生物材料及其用途的制作方法

專利名稱：生物材料及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及重編程分化細胞或細胞的細胞核和重編程的細胞或細 胞的細胞核的用途。特別的，本發明公開了重編程分化細胞來生產胚 胎干細胞樣細胞的方法。
背景技術：
胚胎干細胞是能產生在它起源的生物體內的任何其他細胞類型的 多潛能干細胞。多潛能細胞具有發育成能依次形成每一種機體器官的 全部細胞的所有三類胚胎組織層的能力，并被用來描述能形成機體內 任何和所有細胞及組織的干細胞。這同具有分化成胚外膜和組織、胚 胎和所有胚后組織和器官的能力的全能細胞精細地不同。分化細胞是組成生物體機體組織的細胞，并且，在正常體內情況 下，通常被認為其發育潛能是受到限制的。分化細胞可能會是末端分 化的，即，它們在發育上被阻止為特定的細胞類型(例如，神經元、 肌肉細胞和骨細胞)，或它們可能會保留產生有限數目的在特定譜系內 的其他細胞類型(例如，能產生包括嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和 中性白細胞的許多種免疫細胞的骨髓祖細胞)。哺乳動物，和特別是人類，胚胎干細胞提供了治療和/或預防許多 人類疾病或病態的可能性。特別地，胚胎干細胞提供了產生大范圍人 類細胞類型的方法，這樣的細胞具有巨大的治療價值。然而，當前在 大多數發達國家，在圍繞獲得和使用哺乳動物尤其是人類胚胎干細胞 的方面存在倫理上和實踐上的問題。胚胎干細胞通常起源于胚胎內稱作內細胞團(ICM)的多潛能細 胞群，該群是完整生物體起源的細胞群。ICM在發育的早期出現，典 型地是在受精后三到五天，這依賴于所討論的物種。通過使用克隆操 作，有可能從給定物種的任何個體來生產胚胎。典型地，在當前的克 隆操作中，哺乳動物分化細胞的細胞核被以稱為核移植的程序轉移入去核的通常來源于同一物種的哺乳動物卵母細胞(Campbdl et al., 2005， Reprod Dom Anim 40:256-268 )。已知核移植是難于操作的并且成功率低(Campbell et al., 2005, Reprod Dom Anim 40:256-268)。當成功時，移植的細胞核DNA被受體 卵母細胞重編程，通過模擬受精效應，所述卵母細胞然后能被刺激來 形成胚胎。通常，所述卵母細胞被刺激進入有絲分裂，并且在桑椹胚或胚泡 期被移植入'收養'母親的子宮。該操作具有非常低的成功率并且僅 能生產非常少的有活力的胚胎。在胚胎形成的那些例子中，所述ICM 可能被分離來提供能用在其他應用中的胚胎干細胞。當這種操作被應用于人類或哺乳動物胚胎時，它被稱作治療性克 隆，但它有實踐上和倫理上必須考慮的事。在實踐方面，獲得胚胎干 細胞需要來源于雌性動物的卵細胞的捐獻，在實踐中該卵細胞被局限 為哺乳動物卵細胞，并且這些卵細胞的回收是昂貴的并且從一個雌性 動物中僅能獲得非常少的卵細胞。在倫理方面并且尤其是在與人類有 關時，對在另一個過程中作為中間產物的胚胎的生產，例如在治療性 克隆中生產的胚胎僅作為胚胎干細胞的供體存在廣泛的拒絕。因此，存在研制能用在治療性過程且在沒有克隆程序下并且尤其 是在沒有使用哺乳動物卵母細胞的情況下獲得多潛能、.胚胎干細胞樣 細胞來簡單生產提供胚胎干細胞的胚胎的需求。通過用分化細胞從克隆實驗生產有活力的能繁殖的動物，之前已 經將分化細胞的細胞核成功地向多潛能狀態重編程(Wilmut et al (1997) Nature 385:810-813; Polejaeva et al (2000) Nature 407:86-90)。這些操作 具有非常低的效率和成功率。在這些操作中，分化細胞核被通過核移 植移入去核哺乳動物卵母細胞中并暴露到哺乳動物卵母細胞中的因子 中而重編程到多潛能，所述的因子重新活化細胞核中的基因，并通過 胚胎的產生給予所述細胞多潛能。在這些例子中，所有的操作均在使 用來源于同目的細胞相同物種的物質的情況下進行。細胞中的多潛能可能會通過尋找大量標記基因的表達而被鑒定。 在人中，這些基因包括POU5Fl(編碼轉錄因子Oct-4)、NANOG、Rex-l、 Sox-2和Tert (Ginis et al" 2004 Dev Biol 269:Pages 360-380)。技術熟練人員將從上下文理解其中的POU5 (Oct-4)和NANOG或被提及的任何其他基因或蛋白而不管它是不是被討論的基因或基因產物。Oct-4是通常在包括胚胎干細胞的多潛能細胞中發現和表達的轉 錄因子，但它在正常分化細胞中不表達。Oct-4的活化是同被重編程向 相似于多潛能性狀態的細胞一致的。Oct-4的實驗消除導致胚胎中ICM 的徹底缺失，和繼續分化成原始外胚層的胚胎干細胞未分化表型的喪 失(Nichols et al (1998) Cell. 95:379-391 )。Nanog是也能在多潛能細胞中發現的另一種轉錄因子。在nanog 表達缺少的情況下，胚胎干細胞喪失了它們的多潛能性(Chambers (2004) Cloning Stem Cells 6:386-391 )。存在對生產胚胎干細胞或相似于胚胎干細胞的細胞(所謂的胚胎 干細胞樣細胞)而沒有產生完整胚胎以克服干細胞領域實踐上和倫理 上必須要考慮的事情的方法的需求。因此，本發明以稱為重編程的程 序提供更改例如來源于哺乳動物分化細胞的分化細胞和/或它們的細胞 核的發育潛能到同胚胎干細胞多潛能狀態相似的更多潛能的狀態的方 法。發明內容在本發明的第一方面，提供了生產重編程細胞或重編程細胞的細胞 核的方法，該方法包含暴露分化細胞或分化細胞的細胞核到起源于冷 血脊椎動物卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎的細胞或細胞抽提物，其中的冷血脊椎動物具有一個或多個如下性質(i) 包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在魚中的從位于后部的髖骨延伸而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構(bodyplan);(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(iii) 卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽 提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。優選地，卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或細胞抽提 物表達高度保守形式的Oct-4和nanog。可選地，所述方法能被描述為重編程分化細胞來表達nanog和/或表 達Oct-4和/或是多潛能的方法，所述方法包含暴露分化細胞到冷血脊 椎動物的卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎、或其抽提物，其 中的冷血脊椎動物具有一個或多個下述性質(i) 包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在魚中的從位于后部的 髖骨延伸而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構。(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(iii) 卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽 提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。優選地，卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或細胞抽提 物表達高度保守形式的Oct-4和nanog。進一歩可選地，所述方法能被描述為本發明提供生產胚胎干細胞樣 細胞的方法，或生產重編程的細胞的細胞核的方法，該方法包含將分 化細胞或分化細胞的細胞核同冷血脊椎動物的卵母細胞、卵細胞、卵 巢細胞或早期胚胎、或其抽提物接觸，其中的冷血脊椎動物具有一個或多個下述性質(i) 原始脊椎動物基本結構；'(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(iii) 表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog的卵 母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞。重編程細胞是已經去除或改變其正常分化功能的細胞。重編程細胞 的細胞核是其正常分化功能已經被去除或改變的細胞核。分化細胞是已經發育成具有特定功能的特定細胞類型的細胞，例如 神經細胞或肌肉細胞。這些細胞在正常情況下通常不能發育成其他細 胞類型。在本發明的上下文，重分化細胞是已經是一種特定細胞類型 并且通過使用本發明的方法已經被處理來形成干細胞并隨后再一次轉 化成分化細胞的細胞。重分化細胞可能會是同它最初分化類型相同或 不同類型的細胞。原始基本結構通過考慮屬于生物體骨骼結構的兩個特定標準的一個或兩個能確 定生物體是否具有原始脊椎動物基本結構。第一個標準涉及肋骨結構， 第二個標準涉及髖骨。原始魚和原始兩棲動物具有相似的骨骼結構， 該骨骼結構同帶有所謂的"派生的"骨骼(無尾動物(蛙)骨骼；硬 骨魚骨骼)的生物體的骨骼結構顯著對比。諸如肺魚或蠑螈的具有原始脊椎動物基本結構的生物體具有從脊 骨橫向放射的肋骨。這是引起哺乳動物肋架的脊椎動物骨骼的原始情 況。通過同諸如具有派生基本結構的硬骨魚的生物體對比，該類生物 體的肋骨是背腹放射而不是橫向放射。這個不同使得具有原始脊椎動 物基本結構的魚同那些沒有該基本結構的魚區別開來。作為考慮肋骨的其它選擇，具有原始脊椎動物基本結構的生物體也 能通過考慮髖骨而被鑒定。在原始魚中，骨盤附件從骨骼后部區域中 的髖骨擴展而來。在硬骨魚骨骼中，髖骨在靠近或鄰近肩帶甚至是同 肩帶融合的非常靠前的、在大約魚體的中途點或甚至是那個點的前面、 靠近頭的定位盆鰭的位置中發現。被蠑螈(美西螈)所例證的原始兩 棲動物骨骼保留了連到骨骼后部區域的髖骨。相對照的蛙類具有高度 派生和擴大的骨盆帶。此外，蛙類具有大大降低的數目的在骨盆帶前 的椎骨。圖5圖解了魚和兩棲動物中原始脊椎動物基本結構的保留。原始魚 和原始兩棲動物間的骨骼結構的相似性能被清楚地看到，因為在同派 生骨骼的結構相比較的結構中能清楚看到不同。該圖比較了代表原始 脊椎動物基本結構的肺魚骨骼和代表派生的脊椎動物基本結構典型的 硬骨魚骨骼。也比較了蠑螈(美西螈)和蛙(光滑非洲蟾蜍)的骨骼。肺魚骨骼以背面圖顯示(從背的方向看)。重要地，硬骨魚顯示了 側面圖，圖示了背腹向的脊髓投射/肋骨放射，而不是橫向的。兩棲動 物骨骼也是背面圖。在魚骨骼圖中，小箭頭指向在肺魚中從脊髓橫向 投射的骨頭/肋骨。這是產生肋廓的脊椎動物骨骼的原始情況。請注意， 硬骨魚肋骨腹側投射，而不是橫向投射。這是硬骨魚的革新。支持魚 鰭的背部和腹部投射也是硬骨魚的革新。原始魚保留了進化成具有四 肢的陸生的四腳動物四肢的四肢。重要地，大箭頭指向原始魚和原始 兩棲動物中的髖骨。這是定義原始魚的一個特點，因為在硬骨魚中該髖骨消失。原始脊椎動物基本結構在Johnson a a/(2003) Evolution and Development 5:4, 414-431中被更詳細地討論。如被原腸胚形成運動所定義的，鱘魚、海龜、肺魚和哺乳動物全都 分享了相似的胚胎學。因此，原始脊椎動物基本結構能被鑒定，例如，在X-射線上通過肋 骨和/或脊髓投射的橫向和非背腹向投射。可選的骨骼鑒定是魚中的髖 骨。沒有胚質的生殖細胞在雌性動物中，生殖細胞是指卵母細胞或發育成卵母細胞的前體細胞。當在卵巢中時，卵母細胞定義雌性動物生殖細胞，在排卵后，卵細 胞定義雌性動物的生殖細胞。胚質是在卵細胞、卵母細胞或某些生物體胚胎中發現的含有將產生 生殖細胞譜系的決定子的胞質區域。在沒有胚質的動物中，這些同樣 的分子被分布到整個卵細胞胞質中，也可能到GV (胚泡)中。這些諸 如"amw、 vma和t/az/基因產物的分子是典型的RNA結合蛋白，或編 碼這些分子的信使RNAs，因為這些分子在胚胎干細胞中被發現，因此 它們可能涉及到多能性重編程過程中。具認為，在具有胚質的生物體 中，這些分子被局部化，因此它們在卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或 早期胚胎、或其抽提物中是低豐度和相對不能獲得的，這樣，使具有 胚質的生物體不適于重編程分化細胞。優選地，與本發明有關，具有原始脊椎動物基本結構的冷血脊椎動 物也具有不含胚質的卵母細胞/卵細胞(生殖細胞)。胚質的存在與否可 能解釋了某些生物體如何發育。的確，通過觀察生物體的基本結構， 預測在該生物體內的卵母細胞/卵將是否具有胚質是可能的。特別的， 定義軀干后部末端的后肢是關鍵性的。在缺少胚質時，生殖細胞起源 于在大約被髖骨定義的脊骨部位的后外側中胚層，它們被形成來適應 被排除到這個胚胎后部區域的胞外信號。這些細胞稍后發育成卵母細 胞。在存在胚質時，生殖細胞在更靠前的位置發育并且產生的生物體具有相對靠前的成體形態。具有胚質的生物體的卵母細胞、卵細胞、 卵巢細胞和早期胚胎同那些不具有胚質的相比，其細胞和細胞核重編 程效率更低。展示了原始脊椎動物基本結構的生物體被理解為在它們的生殖細 胞中不具有胚質。原始脊椎動物基本結構的保留被認為是缺少胚質的 后果。為了鑒定那些卵母細胞/卵含有胚質的動物，定義軀干后外側的后肢 是關鍵的。在缺少胚質時，生殖細胞起源于在大約被髖骨定義的脊骨 位置的后側中胚層。其卵含有胚質的動物不需要被生產生殖細胞所需 的胞外后部信號，因為這些細胞被卵提供的物質所特定化，而不是被 從胞外信號而來的物質所特定化。因此，在具有胚質的諸如蛙類和硬 骨魚的絕大多數動物中，這些動物具有相對靠前的成體形態。這些動 物的卵母細胞和卵在重編程中沒有用處。已經顯示，曾經被認為是哺乳動物的革新的哺乳動物中胚質的缺少 在物種的特定譜系中己經是保守的，這些譜系保留了作為在動物的這 個譜系中原始脊椎動物基本結構保留的結果的原始胚胎學特征。在胚 胎保留了原始特征并保留了原始成年脊椎動物形態的哺乳動物和冷血 脊椎動物物種的胚胎中，稱為PGCS的產生生殖系(精子和卵細胞)的 干細胞起源于在發育早期出現的多潛能前體。然而，在大多數實驗中， 諸如非洲蟾蜍或斑馬魚(硬骨魚)生物體的非哺乳動物的PGCs通過與 哺乳動物完全不同的機理形成，并且，等同于哺乳動物的那些多潛能 前體的等效物從未形成。在非洲蟾蜍和斑馬魚中，生殖細胞通過含有 生殖細胞決定子的胚質的不相稱分布在非常早的時候就與體細胞分離開來。遺傳了胚質的細胞然后變成PGCs而不產生體細胞。圖7圖示了大量不同生物體的卵母細胞中胚質的分布。在非洲蟾蜍 卵母細胞中編碼XJaz/和XcW2的RNAs被顯示，編碼va a的RNA在 肺魚卵母細胞中顯示。編碼d。z/和vasa的RNA為鱘魚卵母細胞而顯 示。卵母細胞切片同對這些分子特異的探針反應，并且這些探針通過 使用堿性磷酸酶結合的抗體和顏色檢測的標準方法進行檢測。Xdazl 和Xcat2 RNAs局限于胞質內，指示了胚質。肺魚卵母細胞中的Vasa RNA和鱘魚卵母細胞中的vasa和dazl RNA是均勻分布的，指示了胚乂貝口、J跳，。現在認為，在哺乳動物中產生PGCs的機理在某些更低級的動物中 也存在，但僅在那些符合特定標準的物種中。這些物種能在它們基本 結構的基礎上被鑒定。符合這些標準的物種，例如美西螈，具有同哺 乳動物中的PGC發育相似的PGC發育，和例如編碼Oct-4和nanog的 基因的控制生殖細胞發育的基因的補足物，并因此能重編程分化細胞， 特別是哺乳動物分化細胞。因此可能能準確預測，符合前面提及的標 準的某些物種的卵母細胞將具有同美西螈相等的重編程潛能。不符合 這些標準的物種將不具有相同的保守的多潛能基因的補足物，因此， 將不具有相等的重編程能力。符合所述標準的物種具有被認為是胚質 缺少的結果的原始脊椎動物基本結構。重要地，因為在缺少胚質時， Oct-4和nanog是生產PGCs所需的，因此Oct-4和nanog的保留被認 為是不具有胚質的結果。成體是它們的胚胎學的產物。由于胚胎學是保守的，因此，成體基 本結構是保守的。強迫胚胎的、阻止在蛙類和硬骨魚中所見的主要改 變的機理是生產生殖細胞的機理。在不具有胚質的動物中，PGCs具有 更微弱的存在，假如它們的生產所需的信號被改變，它們能被消除， 并將在胚胎細胞運動中發生主要改變。假如胚質存在，PGCs對這些信 號的改變是抗拒的，因為無論如何它們都形成。這樣，在胚胎上的強 迫被消散、胚胎學的細胞運動發生改變，這是為什么具有胚質的動物 能具有同它們的原始基本結構不同的形態的原因。沒有胚質這個現象 不會發生。如被原腸胚形成運動所定義的，鱘魚、海龜、肺魚和哺乳 動物均分享了相似的胚胎學。Oct-4禾口/或nanog的表達優選地，保留原始脊椎動物基本結構的冷血脊椎動物也具有表達 Oct-4和nanog的卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞。Oct-4禾n/或Nanog表達可能會通過測定編碼所述蛋白的mRNA或測 定蛋白產物本身進行測定。進行該測定方法的例子包括測定mRNA的 RT-PCR法(Makin d a/, technique 2 p295-301 (1990))或測定蛋白產物的抗體法。為了使在卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞中的Oct-4 和/或nanog被認為是高度保守的，其必須同人轉錄因子Oct-4或人 nanog蛋白的DNA結合區域(DBD)分別有至少69%的氨基酸同一性。 對于美西螈Oct-4蛋白AxOct-4，它的73%的氨基酸同小鼠Oct-4 DBD 同一，75%的氨基酸同人0ct-4 DBD同源。來源于斑馬魚和非洲蟾蜍 的被基因ZP0U-2和XLPOU91編碼的不分別給予重編程分化細胞所述 能力的最接近的蛋白是63%同一的，少于所需的69%同一性。功能等 效的Oct-4基因的同一性和活性能通過使用諸如實施例中公開的那些 技術人員熟悉的標準方法進行檢測。優選地，在人0ct-4 DBD和冷血脊椎動物間提起的氨基酸同一性允 許不改變氨基酸殘基極性或電荷的氨基酸保守改變。保守改變的例子 是本領域技術人員所熟知的，并且包括，例如， 一個諸如異亮氨酸、 纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的疏水氨基酸殘基取代為另一個疏水氨基 酸，或諸如精氨酸取代賴氨酸的一個極性氨基酸取代為另一個極性氨 基酸。優選地，當測定兩個蛋白序列間的氨基酸同一性時，保守氨基 酸改變被考慮為相同的氨基酸。因此，氨基酸序列中的保守氨基酸改 變將不影響兩條氨基酸序列間的氨基酸同源性百分比。為了進一步支持對上面討論的內容的理解，編碼各種物種的Oct-4 的基因被比較，那些分享經過鑒定為相似的形態特征的物種比缺少該 形態特征的物種被顯示出具有更緊密相關的0ct-4編碼基因。在這些實 驗中，0ct-4編碼基因從滿足原始形態學描述的標準的水螈 (Notopthalmus viridens)、 f每灣魚尋魚(Asciperser oxyrhynchus)、非洲月市 魚(Protopterus annectans)和紅耳紅腹擬龜(一種海龜，T.scripta)分 離而來。在圖6中，從這些物種分離的Oct-4編碼相關基因的DNA序 列被同從其他物種分離的屬于公共數據庫一部分的最緊密相關的基因 序列相比較，設計來追蹤Oct-4編碼基因進化歷史的假設系統樹被圖 示。在正常條件下，基因序列進化追蹤了動物的進化親緣關系(即物 種種類史)。因此，由于在蠑螈亞目(美西螈和水螈)和蛙科(非洲蟾 蜍、蟾蜍、中國林蛙)間更近的從共同的兩棲動物祖先的分枝，它們 的相關基因的任何序列將被期望是比它們將會是從諸如魚、爬行動物或哺乳動物等其他進化上更遠的物種而來的等效基因序列更相似的。 與諸如哺乳動物和兩棲動物等更高級的物種相比，所有的魚均保存了 相同的必然性(logic)。然而，同傳統的系統發育預測相比較，在圖6 中的分析顯示，蠑螈亞目(即美西螈)、水螈、鱘魚、肺魚和海龜的每 一種均含有同小鼠和人Oct-4基因高度相關的基因，同義基因在它們最 緊密相關的姐妹群，即蛙類、斑馬魚等中沒有發現。在圖6中顯示的基因序列關系對科學共同體(scientific community)不是顯然的，將不 會在任何傳統進化的觀點上被預測到。美西螈(蠑螈亞目物種v4mZ ，toma 廳:dc(3/7畫)白勺Oct-4基因同喃 乳動物Oct-4基因的相關度比在所述數據庫中包括的來源于非洲蟾蜍 的與Oct-4相關的幾個基因的任何其他基因同哺乳動物Oct-4基因的相 關度更高，并能拯救ES細胞，在某些情況下，諸如XLPOU91，比美 西螈Oct-4基因更好(Morrison and Brickman， 2006)。(圖8顯示了美 西螈和小鼠序列的比較)。這個結果暗示，Axoct-4基因是哺乳動物Oct-4 基因的真正的同源物(即通過祖先和功能相關的基因)(這個結論也被 表達譜所支持(Bachvarova ef (2004) Developmental Dynamics 231:871-880)。從祖先Oct-4序列的復制而來的非洲蟾蜍基因數目越高， 就越同Axoct-4和隨后的機理亞功能化相似(Prince and Pickett, 2002; NatRev. Genet.: 3; 827-37)。這個結果暗示，美西螈卵母細胞同哺乳動 物卵母細胞的生化相似性比與不含真正的同源Oct-4的非洲蟾蜍卵母 細胞的生化相似性更高。在哺乳動物中，Oct-4是生產PGCs所必需的。在非洲蟾蜍中不是這 樣，這意味著任何Oct-4同義基因不是哺乳動物Oct-4的真正同源物。 美西螈Oct-4和表達譜機理的同源性現在暗示，Oct-4是生產PGCs所 必需的。這個觀察可能會促成理解為什么美西螈卵母細胞具有比非洲 蟾蜍卵母細胞更高的重編程分化細胞到多潛能的能力，在重編程能力 方面，美西螈卵母細胞表現更像哺乳動物卵母細胞。同時，因為胚質 的缺少也使這些卵母細胞/卵同哺乳動物更相似，因此，與非洲蟾蜍相 比，這一點可能也被涉及到美西螈優良的重編程能力。胚質的缺少可 能會允許諸如Nanos、 vasa和dazl等與胚質相關的全是RNA結合蛋白 的其他因子變得更易于重編程。已經證明，美西螈具有比蛙類Oct-4基因與哺乳動物Oct-4基因更 緊密相關的Oct-4基因，據理解，其他具有與哺乳動物Oct-4基因更緊 密相關的Oct-4基因的生物體也將能重編程哺乳動物分化細胞。同時， Axoct-4的表達譜是同早期哺乳動物胚胎的表達譜等效的。這樣，鱘魚 和肺魚、其他的蠑螈和"原始魚"將全具有同美西螈相當并遠超非洲 蟾蜍、其他蛙類或硬骨魚的重編程能力。優選地，重編程細胞是胚胎干細胞樣細胞。術語"胚胎干細胞樣細胞"在本文中用來指已經被重編程來顯示胚 胎干細胞的性質的分化細胞或含有顯示胚胎干細胞性質的重編程分化 細胞的細胞核的細胞。在被去分化或重編程前，當同這些細胞中的相 同的參數比較時，胚胎干細胞樣細胞可能包括一個或多個但不限定于 下述性質無轉化的繁殖；持久的繁殖；自我更新和產生廣泛組織的 能力；分化成相同或不同于原始分化細胞的細胞類型的能力(多潛能)。優選地，重編程細胞和/或重編程細胞的細胞核表達Oct-4。可選地， 重編程細胞或重編程細胞的細胞核僅表達nanog。重編程細胞或重編程 細胞的細胞核也可能會是多潛能的。很方便地，根據本發明的任何方法生產的重編程細胞和/或重編程細 胞的細胞核既表達Oct-4也表達nanog和/或其它多潛能標記。其它的 多潛能標記包括Sox-2、 Rex-l和TERT。細胞是否是多潛能的能通過多潛能性質的存在進行鑒定，這些性質 能使所述細胞被刺激來分化成它起源的生物體內幾乎任何細胞類型。 多潛能細胞的分化能通過暴露多潛能細胞到祖先介質和/或某些生長因 子中而被誘導，Lanza， 2004. Handbook of Stem Cells: Embryonic/Adult and Foetal Stem Cells 。優選地，在冷血脊椎動物卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎 細胞或細胞抽提物中的Oct-4禾P/或nanog與人類形式的Oct-4和/或 nanog相比是高度保守的，通過這個現象，我們解釋在冷血脊椎動物中 的Oct-4 DNA結合區域同人轉錄因子Oct-4具有至少69%的氨基酸同 源性。優選地，對于nanog基因，同人nanog蛋白分享的類似區域的 同源性將至少是69%，最優選地，是75%。有利地，在冷血脊椎動物卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞中的Oct-4和/或nanog同人轉錄因子Oct-4或人nanog蛋白的DNA 結合區域(DBD)分別具有至少69%的氨基酸同源性。氨基酸同源性能通過使用ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucl. Acids. Res., 22 p4673-4680或任何可選的氨基酸序列比較工具進行測 算。ClustalW方法能用下述參數進行使用配對比對參數-方法精確矩陣(Matrix): PAM，間隙開放罰分(penalty) 10.00，間隙延伸 罰分(penalty): 0.10;多重比對參數-矩陣(Matrix): PAM，間隙開放罰分(penalty): 10.00， ％延遲同源性30;罰(Penalize)末端間隙開間隙分離 距離0，陰性矩陣無間隙延伸罰分(penalty): 0.20，殘基-特定間隙罰 分(penalty):開，親水間隙罰分(penalty):開，親水氨基酸殘基 GPSNDQEKR。特定氨基酸殘基的序列同源性被確定為包括被簡單衍 生化的相同氨基酸殘基。替代的參數也可能是合適的。核苷酸序列同源性也能通過使用下述參數的ClustalW (Thompson et a1.(1994))進行測定配對比對參數-方法精確，矩陣(Matrix): IUB，間隙開放罰分(penalty): 15.00，間隙延伸 罰分(penalty)- 6.66;多重比對參數-矩陣(Matrix): IUB，間隙開放罰分(penalty): 15.00， ％延遲同源性30，陰性矩陣無，間隙延伸罰分(penalty): 6.66， DNA轉換加權0.5。替代的參數也可能是合適的。優選地，編碼保守Oct-4和/或nanog的任何核苷酸序列具有同人 Oct-4和/或nanog序列(按照上面公開的實驗)或在O.l X SSC 65°C (其中的SSC=0.15 MNaCl、 0.015M檸檬酸鈉、pH7.2)的洗滌條件 下同人Oct-4禾口/或nanog序列雜交的編碼同人Oct-4禾口/或nanog功能 等效的蛋白超過69%，例如75%、 80%、 90%或95°/。的同一性。本發明的多肽既包括全長的多肽也包括多肽片段。這樣的多肽可能通過任何常規的方法制備。功能等效的蛋白或蛋白片段指的是具有同人Oct-4禾口/或nanog至少 69%序列同源性并保留同人Oct-4禾口/或nanog相同功能的蛋白或蛋白片 段。這樣的功能能通過本文公開的任何方法進行檢測。根據本發明，"核酸分子"包括單鏈和雙鏈DNA、 RNA和cDNA。 能編碼功能等效的多肽的核苷酸序列的衍生物可能會通過使用本領域 所熟知的任何常規方法而獲得。包括所有蛙類、所有硬骨魚、所有鳥類和大多數爬行類的在缺少保 守Oct-4基因的基本結構的基礎上預測的生物體的組遠大于保留了原 始基本結構的和保留了保守Oct-4基因(包括有尾兩棲動物)和編碼 nanog的同源物的基因的組。因此，只有非常小數目的物種的卵母細胞、 卵巢、卵和早期胚胎或其抽提物適用于本發明。下述譜系保留了保守 的脊椎動物基本結構蠑螈(美西螈或notopthalamus )海龜鍔魚 '盲鰻綱(Hyperotreti)(八目鰻類魚hagfish)七鰓鰻綱(Hyperoartia)(八目鰻lamprey)軟骨魚綱(Chondrichthyes)(鯊魚、魟魚、鰩、chimeras)軟骨硬鱗魚綱(Chondrostei)(硬骨魚綱bichirs、鱘魚、匙吻鱘)半椎魚目(Semionotiformes)(長嘴硬鱗魚)弓鰭魚目(Amiiformes)(弓鰭魚)肺魚亞綱(Dipnoi)(肺魚);禾口腔棘魚綱(Coelacanthimorpha)(腔棘魚)。因此，優選地，冷血脊椎動物從包含兩棲動物、爬行類動物和魚的 組中選擇。優選地，冷血脊椎動物從包含蠑螈、海龜、蜥蜴、鱷魚、盲鰻綱(八 目鰻類魚)、七鰓鰻綱(八目鰻)、軟骨魚綱(鯊魚、魟魚、鰩、chimeras)、 軟骨硬鱗魚綱(硬骨魚亞綱、鱘魚、匙吻鱘等)、半椎魚目(長嘴硬鱗 魚)、弓鰭魚目(弓鰭魚)、肺魚亞綱(肺魚)和腔棘魚綱(腔棘魚)的組中選擇。最優選地，冷血脊椎動物從包含蠑螈、海龜、肺魚和鱘魚的組中選擇。合宜地，所述冷血脊椎動物是包括美西螈和notopthalmus的蠑螈。 可替換蠑螈地，所述冷血脊椎動物是鱘魚科學上的屬Acipenser)。 一個特別的優點是，在提及的大部分生物體中，獲得卵母細胞、卵 細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或它的細胞抽提物相當簡單，并且這 些材料是豐富的。兩棲動物和硬骨魚能具有哺乳動物卵細胞體積的幾 千倍的卵，并且，在數量上遠超哺乳動物卵組織，例如鱘魚(從該魚 中獲得魚子醬)能生產其體重15-25%的卵細胞。收回的材料能被儲藏 并在需要時使用。與此相對照，哺乳動物卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞材料和/或早期 胚胎稀少且難于獲得，此外所述物質在數量上也非常受限。從光滑非洲蟾蜍或任何其它蛙類或任何硬骨魚而來的卵母細胞、卵 細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞和細胞抽提物不適用于本發明的任何 方法。蛙類和硬骨魚(都是冷血脊椎動物)是沒有保留原始基本結構 的兩棲動物和魚的例子，已知它們的卵母細胞含有胚質，并且它們的 Oct-4蛋白與人Oct-4蛋白相比不是高度保守的。優選地，卵母細胞、卵或早期胚胎細胞抽提物包含從卵母細胞、卵 或早期胚胎細胞的細胞核或胚泡(GV)而來的物質。所述細胞核和GV含有特定的轉錄因子Oct-4和Nanog。 位于蛙類sna硬骨魚胚質內的編碼生殖細胞特定RNA結合蛋白的 RNADazl、 VASA和Nanos在胞質中是均勻分布的(Johnson et al., 2001, 243:402-415; Dev，. Biol.; Bachvarova et al.， Dev.爭.231, 871-880)并能 維持具有胚質的生殖細胞中的多能型或生殖細胞專一性但都不能重編 程細胞。按照本發明的方法，暴露分化細胞到冷血脊椎動物的卵母細胞、卵 或早期胚胎或其抽提物的細胞核或胚泡可能通過注射通透化處理的分 化細胞到卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞細胞或早期胚胎細胞，或通過 將通透化處理的分化細胞同所述卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期 胚胎的抽提物進行孵育而獲得。優選地，通透化處理的分化細胞允許在卵母細胞、卵細胞、卵巢細 胞或胚胎或其抽提物中的因子進入該細胞并重編程它，優選地，卵母 細胞、卵細胞、卵巢細胞細胞或胚胎細胞的線粒體或細胞核不能進入 通透化處理的細胞，因此，沒有遺傳物質的交換。分化細胞的通透化 能通過任何諸如用Triton-X-100、洋地黃皂甙或皂角甙處理細胞等本領 域熟知的方法而獲得。優選地，在按照本發明的方法同冷血脊椎動物卵母細胞、卵細胞、 卵巢細胞或早期胚胎或其抽提物進行接觸后，通過使用本領域熟知的 技術，被重編程的細胞通過離心到顯微鏡載玻片或培養皿而回收。優選地，在本發明重編程分化細胞的細胞核的任何方法中，分化細 胞的細胞核可能會通過使用技術人員容易明白的熟知的核移植技術而 同卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎進行接觸(參見上面討論 的文獻)。這樣的技術包括注射分化細胞核到去核的卵母細胞或卵或將 分化細胞同去核的卵母細胞或卵進行融合。基于細胞的工作具有被重編程細胞完整包含在冷血脊椎動物細胞 內的優點。可選地，分化細胞的細胞核可能被同卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞 或早期胚胎的抽提物進行孵育。使用抽提物具有避免為了使卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚 胎中的因子作用于分化細胞或細胞核并導致它的重編程而注射分化細 胞或細胞核到完整卵母細胞、卵或早期胚胎所必需的操作的優點。使 用抽提物也使回收該物質變得容易并允許數千到數百萬的細胞或細胞 核被立即重編程。此外，根據本發明，冷血脊椎動物的卵母細胞、卵 細胞、卵巢細胞和早期胚胎抽提物能以巨大的量進行生產并能被儲存， 在需要時可方便取用。優選地，使用完整卵巢的抽提物。通過使用完整卵巢抽提物，不必 分離細胞組分，對冷血脊椎動物的某些物種而言，分離細胞組分是不可能的。可選地，用來抽提的原材料可能會是通過常規技術，例如0.2%膠原酶消化而從卵巢間質解放的卵母細胞。分化細胞指已經獲得分化成熟狀態的細胞。典型地，分化細胞被給 定細胞內編碼分化相關蛋白的基因的表達而給予特征。例如，神經膠質細胞中髓鞘蛋白的表達和髓鞘的形成是末端分化的神經膠質細胞的 典型例子。分化細胞不能進一步分化或僅能分化成特定細胞譜系中的 特定細胞。優選地，在本發明任何方法中使用的分化細胞是真核細胞。優選地， 分化細胞從哺乳動物獲得。最優選地，所述細胞是人類細胞。優選地，在本發明的任何方法中，分化細胞或它的細胞核在大約5"c和大約3crc間，更優選地，在大約5"c和大約2rc間被暴露到卵母 細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或其抽提物。更優選地，所 述分化細胞或細胞核在與所述卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚 胎細胞或其抽提物起源的生物體體溫一致的溫度同卵母細胞、卵細胞、 卵巢細胞或早期胚胎細胞或其抽提物接觸。如熟練人員將理解的，冷 血動物不具有它們本身自有的體溫，它們身體的溫度就是它們環境的溫度。更優選地，接觸溫度是大約18°C，或冷血脊椎動物通常居住的環境的溫度。優選地，按照本發明制備的重編程細胞的細胞核表達是多潛能標記的基因。優選地，多潛能標記基因包括編碼Oct-4和nanog的基因。假 如Oct-4啟動子的脫甲基化發生，Oct-4基因可能會用作標記。在本發明的第二方面，提供了按照本發明第一方面的方法生產的重 編程細胞。優選地，重編程細胞是胚胎干細胞樣細胞。在本發明的第三方面，提供了按照本發明第一方面的方法生產的重 編程細胞的細胞核。優選地，所述重編程細胞的細胞核可能會隨后被用在標準的己知體 細胞核移植(SCNT)技術中。根據本發明的方法，SCNT技術的效率 被通過第一重編程分化細胞的細胞核而增強。在本發明的第四個方面，提供了生產重分化細胞的方法，該方法包含(a) 生產如本發明第一方面中公開的重編程細胞；禾口(b) 重分化所述重編程細胞到相同類型或不同類型，到該重編程 細胞起源的分化細胞。優選地，通過使用祖先介質影響重分化。 一旦被產生，重編程的分 化細胞能在存在特定生長因子和其它信號分子下(祖先介質)被培養，這些因子或信號分子誘導它們分化到特定細胞類型。生產不同的細胞 類型需要不同的祖先介質。本發明的方法允許從單個個體的分化細胞中獲得多潛能的重編程 細胞，這些重編程的細胞然后能被分化成治療該病人所需要的細胞類 型。在本發明的第五方面，提供了按照本發明第四方面的方法生產的重 分化細胞。在本發明的第六方面，提供了起源于冷血脊椎動物的卵母細胞、卵 細胞、卵巢細胞或早期胚胎的分離細胞或細胞抽提物，其中的冷血脊 椎動物具有一個或多個下述性質(i) 包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或存在于魚中的從位于后 部髖骨擴展而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構；(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(iii) 卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。優選地，卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽提物表達高度保守形式的Oct-4和nanog。優選地，所述細胞和/或細胞抽提物包含來源于卵母細胞、卵或早期胚胎細胞的細胞核或胚泡(GV)的物質。在本發明的第七方面，提供了包含如在本發明第六方面定義的分離細胞或細胞抽提物的藥物組合以及藥學上可接受的載體、輔藥或稀釋劑。此外，提供了包含如在本發明第二方面定義的重編程細胞和/或如在 本發明第三方面定義的重編程細胞的細胞核或如在本發明第五方面定 義的重分化細胞，和藥學上可接受的載體、輔藥或稀釋劑的藥物組合。 合適的藥物載體、輔藥和稀釋劑和組成在實施例中被提供。按照本發明第八方面，提供了治療需要置換或更新細胞的疾病的方 法，該方法包含給予動物有效劑量的如在本發明第六方面定義的分離 細胞或細胞抽提物和/或有效量的如在本發明第二方面定義的重編程細 胞和/或如在本發明第三方面定義的重編程細胞的細胞核或如在本發明 第五方面定義的重分化細胞。按照本發明的第九方面，提供了用作藥劑的本發明第六方面定義的 分離細胞或細胞抽提物和/或如在在本發明第二面定義的重編程細胞和 /或如在本發明第三面定義的重編程細胞的細胞核和/或如在本發明第 五定義的重分化細胞。按照本發明的第十方面，提供了如在本發明第六方面定義的分離細 胞或細胞抽提物和/或如在本發明第二方面定義的重編程細胞和/或如 在本發明第三方面定義的重編程細胞的細胞核和/或如在本發明第五方 面定義的重分化細胞在用于治療需要置換或更新細胞的疾病的藥劑的 制造中的使用。在不同醫療條件下的之后的使用需要不同的細胞/組織類型。 例如，造血干細胞能用來治療遭受白血病痛苦的個體。神經祖細胞 能用來治療遭受諸如阿爾茨海默氏癥或帕金森綜合癥的神經變性失調 癥痛苦的個體。皮膚細胞在個體遭受嚴重燒傷或瘢痕化的情況下能用 作移植物。干細胞的用來產生用來移植的器官和組織的使用為糖尿病、肝病、 心臟病和自身免疫失調癥(僅列舉少量例子)提供了有希望的替代治 療。伴隨移植的主要問題是缺少供體和潛在的被移植組織同受體免疫 系統的不相容。艮P，由于受體將該移植物視為異物而產生的被移植組織的免疫排 斥。使用本發明的方法，胚胎干細胞樣細胞能起源于需要移植物的病 人并隨后被用來生產用來移植到同一病人的組織或器官。這消除了組 織不相容性和免疫排斥的任何問題。這樣，能產生多潛能胚胎干細胞 樣細胞具有巨大的治療潛能，特別是這些細胞是同病人的細胞遺傳相 同的。因此，在本發明的第八、九和十方面，所述疾病從包含神經學疾病 (帕金森病、阿爾茨海默氏癥、脊髓傷害、中風)、皮膚更替、燒傷、 心臟病、糖尿病、骨性關節炎和類風濕關節炎的組中選擇。優選地，所述疾病是神經學疾病，并且合宜地，所述疾病從包含帕 金森綜合癥、阿爾茨海默氏癥、脊髓傷害、中風的組中選擇。在本發明的第十一方面，為重編程分化細胞或為重編程分化細胞的 細胞核提供了試劑盒，該試劑盒包含起源于冷血脊椎動物的卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎的細胞或其細胞抽提物，其中的冷血脊 椎動物具有一個或多個下述性質(i) 包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或存在于魚中的從位于后 部髖骨延伸而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構；(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(m)卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽 提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。和使用所述卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎或其抽提物的 說明書。優選地，卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞 抽提物起源的細胞表達高度保守形式的Oct-4和nanog。隨意地，所述試劑盒進一步包含一個或多個待重編程的分化細胞。進一步隨意地，所述試劑盒可能會包含影響重編程細胞的重分化的 進一步步驟的祖先介質。在本發明的第十二方面，提供了增強細胞克隆的方法，該方法包含 暴露待克隆的細胞到如在本發明第六方面定義的分離細胞或細胞抽提 物中。在本發明的這個方面，所述的待克隆細胞被暴露到的細胞和/或 細胞抽提物以"預浸"("pre-dip")的形式使用。為了提高克隆所述 細胞所需的機會和實驗工作，本發明的所述細胞和/或細胞抽提物能幫 助待克隆的細胞到更多潛能狀態的逆轉。


體現本發明某些優選方面的實施例現在將參考下述附圖進行公開圖1-顯示了尋找在胚胎干細胞(ES)、通透化處理的胎鼠成纖維細 胞(PFF)和注射到美西螈(PFFA)或非洲蟾蜍卵母細胞(PFFX)的 GV中的PFFs中的P -肌動蛋白、nanog和Oct-4基因的RT-PCR實驗 的結果；圖2-顯示了如在Bordzilovskaya等人；1989中定義的超過40個發 育階段的Axananog表達譜。美西螈胚胎的系列發育階段。在 Developmental Biology of the Axolotl. (ed. J. B. Armstrong禾口 G. M.Malacinski), pp. 210-219. New York: Oxford University Press。 EC二早期卵裂，LC:晚期卵裂；圖3-顯示了 PFF在來源于美西螈卵巢的抽提物中的孵育減小了甲 基化DNA的數量。分化細胞是未處理的(對照)或在從美西螈卵巢制 備的抽提物(AxOvEx)中孵育3小時(3h)。細胞用針對甲基化DNA 的抗體進行染色；圖4-顯示了 PFF在美西螈卵巢抽提物(AvOvEx)中的孵育消除了 H3K9染色。圖5-描述了在魚和兩棲動物中的代表進化保守的原始骨骼和派生 成體基本結構的對比。A、以背面觀顯示的肺魚骨骼。B、以側視圖顯 示的硬骨魚。C、以背面觀顯示的蠑螈(美西螈)骨骼。D、以背面觀 顯示的蛙(非洲蟾蜍)骨骼。小箭頭顯示肋骨。大箭頭指向髖骨；圖6-顯示了第V級POU結構域轉錄因子(Oct-4樣基因)的系統進 化分析。基因從所述物種的卵巢分離而來并通過簡約性比較來測定最 緊密相關的序列。在同一簇內的簇族是最緊密相關的；和圖7-顯示了在冷血脊椎動物的胞質中作為胚質存在或缺少的指示 子的生殖細胞特定RNAs的分布的例子；圖8-顯示了通過使用Clustal-W測定的小鼠和美西螈Oct-4的氨基 酸比較。圖9-顯示了通過使用Clustal-W測定的小鼠、大鼠、人、奶牛、犬、 負鼠、雞和美西螈nanog的氨基酸比較。圖10-A、注射哺乳動物細胞后兩天分離的美西螈胚泡；B、用人原 代成纖維細胞注射的卵母細胞在指定的天數被收集及肌動蛋白、Nanog 和Oct-4的表達被通過RT-PCR分析；圖11-顯示了分化細胞暴露到非洲蟾蜍、美西螈和/或鱘魚抽提物后 Nanog和P -肌動蛋白的表達的RT-PCR凝膠；圖12-顯示了存在nanog結合位點的報告基因的激活；圖13-顯示了通過使用Clustal W獲得的Oct-4 DNA結合區域的序列比較-高度保守的物種。圖14-顯示了通過使用Clustal W獲得的Oct-4 DNA結合區域的序列 比較-高度保守的物種和諸如非洲蟾蜍(XLPOU-60和XLPOU-91)和斑馬魚(zPou2)的非相關物種。圖15-顯示了非洲蟾蜍和斑馬魚中的非保守Oct-4等效物與高度保 守Oct-4基因的序列比較的同一性的表格。圖16-在美西螈卵母細胞抽提物(AOC)中孵育的細胞中的DNA 甲基化通過5-甲基胞嘧啶染色進行評估。在處理后1和3小時后經過 處理的細胞通過FACS分類(熒光活化細胞分撿器)。而且，補充腺苷 三磷酸雙磷酸酶(ATP酶抑制劑)的組被包括來顯示所述過程是能量 依賴的。AP:通透化后對照。圖17-在美西螈卵母細胞抽提物中孵育的細胞中的三磷酸化的組蛋 白H3賴氨酸9 (TriH3K9)通過用特異抗體進行的TriH3K9染色進行 評估。在抽提物中孵育處理1和3小時后，處理過的細胞用FACS進 行分類。而且，補充腺苷三磷酸雙磷酸酶(ATP酶抑制劑)的組被包 括來顯示所述過程是能量依賴的。AP:通透化后對照。
具體實施方式
實施例實施例1-來源于美西螈的卵母細胞重編程分化的哺乳動物細胞的能力為了證明來源于美西螈的卵母細胞重編程分化的哺乳動物細胞的 能力，通過使用Byrne " a/(2003) Curr Biol 15:13(14) 1206-13的僅使用 非洲蟾蜍的方法相似的方法，小鼠胎鼠成纖維細胞被直接注射到非洲 蟾蜍(PFFX)和美西螈(PFFA)卵母細胞的GV (胚泡)。培養的小鼠胎鼠成纖維細胞按照Alberio " "/ (2005) Exp Cell Res. 307(1):131-41的方法通過用弱去污劑(洋地黃)的處理進行通透化處 理。當被通透化處理時，來源于GV的分子能彌散進分化細胞或PFF (通透化處理的胎兒成纖維細胞)。大約50到200個PFF細胞被注射到每個Gv中，并且被注射的卵母細胞在2rc下孵育過夜。在那個時間，所述GV被從卵母細胞分割，那些包含PFF的被進一歩考慮。RNA 被從GV中抽提并逆轉錄成cDNA， PCR被用來檢測來源于所述PFF的多潛能基因的表達。更特別的地，PCR被用來測定編碼nanog和Oct-4 的基因的表達。P-肌動蛋白水平被測定作為對照。上面公開的方法具有超過已知方法的有點，該優點為，它濃縮了被 哺乳動物分化細胞表達的RNA并產生了在檢測哺乳動物轉錄物中更高 的敏感性。因為所述目標是來檢測僅是總RNA的極小部分的哺乳動物 RNA， GV的簡單分離提供了龐大的純化步驟，并相應提高了敏感性。結果RT-PCR被進行來檢測PFF細胞中編碼Oct-4和nanog的多潛能標 記基因的表達。P-肌動蛋白的表達也被研究來作為對照。iB-肌動蛋白 在所有細胞中在所有時間進行表達并作為陽性對照來確保實驗操作的 有效性。圖1顯示了當在瓊脂糖凝膠上跑膠時RT-PCR反應的結果。因 為技術熟練人員將知道白色條帶的存在指明了 cDNA的存在，該條帶 的強度指示了cDNA (基因特定產物)的量。圖1中使用的簡寫如下ES-小鼠胚胎干細胞(從Chemicon可獲得)PFF -小鼠通透化處理的胎鼠成纖維細胞-按照Alberio " a/ (2005) Exp Cell Res. 307(1):131畫41的方法制備。PFFA-注射進美西螈卵母細胞GVs的PFF。PFFX-注射進非洲蟾蜍卵母細胞GVs的PFF。如能從圖1看到的，所有研究的樣品均強烈表達了e-肌動蛋白基 因，這證明來源于每一個處理的細胞的RNA能被RT-PCR檢測并且來 源于細胞的組成型高水平基因表達是可檢測的，不管其是否經過處理。 編碼nanog的nanog基因和編碼Oct-4的基因在ES細胞中表達，這是 被期望的，因為這些細胞是多潛能的。Oct-4和nanog (多潛能的標記 物)不在正常的未處理PFF細胞中表達，因為這些細胞是不具有多潛 能的分化的成纖維細胞。當PFF細胞在美西螈卵母細胞的GV中過夜 孵育時(PFFA)， Oct-4和nanog的表達被檢測到。當PFF細胞在非洲 蟾蜍卵母細胞的GV中過夜孵育時(PFFX)，沒有Oct-4或nanog的表 達被檢測到。在PFF細胞在非洲蟾蜍卵母細胞的GV中孵育兩天后， 低水平的Oct-4表達被檢測到但仍沒有nanog的表達被檢測到(數據未顯示)。在2天后被檢測到的Oct-4表達僅能通過RT-PCR實驗的檢測 能力的巨大增加而觀測到，即，通過增加復制的循環數，從30增加到 60個循環。PCR的每一個增加的循環均有效倍增了敏感性，因此，到 60個循環的增加代表了敏感性2到30個冪的增加。甚至是在增加了的 敏感性的條件下，nanog表達也不能被檢測到。來總結，同通透化處理的哺乳動物分化細胞接觸的美西螈卵母細胞 在孵育的18小時內誘導了編碼Oct-4和nanog的多潛能標記基因的強 烈表達。這是同非洲蟾蜍卵母細胞相比較的，非洲蟾蜍卵母細胞盡管 在幾天后也僅誘導了低水平的Oct-4表達，沒有nanog的表達被檢測到。 這樣，美西螈卵母細胞在重編程哺乳動物分化細胞中的多潛能標記基 因的表達方面遠較非洲蟾蜍卵母細胞有效。相應地，美西螈卵母細胞 在重編程分化細胞到胚胎干細胞樣細胞方面也是非常更有效的。在這個及隨后的實施例中，基因的表達通過檢測被所述基因編碼的 RNA進行測定。實施例2-同非洲蟾蜍比較的美西螈和鱘魚材料和方法卵、卵母細胞和卵巢抽提物的制備非洲蟾蜍卵母細胞和卵抽提物按照Hutchison et al., (1988) Dew/c^me"f, 103, 553-566的方法進行制備。未受精的非洲蟾蜍卵細胞 從成熟雌性動物采集而來并在去膠(dejellying)溶液(20mM TrisHCl pH 8.5、 1 mMDTT和110mMNaCl)孵育5分鐘。在去膠后，所述卵細 胞在0.9。/。NaCl鹽水中漂洗三次，在冰冷的含蛋白酶抑制劑(3 u gml-l 亮抑酶肽、1 ugml-l胃酶抑素和l ugml-l抑肽酶)的抽提緩沖液(20mMHepes,pH7.5， 100mMKCl、 5mMMgCl2、 2 mM 醇)中漂洗兩次。所述卵細胞被填充入10ml離心管中并在4'C100,000g 離心10分鐘前移除多余的緩沖液。胞質層被移除并在4。C100,000g離 心30分鐘前補充50ugml-l細胞松弛素B。澄清化的胞質補充10%的 甘油，并以100-200ul等份速凍在液氮中。卵母細胞抽提物從成熟卵 巢通過使用在OR2培養基(82.5 mMNaCl、 2.5 mMKCl、 1 mMCaCl2、1 mM MgCl2、 1 mM NaHC03、 5 mM Hepes， pH 7.8)中的1 mg/ml膠原酶在25'C下消化卵泡細胞2小時進行制備。第4-6期卵母細胞在大小 的基礎上進行選擇，在抽提緩沖液中洗滌并以卵抽提物制備的方法進 行制備。對于美西螈和非洲蟾蜍卵巢抽提物，所述卵巢在冰冷的抽提緩沖 液中洗滌并通過使用電動勻漿機在冰上進行5-10個沖程進行裂解。裂 解物被離心并按公開的用于非洲蟾蜍卵抽提物的方法進行冷凍保藏。鱘魚(小體鱘；科學名Acipenserruthenus)抽提物按如下方法制 備對于卵巢抽提物，所述卵巢在冰冷的抽提緩沖液(如實施例1中 用于蛙類卵抽提物的緩沖液)洗滌并通過使用電動勻漿機在冰上進行 20個沖程進行裂解。裂解物被離心并按公開的用于非洲蟾蜍卵抽提物 的方法進行冷凍保藏。細胞培養、細胞通透化處理和在抽提物中孵育成纖維細胞從35-45日齡的胎牛或從12.5-13.5日齡的小鼠中分離 而來并在培養基(含2mM谷氨酰胺、O.lmM P-巰基乙醇、2mM非必 需氨基酸、100 IU ml-1青霉素和100 u g m"鏈霉素并補充10% FBS 的CM: DMEM培養基)中，在對于牛是39'C對于小鼠和人是37"C的 溫度下在5%C02中培養最多5代。成纖維細胞從去除了生殖脊的13.5 日齡的小鼠中分離而來(小鼠胚胎成纖維細胞，MEFs)。 MEFs在37 °C 5% 02和C02中培養并在被傳代3或4次時被使用。細胞生長到80%融合度并被用于實驗。在胰蛋白酶消化后，細胞 在通透化緩沖液(PB: 20 mM Hepes, pH 7.3、 110 mM醋酸鉀、5 mM 醋酸鈉、2mM醋酸鎂、lmMEGTA、 2 mM DTT和蛋白酶抑制劑)中 洗滌，并隨后在1ml 20-30 u g ml—1的洋地黃皂甙中在冰上孵育1分鐘 15秒(Adam et al (1992) Methods Enzymol. 219， 97—110)。通透化反應通過加入10ml PB進行終止，然后在4°C700g離心10 分鐘。在這些條件下，質膜通透化率為95-100%。通透化處理的細胞被加入到補充了能量再生系統(ERS: 150 ug ml-1肌酸磷酸激酶、60 mM磷酸肌酸)的卵母細胞/卵/卵巢抽提物中 (每u 1抽提物1000個細胞)。通透化處理的MEFs以5000個細胞/u 1被加入到20tU卵母細胞抽提物(美西螈、鱘魚或非洲蟾蜍)并在15'C孵育3小時、6小時或過夜。對照細胞用20ulPB進行孵育。在孵育后，0.5ml PB被加入來漂洗所述細胞，這些細胞然后在 3500G離心5分鐘進行沉淀。上清被移除，沉淀在直到被需要前均冷 凍在-8(TC.反轉錄(RT) PCR反應MEF細胞沉淀被收集并存儲在-8(TC。通過使用RNAeasy系統 (Qiagen)總RNA被抽提(從~100000個細胞中)并在通過使用 Superscript III系統(Invitrogen)進行反轉錄前用DNA酶進行處理 (Ambion)。 2ng的RT反應被用于RT-PCR。使用的引物和條件如下B-肌動蛋白ttctttgCagCtCCttCgtt ，cttttcacggttggccttag (402bp; 56。C退火、1分10秒延伸、32個循環)。 Nanog: atgaagtgcaagcggcagaaa ， cctggtggagtcacagagtagttc (464bp; 56 。C退火、1分10秒延伸、35個循環)。Oct-3/4: gtttgccaagctgctgaagc， caccagggtctccgatttgc (238bp; 56。C退火、1分10秒延伸、38個f盾環)。 RediTaq系統被用于PCR反應(Sigma)。小鼠ES細胞cDNA用作陽性 對照，沒有RT的作為陰性對照。反應產物跑標準的1.2%瓊脂糖凝膠并用溴乙錠染色，并在UV燈 下被視覺化和拍照(圖11)。凝膠中的泳道對應于從在美西螈抽提物中 孵育的細胞抽提的RNA (AX);從在光滑非洲蟾蜍抽提物中孵育的細 胞抽提的RNA (XL);或從在鱘魚抽提物中孵育的細胞抽提的RNA (ST)，或從未用抽提物處理的細胞抽提的RNA (-);孵育3小時、6 小時或過夜(18小時)。左邊的泳道顯示了從Invitrogen購買的作為分子量標準的lOObp DNA梯度。頂部的膠顯示了被預測的來源于用nanog引物進行的PCR 擴增的464bp的DNA條帶，在同用美西螈或鱘魚抽提物處理細胞相對 應的泳道中存在，但在同用非洲蟾蜍抽提物處理的細胞或未用抽提物 處理的細胞相對應的泳道中不存在。底部泳道顯示了作為陽性對照的小鼠3 -肌動蛋白cDNA的擴增。 注意，預測的402bp條帶如期望地在所有泳道中均出現，因為這個基因不被重編程所誘導，它在所有小鼠中在任何時候都存在。如所預期地，更多循環的PCR被檢測nanog所需要，因為這是一個調控基因并 在正常條件下在細胞中以低水平表達。如所預測地，作為結構基因的 P-肌動蛋白被豐富表達。在這些實驗中，Oct-4表達未被激活。這是被預測到的，因為Oct-4 啟動子被甲基化負調控。因此，作為轉錄激活前提的激活需要該啟動 子的去甲基化，也預測到，在這些實驗中使用的短暫的孵育時間對所 述啟動子的徹底去甲基化是不充足的。與此相一致的，實施例1和5 (注射實驗)顯示，在注射進美西螈 卵母細胞的GV后，nanog是相對容易激活的。它需要一天進行激活。 Oct-4轉錄需要大約5天，大概反映了去甲基化Oct-4啟動子所需要的 時間。在注射進非洲蟾蜍卵母細胞中的細胞中的nanog從未被激活， 即使它不需要在先的去甲基化。實施例3 -使用表觀遺傳標記鑒定重編程尋找分化細胞到更多潛能狀態的重編程的另一條途徑是觀察細胞 的表觀遺傳輪廓。表觀遺傳標記在分化細胞的DNA和蛋白質化合物(染色質)中是容易表觀的。在許多情況下，表觀遺傳標記持久地滅 活細胞中某些基因的轉錄。表觀遺傳標記經常簇生在被緊緊壓縮成稱 為異染色質的構型的DNA的巨大區域內。為了獲得分化細胞到多潛能 狀態的重編程，需要這些被抑制的表觀遺傳標記的一些或全部逆轉， 從而使大部分DNA易接近激活。在這一點上，諸如胚胎干細胞的多潛 能細胞比典型的分化細胞含有少得多的異染色質和少得多的表觀遺傳 標記。可能，這反映了在多潛能細胞中的所有或大多數基因對激活的 明顯的可接近性，這是多潛能假定的基本性質。兩個表觀遺傳標記與無活性基因典型相關。大多數細胞的DNA含 有共價連接到CpG島內的胞嘧啶殘基的甲基(CH3)。甲基化的DNA(CH3-DNA)在異染色質中是顯著的，在異染色質中，它能以通過在 免疫化學實驗中使用CH3-DNA特異性抗體明亮染色的核酸點被檢測 至廿。除了CH3-DNA，第二個表觀遺傳標記是CH3基加入到組蛋白的特定氨基酸殘基，組蛋白是結合到DNA來給予核酸DNA更高級的稱為染色質的結構的小的帶高電荷的核蛋白。通常，無活性基因被加入到組蛋白H3的賴氨酸殘基9 (K9)， H3K9的CH3基的存在所標記。在 這種情況下，甲基化的組蛋白(CH3-組蛋白)殘基被結合到DNA并抑 制了它的轉錄激活。為了重編程細胞的基因表達到多潛能狀態，降低 分化細胞的細胞核內的CH3-DNA和CH3-組蛋白的水平將是必需的。 在這一點上，胚胎干細胞含有低水平的CH3-DNA和CH3-組蛋白殘基。圖3圖示了從美西螈卵巢制備的抽提物消除存在于小鼠胎鼠成纖 維細胞(PFF)染色質內的表觀遺傳標記的能力。更明確地，圖3圖示 了所述抽提物消除DNA甲基化的能力。對照的未處理細胞(A)，或 孵育在美西螈卵巢抽提物(AxOvEx)中3小時的細胞(B)通過加入 顯示綠色熒光的FITC-抗5-MeC抗體的免疫細胞組化分析CH3-DNA 的存在。然而，在黑白圖中，這些染色在圖像A、 B、 E和F中均能以 白點的形式被看到。對照細胞(C)和未處理細胞(D)也用碘化吡啶 處理來評估在所述抽提物中的細胞的通透性。碘化吡啶染色是紅色的， 然而在黑白像中它以黑灰色的基本裝滿C和D的細胞的形式被看 到。圖形E和F顯示了既用碘化吡啶也用FITC-抗5-MeC抗體染色的 細胞。同對照細胞相比，在所述抽提物中孵育三小時的PFF含有大大 降低的CH3-DNA染色水平。所述數據表明，美西螈卵巢抽提物具有強 大的去甲基化PFFDNA的能力，消除了一種主要的指示轉錄被抑制的 DNA的表觀遺傳標記。圖4圖示，PFF在美西螈卵巢抽提物(AxOvEx)中的孵育消除了 H3K9染色，因此指明了表觀遺傳標記的消除。PFF在美西螈卵巢抽提 物中孵育3小時(處理過的細胞)。處理過的細胞和未經處理的對照PFF 通過免疫細胞組化分析H3K9染色的存在，鑒定了與轉錄抑制相關的 組蛋白的主要修飾。在A (未處理的)和B (處理過的)細胞中這些 細胞已經用發綠色熒光的FITC-抗H3K9抗體孵育。在黑白圖像中， 這個染色能被看到亮點。細胞的兩個組也都用DNA特異性染料DAPI 處理來指示所述DNA的定位。這個染色發射藍色熒光，然而在黑白圖 中，它能以黑灰形式被看到，參見圖4中的C和D。來源于H3K9染 色和DAPI染色的熒光圖像以每一種樣品進行歸并。該數據表明，在美更通常而言，((3)型的偶氮有機硅氧烷優選為包含2-20個、更優選2-12 個(例如2-6個)硅原子(數量對應于式X中m+n+o+p+q之和)的硅氧烷低聚物。在本發明的橡膠組合物中，偶合體系的總含量優選為2-15phr，更優選 2-12phr(例如4-8phr)。然而，通常希望其用量盡可能地少。相對于增強無機填 料的重量，偶合體系的含量通常為0.5-15重量％;優選小于12重量％，更優 選小于10重量％。(化合物I:化合物n)重量比優選為1:10-10:1，更優選為1:5-5:1，還更 優選為1:3-3:1，例如，:2(0.5)-2:1(2.0)。本發明偶合體系的全部或部分可以(經由"X"官能團師預接枝到本發明組 合物的異戊二烯彈性體上，因而官能化或"預偶合"的彈性體包含用于增強無機 填料的游離"Y"官能團。該偶合體系的全部或部分還可以(經由"Y"官能團)而預 接枝到增強無機填料上，由此"預偶合"的填料然后可經由游離"X"官能團而鍵 合于二烯彈性體上。然而，特別為了更好地使用原態橡膠組合物，優選使用 的全部或部分偶合劑或者接枝到填料上或呈游離態(即未接枝)。 II-4.各種添加劑根據本發明，輪胎面的橡膠組合物還包含所有或部分常用添加劑，所述 添加劑通常用在用于輪胎面制造的彈性體組合物中，例如增塑劑或增量油， 不管后者為芳香性或非芳香性；顏料；保護劑如抗臭氧蠟、化學抗臭氧劑、 抗氧化劑，其優選存在于胎體中；抗疲勞劑；增強或增塑樹脂；描述于例如 上述申請WO 02/10269中的亞甲基受體(例如可溶可熔酚醛樹脂)或亞甲基給 體(例如HMT或H3M);基于硫或基于硫給體和/或基于過氧化物和/或基于雙 馬來酰亞胺的交聯體系；硫化促進劑或硫化活化劑。優選這些組合物包含至少一種選自環烷油、石蠟油、MES油、TDAE油、 甘油酯(尤其為三油酸酯)、具有優選大于30°C的高Tg的增塑烴樹脂及所述化 合物的混合物的化合物作為優選的非芳香性增塑劑或微芳香性增塑劑。所述 優選增塑劑的總含量優選為15-45phr，更優選20-40phr。取決于目的應用，還可以向上述增強填料中加入可用于例如有色輪胎的 側壁或輪胎面的惰性填料(即非增強性填料)，例如粘土顆粒、斑脫土、滑石、 白堊、高嶺土，即若適用的話，淺色增強填料(尤其無機填料)加上炭黑。除偶合劑以外，這些組合物還可以包含偶合活化劑、用于淺色增強填料的卵母細胞在18'C孵育5天。胚泡被從組中的卵母細胞上切離，那些含有人類細胞的胚泡被冷凍 用于分析(圖IOA)。總RNA使用商品抽提試劑盒(RNAeasy試劑盒)進行抽提和用DNA 酶I處理來避免基因組DNA污染。從每一個樣品抽提的RNA被反轉 錄來產生互補DNA (cDNA)。所述cDNA被用于通過使用為下述基因設計的特異引物的標準聚合 酶鏈反應(PCR)擴增人Nanog (正向5， aggcaaacaacccacttctg 3，，和 反向5， tcttcggccagttgtttttc 3，)，人P0U-5F1 (Oct-4基因；正向5， tcccttcgcaagccctcat 3,， 反向5 ， tgacggtgcagggctccggggaggccccat 3 ，)， 禾口 人P-肌動蛋白(正向5， ggacttcgagcaagagatgg 3，，禾Q反向5， agcactgtgttggcgtacag 3 ，)。如在圖10B中顯示的，Nanog表達在孵育于美西螈卵巢中48小時 后的細胞中檢測到。與此相對照，沒有Nanog表達在被注射的非洲蟾 蜍卵母細胞中檢測到。Oct-4表達在被注射后5天的美西螈卵母細胞中 檢測到。因此，在成X細胞(分化細胞)被注射進美西螈卵母細胞的細胞核 后，它們已經被重編程來表達Oct-4和nanog基因。在非洲蟾蜍卵母細 胞中的注射不產生nanog的激活。這些結果是重要的，因為它們顯示，人和小鼠的細胞均能被具有本 發明的性質(例如原始脊椎動物基本結構)的來源于冷血脊椎動物的 細胞/細胞抽提物重編程以及成年細胞能被重編程。分化的成年細胞是 比胎兒細胞更難重編程的，胎兒細胞是在它們的發育中仍然前進的并 且可能還沒有永久的表觀遺傳標記被強加到染色質上。在18攝氏度而不是在室溫孵育被注射的卵母細胞給予了被注射卵 母細胞增強的存活性的優點，所述細胞能被培養至少5天，而該時間 允許充足的時間來激活Oct-4的活化。而且，因為從哺乳動物基因組的 轉錄是溫度依賴的(Alberio et al， 2005)，因此，在這個溫度下轉錄的 抑制可能進一歩幫助重編程。實施例6-包含nanog結合位點的報告基因的激活為了顯示nanog是存在的，顯示nanog能激活包含諸如GATA-4啟 動子的nanog結合位點的報告基因是可能的。在圖12中，實驗測試美 西螈nanog (Axnanog)激活報告基因的能力的結果被展示。GATA-4 啟動子被融合到編碼螢火蟲螢蟲素酶(使螢火蟲在黑暗中發光的蛋白) 的報告基因上。這個蛋白發出能被稱為照度計的機器測量的光線。所 述輸出能被定量。在這個實驗中，空DNA同具有人nanog的DNA和兩個推動Axnanog 表達的克隆進行比較。圖12的方法NIH3T3細胞被接種到24孔板并用0.25 y g/孔的GATA-4報告基因、 0.05ug/孔的pTK-RL (Promega)和空載體(cDNA)、人Nanog或未 標記的美西螈nanog(CMV)或標記的(mR)RFP通過使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)進行轉染。轉染后24小時，細胞被收集并用 雙重螢蟲素酶實驗(Dual luciferase assay) (Promega)進行處理。RLU (相 對螢蟲素酶單位)同空載體對照進行比較。線段顯'示了標準偏差；n=3。實施例7 -美西螈中的nanog分離的確認Axnanog的表達譜被檢查并同小鼠nanog基因的表達譜對照相比 較。發現，Axnanog恰好在它將被預測被表達時表達，就像它在美西 螈發育過程中在多潛能中扮演了角色似的。在小鼠胚胎中，nanog基因在(tin)內細胞團和早期胚泡的細胞的 早期發育過程中被非常短暫的表達。Nanog被知道在這個階段多潛能 的維持中扮演了基本的角色。為了測驗Axnanog在相當的階段是否被 表達，我們分析了它在早期胚胎中的表達。低水平的母源Axnanog RNA 在早期和晚期分裂階段(EC; LC)是可檢測到的，然后在第9階段促 進表達的開始，這標記了當從美西螈胚胎的結合子基因組的轉錄開始 時中-囊胚的轉變。表達在早期原腸胚達到頂峰(第10階段)，并在后 期原腸胚下降(第12階段)。在更后的階段表達是不能檢測到的。因此，Axnanog在同多潛能細胞存在巧合的發育窗期間表達，并且表達 在原腸胚階段后消失，此時所有細胞被認為已經遭遇了到體細胞譜系 的定型，并將被預測不能是多潛能的。在早期胚胎中AxNanog表達通過使用Trizol的標準方法，RNA從處于圖2中指定的階段的每一 個階段的(8、 9、 10、 12、 16、 20、 25、 30、 35和40個發育階段)5 個美西螈胚胎中抽提而來(Bordzilovskaya et al; 1989. Devel叩mental stage series of axolotl embryos. In Developmental Biology of the Axolotl. (ed. J. B. Armstrong and G. M. Malacinski), pp. 210-219. New York: Oxford University Press.)，然后用DNA酶I進行處理。所述RNA使用Superscript (Invitrogen)進行反轉錄。來源于每一 個階段的0.5份cDNA胚胎相等物被用在RCR中，使用的引物為對 于 Axnanog ( Fl : GTTCCAGAACCGAAGGATGA ; Rl : CGAAGGGTACTGCAGAGGAG， 58°C45秒，72。C退火1分鐘)或美 西螈鳥氨酸脫羧酶(ODC; Fl: TGCGTTGGTTTAAAGCTCTC; Rl: ACATGGAAGCTCACACCAAT， 56°C45秒，72°C1分鐘)， 一種組成 型表達的基因用作cDNA完整性的陽性對照。PCR進行35個循環 (Axnanog)或30個循環(ODC)。反應產物在含有溴乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠上進行分離，然后在UV 燈下拍照(圖2)。實施例8 - DNA甲基化確認總體的DNA甲基化通過使用先前描述的具有輕微修改的流程 (Habib " a/" (1999). Exp.Cell Res.風46-53.)的流式細胞術進行確 認。混懸液中的細胞用補充0.1 % tween20和1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行 連續兩次的低速(300g)沉淀運動和輕輕的重懸步驟進行洗滌，然后 用9倍體積的甲醇/PBS (88。/。甲醇/12。/。PBS，體積比)混合并在-2(TC冷凍20分鐘。在室溫下用PBST-BSA洗滌兩次后，細胞用2NHC1在 37。C下連續處理30分鐘，然后用Tris HC1緩沖液(pH 8.8)處理5分 鐘。然后細胞在4。C下用抗-5-MeC抗體(where)孵育過夜后，細胞再 用封閉溶液在37"C處理1小時，所述封閉溶液用PBS-T制備并補充5% BSA。細胞然后用PBS-T連續漂洗三次并在室溫下用以1比200稀釋到 PBST-BSA中的結合到異硫氰酸酯熒光素上的兔抗-小鼠免疫球蛋白 (Dako， Trappes,法國)孵育1小時。最后，樣品在進行流式細胞術 前用PBS洗滌三次并用碘化吡啶(PI) (50 mg/ml，在PBS中)染色 30分鐘。分析用Epics XL流式細胞儀(Beckman Coulter)進行。通過流式細胞術的類似的流程被用于檢測H3K9和HP1阿爾法的改 變。簡而言之，細胞用pH 7.4的補充1% BSA和0.1% Tween 20的PBS (PBST-BSA)洗滌兩次并進而用9倍體積的甲醇/PBS (88%甲醇 /12%PBS，體積比)混合并在-20。C冷凍20分鐘。然后細胞在4t:下用抗-三甲基化的H3K9或抗-HPl阿爾法抗體 (where)孵育過夜后，細胞再在37"C下用封閉溶液處理1小時，所述 封閉溶液用PBS-T制備并補充5% BSA。細胞然后用PBS-T連續漂洗 三次并在室溫下用分別以1比200稀釋到PBST-BSA中的結合到異硫 氰酸酯熒光素上的Dunkey抗兔(1:100， Juckson美國)或山羊抗-小 鼠免疫球蛋白(Dako,Trappes，法國)孵育1小時。最后，樣品在進行流式細胞術前用PBS洗滌三次并用碘化吡啶(PI) (50mg/ml，在PBS中)染色30分鐘。分析用Epics XL流式細胞儀(Beckman Coulter)進行。 流式細胞術的結果在圖16和17中給出。討論細胞基于用CH3-DNa抗體和組蛋白H3K9抗體進行的熒光染色進 行分揀，并隨后被檢査什么百分比的細胞具有完全對照水平的染色， 和什么百分比的細胞顯示出隨時間而降低的熒光。如所述圖表顯示的，在兩個實驗中的細胞中全部水平的熒光均被降 低。這確證了更早的結果并證明，甲基化DNA和組蛋白H3K9的降低實施例9-美西螈卵母細胞抽提物在增強綿羊克隆中的使用本發明的細胞和細胞抽提物可能會用于通過在核移植(NT)前用美 西螈卵母細胞抽提物孵育細胞增強諸如綿羊克隆等克隆操作。綿羊成纖維細胞按Alberio et al.， (2005)描述的針對牛細胞的方法進 行通透化處理。所述細胞在18'C下在美西螈卵母細胞抽提物中孵育3 小時并繼而用作NT的細胞核供體。通透化處理的細胞具有膨脹和圓的 形狀，因此一般很容易在顯微鏡下識別出來并因此選來用于NT。核移 植操作以與Lee et al., (2006) Biol Reprod. 74:691-8描述的相同方式進 行。在培養物中7天后，到胚泡的發育在顯微鏡下進行評估。在7天后， 五個克隆的胚胎發育到胚泡，這表明，在美西螈抽提物中孵育的細胞 是NT有活力的供體。這個實驗已經顯示，暴露哺乳動物體細胞到美西螈卵母細胞抽提物 對克隆的哺乳動物胚胎的前植入發育是沒有害處的。被預測，這些胚胎將顯示出在用暴露到本發明的抽提物的細胞制備 的克隆胚胎到期發育中的改善。妊娠和胚胎的發育是進行的。實施例10-重編程試劑盒本發明的細胞和細胞抽提物能以試劑盒的形式提供，用在本發明的 方法中。這些試劑盒優選地包含所述細胞/細胞抽提物試劑，和至少一 種下述物品使用說明書；用于所述重編程細胞重分化的祖先介質；用于實施所 述重編程的一次性設備，例如，多孔板、諸如預裝移液管的分配器； 將被重編程的分化細胞和通透化處理緩沖液。所述試劑盒能按照所需要的重分化細胞類型進行定制化，在這種試 劑盒中，祖先培養基和說明書可能會根據細胞的類型和終端使用而變 化。實施例11-藥物配方和給藥本發明的進一步的方面是提供藥物配方，該藥物配方包含按照本發 明的第一方面的以及在帶有藥學上或獸醫學上可接受的佐劑、稀釋劑 或載體的混合物中的化合物。優選地，所述配方是單位劑量，包含活性組分的每日劑量或單位、 每曰亞劑量或它的適當的部分。本發明的化合物將以包含活性成份的藥物配方的形式，任意地，以 無毒有機或無機酸、加成鹽的形式，以藥學上可接受的劑量形式，被 經口或通過任何胃腸外的途徑而正常給藥。依賴于將被治療的病癥和 病人以及給藥的途徑，所述組合可能會以變化的劑量給藥。在人類治療中，本發明的組合能被單獨給藥但將通常以混合物的形 式給藥，該混合物具有考慮到預期的給藥途徑和標準藥學實踐而選擇 的合適的藥物輔藥、稀釋劑或載體。例如，本發明的化合物能經口、經口腔或經舌下，以可能包含調味 劑或染色劑的片劑、膠囊劑、胚珠劑、酏劑、溶液或混懸液的形式， 用于即釋-、延釋-或控釋應用目的而給藥。本發明的化合物也可能會經 海綿竇注射而給藥。這樣的片劑可能會含有諸如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、 二元磷酸鈣和甘氨酸的輔藥，諸如淀粉(優選地，玉米、土豆或木薯 淀粉)、淀粉羥乙酸鈉、交聯羧甲基纖維素鈉和某些復雜硅酸鹽類的崩解齊IJ，和諸如聚維酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠的造粒粘合劑。此外，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸、 甘油二十二烷酸酯和滑石粉的潤滑劑可能會被包括。相似類型的固體成分也可能會在明膠膠囊中用作填充劑。優選的輔 藥在這一點上包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖或高分子量聚乙烯二醇。 對于水混懸液和/或酏劑，本發明的化合物可能會同各種增甜或調味劑， 色素或染料，同乳化劑和/或助懸劑和同諸如水、乙醇、丙二醇和甘油 及其組合的稀釋劑進行組合。本發明的成分也能經胃腸外而給藥，例 如，經靜脈、經動脈、經腹膜、經髓鞘、經心室、經胸骨、經顱內、經肌肉或經皮下，或它們可能會通過注射技術而給藥。它們以無菌水 溶液的形式能被最好的使用，該水溶液可能含有其他物質，例如，使 溶液同血液等滲的足夠的鹽或蔗糖。假如必需，該水溶液應該被合適 地緩沖(優選地，到從3到9的pH)。在無菌條件下合適的胃腸外組 成物的制備通過本領域熟練人員熟知的標準藥學技術可容易地完成。合適的用于胃腸外給藥的配方包括水和非水無菌注射溶液，該溶液 可能含有抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和幫助配方同預期的受者的血液等 滲的溶質；及水和非水無菌混懸劑，該混懸劑可能包括懸浮劑和增稠 劑。配方可能在單位劑量或多劑量容器中存在，例如密封的氟奮乃靜 癸酸酯和管形瓶，并可能在冷凍干燥(凍干)條件下進行儲存，僅需 要在使用前加入無菌的例如用于注射的水的液體載體。臨時注射溶液 和混懸劑可從先前公開種類的無菌粉末、顆粒劑和片劑制備。對于給人類患者的經口和胃腸外給藥，本發明的化合物的每日劑量水平將通常從lmg/kg到30mg/kg。這樣，例如，本發明化合物的片劑 或膠囊劑可能含有適當的用于單次或兩次或更多次給藥的活性化合物 的劑量。醫生無論如何將確定對任何單個病人最合適的實際劑量并且 該劑量將隨具體病人的年齡、體重和反應而變化。上述劑量是平均情 況可效仿的。當然，能有個別的例子，在這些例子中更高或更低的范 圍是值得的并且這樣的例子也包括在本發明的范圍內。本發明的化合物也能經鼻或通過吸入而給藥，并通常以干粉吸入器 或從帶有合適的例如二氟二氯甲垸、三氯氟甲垸、二氯四氟乙烷、諸 如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)的氫氟酸、二氧化碳或其他合適氣體的噴射劑的使用的增壓 容器、泵、噴霧器或霧化器提供的氣溶膠噴霧的形式進行傳遞。在增 壓氣體的情況下，劑量單位可通過提供閥門來傳遞測定的數量而確定。 增壓的容器、泵、噴霧器或霧化器可能含有活性物的溶液或混懸劑， 例如，使用作為溶劑的乙醇和噴射劑的混合物，它可能又含有例如三 油酸山梨坦的潤滑劑。用在吸入器或吹入器中的膠囊劑和藥筒(例如， 從明膠制備)可能被配方來含有本發明的化合物和諸如乳糖或淀粉的 合適粉末基的粉末混合物。氣霧劑或干粉配方是優先安排的，以便每一個經過測量的劑量或"一噴"傳遞合適劑量到本發明的化合物到病人。對于氣霧劑，它全 部的每日劑量將從病人到病人而變動，并可能在全天以單劑量或，更 通常，以分份劑量而給藥，這將是被重視的。可選地，本發明的化合物能被以栓劑或子宮托的形式給藥，或它們 可能以洗液、溶液、乳劑、軟膏劑或丸衣粉的形式被局部給藥。本發 明的化合物可能也被經皮給藥，例如，通過使用皮膚貼劑。它們可能 也通過經眼途徑被給藥，特別是對治療眼病。對于眼藥使用，本發明的化合物能以在等滲、調整pH的、無菌鹽 水中的微粒化的懸液或優選地以在等滲、調整pH的、無菌鹽水中的溶液，任意地同諸如benzylalkonium chloride的防腐劑組合而配方。可選 地，它們可能以諸如凡士林油的軟膏劑進行配方。對于皮膚局部應用，本發明的組合能以合適的含有活性物的在例如具有一種或多種下述物質的混合物中混懸或溶解的軟膏劑而配方礦物油、液體礦脂、白礦脂、丙烯乙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯化合 物、乳化蠟和水。可選地，它們能以合適的在例如一種或多種下述物質的混合物中混懸或溶解的洗液或乳膏被配方礦物油、硬脂山梨坦、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨酯60、十六垸基酯蠟、棕櫚油、2-辛基月桂醇、苯甲醇和水。 嘴部局部給藥的合適組合包括錠劑，該劑型包含在通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠的調味基中的活性成分；軟錠劑，該劑型包含在諸如 明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠的惰性基中的活性成分；和漱口劑， 該劑型包含在合適液體載體中的活性成分。通常，在人類中，本發明的化合物經口或局部給藥是優選的途徑， 是最方便的。在受體遭受吞咽紊亂或遭受經口給藥后藥物吸收損害的 情況下，所述藥物可能經胃腸外，例如經舌或經口腔而給藥。對于獸醫使用，本發明的化合物根據正常的獸醫實踐以適于接受的 配方而給藥，并且獸醫外科將確定對特定動物最合適的給藥方案和給 藥途徑。
權利要求
1、生產重編程細胞或重編程細胞的細胞核的方法，所述方法包含暴露分化細胞或分化細胞的細胞核到起源于冷血脊椎動物的卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎的細胞或其細胞抽提物，其中的冷血脊椎動物具有一個或多個下述性質(i)包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在魚中的從位于后部的髖骨延伸而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構；(ii)不含胚質的生殖細胞；和/或(iii)卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。
2、 根據權利要求l的方法，其中的重編程細胞是胚胎干細胞樣細胞。
3、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的重編程細胞和/或重編 程細胞的細胞核表達Oct-4。
4、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的重編程細胞或重編程 細胞的細胞核表達nanog。
5、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的重編程細胞或重編程 細胞的細胞核是多潛能的。
6、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的在冷血脊椎動物卵母 細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或細胞抽提物中的Oct-4和/ 或nanog分別具有同人轉錄因子Oct-4和人nanog蛋白至少69%的氨基 酸同一性。
7、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的在冷血脊椎動物卵母 細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞中的Oct-4和/或nanog分別具有同人轉錄因子Oct-4或人nanog蛋白的DNA結合區域(DBD)至 少69%的氨基酸同源性。
8、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的冷血脊椎動物從包含 兩棲動物、爬行動物和魚的組中選擇。
9、 根據權利要求8的方法，其中的冷血脊椎動物從包含蠑螈，海 龜，蜥蜴，鱷魚，盲鰻綱(八目鰻類魚)；七鰓鰻綱(八目鰻)；軟骨 魚綱(鯊魚、魟魚、鰩、chimeras);軟骨硬鱗魚綱(硬骨魚亞綱、鱘 魚、匙吻鱘等)；半椎魚目(長嘴硬鱗魚)；弓鰭魚目(弓鰭魚)；肺魚 亞綱(肺魚)和腔棘魚綱(腔棘魚)的組中選擇。
10、 根據權利要求9的方法，其中的冷血脊椎動物從包含蠑螈、海龜、肺魚和鱘魚的組中選擇。
11、 根據權利要求io的方法，其中的冷血脊椎動物是蠑螈。
12、 根據權利要求ll的方法，其中的蠑螈是美西螈或notopthalmus。
13、 根據權利要求10的方法，其中的冷血脊椎動物是鱘魚。
14、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的卵母細胞、卵或早 期胚胎細胞抽提物包含來源于卵母細胞、卵或早期胚胎細胞的細胞核 或胚泡(GV)的物質。
15、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的分化細胞被通透化 處理。
16、 根據任何在先的權利要求的方法，其中的分化細胞是真核細胞。
17、 根據權利要求16的方法，其中的分化細胞是哺乳動物細胞。
18、 根據權利要求17的方法，其中的分化細胞是人類細胞。
19、 根據權利要求1到18的方法生產的重編程細胞。
20、 根據權利要求2到18的方法生產的胚胎干細胞樣細胞。
21、 根據權利要求1到18的方法生產的重編程細胞的細胞核。
22、 生產重分化細胞的方法，所述方法包含(a) 如權利要求1到18的任何一項公開的方法生產重編程細胞;和(b) 重分化所述重編程細胞到同一類型或不同類型的分化細胞， 到所述分化細胞起源的分化細胞。
23、 如權利要求22要求的方法，其中的重分化通過使用祖先介質 進行影響。
24、 根據權利要求22或23的方法生產的重分化細胞。
25、 起源于冷血脊椎動物的卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期 胚胎的分離細胞或細胞抽提物，其中的冷血脊椎動物具有一個或更多 個下述性質(0包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在魚中的從位于后部的 髖骨延伸而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構；(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(iii) 卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽 提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。
26、 根據權利要求25的細胞抽提物，其中的抽提物包含來源于卵 母細胞、卵細胞或早期胚胎細胞的細胞核或胚泡(GV)的物質。
27、 藥物組合物，所述藥物組合物包含如在權利要求25和26中 定義的分離細胞或細胞抽提物和藥學上可接受的載體、輔藥或稀釋劑。
28、 藥物組合物，所述藥物組合物包含如在權利要求19中定義的 重編程細胞和/或如在權利要求21中定義的重編程細胞的細胞核或如 在權利要求24中定義的重分化細胞，和藥學上可接受的載體、輔藥或 稀釋劑。
29、 治療需要置換或更新細胞的疾病的方法，所述方法包含給予 有效量的如在權利要求25和26中定義的分離細胞或細胞抽提物和/或 有效量的如在權利要求19中定義的重編程細胞和/或如在權利要求21 中定義的重編程細胞的細胞核和/或有效量的通過權利要求24的方法 生產的重分化細胞到動物。
30、 如在權利要求25和26中定義的分離細胞或細胞抽提物和/或 如在權利要求19中定義的重編程細胞和/或如在權利要求21中定義的 重編程細胞的細胞核和/或如在權利要求24中定義的重分化細胞用作 藥劑。
31、 如在權利要求25和26中定義的分離細胞或細胞抽提物和/或 如在權利要求19中定義的重編程細胞和/或如在權利要求21中定義的 重編程細胞的細胞核和/或如在權利要求24中定義的重分化細胞制備 在用于治療需要置換或更新細胞的疾病的藥劑中的用途。
32、 權利要求29的方法或權利要求30或31的使用途，其中的疾 病從包含神經學疾病(帕金森病、阿爾茨海默氏癥、脊髓傷害、中風)、 皮膚更替、燒傷、心臟病、糖尿病、骨性關節炎和類風濕關節炎的組 中選擇。
33、 權利要求32的方法或用途，其中的疾病是神經學疾病。
34、 權利要求33的方法或用途，其中的神經學疾病從包含帕金森病、阿爾茨海默氏癥、脊髓傷害、中風的組中選擇。
35、 用于重編程分化細胞或用于重編程分化細胞的細胞核的試劑 盒，該試劑盒包含起源于冷血脊椎動物的卵母細胞、卵細胞、卵巢細 胞或早期胚胎的細胞或其細胞抽提物，其中的冷血脊椎動物具有一個 或多個下述性質(i )包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射和/或存在于魚中的從位于后 部髖骨延伸而來的骨盤附件的原始脊椎動物基本結構；(ii) 不含胚質的生殖細胞；和/或(iii) 卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽 提物起源的細胞表達高度保守形式的Oct-4禾卩/或高度保守形式的 nanogo和使用所述卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎或其抽提物 的說明書。
36、 如權利要求35所要求的試劑盒，所述試劑盒進一步包含一種 或多種待重編程的分化細胞。
37、 根據權利要求35或36的試劑盒，所述試劑盒進一步包含影 響重編程細胞的重分化的進一步步驟的祖先介質。
38、 增強細胞克隆的方法，所述方法包含暴露待克隆細胞到如在 權利要求25和26中定義的分離細胞或細胞抽提物中。
39、 基本上如本文參照所述實施例和附圖公開的方法。
40、 基本上如本文參照所述實施例和附圖公開的分離細胞或細胞 抽提物。
41、 基本上如本文參照所述實施例和附圖公開的組合。
42、 基本上如本文參照所述實施例和附圖公開的使用。
43、基本上如本文參照所述實施例和附圖公開的試劑盒。
全文摘要
生產重編程細胞或重編程細胞的細胞核的方法，所述方法包含暴露分化細胞或分化細胞的細胞核到起源于冷血脊椎動物卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎的細胞或其細胞抽提物，其中的冷血脊椎動物具有一個或多個如下性質(i)包括橫向投射肋骨和/或脊髓投射的原始脊椎動物基本結構；(ii)不含胚質的生殖細胞；和/或(iii)卵母細胞、卵細胞、卵巢細胞或早期胚胎細胞或所述細胞抽提物，表達高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。本發明也提供了重編程細胞的用途。
文檔編號C07K14/47GK101228263SQ200680026855
公開日2008年7月23日 申請日期2006年7月21日 優先權日2005年7月22日
發明者A·約翰遜, K·坎貝爾, R·阿爾貝里奧 申請人:諾丁漢大學