Ltd)。

降血脂藥可以是LD2受體活性的上調劑，例如MD-700(Taisho Pharmaceutical Co.Ltd)和LY295427(Eli Lilly)。

適合與本文所述化合物聯用的膽固醇吸收抑制劑的實例包括SCH48461(Schering-Plough)，以及在以下文獻中公開的那些實例Atherosclerosis 115，45-63(1995)和J.Med.Chem.41，973(1998)。

適合與本文所述化合物聯用的回腸Na+/膽汁酸共同轉運蛋白抑制劑的實例包括在Drugs of the Future，24，425-430(1999)中公開的化合物。

可與一種或多種式I化合物聯用的脂氧合酶抑制劑包括15-脂氧合酶(15-LO)抑制劑(例如苯并咪唑衍生物，公開于WO97/12615)，15-LO抑制劑(公開于WO 97/12613)，異噻唑酮(公開于WO 96/38144)，以及15-LO抑制劑(公開于Sendobry等，″Attenuationof diet-induced atherosclerosis in rabbits with a highly selective15-lipoxygenase inhibitor lacking significant antioxidant properties(利用缺乏明顯抗氧化活性的高選擇性15-脂肪氧合酶抑制劑，來減少兔子因膳食引起的動脈粥樣硬化)″，Brit.J.Pharmacology(1997)120，1199-1206，和Cornicelli等，″15-Lipoxygenase and its InhibitionANovel Therapeutic Target for Vascular Disease(15-脂氧合酶及其抑制作用血管疾病的新治療靶標)″，Current Pharmaceutical Design，1999，5，11-20)。

適合與本文所述化合物聯用的抗高血壓藥的實例包括β腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑(L型和T型；例如地爾硫

、維拉帕米、硝苯地平、氨氯地平和買比福迪(mybefradil))、利尿劑(例如氯噻嗪、氫氯噻嗪、氟甲噻嗪、氫氟噻嗪、芐氟噻嗪、甲氯噻嗪(methylchlorothiazide)、三氯噻嗪(trichloromethiazide)、泊利噻嗪、芐噻嗪、依他尼酸(ethacrynic acid)、三苦納芬(tricrynafen)、氯噻酮、呋塞米、沐索里麥(musolimine)、布美他尼、氨苯蝶啶、阿米洛利、螺內酯)、腎素抑制劑、ACE抑制劑(例如卡托普利、佐芬普利、福辛普利、依那普利、西羅普利、西拉普利、地拉普利、噴托普利、喹那普利、雷米普利、賴諾普利)、AT-1受體拮抗劑(例如氯沙坦、厄貝沙坦、纈沙坦)、ET受體拮抗劑(例如西他生坦(sitaxsentan)、阿佐生坦(atrsentan)、以及美國專利5,612,359和6,043,265中公開的化合物)、雙重ET/AII拮抗劑(例如在WO 00/01389中公開的化合物)、中性內肽酶(NEP)抑制劑、血管肽酶(vasopepsidase)抑制劑(雙重NEP-ACE抑制劑)(例如奧馬曲拉和吉馬曲拉(gemopatrilat))，以及硝酸鹽類。

適合與本文所述化合物聯用的抗肥胖癥藥的實例包括NPY受體拮抗劑、NPY-Y2或NPY-Y4受體激動劑、胃泌酸調節肽、MCH拮抗劑、GHSR拮抗劑、CRH拮抗劑、β3腎上腺素能激動劑、脂肪酶抑制劑、5-羥色胺(和多巴胺)重攝取抑制劑、甲狀腺受體β藥物、CB-1拮抗劑和/或食欲抑制藥。

可任選與本文所述化合物聯用的β3腎上腺素能激動劑包括AJ9677(Takeda/Dainippon)、L750355(Merck)或CP331648(Pfizer)，或其它已知β3激動劑，例如公開于以下文獻的β3激動劑美國專利5,541,204、5,770,615、5,491,134、5,776,983和5,488,064，優選AJ9677、L750,355和CP331648。

可任選與本文所述化合物聯用的脂肪酶抑制劑的實例包括奧利司他或ATL-962(Alizyme)，優選奧利司他。

可任選與式I化合物聯用的5-羥色胺(和多巴胺)重攝取抑制劑可以是西布曲明、托吡酯(Johnson&Johnson)或阿索開(Regeneron)，優選西布曲明和托吡酯。

可任選與本文所述化合物聯用的甲狀腺受體β化合物的實例包括甲狀腺受體配體，例如公開于以下文獻中的那些配體WO97/21993(U.Cal SF)、WO 99/00353(KaroBio)和WO 00/039077(KaroBio)，優選KaroBio申請的化合物。

可任選與本文所述化合物聯用的CB-1拮抗劑的實例包括CB-1拮抗劑和利莫那班(SR141716A)。

NPY-Y2和NPY-Y4受體激動劑的實例分別包括PYY(3-36)和胰多肽(PP)。

可任選與本文所述化合物聯用的食欲抑制藥包括右苯丙胺、芬特明、苯丙醇胺或馬吲哚，優選右苯丙胺。

合適的抗精神病藥的實例包括氯氮平、氟哌啶醇、奧氮平

、百憂解

和阿立哌唑

上述專利和專利申請都通過引用結合到本文中。

上述其它治療藥當與本文所述化合物聯用時，可按例如Physician′s Desk Reference所指示的用量來使用，按照以上專利所提出的用量來使用，或者由本領域普通技術人員另行確定。
劑量和制劑
可將合適的式I的11聚體肽，單用與可接受的載體混合，以藥物制劑形式給予患者，以治療糖尿病和其它相關疾病。糖尿病治療領域技術人員可容易地確定將化合物給予需要這類治療的哺乳動物(包括人)的劑量和途徑。給藥途徑可包括但不限于口服、口腔內、直腸、經皮、口腔含化、鼻內、肺部、皮下、肌內、皮內、舌下、結腸內、眼內、靜脈內或腸道給藥。按照給藥途徑，根據可接受的藥學實踐來配制化合物(Fingl等，載于″The Pharmacological Basis ofTherapeutics″，第1章，第1頁，1975；″Remington′s PharmaceuticalSciences″，第18版，Mack Publishing Co，Easton，PA，1990)。

本文所述的藥學上可接受的11聚體肽組合物可以多種劑型來給藥，如片劑、膠囊劑(分別包括持續釋放或定時釋放制劑)、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、原位凝膠劑、微球體、結晶復合物、脂質體、微乳劑、酊劑、混懸劑、糖漿劑、氣溶膠噴霧劑和乳劑。本文所述的組合物也可經口服、靜脈內(推注或輸注)、腹膜內、皮下、經皮或肌內的形式給藥，全都采用藥學領域普通技術人員所熟知的劑型。可單獨給予組合物，但通常與藥用載體一起給予，該載體根據所選給藥途徑和標準藥學實踐來選擇。

本文所述組合物的給藥方案，當然會因已知因素而異，所述因素例如具體藥物的藥代動力學特征及其給藥方式和途徑；接受者的物種、年齡、性別、健康狀況、醫療狀況和體重；癥狀的性質和程度；同時治療的種類；治療頻率；給藥途徑、患者的肝腎功能，以及所需效果。醫師或獸醫可作出決定并開具預防、對抗或阻止疾病狀態發展所需的有效量的藥物。

就一般性指導而言，當用于指定作用時，活性成分的每日口服劑量范圍約為0.001-1000mg/kg體重，優選每天約0.01-100mg/kg體重，而最優選約0.6-20mg/kg/天。當用于指定作用時，對于靜脈內給藥，在以恒定速率輸液期間，活性成分的每日劑量范圍大約為0.001-100.0ng/min/Kg體重。這類恒定靜脈內輸液的優選給予速率可以是0.01-50ng/min/Kg體重，最優選0.01-10.0ng/min/Kg體重。可以單次日用量給予本文所述的組合物，或可以每天兩、三或四次的分次劑量給予總日用量。本文所述的組合物也可通過緩釋型制劑來給予，這將會視需要在幾天/周/月內持續釋放藥物。

可以鼻內形式、通過局部使用合適鼻內溶媒，或通過經皮途徑、使用經皮皮膚貼劑，給予本文所述的組合物。當用經皮遞送系統的形式給藥時，在給藥方案中劑量的給予當然將會是連續而非間斷的。

組合物通常與合適藥用稀釋劑、賦形劑或載體(本文統稱藥用載體)制成混合物來給予，所述藥用載體是對于所需給藥形式而適當選出的并且符合常規藥學實踐，給藥形式即口服片劑、膠囊劑、酏劑、有或無拋射劑的氣溶膠噴霧劑和糖漿劑。

例如，對于片劑或膠囊劑形式的口服給藥，可將活性藥物成分與口服無毒的藥學上可接受的惰性載體混合，例如但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸鈣、硫酸鈣、甘露醇和山梨醇；對于液體形式的口服給藥，可將口服藥成分與任何口服無毒的藥學上可接受的惰性載體混合，例如但不限于乙醇、甘油和水。此外，在需要或必要時，也可將合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入混合物中。合適的粘合劑包括但不限于淀粉、明膠、天然糖類(例如但不限于葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑)、天然和合成樹膠(如阿拉伯膠、西黃蓍膠或藻酸鈉)、羧甲基纖維素、聚乙二醇和蠟。這些劑型中所用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉和氯化鈉。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、皂土和黃原膠。

本文所述的組合物也可與混合膠束或脂質體遞送系統的形式來給予，所述遞送系統例如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。可由各種磷脂類(例如膽固醇、硬脂胺或磷酯酰膽堿)制成脂質體。可加入滲透增強劑，以提高藥物的吸收。

因為已經知道前體藥物提高藥物的許多所需性質(即溶解度、生物利用度、制備等)，所以可以前體藥物的形式遞送本文所述化合物。因此，本文所述主題包括本文要求保護的化合物的前體藥物、其遞送方法以及含有它們的組合物。

本文所述的組合物也可與作為可靶向的藥物載體的可溶性聚合物偶聯。這類聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羥乙基天冬酰胺苯酚、或被棕櫚酰基殘基取代的聚環氧乙烷-聚賴氨酸。此外，本文所述的組合物也可與一類生物可降解的聚合物混合，用于達到控制釋放藥物目的，所述聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacylates)、以及水凝膠的交聯或兩親嵌段共聚物。

適合給藥的劑型(藥物組合物)的每一劑量單位可含有約0.01毫克至約500毫克的活性成分。在這些藥物組合物中，活性成分含量通常占組合物總重量的約0.5-95％(重量)。

明膠膠囊劑可含有活性成分和粉末狀載體，如乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂和硬脂酸。類似稀釋劑可用于制備壓制片劑。片劑和膠囊劑都可制備成持續釋放產品的形式，以便在數小時期間連續釋放藥物。壓制片劑可以包糖衣或薄膜衣，以便掩蓋任何令人不快的味道，并阻止片劑接觸空氣，或者為了選擇性地在胃腸道內崩解而包腸溶衣。

口服給藥的液體劑型可含有著色劑和矯味劑，以便增加患者的接受度。

一般而言，水、合適的油、鹽水、含水右旋糖(葡萄糖)和相關糖溶液、以及二醇類(例如丙二醇或聚乙二醇)都是用于胃腸外溶液劑的合適載體。胃腸外給藥的溶液劑優選含有活性成分的水溶性鹽、合適穩定劑，必要時含有緩沖物質。抗氧化劑(例如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸)，無論單用還是聯用，都是合適的穩定劑。也使用檸檬酸及其鹽類和EDTA鈉。此外，胃腸外溶液劑也可含有防腐劑，如苯扎氯銨、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯和氯丁醇。

合適的藥物載體可參見該領域的標準參考教科書Remington“The Science amd Practice of Pharmacy”，第19版，MackPublishing Company，1995。

給予本文所述化合物的代表性的有用藥物劑型舉例說明如下 膠囊劑
用100毫克粉末狀活性成分、150毫克乳糖、50毫克纖維素和6毫克硬脂酸鎂填裝標準兩節式硬質明膠膠囊，來制備大量的單位膠囊劑。
軟質明膠膠囊劑
可制備活性成分與食用油(例如大豆油、棉子油或橄欖油)的混合物，并通過容積式泵將其注入明膠內，制成含有100毫克活性成分的軟質明膠膠囊。膠囊應經洗滌并干燥。
片劑
可通過常規方法制備片劑，使得劑量單位為例如100毫克活性成分、0.2毫克膠態二氧化硅、5毫克硬脂酸鎂、275毫克微晶纖維素、11毫克淀粉和98.8毫克乳糖。可采用適當包衣，增加適口性或延遲釋放。
注射劑
本文所述的11聚體肽組合物的注射用制劑可能需要或不需要使用賦形劑，例如已由管理部門批準的賦形劑。這些賦形劑包括但不限于溶劑和助溶劑、增溶劑、乳化劑或增稠劑、螯合劑、抗氧化劑和還原劑、抗微生物防腐劑、緩沖劑和pH調節劑、填充劑、防護劑和張力調節劑，以及特殊添加劑。注射用制劑必須是無菌、無熱原的，并且就溶液劑而言不含顆粒性物質。

例如，將1.5％(重量)的活性成分在藥學上可接受的緩沖劑(可以含有或不含助溶劑或其它賦形劑)中攪拌，可以制備適于注射用藥的胃腸外組合物。應當用氯化鈉使溶液劑成為等滲溶液，然后進行滅菌。
混懸劑
可制備口服和/或胃腸外給藥用的水性混懸劑，使得例如每5ml含有100mg細微活性成分、20mg羧甲基纖維素鈉、5mg苯甲酸鈉、含1.0g山梨醇溶液(美國藥典)和0.025ml香草醛或其它適口的矯味劑。
生物可降解的微粒
例如，通過將合適的生物可降解的聚合物溶于溶劑中，向該聚合物溶液中加入待摻入的活性藥物，并從基質中除去溶劑，因而形成活性藥物分布在整個基質中的聚合物基質，來制備適于注射給藥用的持續釋放的胃腸外組合物。

根據以上所述內容，對本文所述并要求保護的主題進行的許多修改和變化都是可能的。因此可以理解，在所附權利要求書范圍之內，可以實施權利要求書中記載而非本文中具體描述的主題。

權利要求書中記載的主題并不受到具體實施方案描述范圍的限制，這些具體實施方案僅僅是要求保護主題的單一實施方案。根據以上描述和附圖，除了本文所示和所述之外的功能等同的方法和組份，對于本領域技術人員來說是顯而易見的。這類修改將會落入所附權利要求書范圍之內。本文所引用的所有參考文獻全都通過引用結合到本文中。
權利要求
1. 一種分離的多肽，包含下式I的序列
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11
式I
其中，
Xaa1為天然或非天然存在的氨基酸，包含咪唑環或噻唑環，例如組氨酸或噻唑基丙氨酸；其中所述氨基酸的任何碳原子任選被氫或一個或多個烷基、或一個或多個鹵素取代；其中所述氨基酸的游離氨基可被羥基取代或者可任選被以下基團取代氫、烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基、甲氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基；
并且其中Xaa1的氨基任選不存在，使得Xaa1是組氨酸或噻唑基丙氨酸的脫氨基酸，其中任何碳原子任選被烷基、鹵素或羥基取代；
Xaa2為天然或非天然存在的氨基酸，選自α-氨基-異丁酸(Aib)；(L)-丙氨酸、D-丙氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、(L)-脯氨酸、(S)-α-甲基-脯氨酸[α-Me-Pro]、(L)-氮雜環丁烷(Azt)、(S)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)、(L)-纈氨酸、(R)-異纈氨酸和(S)-異纈氨酸，并且其中所述氨基酸的碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代；
Xaa3為天然或非天然存在的氨基酸，包含含有羧酸的氨基酸側鏈，例如天冬氨酸或谷氨酸；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代；
Xaa4為甘氨酸；
Xaa5為天然或非天然存在的氨基酸，選自(L)-蘇氨酸、(L)-別蘇氨酸、(L)-絲氨酸、(L)-正纈氨酸、(L)-正亮氨酸；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代；
Xaa6為天然或非天然存在的氨基酸，包含二取代的α-碳；其中所述氨基酸的側鏈之一含有芳環或雜芳環，例如α-甲基-苯丙氨酸、α-甲基-2-氟苯丙氨酸和α-甲基-2，6-二氟苯丙氨酸，其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基取代；并且其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個鹵素取代；
Xaa7為天然或非天然存在的氨基酸，包含被羥基取代的氨基酸側鏈，例如L-蘇氨酸或L-別蘇氨酸；其中所述氨基酸的任何碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代；
Xaa8為天然或非天然存在的氨基酸，選自L-絲氨酸、L-組氨酸和L-天冬酰胺；其中所述氨基酸的一個或多個碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代；
Xaa9為天然或非天然存在的氨基酸，包含含有羧酸的氨基酸側鏈，例如L-天冬氨酸或L-谷氨酸；其中所述氨基酸的一個或多個碳原子任選被一個或多個烷基或鹵素取代；
Xaa10為下式II、III或IV的天然或非天然存在的氨基酸；
式II 式III
式IV
其中R3、R4和R6各自選自氫、烷基、甲基、乙基、芳基、雜環基、雜芳基、鹵素、羥基、羥基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、甲氧基、芳氧基、甲酰胺、取代甲酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基和芳基磺酰基；
和
其中X1、X2、X3、X4和X5各自為C或N，前提條件是X1、X2、X3、X4和X5中的至少一個為N；
Xaa11為下式IIa、IIIa或IVa的天然或非天然存在的氨基酸；
式IIa式IIIa
式IVa
其中所述氨基酸的C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)；
其中R1和R2各自為烷基或芳烷基；
其中R3a、R4a和R6a各自選自氫、烷基、芳基、雜環基、雜芳基、鹵素、羥基、羥基烷基、氰基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、甲氧基、芳氧基、甲酰胺、取代甲酰胺、烷基酯、芳基酯、烷基磺酰基和芳基磺酰基；
其中R7選自氫、甲基和乙基；
其中X1、X2、X3、X4和X5各自為C或N，前提條件是X1、X2、X3、X4和X5中的至少一個為N；和
其中當Xaa10為式II氨基酸時，Xaa11不為式IIa氨基酸。
2. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸。
3. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa10為式III的天然或非天然存在的氨基酸。
4. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸。
5. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa1選自L-His、D-His、L-N-甲基-His、D-N-甲基-His、L-4-噻唑基Ala、D-4-噻唑基Ala、脫氨基-His、脫氨基-噻唑基Ala、3-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙酰基、(S)-3-(1H-咪唑-4-基)-2-羥基丙酰基(L-β-咪唑乳酰基)；和
其中如果存在末端氨基，則所述末端氨基任選被以下基團取代氫、烷基、二烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基、甲氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基。
6. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa2選自L-Ala、D-Ala、N-甲基-L-Ala、N-甲基-D-Ala、L-Pro、(S)-α-甲基-L-Pro(α-Me-Pro)、(L)-氮雜環丁烷(Azt)、(S)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)和α-氨基異丁酸(Aib)。
7. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa3選自L-Glu、L-Asp和L-Gla。
8. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa4為Gly。
9. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa5選自L-Thr、L-Nle、L-Nva、L-Aoc和L-別Thr。
10. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa6選自L-α-Me-Phe、L-α-Et-Phe、L-α-Me-2-氟-Phe、L-α-Me-3-氟-Phe、L-α-Me-2，3-二氟-Phe、L-α-Me-2，6-二氟-Phe和L-α-Me-Phe(五氟)。
11. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa7為L-Thr或L-別蘇氨酸。
12. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa8選自L-Ser、L-His和L-Asn。
13. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa9為L-Asp。
14. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸，進一步用下式VI定義
其中，R3選自烷基和鹵素；和
R6選自羥基和甲氧基。
15. 權利要求2的分離的多肽，其中所述式II的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)-苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-乙氧基-2’-乙基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-乙氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸；4-[(3’，4’-二甲氧基)苯基]苯丙氨酸；和4-[(2’-乙基-4’-羥基)-苯基]苯丙氨酸。
16. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸，進一步用下式VIa定義
式VIa
其中，R3a選自甲基、乙基和氟；而且其中R7選自氫和甲基。
17. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸，進一步用下式VIIa定義
式VIIa
其中R3a為甲氧基；和
R7選自氫和甲基。
18. 權利要求3的分離的多肽，其中所述式III的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]-4-苯丙氨酸；4-[2’-(6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(3’，5’-二甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(2’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；和4-[3’-(6’-甲基)吡啶基)苯丙氨酸。
19. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa10為所述式IV的天然或非天然存在的氨基酸。
20. 權利要求19的分離的多肽，其中所述式IV的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸和4-[(2’-乙基-4’-羥基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸。
21. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa11為所述式IIa的天然或非天然存在的氨基酸。
22. 權利要求21的分離的多肽，其中所述式IIa的天然或非天然存在的氨基酸選自4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-氟苯基)苯丙氨酸；4-(2’-氯苯基)苯丙氨酸；4-[(3’，4’-二甲氧基)苯基]苯丙氨酸；和4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸；
其中所述氨基酸的C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)，其中R1和R2各自為烷基或芳烷基；
其中R7選自氫和甲基。
23. 權利要求1的分離的多肽，其中所述Xaa11為所述式IIIa的天然或非天然存在的氨基酸。
24. 權利要求23的分離的多肽，其中所述式IIIa的天然或非天然存在的氨基酸選自4-[(6’-甲基)-2’-吡啶基]苯丙氨酸；4-[(6’-甲基)-3’-吡啶基]苯丙氨酸；4-[(6’-乙基)-2’-吡啶基)]苯丙氨酸；和4-[(6’-乙基)-3’-吡啶基)]苯丙氨酸；
其中所述氨基酸的C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)，其中R1和R2各自為烷基或芳烷基；
其中R7選自氫和甲基。
25. 權利要求4的分離的多肽，其中所述式IVa的天然或非天然存在的氨基酸選自4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-氟苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(4’-三氟甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；和4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸。
26. 權利要求1的分離的多肽，其中
Xaa1為選自以下的氨基酸L-His、D-His、L-N-甲基-His、D-N-甲基-His、L-α-甲基-His、D-α-甲基-His、L-4-噻唑基丙氨酸、D-4-噻唑基丙氨酸、脫氨基-His、脫氨基-噻唑基丙氨酸、3-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙酰基、(S)-3-(1H-咪唑-4-基)-2-羥基丙酰基(L-β-咪唑乳酰基)；
其中如果存在末端氨基，則所述末端氨基任選被以下基團取代氫、烷基、酰基、苯甲酰基、烷氧基羰基例如甲氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、雜環氧基羰基、雜芳基烷氧基羰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、芳烷基氨基甲酰基、雜環基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、雜芳烷基磺酰基或雜芳基磺酰基；
Xaa2為選自以下的氨基酸L-Ala、D-Ala、N-甲基-L-Ala、N-甲基-D-Ala、L-Pro、(S)-α-甲基-脯氨酸[α-Me-Pro]、(L)-氮雜環丁烷(Azt)、(S)-α-甲基-氮雜環丁烷(α-Me-Azt)和氨基異丁酸(Aib)；
Xaa3為選自L-Glu、L-Asp和L-Gla的氨基酸；
Xaa4為選自Gly的氨基酸；
Xaa5為選自以下的氨基酸L-Thr、L-Nle、L-Nva、L-Aoc和L-別Thr；
Xaa6為選自以下的氨基酸L-α-Me-Phe、L-α-Et-Phe、L-α-Me-2-氟-Phe、L-α-Me-3-氟-Phe、L-α-Me-2，3-二氟-Phe、L-α-Me-2，6-二氟-Phe和L-α-Me-Phe(五氟)；
Xaa7為選自L-Thr和L-別蘇氨酸的氨基酸；
Xaa8為選自L-Ser、L-His和L-Asn的氨基酸；
Xaa9為L-Asp；
Xaa10為選自式II、III和IV氨基酸的天然或非天然存在的氨基酸；
其中式II為選自以下的氨基酸4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)苯基]苯丙氨酸；4-[(2’-乙基-4’-羥基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-乙氧基-2’-乙基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-[(4’-乙氧基-2’-甲基)苯基]苯丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)苯丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)苯丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸；和4-[(3’，4’-二甲氧基)苯基]苯丙氨酸；
其中式III為選自以下的氨基酸4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]-4-苯丙氨酸；4-[2’-(6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(3’，5’-二甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[2’-(4’-甲氧基-6’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(4’-甲氧基-6’-甲基)吡啶基]苯丙氨酸；4-[3’-(2’-乙基)吡啶基]苯丙氨酸；和4-[3’-(6’-甲基)吡啶基)苯丙氨酸；
其中式IV為選自以下的氨基酸4-[(4’-甲氧基-2’-乙基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-[(4’-甲氧基-2’-甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；和4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；
和
Xaa11為選自式IIa、IIIa和IVa氨基酸的天然或非天然存在的氨基酸；
其中式IIa為選自以下的氨基酸4’-(2-甲基苯基)苯丙氨酸；4’-(2’-氟苯基)苯丙氨酸；和4-[(3’，5’-二甲基)苯基]苯丙氨酸；
其中式IIIa為選自以下的氨基酸4-(6’-甲基-2’-吡啶基)苯丙氨酸；4-(6’-甲基-2’-吡啶基)苯丙氨酸；4-(6’-乙基-2’-吡啶基)苯丙氨酸；和4-(6’-乙基-3’-吡啶基)苯丙氨酸；
其中式IVa為選自以下的氨基酸4-(2’-甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；4-(2’-氟苯基-3-吡啶基丙氨酸；4-[(3’，5’-二甲基)苯基]-3-吡啶基丙氨酸；4-(4’-三氟甲基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；和4-(2’-乙基苯基)-3-吡啶基丙氨酸；
其中所述C端羰基碳與氮連接構成甲酰胺(NH2)、烷基甲酰胺(NHR1)或二烷基甲酰胺(NR1R2)，其中R1和R2各自為烷基或芳烷基；
其中R7選自氫和甲基，和
其中當Xaa10為式II氨基酸時，Xaa11不為式IIa氨基酸。
27.權利要求1的分離的多肽，選自
28. 一種分離的多肽，選自
29. 權利要求1的分離的多肽，選自
30. 權利要求1的分離的多肽，其中所述分離的多肽是
31. 一種分離的多肽，其中所述分離的多肽是
32. 一種藥物組合物，所述組合物包含式I的分離的多肽及其藥學上可接受的載體。
33. 一種聯合藥物，所述聯合藥物包含式I的分離的多肽和至少一種選自以下的治療藥抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、抗高血壓藥、抗動脈粥樣硬化藥和降血脂藥。
34. 權利要求33的聯合藥物，其中所述抗糖尿病藥為至少一種選自以下的藥物雙胍、磺酰脲、葡萄糖苷酶抑制劑、PPARγ激動劑、PPARα/γ雙重激動劑、aP2抑制劑、DPP4抑制劑、胰島素增敏劑、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰島素和美格列奈。
35. 權利要求34的聯合藥物，其中所述抗糖尿病藥為至少一種選自以下的藥物二甲雙胍、格列本脲、格列美脲、格列派瑞、格列吡嗪、氯磺丙脲、格列齊特、阿卡波糖、米格列醇、吡格列酮、曲格列酮、羅格列酮、胰島素、法格立他扎、伊格列酮、雷格利特、貝拉格列酮、CAS RN335149-08-1、(Z)-1，4-雙{4-[(3，5-二氧代-1，2，4-噁二唑烷-2-基)甲基]苯氧基}丁-2-烯、里福格列酮、雷法葛倫、瑞格列奈、那格列奈、(S)-2-芐基-4-氧代-4-(順-全氫異吲哚-2-基)丁酸鈣鹽、特沙格利、L-苯丙氨酸、N-[(1Z)-1-甲基-3-氧代-3-苯基-1-丙烯基]-4-[3-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)丙基]、苯甲酰胺、5-[(2，4-二氧代-5-噻唑烷基)甲基]-2-甲氧基-N-[[4-(三氟甲基)苯基]甲基]、依蘭納泰、8-37-胰高血糖素樣肽I(人)、N-[3-(1H-咪唑-4-基)-1-氧代丙基]-26-L-精氨酸-34-[N6-(1-氧代辛基)-L-賴氨酸]、8-36-胰高血糖素相關肽1(灌叢八齒鼠(octodon degus))、N-[3-(1H-咪唑-4-基)-1-氧代丙基]-26-L-精氨酸-34-[N6-(1-氧代辛基)-L-賴氨酸]-36a和賽紅霉素。
36. 權利要求33的聯合藥物，其中所述抗肥胖癥藥為至少一種選自以下的藥物β3腎上腺素能激動劑、脂肪酶抑制劑、5-羥色胺重攝取抑制劑、多巴胺重攝取抑制劑、5-羥色胺和多巴胺重攝取抑制劑、甲狀腺受體β化合物和食欲抑制藥。
37. 權利要求36的聯合藥物，其中所述抗肥胖癥藥為至少一種選自以下的藥物奧利司他、舍列斯特、雷法布艮、N-[4-[2-[[(2S)-3-[(6-氨基-3-吡啶基)氧基]-2-羥基丙基]氨基]乙基]苯基]-4-(1-甲基乙基)苯磺酰胺、(S)-N-[4-[2-[[3-[(6-氨基-3-吡啶基)氧基]-2-羥基丙基]氨基]乙基]苯基]-4-(1-甲基乙基)-苯磺酰胺CAS RN335149-25-2、西布曲明、托吡酯、阿索開、右苯丙胺、芬特明、苯丙醇胺和馬吲哚。
38. 權利要求33的聯合藥物，其中所述降血脂藥為至少一種選自以下的藥物MTP抑制劑、膽固醇酯轉移蛋白、HMG CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成酶抑制劑、貝酸衍生物、LDL受體活性上調劑、脂氧合酶抑制劑或ACAT抑制劑。
39. 權利要求38的聯合藥物，其中所述降血脂藥為至少一種選自以下的藥物普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、尼伐他汀、菲沙他汀、非諾貝特、吉非貝齊、氯貝丁酯、阿伐麥布、N-[2，6-雙(1-甲基乙基)苯基]-2-(十四烷基硫代)-乙酰胺、3-(13-羥基-10-氧代十四烷基)-5，7-二甲氧基-1(3H)-異苯并呋喃酮、托切普和/或(3α，4α，5α)-4-(2-丙烯基膽甾烷-3-醇)。
40. 一種治療或延遲以下疾病的發展或發作的方法糖尿病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病性腎病、傷口愈合、胰島素抵抗、高血糖癥、高胰島素血癥、X綜合征、糖尿病并發癥、血中游離脂肪酸或甘油水平升高、高血脂癥、肥胖癥、高甘油三酯血癥、動脈粥樣硬化或高血壓；所述方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的式I的分離的多肽。
41. 權利要求40的治療或延遲方法，所述方法還包括同時或序貫給予治療有效量的一種或多種選自以下的治療藥抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、抗高血壓藥和抗動脈粥樣硬化藥和降血脂藥。
42. 一種治療或延遲以下疾病的發展或發作的方法糖尿病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病性腎病、傷口愈合、胰島素抵抗、高血糖癥、高胰島素血癥、X綜合征、糖尿病并發癥、血中游離脂肪酸或甘油水平升高、高血脂癥、肥胖癥、高甘油三酯血癥、動脈粥樣硬化或高血壓；所述方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的權利要求34-40中任一項的聯合藥物。
43. 一種包含下列結構的化合物
其中，P為氫或芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(t-Boc)；而其中R3a選自甲基、乙基和氟；并且其中R7選自氫和甲基。
44. 一種包含下列結構的化合物
其中P為氫或芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(t-Boc)；而其中R3a為甲氧基；并且其中R7選自氫和甲基。
45. 權利要求1的分離的多肽，其中
Xaa1為L-組氨酸，其中Xaa1的氨基是未取代的；
Xaa2選自下列基團
Xaa3為L-谷氨酸或L-組氨酸；
Xaa4為甘氨酸；
Xaa5為L-蘇氨酸；
Xaa6選自下列基團
Xaa7為L-蘇氨酸；
Xaa8選自下列基團
Xaa9為L-天冬氨酸；
Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式II的天然或非天然存在的氨基酸選自
其中Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式IVa的天然或非天然存在的氨基酸選自
R1和R7選自氫和甲基。
46. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa1選自
Xaa2選自
Xaa3為L-谷氨酸或L-組氨酸；Xaa4為甘氨酸；Xaa5為L-蘇氨酸；
Xaa6選自
Xaa7為L-蘇氨酸；Xaa8選自
Xaa9為L-天冬氨酸；
Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式II的天然或非天然存在的氨基酸選自
并且其中Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式IVa的天然或非天然存在的氨基酸選自
并且其中R1和R7選自氫和甲基。
47. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa1為
R8選自
Xaa2選自
Xaa3為L-谷氨酸或L-組氨酸；
Xaa4為甘氨酸；
Xaa5為L-蘇氨酸；
Xaa6選自
Xaa7為L-蘇氨酸；
Xaa8選自
Xaa9為L-天冬氨酸；
Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式II的天然或非天然存在的氨基酸選自
Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式IVa的天然或非天然存在的氨基酸選自
并且其中R1和R7選自氫和甲基。
48. 權利要求1的分離的多肽，其中Xaa1為下列α-羥酸
Xaa2選自
Xaa3為L-谷氨酸或L-組氨酸；
Xaa4為甘氨酸；
Xaa5為L-蘇氨酸；
Xaa6選自
Xaa7為L-蘇氨酸；
Xaa8選自
Xaa9為L-天冬氨酸；
Xaa10為式II的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式II的天然或非天然存在的氨基酸選自
Xaa11為式IVa的天然或非天然存在的氨基酸，其中所述式IVa的天然或非天然存在的氨基酸選自
并且其中R1和R7選自氫和甲基。
全文摘要
本文所述主題提供具有類似于或優于天然GLP-1肽的生物活性的新的人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體調節劑，因而可用于治療或預防GLP活性相關疾病或障礙。所述化合物包括經化學修飾的肽，其不僅刺激II型糖尿病的胰島素分泌，而且還產生其它有益促胰島素反應。這些合成肽GLP-1受體調節劑表現出對蛋白酶剪切的穩定性增加，使其成為用于口服或胃腸外給藥的理想候選治療藥。所公開并要求保護的肽在糖尿病功效模型中顯示出良好藥代動力學特性和良好潛力。
文檔編號C07K7/06GK101282991SQ200680026958
公開日2008年10月8日 申請日期2006年5月26日 優先權日2005年5月26日
發明者W·R·艾文, C·瑪沛里, D·J·雷辛格, V·G·李, R·B·索斯基, 朱怡恒 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司