抗gm-csf抗體和其用途的制作方法

專利名稱：：抗gm-csf抗體和其用途的制作方法抗GM-CSF抗體和其用途
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粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)最初稱為造血生長因子。其由許多細胞類型產生，包括淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞及一些惡性細胞(Metcalf等人，1986;Clark及Kamen，1987;Hart等人，1988;Metcalf等人，1986)。除對造血前驅細胞具有生長刺激及分化功能外，也發現GM-CSF對表達GM-CSF受體的免疫系統細胞具有多種作用(參見:Hamilton,2002;deGroot等人，1998)。所述功能中最重要的是在數種免疫及發炎過程中對單核細胞、巨噬細胞及粒細胞的激活(Gasson等人，1990b;Gasson等人，1990a;Hart等人，1988;Rapoport等人，1992)。成熟的GM-CSF為含有127個氨基酸具有兩個糖基化位點的單體蛋白質。糖基化程度可變導致分子量介于14kDa與35kDa之間。非糖基化及糖基化的GM-CSF顯示相似的活體外活性(Cebon等人，1990)。GM-CSF的晶體學分析顯示由四個短a螺旋組成的桶狀結構(Diederichs等人，1991)。總體折疊與諸如生長激素、白細胞介素-2及白細胞介素-4等其他生長因子相似。GM-CSF通過結合至其受體發揮其生物活性(Kastelein及Sha-nafelt,1993;Sisson及Dinarello,1988)。GM-CSF受體(GM-CSF-R)表達的最重要位點是在骨髓細胞及內皮細胞的細胞表面，而淋巴細胞是GM-CSF-R陰性的。天然受體由至少兩個亞單位(a及P)組成。a亞單位賦予配體特異性并以毫微摩爾親和力結合GM-CSF(Gearing等人，1989;Gasson等人，1986)。(3亞單位也為白細胞介素-3及白細胞介素-5受體錯合物的一部分并與GM-CSF受體a亞單位及GM-CSF聯合導致形成具有微微摩爾結合親和力的錯合物(Hayashida等人，1990)。己對受體在GM-CSF上的結合結構域實施定位GM-CSF與其受體的卩亞單位經由在GM-CSF第一a螺旋中非常有限的區域相互作用(Shanafelt等人,1991b;Shanafelt等人，1991a;Lopez等人，1991)。可將與a亞單位的結合定位至第三a螺旋、螺旋C、與螺旋C及D連接的環的起始殘基及GM-CSF的羧端尾部(Brown等人，1994)。GM-CSF三聚體受體錯合物的形成導致包括JAK/STAT家族、Shc、Ras、Raf、MAP激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶及NFkB等分子的錯合物信號級聯激活，最后導致c-myc、c-fos及c-jun轉錄。激活主要由受體的卩亞單位引起(Hayashida等人，1990;Kitamura等人，1991;Sato等人，1993)。共享的|3亞單位也是IL-3、IL-5及GM-CSF發揮的疊加功能的原因(參見deGroot等人，1998)。除其造血生長和分化刺激活性外，GM-CSF尤其起促炎性細胞因子的作用。巨噬細胞和單核細胞以及中性白細胞和嗜曙紅細胞由GM-CSF激活，導致釋放其他細胞因子及趨化因子、基質降解蛋白酶，HLA增加及CC-趨化因子受體或細胞粘附分子的表達增加。同樣，后者又導致炎癥細胞成發炎組織的趨化性增加(Chantry等人，1990;Hamilton,2002;Sisson及Dinarello，1988;Zhang等人，1998;Hamilton等人，1993;Lopez等人，1986;Cheng等人，2001;Gomez-Cambronero等人，2003)。通常，GM-CSF協同其他炎癥性刺激因子(例如其他細胞因子或LPS)發揮其活性，例如用GM-CSF與(例如)LPS聯合處理的中性白細胞會顯示增加的氧化爆發(Kaufman等人，1989;Rap叩ort等人，1992)。GM-CSF作為抗炎療法的耙點由于其在免疫系統中的多種激活功能，GM-CSF可視為抗炎療法的靶點。諸如類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥(MS)、克羅恩(Crohn's)病、牛皮癬、哮喘病、特應性皮炎或休克等慢性及急性炎癥性疾病可充分受益于GM-CSF活性的阻斷及隨后GM國CSF反應細胞有害活性的降低(Hamilton,1993;Zhang等人，1998;Hamilton,2002)。關節炎數個組已證實GM-CSF以及其受體存在于關節炎患者的滑膜關節中(Alvaro國Gracia等人，1991;Xu等人，1989;Haworth等人，1991)。此外，i正實GM-CSF在用GM-CSF治療費耳提氏(Felty's)綜合癥中的嗜中性白細胞減少癥的患者中(Hazenberg等人，1989)或于化學療法后(deVries等人，1991)引起突發類風濕性關節炎。阻斷GM-CSF的抗體治療關節炎有效性的最初線索來自小鼠活體內研究(Campbell等人，1997;Campbell等人，1998;Cook等人，2001)。具體來說，Cook等人證實GM-CSF中和抗體在膠原誘導性關節炎模型中顯示功效。GM-CSF阻斷可使疾病嚴重程度減輕，所述疾病嚴重程度涉及炎癥、軟骨破壞及在最初受侵襲的肢中的疾病擴散或至其他肢的擴散。抗GM-CSF療法具有數種患有類風濕性關節炎或患有其他炎癥性疾病的患者可受益的效果。期望GM-CSF阻斷可抑制或降低a)成熟單核細胞、巨噬細胞及中性白細胞的激活及數量。具體來說，中性白細胞及巨噬細胞大量存在于滑液及膜中。己證實在滑膜中巨噬細胞的數量與RA關節的糜爛程度有關(Mulherin等人，1996;Burmester等人，1997)。巨噬細胞是多種其他促炎性細胞因子及基質降解蛋白酶的來源。由中性白細胞產生11202是發生在關節炎關節處破壞性過程的一部分(Babior，2000)。b)骨髓樹突細胞(DC)的分化及滑液DC(等于滑膜細胞)的激活。GM-CSF上調并維持HLAII類在DC及RA滑膜細胞上的表達(Alvaro-GraciaJM等人，1991)。在關節內指示DC獲得與炎癥性T細胞選擇性激活相關的功能。已將特異性HLA-DR等位基因與RA易感染性相關聯并且經由DC抗原提呈的T細胞激活可在所述類型免疫疾病中起至關重要的作用(Santiago-Schwarz等人，2001)。多發性硬化癥在多發性硬化癥中，GM-CSF水平的提高與MS的癥狀活躍期有關(Carried等人，1998;McQualter等人，2001)并且GM-CSFV-小鼠未能在MS、實驗性腦脊髓炎、EAE的模型系統中感染疾病(McQualter等人，2001)。哮喘病已報道在哮喘病中肺中GM-CSF的量增加(Broide及Firestein,1991)。同時，嗜曙紅細胞增加，GM-CSF與白細胞介素-5以三種方式協同作用而導致嗜曙紅細胞增加i)剌激祖細胞分化至嗜曙紅細胞；ii)刺激它們的功能激活；及iii)延長嗜曙紅細胞在肺中的存活(Broide等人，1992;Yamashita等人，2002)。因此，通過阻斷GM-CSF減少哮喘氣道中嗜曙紅細胞的存活可能改善疾病。抗GM-CSF中和抗體的有效性在鼠科動物哮喘病模型中進一步得到證實，其中投與所述抗體可達成氣道高反應性及氣道炎癥的顯著減輕(Yamashita等人，2002)。在不同小鼠模型中，肺的LPS依賴性炎癥可通過在小鼠中施用抗GM-CSF抗體22E9減輕(Bozinovski等人，2003)。毒性作用破壞性粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因純合的小鼠至多12周齡發育正常并且沒有顯示明顯的造血干擾。雖然大多數GM-CSF缺失的小鼠表面上健康且可繁殖，但全部發育具有混亂及減少的膠原纖維束的紊亂的血管細胞外基質及具有削弱的肺部表面活性物質清除率及對肺中微生物病原體抗性降低的異常肺。后者的病理學特征與人類疾病肺泡蛋白沉積癥(PAP)類似。GM-CSF對于維持主要類型的成熟造血細胞及其前驅體在血液、骨髓及脾中的正常水平似乎不是非常關鍵的。然而，它們暗示GM-CSF對正常血管的形成、肺部生理機能及對局部感染的抗性是非常關鍵的(Stanley等人，1994;Dranoff等人，1994;Plenz等人，2003;Shibata等人，2001)。最近，GM-CSF自身抗體與PAP的強相關性另外表明人類PAP發病機制中的GM-CSF信號轉導異常。共同地，所述觀察表明GM-CSF在調節肺中表面活性物質自身穩態及肺泡巨噬細胞先天性免疫功能中具有重要作用(Bonfield等人，2002;Trapnell及Whitsett，2002;Uchida等人，2004;Kitamura等人，1999)。已在患有重癥肌無力的患者中描述對GM-CSF具有阻斷活性的高滴定度自身抗體。這些患者沒有顯示任何其他自身免疫現象或造血缺失或"其他明顯的臨床相關性"(Meager等人，1999)。化合物E21R(—種對抗GM-CSF功能的GM-CSF的修飾形式)已在階段I安全試驗中予以評價并發現其在癌癥患者中具有良好的安全性質(Olver等人，2002)。因此，除應密切檢測的肺功能外，當使用抗GM-CSF療法時，預計沒有其他副作用。迄今為止，僅已產生源自非人類物種的具有GM-CSF中和功能的抗體。例如，歐洲專利第0499161號Al闡述通過用寡肽(其序列源自GM-CSF)對小鼠實施免疫作用產生的抗體。此外，所述申請案揭示一種使需要其的哺乳動物中GM-CSF不期望作用減輕的方法，所述方法包括向所述哺乳動物投與GM-CSF-抑制量的免疫球蛋白。然而，所述抗體是鼠科動物抗體，使其不適于人類投與。此外，WO03/068920揭示一種抑制性嵌合小鼠/人類IgGl抗體。含有非人類序列的抗體可能在人類患者中引起免疫反應并且不適合治療投與。例如，在需要長期治療的疾病(例如慢性炎癥性疾病，如類風濕性關節炎、哮喘病及多發性硬化癥)中，連續投與非人類治療劑會使嚴重炎癥性反應及產生可中和治療劑的人類抗體的可能性增加。相應地，鑒于抗GM-CSF抗體療法的巨大潛力，當前急需具有高親和力的可有效阻斷GM-CSF/GM-CSF受體相互作用的人類抗GM-CSF抗體。此外，具有一種或多種可與一種或多種非人類物種的GM-CSF交叉反應的抗體以在基于動物的活體內模型中測試其功效會是有利的。本發明通過提供下文所述的充分高度有效的抗GM-CSF抗體滿足所述及其他需
發明內容本發明的一個目的是提供可有效阻斷GM-CSF/GM-CSF受體相互作用的人類及人源化抗體。本發明的另一個目的是提供對人類投與安全的抗體。本發明的又一個目的是提供通過使用一種或多種本發明抗體治療與GM-CSF存在有關的疾病和/或病癥的方法。所述及其他本發明目的在本文更全面地予以闡述。一方面，本發明提供對人類GM-CSF具有特異性的抗原結合區，其中經分離的人類或人源化抗體或其功能片段能夠(i)在以下條件下將0.5pg/ml人類GM-CSF與在約2xl05個CH0-K1細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少50%:(a)在CH0-K1細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度與在約2xl05個CHO-GMRa#ll細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度相似；及(b)所述經分離的人類或人源化抗體或其功能片段的濃度為約5pg/ml;及(ii)在TF-1增殖分析中以比參考抗體BVD2-21C11和/或參考抗體MAB215低至少5倍的ICso值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。本文所用"TF-1增殖分析"定義為本質上如在實例5B中所述的分析。所屬
技術領域：
的技術人員可按照本文提供的教示以相似于在約2xl05個CHO-GMRa#ll細胞上表達的濃度表達人類GM-CSF受體a鏈的CHO-K1細胞。本發明也提供包含如本文所揭示抗原結合區的經分離的人類或人源化抗體或功能抗體片段。所述抗體或其功能片段可包含抗原結合區，所述抗原結合區包含在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的H-CDR3區；所述抗原結合區可進一步包含在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的H-CDR2區；并且所述抗原結合區也可包含在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的H-CDR1區。所述抗體或其功能片段可包含抗原結合區，所述抗原結合區包含在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的可變重鏈。本發明所述GM-CSF特異性抗體可包含抗原結合區，所述抗原結合區包含在SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的L-CDR3區；所述抗原結合區可進一步包含在SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的L-CDR2區；并且所述抗原結合區也可包含在SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的L-CDR1區。所述抗體或其功能片段可包含抗原結合區，所述抗原結合區包含在SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的可變輕鏈。本發明也包括本文所揭示序列的肽變體。因此，本發明包括具有如下重鏈氨基酸序列的抗GM-CSF抗體在CDR區中與在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的CDR區具有至少60%序列一致性；和或在CDR區中與在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的CDR區具有至少80。/。序列同源性。本發明進一步包括具有如下輕鏈氨基酸序列的抗GM-CSF抗體在CDR區中與在SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的CDR區具有至少60%序列一致性；和或在CDR區中與在SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的CDR區具有至少80%序列同源性。本發明抗體可為IgG(例如IgG。，而抗體片段可為(例如)Fab或scFv。因此，本發明抗體片段可為或可包含以一種或多種本文所述方式表現的抗原結合區。本發明也關于經分離的核酸序列，每一核酸序列皆能夠編碼對GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或功能抗體片段的抗原結合區。所述核酸序列可編碼經分離的人類或人源化抗體或其功能片段的可變重鏈，其包括SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、44、45、46、47或48或在高度嚴格的條件下與SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、44、45、46、47或48的互補鏈雜交的核酸序列。所述核酸可編碼經分離的人類或人源化抗體或其功能片段的可變輕鏈，其包括SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、53、54、55、56或57或在高度嚴格的條件下與SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，53、54、55、56或57的互補鏈雜交的核酸序列。所述核酸序列可編碼對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或功能抗體片段的抗原結合區，其中所述抗體或其功能片段能夠(i)在以下條件下將0.5pg/ml人類GM-CSF與在2xl05個CH0-K1細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少50%:(a)在所述CH0-K1細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度與在2xl()S個CHO-GMRa^1細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的濃度相似；及(b)所述經分離的人類或人源化抗體或其功能片段的濃度為約5Hg/ml;及(ii)在TF-1增殖分析中以比參考抗體BVD2-21C11和/或參考抗體MAB215低至少5倍的1(35()值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。本發明核酸適于重組產生。因此，本發明也關于包含本發明核酸序列的載體及宿主細胞。所述宿主細胞可為細菌細胞或真核細胞。本發明組合物可用于治療性或預防性應用。因此，本發明包括包含本發明抗體(或功能抗體片段)和用于此的醫藥上可接受的載劑或賦形劑的醫藥組合物。在相關方面中，本發明提供一種治療與GM-CSF的不期望存在或GM-CSF表達細胞有關的疾病或病癥的方法。所述方法包括向需要其的個體投與有效量的包含本文所述或所涵蓋本發明抗體的醫藥組合物的步驟。所述疾病或病癥可為炎癥性疾病，例如類風濕性關節炎、多發性硬化癥、克羅恩病、牛皮癬、哮喘病、特應性皮炎和休克。本發明人類或人源化抗體(及其功能片段)可與大鼠和/或恒河猴(rhesus或macaca)GM-CSF交叉反應，如通過溶液平衡滴定(SET)和/或TF1增殖分析所測定。圖la提供各種新穎抗體可變重鏈區的核酸序列。圖lb提供各種新穎抗體可變重鏈區的氨基酸序列。CDR區HCDR1、HCDR2及HCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名。圖2a提供各種新穎抗體可變輕鏈區的核酸序列。圖2b提供各種新穎抗體可變輕鏈區的氨基酸序列。CDR區LCDR1、LCDR2及LCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名。圖3提供基于一致序列的HuCAI^抗體主導基因序列的可變重鏈區的氨基酸序歹U。CDR區HCDR1、HCDR2及HCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名(SEQIDNO:41)。圖4提供基于一致序列的HuCAI^抗體主導基因序列的可變輕鏈區的氨基酸序歹U。CDR區LCDR1、LCDR2及LCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名(SEQIDNO:42)。圖5提供pMORPHX9_MOR03929—FH表達載體的DNA序列的實例(SEQIDNO:43)。圖6提供GM-CSF受體a的表達水平，如使用GM-CSF受體a的特異性抗體MAB1006通過FACS分析所測定。CHO-GMRa#ll(實線)與CH0-K1(虛線)比較顯示。X軸代表在FL2通道中測量的相對熒光值(RFL);y軸代表細胞計數。具體實施方式本發明基于對GM-CSF具有特異性或具有高親和力并且具有一種或多種其他新穎特性的新穎抗體的發現。較佳地，本發明抗體可向個體遞送治療益處。本發明抗體可為人類或人源化抗體，其可用于多種領域，本文將對其進行更為全面的闡述。本文將"人類"抗體或人類功能抗體片段定義為并非嵌合(例如非"人源化")且并非(完全或部分地)源自非人類物種的抗體或功能抗體片段。人類抗體或功能抗體片段可源自人類或可為合成人類抗體。本文將"合成人類抗體"定義為具有完全或部分源自基于在電腦上對已知人類抗體序列分析的合成序列的序列的抗體。人類抗體序列或其片段的電腦上的設計可如下達成(例如)分析人類抗體或抗體片段序列資料庫并利用由其中獲得的資料設計多肽序列。人類抗體或功能抗體片段的另一個實例是由自來源于人類的抗體序列文庫(即，所述文庫基于由人類天然來源獲取的抗體)分離出的核酸編碼的人類抗體或功能抗體片段。本文將"人源化抗體"或人源化抗體功能片段定義為如下者(i)源自非人類來源(例如，具有異源免疫系統的轉基因小鼠)者，所述抗體基于人類種系序列；或(ii)嵌合者，其中可變結構域源自非人類來源且恒定結構域源自人類來源；或(iii)CDR移植者，其中可變結構域的CDR源自非人類來源，而一個或多個可變結構域的框架源于人類來源且恒定結構域(若存在)源于人類來源。若所述抗體能夠辨別所述抗原與一種或多種參考抗原，則認為本文所用抗體可"特異性結合"抗原(本文為GM-CSF)、對抗原"具有特異性"或"特異識別"抗原，因為結合特異性并非絕對性質而為相對性質。在其最通用形式中(且當未提及經定義參考物時)，"特異性結合"是指抗體辨別受關注抗原與無關抗原的能力，如(例如)根據下列方法之一所確定。所述方法包括但不限于西方點漬分析、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試及肽掃描。例如，可實施標準ELISA分析。可通過標準顯色系統(例如二級抗體與辣根過氧化物及四甲基聯苯胺與過氧化氫)實施評分。在某些孔中的反應通過光密度(例如，在450nm下)實施評分。典型背景(等于陰性反應)可為0.1OD;典型陽性反應可為10D。此表明，陽性/陰性差會超過10倍。通常，結合特異性的測定并非通過使用單個參考抗原實施而是通過使用一組約3個至5個無關抗原(例如奶粉、BSA、鐵傳遞蛋白或諸如此類)實施。然而，"特異性結合"也可指抗體辨別靶抗原與一種或多種可用作參考點的密切相關抗原的能力，例如辨別GM-CSF與IL3、IL5、IL-4、IU3或M-CSF。此外，"特異性結合"可指抗體辨別其靶抗原不同部分(例如GM-CSF的不同結構域或區域)或辨別GM-CSF的一種或多種關鍵氨基酸殘基或若干段氨基酸殘基的能力。同樣，本文將本文所用"免疫球蛋白"(Ig)定義為屬于類別IgG、IgM、IgE、IgA或IgD(或其任何亞類)的蛋白質，并包括所有傳統已知抗體及其功能片段。本文將抗體/免疫球蛋白的"功能片段"定義為保留抗原結合區的抗體/免疫球蛋白片段(例如，IgG可變區)。我們發現抗體的"抗原結合區"通常位于抗體的一個或多個超變區(即，CDR-1、CDR-2禾B/或CDR-3區)中；然而，可變"框架"區也可在抗原結合中發揮重要作用，例如為CDR提供支架結構。較佳地，"抗原結合區"至少包含可變輕(VL)鏈的4至103位氨基酸殘基及可變重(VH)鏈的5至109位氨基酸殘基，更佳地包含VL的3至107位氨基酸殘基及VH的4至111位氨基酸殘基，且尤佳為完整的VL鏈及VH鏈(VL的1至109位氨基酸及VH的1至113位氨基酸；根據WO97/08320進行編碼)。用于本發明的較佳免疫球蛋白類別為IgG。本發明"功能片段"包括F(ab')2片段、Fab片段、scFv或包含單個免疫球蛋白可變結構域或單個結構域抗體多肽的構建體的結構域，例如單個重鏈可變結構域或單個輕鏈可變結構域。F(ab')2或Fab可經構建以最小化或完全消除CH1與CL結構域之間發生的分子間二硫化物相互作用。本發明抗體可源自基于已在電腦上加以設計并由合成產生的核酸編碼的氨基酸序列的重組抗體文庫。抗體序列的電腦上設計可如下達成例如，分析人類序列資料庫并利用由其中獲得的資料設計多肽序列。用于設計并獲取電腦上形成的序列的方法闡述于(例如)Knappik等人，J.Mol.Biol.(2000)296:57;Krebs等人，J.Immunol.Methods.(2001)254:67;及頒予Knappik等人的美國專利第6,300,064號，特此其全文以引用方式并入本文中。本發明抗體貫穿本案全文，會提及下列本發明代表性抗體:"抗體號"或"MOR"03684、04251、03929、04252、04287、042卯、04302、04350、04354、04357、03682、04283、04297及04342。MOR03684代表具有對應于SEQIDNO:1(DNA)/SEQIDNO:11(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:21(DNA)/SEQIDNO:31(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04251代表具有對應于SEQIDNO:2(DNA)/SEQIDNO:12(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:22(DNA)/SEQIDNO:32(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR03929代表具有對應于SEQIDNO:3(DNA)/SEQIDNO:13(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:23(DNA)/SEQIDNO:33(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04252代表具有對應于SEQIDNO:4(DNA)/SEQIDNO:14(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:24(DNA)/SEQIDNO:34(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04287代表具有對應于SEQIDNO:5(DNA)/SEQIDNO:15(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:25(DNA)/SEQIDNO:35(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04290代表具有對應于SEQIDNO:6(DNA)/SEQIDNO:16(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:26(DNA)/SEQIDNO:36(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04302代表具有對應于SEQIDNO:7(DNA)/SEQIDNO:17(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:27(DNA)/SEQIDNO:37(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04350代表具有對應于SEQIDNO:8(DNA)/SEQIDNO:18(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:28(DNA)/SEQIDNO:38(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04354代表具有對應于SEQIDNO:9(DNA)/SEQIDNO:19(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:29(DNA)/SEQIDNO:39(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04357代表具有對應于SEQIDNO:10或48(DNA)/SEQIDNO:20(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:30或57(DNA)/SEQIDNO:40(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR03682代表具有對應于SEQIDNO:44(DNA)/SEQIDNO:49(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:53(DNA)/SEQIDNO:58(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04283代表具有對應于SEQIDNO:45(DNA)/SEQIDNO:50(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:54(DNA)/SEQIDNO:59(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04297代表具有對應于SEQIDNO:46(DNA)/SEQIDNO:51(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:55(DNA)/SEQIDNO:60(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。MOR04342代表具有對應于SEQIDNO:47(DNA)/SEQIDNO:52(蛋白質)的可變重鏈區及對應于SEQIDNO:56(DNA)/SEQIDNO:61(蛋白質)的可變輕鏈區的抗體。一方面，本發明提供具有可特異性結合GM-CSF或對GM-CSF具有高親和力的抗原結合區的抗體。若親和力測量值至少為100nM(Fab片段的單價親和力)，則認為抗體對抗原具有"高親和力"。本發明抗體或抗原結合區較佳可以約小于100nM、更佳小于約60nM且甚佳小于約30nM的親和力與GM-CSF結合。更佳為可以小于約10nM且更佳小于約3nM的親和力與GM-CSF結合的抗體。例如，本發明抗體對GM-CSF的親和力可為約10.0nM或lpM(Fab片段的單價親和力)。表1提供本發明代表性抗體的親和力的概述，如通過表面等離子體共振(Biacore)及溶液平衡滴定(SET)分析所測定表l:抗體親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>"nd":未測定參閱表1可知，MOR03684、04251、03929、04252、04357、04290、04302、04350及04354的親和力是通過在固定重組GM-CSF上實施表面等離子體共振(Biacore)測量的。Fab形式的MOR03684、04251、03929、04252、04357、04290、04302、04350及04354展現出介于約6420與7pM之間的單價親和力。所述Fab形式也用于通過溶液平衡滴定(SET)測定親和力。表1的右列表示以此方法的介于約16000與0.4pM之間的結合強度。本發明抗體較佳為可與人類及至少一種其他物種(可為嚙齒類動物物種或非人類靈長類動物)發生交叉反應的物種。所述非人類靈長類動物可為恒河猴。所述嚙齒類動物物種可為大鼠。對用相同抗體在多個物種中實施活體內研究而言，可與至少一種嚙齒類動物物種發生交叉反應的抗體(例如)能夠提供優于已知抗GM-CSF抗體的靈活性及益處。較佳地，本發明抗體不僅能夠結合GM-CSF，而且能夠將人類GM-CSF與在CHO-Kl細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少25%，較佳至少50%，更佳至少60%,更佳至少70%，尤佳至少85%且最佳至少100%。在較佳實施例中，本發明抗體能夠在以下條件下將0.5pg/ml人類GM-CSF與在約2xl05個CHO-Kl細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少50%:在所述CHO-Kl細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的濃度與在約2xl()S個CHO-GMRa#ll細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的濃度相似；并且本發明抗體的濃度為約5ng/ml。在這點上，所屬
技術領域：
的技術人員可通過以下獲得以相似于在約2xl()S個CHO-GMRa#ll細胞上表達的濃度表達人類GM-CSF受體a的CHO-Kl細胞例如，通過用編碼GM-CSF受體a的適宜表達載體轉染一群CHO-Kl細胞以產生表達所定義水平GM-CSF受體a的不同的穩定的細胞系；然后，按照基本上如實例3C中所述的方案在FACS分析中對所述穩定的細胞系進行分析以測定GM-CSF受體a表達水平；通過對所述經轉染細胞的中值熒光值(MFL)與在實例3C中所給出的MFL值進行比較識別以相似于在約2xl()S個CHO-GMRa#ll細胞上表達的濃度表達人類GM-CSF受體a的細胞系。若所述經轉染細胞系的MFL值偏離在實例3C中所給出的CHO-GMRa#ll細胞的MFL值不大于兩倍，則本文所用細胞系定義為以"相似"于在約2xl()S個CHO-GMRa#ll細胞上表達的濃度表達GM-CSF受體a。此外，本發明抗體能夠在TF-1增殖分析中以比參考抗體BVD2-21C11和,/或MAB215低的ICso值中和人類GM-CSF，較佳以比參考抗體BVD2-21C11和/或MAB215低至少5倍的ICso值，更佳以比參考抗體BVD2-21C11和/或MAB215低至少10倍的IC5o值，更佳以比參考抗體BVD2-21C11和/或MAB215低至少15倍的1(35()值，更佳以比參考抗體BVD2-21C11和/或MAB215低至少20倍的ICso值，更佳以比參考抗體BVD2-21C11和/或MAB215低至少30倍的IC5。值，更佳以比參考抗體BVD2-21C11禾tl/或MAB215低至少50倍的ICso值，更佳以比參考抗體BVD2-21C11禾口/或MAB215低至少100倍的IC5()值并且最佳以比參考抗體BVD2-21C11和/或MAB215低至少120倍的ICs。值。肽變體本發明抗體不限于本文提供的具體肽序列。相反，本發明也涵蓋所述多肽的變體。參閱本發明揭示內容及傳統可用技術及參考文獻，所屬
技術領域：
的技術人員能夠制備、測試并使用本文所揭示抗體的功能變體，同時會了解，能夠阻斷GM-CSF與GM-CSF受體a鏈相互作用的變體涵蓋于本發明范圍內。此背景所用"阻斷GM-CSF與GM-CSF受體a鏈的相互作用的能力"意指歸屬于本發明抗GM-CSF抗體的功能特征。變體可包括(例如)與本文所揭示的肽序列相比具有至少一個經改造互補決定區(CDR)(超變)和/或框架(FR)(可變)結構域/位點的抗體。為更好地闡明這個概念，以下呈現抗體結構的簡要闡述。抗體由兩條肽鏈構成，每條含有一個(輕鏈)或三個(重鏈)恒定結構域及可變區(VL，VH)，其中后者在每一種情況下皆由4個FR區及3個間隔開的CDR構成。抗原結合位點由一個或多個CDR形成，而FR區為CDR提供結構框架并且也可在抗原結合中發揮重要作用。藉由改變CDR或FR區的一種或多種氨基酸殘基，所屬
技術領域：
的技術人員可以常規方式形成突變的或多樣化的抗體序列，例如，可就新性質或改良性質針對抗原來篩選所述抗體序列。表2a(VH)及2b(VL)描繪本發明某些抗體的CDR及FR區并對彼此及相應一致序列或"主導基因"序列的指定位置處的氨基酸加以比較(如美國專利第6,300,064號中所述)<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>表2a繼續:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2b繼續:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>已用其真正的N-末端對原來的HuCAI^主導基因實施構建，例如VIA3包含在位置1及2處的氨基酸"SY";并且VH3包含在位置1處的氨基酸"E"。在HuCALFab文庫(包括HuCALGOU^文庫)構建期間，將在VIA3鏈中的最初兩個氨基酸改變成"DI";并且將在VH3鏈中的最初兩個氨基酸改變成"Q"。所屬
技術領域：
的技術人員可使用表2a及2b中的資料來設計在本發明范圍內的肽變體。較佳是通過改變一個或多個CDR區內的氨基酸來構建變體；變體也可能具有一個或多個經改造框架區。參閱所述新穎抗體彼此間的比較可知，可經改變的候選殘基包括MOR04251(例如)可變輕鏈的殘基27或51及(例如)可變重鏈的殘基32或56，因為所述為彼此相比存在差異的位置。改變也可在框架區內進行。例如，能夠在與種系序列相比存在殘基差異之處對肽FR結構域實施改造。參閱所述新穎抗體與相應一致序列或"主導基因"序列的比較可知，可改變的候選殘基包括(例如)MOR04251可變輕鏈的殘基27、50或90(與VD3相比較)及(例如)MOR04251可變重鏈的殘基33、52或96(與VH3相比較)。或者，所屬
技術領域：
的技術人員能夠通過利用(例如)Knappik等人(2000)及頒予Knappik等人的美國專利第6,300,064號所述程序對本文所揭示的氨基酸序列及相同類別所述抗體的已知序列加以比較進行相同分析。此外，可如下獲得變體用一個MOR作為起始點用以通過使MOR中的一個或多個氨基酸殘基(較佳為一個或多個CDR中的氨基酸殘基)多樣化來進行最優化并從所得抗體變體集合中篩選出具有改良性質的變體。尤佳為VL的CDR-3、VH的CDR-3、VL的CDR-1和/或VH的CDR-2中一個或多個氨基酸殘基的多樣化。多樣化可通過使用三核苷酸誘變(TRIM)技術合成一組DNA分子來實施(Virnekas等人，1994)。疾寧賓基虔,沐可制備保留本文所述抗體肽序列整個分子結構的多肽變體。鑒于單個氨基酸的性質，所屬
技術領域：
的技術人員會認可一些合理取代。例如，氨基酸取代(即"保守取代")可基于有關殘基在極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性性質方面的相似性實施。例如，(a)非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；(b)極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；(c)帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、離氨酸及組氨酸；及(d)帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。取代通常可在(a)至(d)群組內進行。此外，甘氨酸及脯氨酸可根據其破壞a螺旋的能力彼此取代。同樣，某些氨基酸(例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸及離氨酸)更常見于a螺旋中，而纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及蘇氨酸更常見于P折疊片中。甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺及脯氨酸常見于轉角中。一些較佳取代可在以下基團中進行(i)S與T;(ii)P與G;及(iii)A、V、L與I。若已知遺傳密碼及重組及合成DNA技術，所屬
技術領域：
的科學工作者可容易地構建編碼保守氨基酸變體的DNA。本文所用兩個多肽序列間的"序列一致性"表示兩個序列間相同氨基酸的百分比。"序列同源性"表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。本發明的較佳多肽序列在CDR區具有至少60%、更佳至少70%或80%、甚佳至少90%且最佳至少95%的序列一致性。較佳抗體在CDR區也具有至少80%、更佳90%且最佳95%的序列同源性。本發明DNA分子本發明也關于編碼本發明抗體的DNA分子。所述序列包括(但不限于)那些在圖la及2a中所示的DNA分子。本發明DNA分子并不限于本文所揭示的序列，而且包括其變體。涵蓋于本發明的DNA變體可參考其在雜交方面的物理性質加以闡述。所屬
技術領域：
的技術人員會了解，可使用核酸雜交技術利用DNA識別其補體及其等效物或同系物(因為DNA是雙鏈的)。也應了解，在互補性低于100%時可發生雜交。然而，給定適當選擇的條件，可利用雜交技術根據DNA序列與特定探針的結構相關性區分DNA序列。有關所述條件的指導參見Sambrook等人，1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,USA)及Ausubel等人，1995(Ausubel，RM"Brent，R"Kingston,R.E"Moore,D.D.，Sedman,J.G.，Smith,J.A.及Struhl,K.編輯(1995).CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYork:JohnWileyandSons)。兩個多核苷酸序列之間的結構相似性可表示成在其下兩個序列可以彼此雜交的條件"嚴格性"的函數。本文所用術語"嚴格性"指條件不利于雜交的程度。嚴格性條件非常不利于雜交，并且僅結構上最為相關的分子會在所述條件下彼此雜交。相反，非嚴格性條件有利于展現較低程度結構相關性的分子進行雜交。因此雜交嚴格性與兩個核酸序列的結構關系直接相關。以下關系可用于使雜交與相關性相關聯(其中Tm為核酸雙鏈的解鏈溫度)a.Tm=69.3+0.41(G+C)%b.不匹配堿基對的數量每增加1%，雙鏈DNA的Tm降低1°C。c.(Tm、2-(T山=18.5log10p2/nl其中pi及為兩種溶液的離子強度。雜交嚴格性與多種因素相關，包括總DNA濃度、離子強度、溫度、探針尺寸及破壞氫鍵的作用劑的存在。促進雜交的因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較大的探針尺寸及不存在破壞氫鍵的作用劑。雜交通常分兩個階段進行"結合"階段及"洗滌"階段。首先，在結合階段探針在有利雜交的條件下與靶結合。在此階段通常通過改變溫度來控制嚴格性。對于高嚴格性，溫度通常介于65"C與70'C之間，使用短的(〈20nt)寡核苷酸探針除外。代表性雜交溶液含有6XSSC、0.5%SDS、5XDenhardt's溶液及100昭非特異性載體DNA。參見Ausubel等人，部分2.9，附錄27(1994)。當然，已知許多不同但在功能上等效的緩沖條件。當相關性程度較低時，可選擇較低溫度。低嚴格性結合溫度介于約25i:與4(TC之間。培養基嚴格性介于至少約4(TC與小于約65'C之間。高嚴格性為至少約65'C。然后，通過洗滌移除過量探針。在此階段通常采用更為嚴格的條件。因此，所述"洗漆"階段在經由雜交確定相關性過程中最為重要。洗滌溶液通常含有較低鹽濃度。一種實例性中等嚴格性的溶液含有2XSSC及0.1%SDS。高嚴格性洗滌溶液含有小于約0.2XSSC的等效物(在離子強度方面)，其中較佳嚴格性溶液含有約0.1XSSC。與各種嚴格性相關的溫度與上述用于"結合"者相同。洗滌溶液通常也會在洗滌期間更換數次。例如，典型高嚴格性洗滌條件包括在55'C下洗滌兩次(每次30分鐘)并在60。C下洗滌三次(每次15分鐘)。因此，本發明包括可與圖la及2a中所示分子在高嚴格性結合及洗滌條件下雜交的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有本文所述性質的抗體或其功能片段。較佳分子(就mRNA而言)是那些與本文所述DNA分子之一具有至少75。/。或80。/。(較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%)同源性或序列一致性的分子。勸激箏被沐應了解，本文提供的DNA分子變體可以若干不同方式構建。例如，其可作為完全合成的DNA加以構建。有效合成介于20至約150個核苷酸的寡核苷酸的方法普遍適用。參見Ausubel等人，部分2.11，附錄21(1993)。可以首先由Khorana等人，J.Mol.Biol.72:209-217(1971)報道的方式合成及組裝重疊寡核苷酸；也參見Ausubel等人，上述文獻，部分8.2。較佳地，借助在基因5'及3'末端構建的適宜限制酶切位點對合成DNA加以設計以便于克隆至適宜載體中。如所述，形成變體的方法以本文所揭示的DNA之一開始并且隨后實施定點誘變。參見Ausubel等人，上述文獻，第8章，附錄37(1997)。在一個典型方法中，將靶DNA克隆至單鏈DNA噬菌體載體中。分離單鏈DNA并與含有期望核苷酸改變的寡核苷酸進行雜交。合成互補鏈并將雙鏈噬菌體導入宿主中。所得后代中的一些會含有期望的突變體，可利用DNA定序對其加以確認。此外，各種能夠使后代噬菌體成為期望突變體的可能性增加的方法均適用。所述方法為業內技術人員所熟知且用于形成所述突變體的試劑盒市面有售。重組DNA構建體及表達本發明進一步提供含有一個或多個本發明核苷酸序列的重組DNA構建體。本發明重組構建體可與載體(例如質粒、噬粒、噬菌體或病毒載體)聯合使用，可將編碼本發明抗體的DNA分子插入所述載體中。編碼基因可通過闡述于Sambrook等人，1989及Ausubel等人，1989的技術產生。或者，DNA序列可利用(例如)合成器以化學方式合成。參見(例如)闡述于OligonucleotideSynthesis(1984，Gait編輯，IRLPress,Oxford)的技術，其全文以引用方式并入本文中。本發明重組構建體包含在能夠表達編碼DNA的RNA和/或蛋白質產物的表達載體中。所述載體可進一步包含調節序列，包括以可操作方式與開放閱讀框(ORF)相連的啟動子。所述載體可進一步包含選擇標記物序列。也可能需要特異性起始信號及細菌分泌信號以便有效轉譯插入的靶基因編碼序列。本發明進一步提供含有至少一個本發明DNA的宿主細胞。所述宿主細胞實際上可為適用于表達載體的任何細胞。其可為(例如)高等真核生物宿主細胞(例如哺乳動物細胞)、低等真核生物宿主細胞(例如酵母細胞)或原核細胞(例如細菌細胞)。重組構建體向所,述宿主細胞中的導入可通過磷酸鈣轉染法、DEAE、葡聚糖介導的轉染法、電穿孔法或噬菌體感染法實現。潘朦表達用于細菌用途的有用表達載體可通過插入編碼期望蛋白質的結構DNA序列連同適宜的處于可操作閱讀期的轉譯起始信號及終止信號以及功能啟動子來構建。所述載體會包含一個或多個表型選擇標記物及復制起始點以確保載體的維持且(若需要)提供宿主內的擴增。用于轉化的適宜原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、沙門氏鼠傷寒菌(Salmondlatyphimurium)及假單胞菌屬、鏈霉菌屬及葡萄球菌屬各屬中的各種種類。細菌載體可以為(例如)以噬菌體、質粒或噬粒為基礎的。所述載體可包含源自通常含有熟知克隆載體pBR322(ATCC37017)元件的市售質粒的選擇標記物及細菌復制起始子。轉化適宜宿主菌株且宿主菌株生長至適當細胞密度后，通過適當方法(例如，溫度變化或化學誘導)來使所選啟動子解除抑制/受到誘發并將細胞培養額外的一段時間。通常通過離心收獲細胞，通過物理或化學方法使其破裂，并保留所得粗制提取物以用于進一步純化。在細菌系統中，可方便地根據擬用于所表達蛋白質的用途選擇多種表達載體。例如，當欲產生大量所述蛋白質時，對于形成抗體或篩選肽文庫，可能會需要(例如)可指導易于純化的融合蛋白質產物高水平表達的載體。治療方法治療方法涉及向需要治療的個體投與治療有效量的本發明所涵蓋的抗體。本文將"治療有效"量定義為量足以有效阻斷在個體經治療區域中GM-CSF與其受體相互作用的抗體的量一可以單次劑量或按照多劑量方案、單獨或與其他作用劑(其會使不利情況得以緩和，但其量需在毒理學上容許)聯合投與。所述個體可為人類或非人類動物(例如，大鼠或恒河猴)。本發明抗體可與已知藥劑共投與，并且在一些情況下所述抗體自身可能受到修飾。例如，抗體能夠與免疫毒素或放射性同位素結合，從而有可能進一步增強功效。本發明抗體可在多種情形(其中不期望GM-CSF表達或存在)中用作治療或診斷工具。尤其適于用本發明抗體治療的疾病及病癥是諸如類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥、克羅恩病、牛皮癬、哮喘病、特應性皮炎或休克等炎癥性疾病。為治療任一種上述疾病，可以傳統方式使用一種或多種生理上可接受的載劑或賦形劑調配用于本發明的醫藥組合物。本發明抗體可以任何適宜方式投與，投與方式可隨擬治療病癥的類型發生變化。可用的投與途徑包括非經腸(例如，肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下)、肺內和鼻內投與以及(若需要局部免疫抑制治療)病灶內投與。此外，本發明抗體可以(例如)所述抗體的遞減劑量經脈沖輸注投與。較佳地，所述定量給藥部分視投與期的長短而通過注射(最佳為靜脈內或皮下注射)投與。擬投與的量需視多種因素(例如臨床癥狀、個體重量、是否投與其他藥物)而定。所屬
技術領域：
的技術人員會了解，投與途徑會隨擬治療的疾病或病癥而發生變化。根據本發明，新穎多肽的治療有效量的確定在很大程度上取決于特定患者特征、投與途徑及擬治療疾病的性質。通用指導可見于(例如)出版物InternationalConferenceonHarmonisation及Remington'sPharmaceuticalSciences,27及28章，第484至528頁(第18版，AlfonsoR.Gennaro編輯，Easton,Pa.:MackPub.公司，1990)。更具體來說，確定治療有效量會取決于諸如藥劑毒性及功效等因素。毒性可利用業內熟知及見于上述參考文獻的方法測定。功效可利用相同指導結合下文實例中所述的方法診斷方法多種細胞類型表達GM-CSF，包括淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞和一些惡性細胞；因此，本發明抗GM-CSF抗體可用以成像或顯像患者不同組織中GM-CSF可能聚集的部位。在這點上，可通過使用放射性同位素、親和力標記物(例如生物素、抗生物素蛋白等等)、熒光標記物、順磁性原子等以可檢測方式對抗體實施標記。用于達成所述標記的程序為業內所熟知。抗體在診斷成像中的臨床應用由Grossman,H.B.,Urol.Clin.NorthAmer.13:465-474(1986))、Unger,E.C.等人，Invest.Radiol.20:693-700(1985))及Khaw,B.A.等人，Science209:295-297(1980))予以評述。例如，所述以可檢測方式標記的抗體集中點的檢測可能指示炎癥的部位。在一個實施例中，所述檢査可如下進行取出組織或血液樣品并在以可檢測方式標記的抗體存在下對所述樣品實施培育。在一個較佳實施例中，所述技術以非侵害性方式通過使用磁成像、熒光自顯影術等進行。所述診斷測試可用于監測疾病治療的成功性，其中GM-CSF的存在或不存在為相關指標。本發明也涵蓋抗GM-CSF抗體的用途，如本文所述用于來自體內的體外裝置中的診斷。治療及診斷組合物可根據已知方法對本發明抗體實施調配以制備醫藥上有用的組合物，其中本發明抗體(包括其任何功能片段)可在混合物中與醫藥上可接受的載劑媒劑混合。適宜媒劑及其調配物(例如)在Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版，AlfonsoR.Gennaro編輯，Easton,Pa.:MackPub.公司，1990)中予以闡述。為形成適于有效投與的醫藥上可接受的組合物，所述組合物會包含有效量的一種或多種本發明抗體連同適宜量的載劑媒劑。可對制備物進行適當調配以實現活性化合物的控制釋放。可通過使用聚合物來復合或吸收抗GM-CSF抗體獲得控制釋放制備物。所述控制遞送可如下實施選擇適宜大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白)及大分子濃度以及摻合方法以實現控制釋放。另一種可用于通過控制釋放制備物來控制作用時間的方法是將抗GM-CSF抗體摻入聚合材料(例如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)顆粒中。或者，代替將所述作用劑摻入聚合物顆粒中，可能將所述材料分別裝入通過(例如)凝聚技術或通過介面聚合制備的微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，或裝入膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微滴乳液、納米顆粒及納米囊或粗滴乳液)中。所述技術揭示于Remington'sPharmaceuticalSciences(1980)。所述化合物可經調配用于通過注射(例如，濃注或連續輸注)的非經腸投與。用于注射的調配物可以單位劑型提供，例如存于安瓿或存于多劑量容器中(添加有防腐劑)。所述組合物可呈存于油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液形式，且可包含諸如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑等調配劑。或者，所述活性成份可呈粉劑形式，以便在使用前用適宜媒劑(例如無菌無熱原水)構造。所述組合物(若需要)可存于包裝或分配器裝置中，其可包含一個或多個含有所述活性成份的單位劑型。包裝可包括(例如)金屬或塑性箔(例如泡罩包裝)。所述包裝或分配器裝置可附有用于投與的說明書。參閱以下實施例可進一步理解本發明，所述實例僅為舉例說明目的而非意欲限制本發明。實例實例1:自HnCALGOU^文庫形成人類GM-CSF特異性抗體A.噬粒拯救、噬菌體擴增及純化在含有34嗎/ml氯霉素及1%葡萄糖的2xYT培養基(2xYT-CG)中對HuCALGOLD⑧文庫實施擴增。在OD,為0.5時(在37'C下30分鐘，不振蕩；在37'C下30分鐘，于250rpm下振蕩)進行輔助噬菌體感染后(VCSM13)，將細胞離心(4120g;5分鐘；4°C)，重新懸浮于2xYT/34pg/ml氯霉素/50嗎/ml卡那霉素(kanamycin)/0.25mMIPTG中并在22'C下生長過夜。用PEG自上清液中沉淀出噬菌體，重新懸浮于PBS/20M甘油中并在-8(TC下保存。兩輪淘選之間的噬菌體擴增如下進行用洗脫出的噬菌體感染對數生長期中期的大腸桿菌(E.coli)TGl細胞并鋪板于補充有1%葡萄糖及34)ig/ml氯霉素的LB-瓊脂上。在3(TC下培育過夜后，刮掉集落并用于接種2xYT-CG直至達到OD咖^為0.5并且如上所述加入輔助噬菌體。B.用HuCALGOLD⑧進行淘選應用數種淘選策略以便選擇可識別人類GM-CSF的抗體。總起來說，將HuCALGOU^抗體-噬菌體分成三個包含不同VH主導基因的池。所述池逐個經受a)三輪在直接涂覆于涂有中性鏈親和素的96孔板上(Pierce,Rockford,IL)作為固態載體的生物素化人類GM-CSF蛋白質(由R&DSystems,Minneapolis,MN定做)上進行的固相淘選或b)三輪在捕獲至涂有鏈親和素的Dynabeads(Dynal,Oslo,Norway)上的生物素化人類GM-CSF蛋白質上進行的溶液淘選。詳細來說，為在固定生物素化GM-CSF上實施淘選，將中性鏈親和素板的孔用300^PBS洗滌三次。將抗原在PBS中稀釋至濃度為3jug/ml(200nM)并在室溫下將0.1ml涂覆每個孔2h。在用300.tilPBS實施兩次洗滌步驟后，用含有于PBS中1:1稀釋的2xChemiblocker(Chemicon,Temecula，CA)的阻斷緩沖液對所述孔實施培育。在選擇之前，將100^HuCALGOU^噬菌體在室溫下預吸附于100^含有0.4^25%Tween20的阻斷緩沖液中0.5h。在RT下，將經阻斷的噬菌體以100^等分樣轉移至中性鏈親和素板孔，保持0.5h。重復兩次所述步驟以便預吸收。在對經涂覆及經阻斷的中性鏈親和素微量滴定板實施洗滌(2x300^PBS)后，將0.1ml所述預吸附的噬菌體添加至涂覆孔中并在RT下輕輕振蕩培育1.5h。所述培育之后，在RT下用PBS/0.05%Tween20實施10個洗滌循環。在RT下，通過將120pi存于10mMTrispH8.0中的20mMDTT添加至每個孔洗脫結合噬菌體10min。移除洗脫液并將其添加至生長至OD6QQ咖為0.6-0.8的14ml大腸桿菌TG1中。再次用200^PBS洗滌孔并也將此溶液添加至TG1細胞中。使大腸桿菌的噬菌體感染在37。C下不振蕩實施45min。此外，將生長至OD6()()nm為0.6_0.8的200^1TGI細胞在37。C下于45分鐘內添加至選擇孔中(不振蕩)。將所述TG-1細胞添加至已經含有自第一洗脫步驟的噬菌體的14ml培養物中。在5000rpm下離心10min后，將細菌團各自重新懸浮于500pl2xYT培養基中，鋪板于2xYT-CG瓊脂板上并在3(TC下培育過夜。然后自所述板上刮下集落并如上所述對噬菌體實施拯救及擴增。以與第一輪選擇相同的方式實施第二及第三輪選擇，唯一差別是在結合噬菌體后洗滌條件更為嚴格。此外，在第三輪選擇中，使噬菌體在涂有鏈親合素的珠粒上(DynabeadsM-280;Dynal)經受額外的預吸附步驟。通過在RT下培育30min用Chemiblocker溶液對Eppendorf試管實施阻斷。每個噬菌體池的0.3ml與含有0.05%Tween20的2xChemiblocker溶液1:1混合并在RT下在經阻斷的Eppendorf試管中于旋轉器上培育1h。然后將經阻斷的噬菌體轉移至新近阻斷的Eppendorf試管中并在另外30min內添加50(ilDynabeadsM-280以便預吸附。使用磁性裝置(DynalMPC-E)移除珠粒。然后將150pl噬菌體分液轉移至中性鏈親和素板上以便如第1輪及第2輪進一步預吸附(參見上文)。對于使用結合至Dynabeads的生物素化GM-CSF的溶液淘選，可采取以下方案在4。C下，用1.5ml經PBS1:1稀釋的2xChemiblocker將1.5mlEppendorf試管阻斷過夜。用200^PBS對200^涂有鏈親合素的磁性珠粒(DynabeadsM-280;Dynal)實施1次洗滌并重新懸浮于200pilxChemiblocker(在lxPBS中稀釋)中。珠粒的阻斷在4'C下于預阻斷的試管中實施過夜。對于每一種淘選條件在RT下將稀釋于500^PBS中的噬菌體與500^2xChemiblocker/0.1%Tween混合1h(旋轉器)。實施兩次噬菌體預吸附過程將50pl經阻斷的鏈親和素磁性珠粒添加至經阻斷的噬菌體中并在RT下于旋轉器上培育30min。在經由磁性裝置(DynalMPC-E)分離珠粒后，將噬菌體上清液(約1ml)轉移至新阻斷的試管中并在50pl經阻斷的珠粒上于30min內重復預吸附過程。然后，將200nM生物素化hGM-CSF添加至存于新阻斷的1.5ml試管中的經阻斷噬菌體中并在RT下于旋轉器上培育1h。將100,ul經阻斷的鏈親和素磁性珠粒添加至每個淘選噬菌體池中并在RT下于旋轉器上培育10min。用磁性顆粒分離器(DynalMPC-E)收集結合至生物素化GM-CSF并因此固定至磁性珠粒的噬菌體。然后將珠粒在PBS/0.05%Tween中使用旋轉器洗滌7次，隨后用PBS再洗滌三次。在10min內將存于10mMTris/HClpH8中的300pl20mMDTT添加至每個試管中實施自Dynabeads的噬菌體的洗脫。通過磁性顆粒分離器移除Dynabeads并將上清液添加至14ml生長至OD6oo肌為0.6-0.8的大腸桿菌TG-1培養物中。然后將珠粒用200(ilPBS洗滌一次并將含有額外的移除噬菌體的PBS添加至14ml大腸桿菌TG-1培養物中。在5000rpm下離心10min后，將細菌團各自重新懸浮于500pl2xYT培養基中，鋪板于2xYT-CG瓊脂板上并在3(TC下培育過夜。然后自所述板上刮下集落并如上所述對噬菌體實施拯救及擴增。根據第一輪方案在生物素化GM-CSF上實施第二及第三輪溶液淘選，只是提高洗滌程序的嚴格性。C.所選Fab片段的亞克隆及可溶Fab片段的表達將所選HuCALGOU^噬粒的插入的Fab編碼序列亞克隆至表達載體pMORPHx9—Fab—FH(圖5)中以促進可溶Fab快速表達。所選克隆的DNA用Xbal及EcoRI消化從而切出插入的Fab編碼序列(ompA-VLCL及phoA-Fd)，并克隆至經Xbal/EcoRI消化的載體pMORPHX9—Fab_FH中。在所述載體中表達的Fab攜帶有兩個C-末端標簽(分別為FLAGTM及6xHis)以便于檢測及純化。D.HuCALGOLDFab抗體在大腸桿菌中的微表達將在亞克隆至pMORPHX9_Fab_FH中后獲得的單集落用于接種每個孔中含有100pi2xTY/Cm/l%Glu培養基的無菌96-孔微量滴定板的孔，并在37。C下生長過夜。將5^每種TG-1大腸桿菌培養物轉移至每個孔中含有100nl2xTY/Cm/0.1%Glu培養基的新無菌96-孔微量滴定板上。在30'C下在微板振蕩器上于400rpm下振蕩對微量滴定板實施培育，直至培養物略微混濁(約2-4h)，其中OD6oo^為0.5。向所述表達板的每個孔中添加20pl2xYT/Cm/3mMIPTG(最終濃度為0.5mMIPTG)，用透氣帶密封并在3(TC下于400rpm下振蕩培育過夜。全細胞溶解產物(BEL提取物)的形成向所述表達板的每個孔中添加40^含有2.5mg/ml溶菌酶的BEL緩沖液(2xBBS/EDTA:24.7g/I硼酸、18.7gNaCI/1、1.49gEDTA/1，pH8)并在22。C下在微量滴定板振蕩器(400rpm)上培育1h。BEL提取物用于通過ELISA或BioVerisM系列@384分析儀實施的結合分析(見實例2)。E.HuCALGOLDFab抗體在大腸桿菌中的表達及純化pM0RPHX9—Fab—FH編碼的Fab片段在TG-1細胞中的表達在振蕩燒瓶培養物中用11補充有34pg/ml氯霉素的2xYT培養基實施。在用0.5mMIPTG誘導后，細胞在22'C下生長16h。通過細胞破碎儀(FrenchPress)制備細胞團的全細胞提取物并通過鎳/NTA色譜法(Qiagen,Hilden，Germany)分離Fab片段。通過UV分光光度測定法測定濃度(Krebs等人，2001)。實例2:hGM-CSF特異性抗體的識別通過ELISA或BioVeris(BioVerisM系列@384分析儀)對通過上述淘選策略選擇的個體大腸桿菌克隆的BEL提取物進行分析，以識別編碼hGM-CSF特異性Fab的克隆。A.酶聯免疫吸附分析(ELISA)技術在RT下，將人類重組生物素化GM-CSF(R&DSystems)以存于PBS中的1.5jug/ml涂覆至中性鏈親和素微量滴定板上2h。在涂覆抗原后，在RT下用PBS/0.05%Tween(PBS-T)與1%BSA將孔阻斷1h。在用PBS-TBEL提取物洗滌所述孔后，將純化的HuCAL⑧Fab或對照IgG稀釋于PBS中，添加至所述孔中并在RT下培育lh。使用以下二級抗體來檢測一級抗體偶聯有堿性磷酸酶(AP)的AffiniPureF(ab')2片段、山羊抗人類、抗小鼠或抗大鼠IgG(JacksonImmunoResearch)。對于AP偶聯體的檢測，根據制造商說明書使用諸如AttoPhos(Roche)等熒光底物。在所有培育步驟之間將微量滴定板孔用PBS-T洗滌三次并在最后與二級抗體一起培育后洗滌三次。熒光在TECANSpectrafluor板讀數器上測量。B.基于電化學發光(BioVeris)的結合分析，用以檢測在溶解產物中的GM-CSF結合Fab對于檢測在大腸桿菌溶解產物(BEL提取物)中的GM-CSF結合Fab抗體，采取不同于ELISA實驗的另一種選擇，在BioVerisM-SERIES384分析儀(BioVeris，Eur叩e，Witney,Oxforfshire,UK)中對結合實施分析。為此，將BEL提取物至少1:50并且最多1:1000稀釋在分析緩沖液(PBS/0.05%Tween20/0.5。/。BSA)中以用于BioVeris篩選。將生物素化GM-CSF(R&DSystems)以0.1昭/ml濃度結合至涂有鏈親和素的順磁性珠粒Dynabeads(Dy-nal)。96或384孔板的每個孔使用25或15plDynabead-母液的1:25稀釋液。將珠粒用分析緩沖液洗滌三次后，在30min內在RT下于振蕩器上添加生物素化GM-CSF。然后將珠粒用分析緩沖液洗滌三次并且最后重新懸浮于新鮮的分析緩沖液中。使用BV-tag(BioVerisEurope,Witney,Oxfordshire,UK)對抗人類(Fab)'2(Dianova)實施釕標記。在臨使用前將所述二級抗體以6pg/ml濃度添加至結合有GM-CSF的珠粒中。將100或60pi含有Fab抗體的大腸桿菌表達培養物的經稀釋BEL提取物(見上文)填入96或384孔板的孔中并分別添加25或15jal結合有GM-CSF的珠粒加上抗Fab-BV-tagTM二級抗體的混合物至每個孔中并在RT下在板振蕩裝置上培育2h。在BioVerisM-SERIES384分析儀中對所述板進行分析。在序列分析后，識別出七十四(74)個顯示足夠強結合(在ELISA中信噪比大于10:1或在BioVeris中信噪比大于50:l)的特異克隆。對所述克隆進行表達、純化并在功能分析中進行測試。C.所選抗hGM-CSFFab的分子特異性及物種交叉反應性的測定對抗hGM-CSF抗體與以下分析物的交叉反應性進行測定大鼠及小鼠GM-CSF、人類IL-3、人類IL-4、人類IL-5、人類IL-13、人類M-CSF(全部來自Peprotech,London,UK)。所述在捕獲裝置中通過表面等離子體共振(Biacore3000,Uppsala,Sweden)實施。用5000-6000RU抗F(ab)2(Dianova，AffmipureF(ab)2片段山羊抗人類IgG,F(ab)2片段特異性)對CM5芯片(Biacore,Sweden)進行涂覆；在所有4個流式細胞上80pg/mllOmM乙酸緩沖液，pH值為4，使用標準EDC-NHS胺偶聯化學法。在流式細胞上，捕獲2-4個特異性GM-CSFFab(20pl500nMFab以5pl/ml流速，300-400RU)。在捕獲特異性Fab后，注入緩沖液以確定抗Fab/Fab相互作用的離解。在隨后的循環中，以介于15與2000nM之間的濃度注入分析物生長因子(20pl，流速為20pl/min)以測定特異性信號。然后，手動扣除特異性信號中所達成的緩沖液感應圖。在每一循環后，用100mMHC1(5pl)對流式細胞實施再生。對七個HuCAI^抗hGM-CSF抗體(包括MOR03684及MOR03682)進行測試并且所述抗體對人類GM-CSF具有特異性并且沒有與任何其他細胞因子或小鼠或大鼠GM-CSF結合。相反，FabMOR03929對大鼠GM-CSF顯示顯著的交叉反應性。實例3:抑制GM-CSF與GM-CSF受體a間相互作用的抗人類GM-CSFFab候選物的識別對選自HuCALGOLD②文庫的74個不同的hGM-CSF特異性抗體針對抑制GM-CSF與其受體間相互作用的潛力實施測試。以兩種方式測試所述相互作用(i)一種為使用GM-CSF依賴性TF-1細胞系的增殖分析(amura等人，1989)及(ii)另一種為用表達GM-CSF受體a鏈的重組CHO細胞系的ACS分析。在TF-1增殖分析中，對抗GM-CSF抗體阻斷GM-CSF與內源性GM-CSF受體(由a及|3鏈組成)間相互作用的能力加以分析，導致細胞增殖減少。在FACS分析中，對GM-CSF與GM-CSF受體a鏈間相互作用的特異性抑制進行測定。A.恒河猴(macacamulatta)及人類GM-CSF的克隆及表達通過基因合成(GeneARTGmbH,Regensburg,Germany)對恒河猴GM-CSF全長cDNA(GenBank登記號AY007376)加以合成并克隆至pCR-Script-Amp載體(Stratagene:LaJolla,CA,USA)中。隨后，將cDNA克隆至真核生物表達載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen，Paisley,UK)中產生pcDNA-macGM-CSF。通過RT-PCR技術自分離自lxl0e7TF-1細胞的RNA使用自Qiagen(Hilden,Germany)的RNeasy試劑盒克隆人類GM-CSF的cDNA(Genbank登記號NP_000749)。在通過PCR對GM-CSFcDNA實施擴增后，使用隨機六聚體(Gibco)用SuperscriptII試劑盒實施反轉錄。將所獲得的PCR產物克隆至表達載體pcDNA3.1(+)產生pcDNA-huGM-CSF。使用Lipofectamine(Stratagene,LaJolla,USA)分別用所述表達載體瞬時轉染HEK293細胞。在轉染后4天收獲含有分泌的重組恒河猴或人類GM-CSF的培養基。B.使用人類或恒河猴GM-CSF抗hGM-CSFFab對TF-1細胞的GM-CSF依賴性增殖的抑制根據提供商的方案(DSMZ,Braunschweig,Germany;DSMZ號ACC334)生長TF-1(Kitamura等人，1989)細胞。用RPMI1640培養基(10%FCS)對TF-1細胞實施兩次洗滌并隨后以平底96孔細胞培養皿的每個孔以2xl05細胞/ml濃度實施播種。將0.5ng/ml的人類重組GM-CSF("Leucomax"，ESSEXPharma,Mtinchen)及HuCAL②Fab抗體(200ng/ml-200ug/ml，在RPMI1640培養基中稀釋，10%FCS)混合30min并將50混合物添加至TF-1細胞中以使GM-CSF的最終濃度為0.25ng/ml。在最后GM-CSF濃度為0.25ng/ml下培育TF-1細胞(不加入抗體)測量最大細胞增殖(0%抑制)。TF-1增殖的100%抑制係通過自分析中省略GM-CSF并保持細胞僅在RPMI1640培養基(10%FCS)中測量。然后在37"和5%C02下在增濕室內將TFl細胞培育72小時。根據制造商的建議通過添加MTT或XTT試劑(Roche,Mannheim,Germany)測量細胞活力。總共識別出19個顯示顯著抑制TF-1增殖的Fab。粘合劑MOR03682、MOR03684及MOR03929在2濃度下顯示大于50%的TFl細胞增殖的一貫抑制。因為不能達成完全抑制，所以所述非最優化Fab的抑制活性的強度不足以測定IC5o劑量。相比之下，單克隆抗體BVD2-21C11(BDBiosciencesPharm-ingen;Cat存554503)及MAB215(R&DSystems;Ca說MAB215)能夠完全抑制TF-1增殖。此外，在TF-1增殖分析中對MOR03682及MOR03684與天然人類GM-CSF的結合加以測試。使用分泌天然人類GM-CSF至培養基中的5637細胞(DSMZ號:ACC35)的上清液，而不是添加經純化的人類重組GM-CSF至TF-1細胞中。自對用5637上清液不同稀釋液的重組人類GM-CSF效果進行比較的劑量反應曲線確定所述培養基含有約5ng/ml天然人類GM-CSF。通過用抗人類GM-CSFFabMOR03682或MOR03684對5637上清液實施預培育阻斷天然人類GM-CSF與TF-1細胞的結合，以使與用重組人類GM-CSF的實驗相比細胞的生存能力降低。因此，MOR03684及MOR03682結合至天然人類GM-CSF。在所述分析中沒有測試FabMOR03929。此外，在TF-1增殖分析中對與恒河猴GM-CSF的交叉反應性進行了測試。使用分泌重組恒河猴GM-CSF至培養基中的經轉染HEK293細胞的上清液，而不是添加純化的人類GM-CSF至TF-1細胞中。TF-1細胞在含有恒河猴GM-CSF的上清液存在下，而不是在經轉染HEK293細胞的上清液存在下增殖。自對用HEK-293培養基不同稀釋液的重組人類GM-CSF效果進行比較的劑量反應曲線確定所述經轉染細胞的培養基含有約2ng/ml恒河猴GM-CSF。通過用抗人類GM-CSFFabMOR03682或MOR03684對恒河猴GM-CSF上清液進行預培育阻斷恒河猴GM-CSF與TF-1細胞的結合，以使細胞的生存能力顯著降低。因此，MOR03682及MOR03684與恒河猴GM-CSF可交叉反應。在所述分析中沒有測試FabMOR03929。C.通過抗hGM-CSFFab阻斷GM-CSF結合至GM-CSF受體a為測試GM-CSF與細胞表面表達GM-CSF受體a鏈的結合，將cDNA克隆至表達載體中并穩定轉染至CHO-K1細胞(DSMZACCIIO)中。表達GM-CSF受體a鏈的穩定CHO-K1細胞系的克隆將人類GM-CSF受體a鏈的cDNA(Genbank登記號M64445)通過RT-PCR技術自分離自1xl0e7TF-1細胞的RNA使用自Qiagen(Hilden,Germany)的Rneasy試劑盒進行克隆。使用隨機六聚體(Gibco)用SuperscriptII試劑盒實施反轉錄。然后使用以下引物對GM-CSF-受體a鏈cDNA實施擴增5':N-GCRa-plusSS:TTCTCTGGATCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCC及3':C-flGCRa:ACCCTCCAATTGTCAGGTAATTTCCTTCACGGTC。所述PCR反應產生約1250bp的產物，其用EcoRI及BamHI(NewEnglandBioLabs)消化。用相同酶對表達載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen,Paisley,UK)加以消化。在對經消化的載體及PCR產物予以純化后，將所述片段連接并通過電穿孔轉化成大腸桿菌DH10B細胞。在制備質粒DNA并定序后識別正確的克隆。正確的克隆(pcDNA3.1(+)-GM-CSFRa)包含全長人類GM-CSF受體acDNA。根據提供商的方案(DSZM,Braunschweig,Germany;DSMZ號ACC110)生長CHO-K1細胞。對于轉染，使細胞在6孔板中生長至80%匯合并用5嗎與10^Lipofectamine2000試劑(Invitrogen)混合的pcDNA3.1(+)-GM-CSFRa的DNA實施培育。在48h后，用1mg/mlG418(Gibco)喂養細胞并在另外24h后，用所述含有2mg/mlG418者代替培養基。兩周后，將單一細胞播種至96孔培養皿的孔中。生長為單一的克隆并且對每個克隆的5xl()S個細胞針對GM-CSFR-a表達通過FACS分析使用在1嗎/ml濃度下的鼠科動物IgGMAB1006(ChemiconInternational,Temecula,CA)作為一級抗體及以1:200稀釋的(R-PE-AffiniPure(Fab')2山羊抗小鼠IgG(Dianova)作為二級抗體實施測試。將一級及二級抗體依序與所述細胞一起培育1h，同時在所述步驟之間在FACS緩沖液(PBS，3。/。FCS)中洗滌細胞。經染色細胞的熒光性在FL2通道中使用FACSCalibur系統(BectonDickinson)予以量化。在所分析的克隆中，克隆CHO-GMRa#ll顯示最高的中值熒光強度。CHO-GMRa#ll的中值熒光值(MFL值)經測定為157(圖6)。GM-CSF結合至在CHO-GMRa#ll上表達的GM-CSF受體a的FACS分析在添加至細胞中之前，于RT下將濃度增加(0.1至100pg/ml)的抗體與生物素化GM-CSF(0.5昭/ml)在FACS緩沖液(PBS/3。/。FBS/NaN30.05。/。)中共培育30min。所有染色皆在圓底96孔培養板(NalgeNunc)中實施，其中每孔有1-5x105個細胞。將2xlOE5個CHO-GMRa#ll細胞吸收于50^1含有抗體/GM-CSF的FACS緩沖液中并在4。C下培育1h。然后將細胞用150plFACS緩沖液/孔洗滌一次并吸收于100pl經藻紅蛋白標記的鏈親和素(BDBiosciencesPharmingen)中，其已在FACS緩沖液中以1:400稀釋。在4"下培育lh后，將細胞用FACS緩沖液洗滌兩次，重新懸浮于100plFACS緩沖液中并經由細胞在FACScalibur(BectonDickinson)中的FL2熒光強度測量與生物素化GM-CSF的結合。ICs。值自使用GraphPadPrismv3.03軟件所獲得的劑量反應曲線應用非線性回歸曲線擬合確定。Fab抗體MOR03682、MOR03684及MOR03929顯示顯著抑制GM-CSF結合至細胞表面表達GM-CSF受體a。實例4:通過逐步交換CDR盒的所選Fab的親和力成熟A.親和力成熟Fab文庫的產生及淘選為提高抗GM-CSFFab片段的親和力及抑制活性，使克隆MOR03682、MOR03684及MOR03929經受親和力成熟。在這點上，通過盒式誘變使用三核苷酸定向誘變使CDR區最優化(Vimekas等人，1994;Nagy等人，2002)。序列分析揭示在所分析的三個親本克隆的CDR間沒有序列同源性。表2a及2b提供親本克隆MOR03682、MOR03684及MOR03929的6個CDR肽序列。下面簡要闡述用于Fab最優化的方案。將自表達載體pMORPHX9Fab—FH的Fab片段克隆至噬粒載體中(美國專利第6,753,136號)。然后，應用兩個不同的策略使親本Fab的親和力及功效最優化。首先，產生一個噬菌體抗體Fab文庫，其中每個親本的L-CDR3由個體X輕鏈CDR3序列的全體替代。在第二文庫中，H-CDR2區由個體重鏈CDR2序列的全體替代。通過將多樣化的克隆轉化成大腸桿菌TOP10F'(Invitrogen)產生親和力成熟文庫。如實例1A中所述制備噬菌體。集中MOR03684及MOR03682二者的L-CDR3文庫并且集中源自MOR03684及MOR03682二者的H-CDR2文庫，然而源自MOR03929的L-CDR3及H-CDR2文庫在選擇過程中分開保存。基本上如實例1B中所述并應用更嚴格的選擇條件在溶液中的生物素化GM-CSF上實施三輪淘選。B.基于電化學發光(BioVeris)的結合分析，用以檢測溶解產物中改良的GM-CSF結合Fab對于大腸桿菌溶解產物(BEL提取物)中GM-CSF結合Fab抗體的檢測，基本上如實例2B中所述在BioVerisM-384SERIESWorkstation(BioVerisEurope,Witney,Oxforfshire,UK)中對結合實施分析。對具有最高ECL值的Fab實施純化并通過溶液平衡滴定(SET;Haenel等人，2005)及表面等離子體共振(Biacore)(見實例4D)對其進行親和力測量。C.改良的VL(L-CDR3)與改良的VH(H-CDR2)的X-克隆為進一步改良親和力，將來自成熟Fab(源自相同親本克隆)的獨立優化的H-CDR2及L-CDR3結合，因為所述結合會達成親和力進一步增加的可能性較高(Yang等人，1995;Schier等人，1996;Chen等人，1999)。將所述過程(稱為X-克隆)應用至源自親本克隆MOR03929的粘合劑，因為自H-CDR2及L-CDR3文庫二者中均識別出具有改良親和力的Fab。所述可通過將整個輕鏈(Xbal/Sphl片段)自L-CDR3-最優化的供體克隆轉移至H-CDR2-最優化的受體克隆完成。表3:X-克隆結合<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>對于所得到的4個Fab，對VL及VH實施定序以確定將正確的VL轉移至各自H-CDR2改良的載體骨架。表2a及2b顯示列于表3中的所有MOR03929及3682的衍生物的VH及VL蛋白質序列。D.利用溶液平衡滴定(SET)及表面等離子體共振(Biacore)測定微微摩爾親和力對于KD測定，使用Fab的單體部分(至少90%單體含量，通過分析型SEC進行分析；Superdex75,AmershamPharmacia)。溶液中基于電化學發光(ECL)的親和力測定及數據評價基本上如Haenel等人(2005:AconstantamountofFabwasequilibratedwithdifferentconcentrations(serial5"dilutions)ofhumanGM-CSF(Leucomax)insolution.)所述實施。添加結合至順磁性珠粒(M-280Streptavidin,Dynal)的生物素化人類GM-CSF(R&DSystems)及經BV-tagTM(BioVerisEurope,Witney,Ox隱forfshire,UK)標記的抗人類(Fab)'2(Dianova)并培育15-30min。隨后，使用M-SERIES384分析儀(BioVerisEurope)經由ECL檢測對未結合的Fab進行量化。根據Friguet等人，1985，在檢測期間注意避免顯著的至固相的平衡偏移。使用上文所述分析條件測定Fab的親和力，其顯示于表4中。此外，動力學SPR分析在Fl芯片(Biacore，Sweden)上使用標準EDC-NHS胺偶聯化學法實施，所述芯片涂覆有存于10mMNa-乙酸鹽(pH值為4.5)中的密度為約100的RU重組人類GM-CSF(Peprotech)。將相應量的HSA固定在參考流式細胞上。PBS(136mMNaCl，2.7mMKC1,10mMNa2HP04，1.76mMKH2P04，pH值為7.4)加上0.005%Tween20用作運行緩沖液。以6.3-200nM濃度系列以20pl/min流速使用Fab。締合期設定為60s且離解期設定為120s(親本的)或至多600s(親和力最優化的)。為在較長時間內檢測離解期，使用基本上根據Drake等人，(2004)的以下條件以200nM單一濃度使用Fab;流速設定為100pl/min并且離解期設定為6000-18.000s。基于在所述分析條件下測定的解離速率(off-rate)率估計Fab的親和力，其顯示于表4中。表4:通過Biacore及溶液平衡滴定(SET)所測定的抗hGM-CSFFab的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>E.利用溶液平衡滴定(SET)測定對大鼠GM-CSF的親和力基本上如實例4D中所述，在溶液中使用大鼠GM-CSF(Peprotech)(而不是人類GM-CSF)作為分析物實施對大鼠GM-CSF親和力的測定。根據Haenel等人，(2005)計算親和力。在所述分析中，FabMOR04357對大鼠GM-CSF的親和力測定為Kd=1.0nM。實例5:抑制GM-CSF與GM-CSF受體a鏈間相互作用的最優化的抗人類GM-CSFFab的表征A.GM-CSF受體a結合分析如上文(實例3C)所述，使用0.5pg/ml(35nM)生物素化GM-CSF實施GM-CSF受體結合分析。通過在最終GM-CSF濃度為0.5pg/ml的生物素化GM-CSF(不加入抗體)下培育細胞測量GM-CSF對CHO-GMRa#ll細胞的最大結合(0°/。抑制)。GM-CSF結合的100%抑制通過自分析中省略GM-CSF測量。ICs。值自使用GraphPadPrismv3.03軟件所獲得的劑量反應曲線應用非線性回歸曲線擬合確定。對具有改良親和力的Fab、親本Fab及單克隆參考IgG實施分析。表5概述在所述分析中所獲得的ICso值。在5pg/ml抗體濃度下達成的％抑制也在表5中給出表5:在受體抑制分析中抗hGM-CSFFab的ICso值<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*在此情況下沒有s形劑量反應曲線可以擬合所述分析定性顯示自親和力成熟及X-克隆所獲得的Fab阻止GM-CSF結合至GM-CSF受體a鏈并且因此保留其親本Fab的阻斷機制。所述分析需要用35nM(0.5pg/ml)濃度的生物素化GM-CSF實施以在FACS中獲得顯著信號。因此，阻斷50。/。GM-CSF理論上需要17.5nMFab(或8.75nMIgG)，因而對確定1(35()值設定了限制。B.使用人類GM-CSF抗hGM-CSFFab對TF-1的GM-CSF依賴性增殖的抑制如實例3B中所述實施TF-1增殖分析。對具有改良親和力的Fab及親本Fab以及單克隆參考IgG實施分析。IC5。值自使用GraphPadPrismv3.03軟件所獲得的劑量反應曲線應用非線性回歸曲線擬合確定。表6概述在所述分析中所獲得的ICso值。表6:在TF-1增殖分析中抗hGM-CSFFab及對照IgG的IQo值<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在另一組實驗中，測定親本FabMOR03682、其親和力成熟衍生物MOR04283、MOR04297及x-克隆變體MOR04342在TF-1增殖分析中的IQo值。表7概述在所述分析中所獲得的IQ。值。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>所述實驗顯示在親和力成熟及X-克隆后達成ICs。值較大改良。例如，MOR04357、MOR04350、MOR04354顯示與其親本MOR03929相比改良>2000倍的IC5o值并且超過BVD2-21C11及Mab215的潛力。實例6:MOR04357轉化為人類IgGl形式A.使FabDNA序列基因最優化以在哺乳動物表達系統中表達。為使MOR04357VH及VL的DNA最優化以便哺乳動物基因表達(例如改變密碼子用法、GC含量等)，利用自Geneart(Regens-burg,Germany)的GeneOptimizerTM軟件確定所述最優化的VH及VLDNA序歹!j，其在Geneart(Regensburg，Germany)基因合成并克隆至pPCR-Script載體中，產生055906pPCR-Script及055907pPCR-Script。SEQIDNO:48顯示各自的VH序列，而SEQIDNO:57顯示各自的VL序列。B.克隆FabMOR04357至人類IgGl形式中及IgGl表達為表達全長免疫球蛋白(Ig)，將基因最優化的重鏈(VH)及輕鏈(VL)的可變結構域片段自pPCR-Script載體(實例5a)亞克隆至人類IgGl的pMORPH2_h_Ig載體系列中。自055906pPCR-Script經由Nhel/Blpl消化分離出MOR04357經密碼子最優化的VH并插入經相同限制酶切割的pMorph2—h—IgGlf主導載體中。所述載體已經含有人類恒定區。所得表達質粒稱為pMorph2—h—IgGlf_MOR04357—co。自055907pPCR-Script經由Nhel/Hpal消化分離出MOR04357經密碼子最優化的VL并插入經相同限制酶切割的pMorph2一h—IgX2主導載體中。所述載體已經含有人類V直定區。所得表達質粒稱為pM2_h—IgX2_MOR04357一co。C.人類IgG的瞬時表達及純化用等摩爾量的igG重鏈及輕鏈表達載體DNA對真核生物HKB11細胞實施轉染。在轉染后3至7天收獲細胞培養物上清液。在將上清液的pH值調節至8.0并無菌過濾后，對溶液實施標準蛋白質A親和色譜法(rProteinAFF或MabSelectSURE,GEHealthcare)。將緩沖液交換為1xDulbcecco'sPBS(pH7.2,Invitrogen)并對樣品實施無菌過濾(0.2pm)。相對1xDulbcecco'sPBS(pH6.5,Invitrogen)對MOR04357IgGl實施透析。在變性、還原條件下于SDS-PAGE中或通過使用AgilentBioAnalyzer及在天然狀態下通過SE-HPLC分析IgG的純度。D.利用溶液平衡滴定(SET)測定微微摩爾親和力対于Kd測定，使用IgGl的單體部分(至少90%單體含量，通過分析型SEC進行分析；Superdex75，AmershamPharmacia)。溶液中基于電化學發光(ECL)的親和力測定及數據評價基本上如Haenel等人，2005所述及如實例4B中所述實施。MOR04357IgGl對人類重組GM-CSF的KD值經測定為1.1pM。E.利用溶液平衡滴定(SET)測定對大鼠GM-CSF的親和力基本上如實例4D中所述，在溶液中使用大鼠GM-CSF(Peprotech)(而不是人類GM-CSF)作為分析物實施對大鼠GM-CSF親和力的測定。根據Haenel等人，(2005)計算親和力。MOR04357IgGl對大鼠重組GM-CSF的KD值經測定為130pM。實例7:源自最優化抗人類GM-CSFFab的MOR04357IgGl的表征A.使用人類及恒河猴GM-CSF抗hGM-CSFIgG對TF-1的GM-CSF依賴性增殖的抑制如實例3B中所述實施TF-1增殖分析。以IgGl形式對MOR04357加以分析并且作為對照對單克隆參考IgG加以分析。ICso值自使用GraphPadPrismv3.03軟件所獲得的劑量反應曲線應用非線性回歸曲線擬合確定。表8概述在所述分析中所獲得的IC50值。在所述分析中使用GM-CSF的三種不同變體:第一，在大腸桿菌中產生的0.25ng/ml濃度的重組人類GM-CSF;第二，自經pcDNA-huGM-CSF瞬時轉染(見實例3A)的HEK293的培養物上清液，其含有重組人類GM-CSF;及第三，自經pcDNA-macGM-CSF瞬時轉染(見實例3A)的HEK293細胞的培養物上清液，其含有重組恒河猴(macacamulatto或rhesus)GM-CSF。對于TF-1增殖分析，在TF-1細胞顯示與在0.25ng/ml在大腸桿菌中產生的經純化重組人類GM-CSF的規定濃度下所給增殖相比相似的增殖的稀釋液中，使用所述HEK293培養物上清液作為各自GM-CSF的來源。表8:在TF-1增殖分析中MOR04357IgG及對照IgG的IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>所述實驗顯示在親和力成熟及X-克隆后達成IC5o值的較大改良，其中在自Fab轉化為IgGl形式后保存。IgGlMOR04357顯示與FabMOR03929相比改良>2000倍的IC5Q值并且超過BVD2-21C11及Mab215的潛力。參考文獻Alvaro-GraciaJM,ZvaiflerNJ，BrownCB，KaushanskyK及FiresteinGS.(1991).Cytokinesinchronicinflammatoryarthritis.VI.Analysisofthesynovialcellsinvolvedingranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorproductionandgeneexpressioninrheumatoidarthritisanditsregulationbyIL-1andtumornecrosisfactor-alpha.JImmunol146,3365-3371.Babior,B.(2000).Phagocytesandoxidativestress.AmJMed109,33-44.Bonfield,T丄.，Kavuru,M.S.及Thomassen，M丄(2002).Anti隱GM-CSFtiterpredictsresponsetoGM-CSFtherapyinpulmonaryalveolarproteinosis.ClinImmunol105,342-350.Bozinovski,S.,Jones,J.,Beavitt,S丄,Cook,A.D.，Hamilton,J.A.及Anderson,G.P.(2003).InnateimmuneresponsestolipopolysaccharideinmouselungaresuppressedandreversedbyneutralizationofGM-CSFviarepressionofTLR-4.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.Broide,D.H.及Firestein,G.S.(1991).Endobronchialallergenchallengeinasthma.Demonstrationofcellularsourceofgranulocytemacrophagecolony-stimulatingfactorbyinsituhybridization.JClinInvest88,1048-1053.Broide,D.H.，Paine,M.M.及Firestein,G.S.(1992).Eosinophilsexpressinterleukin5andgranulocytemacrophage-colony-stimulatingfactormRNAatsitesofallergicinflammationinasthmatics.JClinInvest90,1414-1424.Brown,C.B.,Pihl,C.E.及Kaushansky，K.(1994).Mappingofhumangranulocyte-macrophage曙colony-stimulating-factordomainsinteractingwiththehumangranulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor陽receptoralpha-subunit.EurJBiochem225,873-880.Burmester,G.R.,Stuhlmuller.B.，Keyszer,G.及Kinne,R.W.(1997).Mononuclearphagocytesandrheumatoidsynovitis.MastermindorworkhorseinarthritisArthritisRheum40,5-18.Campbell,I.K.,Bendele，A"Sm他，D.A.及Hamilton,J.A.(1997).Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorexacerbatescollageninducedarthritisinmice.AnnRheumDis56，364-368.Campbell，I.K.，Rich,M丄，Bischof，R丄，Dunn，A.R.,Grail,D.及Hamilton,J.A.(1998).Protectionfromcollagen-inducedarthritisingranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor-deficientmice.JImmunol161，3639-3644.Carrieri,P.B.,Provitera,V"DeRosa,T.,Tartaglia，G.，Gorga,F.及Perella,O.(1998).Profileofcerebrospinalfluidandserumcytokinesinpatientswithrelapsing-remittingmultiplesclerosis:acorrelationwithclinicalactivity.ImmunopharmacolImmunotoxicol.20:373-382.Cebon,J.，Nieola，N.A.，Ward,M.,Gardner,I.,Dempsey，P丄,Layton,J.E.,Duhrsen,U.,Bur陽gess,A.，Nice,E.C.及Morstyn,G.(1990).Granulocyte-macrophagestimulatingfactorfromhumanlymphocytes.JBiolChem265,4483-4491.Chantry,D.，Turner,M.,Brennan,F.,Kingsbury,A.及Feldmann，M.(1990).Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorinducesbothHLA-DRexpressionandcytokineproductionbyhumanmonocytes.Cytokine2,60-67.ChenY"WiesmannC.,FuhG"LiB.,ChristingerH.W.,McKay.P，deVosA.M.,LowmanH.B.(1999).Sele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、27、28、29、30、53、54、55、56或57;或(ii)在高度嚴格的條件下與SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、53、54、55、56或57的互補鏈雜交的核酸序列，其中所述抗體或其功能片段對人類GM-CSF具有特異性。29、一種載體，其包含如權利要求24至28中任一權利要求所述的核酸序列。30、一種經分離的細胞，其包含如權利要求29所述的載體。31、如權利要求30所述的經分離的細胞，其中所述細胞為細菌細胞。32、如權利要求30所述的經分離的細胞，其中所述細胞為真核細胞。33、一種醫藥組合物，其包含如權利要求1至6中任一權利要求所述的人類或人源化抗體或功能片段和用于此的醫藥上可接受的載劑或賦形劑。34、一種治療與不期望存在GM-CSF有關的疾病或病癥的方法，其包括向有需要的個體投與有效量的如權利要求33所述的醫藥組合物的步驟。35、如權利要求34所述的方法，其中所述疾病或病癥為炎癥性疾病。36、如權利要求35所述的方法，其中所述炎癥性疾病選自類風濕性關節炎、多發性硬化癥、克羅恩(Crohn's)病、牛皮癬、哮喘病、特應性皮炎和休克的列表。37、如權利要求1至6中任一權利要求所述的人類抗體，其中所述人類抗體為合成人類抗體。38、如權利要求18或19所述的經分離的抗原結合區，其中所述序列一致性為至少80%。全文摘要本發明提供對在多種疾病或病癥中起重要作用的GM-CSF具有特異性的重組抗原結合區、抗體和其功能片段。因此，這些抗體可用于治療(例如)諸如類風濕性關節炎等炎癥性疾病。本發明抗體也可用于診斷學領域，以及用于進一步研究GM-CSF在多種疾病進展中的作用。本發明也提供編碼前述抗體的核酸序列、包含所述核酸序列的載體、醫藥組合物和帶有使用說明的試劑盒。文檔編號C07K16/24GK101218255SQ200680024981公開日2008年7月9日申請日期2006年5月17日優先權日2005年5月18日發明者伊麗莎白·托馬森-沃爾夫,斯特凡·施泰德爾申請人:莫菲西斯公司