專利名稱::改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物及其作為用于陰離子生物活性因子的轉染劑的用途的制作方法改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物及其作為用于陰離子生物活性因子的轉染劑的用途發明領域本發明涉及包括內部陽離子胺(銨)基和外部非毒性端基的改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物、包括所述樹枝狀聚合物的藥物組合物、用子的轉染劑的用途、,用于基因治療特、別是用于治j"癌癥的用途。'、
背景技術:
樹枝狀聚合物為具有明確定義的、高度支化的分子結構的合成大分子,其以算術逐步方式合成。每個重復的反應序列產生所謂的"更高代"(G)分子,其具有實際上雙倍的分子量和雙倍(離散)數量的官能端基。從1985年以來,已經研發了許多化學不同類型的樹枝狀聚合物,比如Tomalia的聚(酰胺基氨基)PAMAM-樹枝狀聚合物、Newkome的arborols、Fr6chet的聚醚樹枝狀聚合物、Meijer和Miilhaupt的聚(丙烯亞胺)PPI-樹枝狀聚合物和Moore的苯乙炔樹枝狀聚合物(SchlmerDA,1999)。因為它們限定的結構、窄的多分散性、限定的納米尺寸和端基的易改進性,樹枝狀聚合物被認為是用于生命科學和藥物化學中各種功能的令人感興趣的候選物。特別地,已經研究了它們作為在藥物治AK等人,2002;EsfandR等人,2001,LiuM等人1999,StiribaSE等人,2002,BosmanAW等人,1999,TangMX等人,1997)。基因治療定義為將核酸(比如DNA)遞送至細胞中,優選真核細胞(比如人類細胞)以獲得治療效果。該效果可由對治療有用的矯正遺傳缺陷或者(過)表達蛋白質引起。在樹枝狀聚合物中,PAMAM樹枝狀聚合物作為用于基因遞送的潛在轉染劑最受注意,因為這些樹枝狀聚合物帶正電荷,并且可以結合在生理學pH下的DNA。也已研究了一些其它的樹枝狀聚合物類型(LoupC等人,1999,ChoiJS等人,2000,OhasakiM等人,2002,ShahDS等人,2000,LiuMJ等人,1999,JoesterD等人,2003)。Szoka等人最先提供了成功地由PAMAM樹枝狀聚合物介導的DNA-轉染,如由體外試驗證實(HaenslerJ等人,1993)。隨后,公開了有關PAMAM-樹枝狀聚合物的協同和轉染行為的其它研究(Kukowska-LatalloJ等人,1996,DeLongR等人,1997,BielinskaA等人,1996,ShchepinovMS等人,1997,QinL等人,1998,YooH等人,1999,ChengH等人,2000,OttavianiMF等人,2000,KiharaF等人,2003)。特別地,已經發現熱處理的、部分降解的PAMAM-樹枝狀聚合物作為體外DNA載體進行得更好(TangMX等人,1996):這些活化的PAMAMs是以名稱SuperFect(Qiagen②)商業可獲得的。已經報道用于PAMAM樹枝狀聚合物的成功轉染必須使用約5-20的電荷比(電荷比定義為位于PAMAM中的末端陽離子胺的數目與在DNA中的磷酸酯的數目之比),即過量的轉染劑(HaenslerJ等人,1993,BielinskaAU,等人,1999)。也已提出將其中一部分末端胺已經用二醇鏈改性的PAMAM樹枝狀聚合物作為潛在的DNA-轉染劑(LuoD等人,2002)。然而,在該研究中,高濃度的樹枝狀聚合物已被用于DNA結合和轉染試驗,同時需要使用那些以較低濃度作用的試劑。對PAMAM樹枝狀聚合物的最新研究給出了它們與細胞膜相互作用的基本信息(HongS等人,2004),同樣在基因載體設計中下一步驟已作為已經制備和研究的靶向抗體部分的PAMAMs(ThomasTP等人,2004),并且已經表明PAMAMs可以與RNA分子相互作用,導致抑制某些核酶的活性(WuJ等人,2005)。確定轉染劑的有用性的重要因素是該試劑的毒性和效力。雖然某些文獻(RobertsJC等人,1996)已經表明PAMAM樹枝狀聚合物具有的毒性取決于它們的代,并且其它文獻(SzokaFC等人,1996)已證實PAMAM樹枝狀聚合物比聚賴氨酸(pLys)的毒性更小,但其它數據建議特別是胺封端的PAMAM樹枝狀聚合物顯示出溶血和細胞毒性行為,而具有末端羧酸酯基團的PAMAM樹枝狀聚合物是無毒的(DuncanR等人,1996,MalikN等人,2000)。不幸的是,當使用具有高級胺官能化的PAMAM樹枝狀聚合物時,似乎轉染更有效,大概是因為這對于在生理學pH的DNA結合產生了更多的陽離子位點(參見例如在TangMX1996中的圖7)。聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物是在DSMResearch(Geleen,theNetherlands)(deBrabander-van-denBergEMM等人,1993)和獨立地在Miilhaupt組(W6rner等人,1993)中研發的一類特定種類的樹枝狀聚合物。表1顯示五種胺封端的PPI-樹枝狀聚合物的分子特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>它們是在SyMO-Chem(www.svmo-chem.nl,Eindhoven,theNetherlands)商業可獲得的,而且可以作為用于改性目的的原料起作用。作為一個實例,第二代PPI-樹枝狀聚合物的分子結構表示在圖1中。PPI-樹枝狀聚合物的特征在于它們的分子量、它們的外部胺端基和內部叔胺基(參見表l)。當然,由于在各代合成中的反應不完全,樹枝狀聚合物可以是不完善的,因此某些內胺的功能也可以具有仲胺功能。在本發明的上下文中,應當理解PPI樹枝狀聚合物指1、2、3、4或5代樹枝狀聚合物,進一步包括不完全的樹枝狀聚合物及其混合物,在改性前,包括相當數量的內叔胺基。具有胺端基的PPI-樹枝狀聚合物在水中緩慢地降解,更重要地,毒性太大而不能用于在DNA-遞送系統中使用,盡管有結合(KabanovVA等人,2000)和轉染(ZinselmayerBH等人,2002)測定的報道。文獻結構的毒性,而與其內"^結構無關(MadkN^^人,2olo)。^)此,可以化學改性PPI-樹枝狀聚合物的表面以產生具有低毒性的遞送系統;另外,表面改性也可以促進水溶性和對水解的穩定性。除了外部改性外,通過季銨化內部叔胺以產生陽離子銨位點來改性PPI或PAMAM樹枝狀聚合物的內部是可能的。實際上,之前已經報道了PPI-樹枝狀聚合物的季銨化反應(Elissen-RomanC等人,1997,PanY等人,1999,PanY等人,2000)。Ford等人(KreiderJL等人,2001)給出了具有在外部和季4妄化的內部位點的短的二醇鏈的G2和G4PPI樹枝狀聚合物,但是該作者;i最近,也已經報道了具有陽離子改性的內部的PAMAMs:當用熒光素酶基因表達試^r測定時,它們的轉染效力比PEI或未改性的PAMAM參照物的低(LeeJH等人,2003)。雖然作者沒有提及這一點,但內部季銨化的PAMAMs^艮可能易于顯示出逆向邁克爾加成反應,意味著這些陽離子改性的樹枝狀聚合物大都可能降解而不穩定。
發明內容根據本發明,給出了改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物,其中所述聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物在外部和內部改性,旨在產生用于陰離子生物活性因子的水溶性的、水解穩定的和無毒的轉染劑。通過將胺端基轉變成式(I)的基團來在外部改性所述PPI-樹枝狀聚合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中R為選自Cwo烷基、聚乙二醇基和聚乙二醇沒食子基(gallyl)的基團,因為這些端基保留了水溶性,同時證實其阻斷了胺端基產生無毒的物質。通過內部(主要是叔)胺基與季銨化試劑比如碘曱烷、氯甲烷等反應來改性PPI-樹枝狀聚合物的內部,從而產生具有多個季銨化陽離子位點的微環境。根據PPI-樹枝狀聚合物的代,分別對于第l代和第5代,陽離子位點的量可以從2至60變化,條件是所述季銨化反應定量地進行。預期在樹枝狀聚合物內部高局部濃度的陽離子位點會使這類樹枝狀分子能夠與陰離子生物活性因子形成絡合物。因此,本發明涉及l、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物,也包括不完全的樹枝狀聚合物及其混合物,包括外部端基和內部胺基,其特征在于(a)基本上所有的外部端基為式(I)的基團,其中R為選自下述的基團Cu烷基,下式的聚乙二醇基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中n為3、4、5、6、7、8、9、10、11或12;和下式的聚乙二醇沒食子基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中每個m獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12;和(b)基本上所有的內部胺基為陽離子季銨基團。另外,本發明涉及l、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物,也包括不完全的樹枝狀聚合物及其混合物,其特征在于所述(a),首先聚(丙;希亞胺)初f枝狀聚合物與酰化劑反應,所述聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物基本上包含外部胺端基和內部叔胺基,所述酰化劑選自乙酸酐、d-化烷基鹵化物、下式的聚乙二醇酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中n為3、4、5、6、7、8、9、10、11或12;和下式的聚乙二醇沒食子酰卣化物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中每個m獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12,并且X為卣化物;和(b)步驟(a)中得到的產物與季銨化試劑反應。優選地,所述Cwo烷基為甲基、乙基、異丙基、正丙基、叔丁基、正丁基或戊基。最優選地,Cw。烷基為曱基。作為卣化物,氯化物、溴化物或碘化物是優選的。氯化物為特別優選的。優選地,n為3、4、5或6,最優選3或4。優選地,m為3、4、5或6,最優選3或4。作為季銨化試劑,可以使用本領域技術人員已知用于進行預期任務,即將叔胺基轉化成季銨基的任何試劑。優選地,使用面代曱烷,最優選碘曱烷,但也可以使用包括do烷基的試劑作為相轉移劑。結合是指可逆地偶合具有至少一個陰離子位點的化學個體與至少一個陽離子位點的任何相互作用。本發明也涉及適于給藥至哺乳動物,優選人類的藥物組合物,其特征在于其包括(a)根據本發明的改性聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物;和(b)陰離子生物活性治療因子。陰離子生物活性因子是指任何能夠與陽離子位點結合的化學個體,特別是藥物活性化合物、核酸、核酸序列、DNA和RNA的低聚物、多核苷酸、DNA酶、單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈RNA、反義RNA和DNA、錘頭(hammerhead)RNA、短干擾RNA、微RNA、核酶等;或其組合。特別優選的是具有相對低分子量,優選等于或少于5,000道爾頓的陰離子生物活性因子,更特別地是具有相對低數量的堿基對(例如低聚DNAs或低聚RNAs),優選少于50個堿基對。在本申請中,本發明人使用了33個鏈節的單鏈催化的DNA酶作為核酸模型來研究新提出的改性PPI-樹枝狀聚合物的結合和轉染能力。已經在體外以及體內進行了所述轉染試驗。因為它們在血清和血液中的低毒性和穩定性,本發明的樹枝狀化合物適宜作為轉染劑,并且包括所述化合物的藥物組合物尤其適用于基因治療,最優選在人類中,更特別用于癌癥的治療。更優選地,所述癌癥為與肝、腎有關的腫瘤、急性淋巴母細胞性白血病、急性粒細胞白血病、尤因肉瘤、妊娠期滋養層癌、何杰金病、非何杰金(氏)淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤擴散大細胞淋巴瘤(Burkitt'slymphomadiffuselargecelllymphoma)、濾泡性混合淋巴瘤、成'淋巴細胞性淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、陰嚢癌、腎母細胞瘤、肛門癌、膀胱癌、乳腺癌、'l"曼性淋巴細胞性白血病、慢性粒性白血病、毛細胞白血病、腦癌和頸癌、肺(小細胞)癌、多發性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、卵巢癌、腦腫瘤(星形細胞瘤)、宮頸癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、卡波濟氏肉瘤、肺(非小細胞)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、乳腺癌、結腸直腸癌(m期)、骨肉瘤、卵巢癌(m期)或其組合。本發明也涉及l、2、3、4或5代的改性聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物,也包括不完全樹枝狀聚合物及其混合物,包括外部端基和內部胺)述S基團Q二烷基、下式的聚乙i醇i:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中n為3、4、5、6、7、8、9、10、11或12;和下式的聚乙二醇沒食子基其中每個m獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。另外,本發明涉及l、2、3、4或5代的改性聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物,也包括不完全的樹枝狀聚合物及其混合物,其特征在于所述改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物是通過下述步驟獲得的首先聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物與酰化劑反應,所述聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物基本上包含外部胺端基和內部叔胺基,所述酰化劑選自乙酸酐、C!-o烷基卣化物,下式的聚乙二醇酸其中每個m獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12,并且X為卣化物。本發明現在將用大量實驗來更詳細地闡述和解釋,但不限于此。已經在文獻中描述了用二醇沒食子酸酯基改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物的合成(參見Baars,M.W.P丄.,Kleppinger,R.,Koch,M.H丄,Yeu,S丄.,Meijer,E.W.,Angew.Chem.Int.EdEngl.,2000,39,1285和該文獻的引用信息)。對于二醇沒食子酸酯(即沒食子酸或3,4,5-三羥基苯曱酸,由三個單曱氧基四甘醇基團修飾)的合成,可以參閱相同的參考文獻。在之前的文獻中沒有報道用乙酰基或聚乙二醇沒食子酸酯基季銨化的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物。-C6H2-3,4,5^(0--CH2——CH2—O--Me)3HOOC—CH2—O--CH2_CH2—O--Me其中n為3、4、5、6、7、8、9、10、11或12;和下式的聚乙二醇沒食子酰囟化物實驗1.改性聚(聚乙烯亞胺)樹枝狀聚合物的合成具有胺端基的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物從SyMO-Chem(www.svmo-chem.nl)獲得,并且通常表示為DAB-Am-4(1代)、DAB-Am-8(2代)、DAB-Am-16(3代)、DAB-Am-32(4代)和DAB-Am-64(5代),分別為第一、第二、第三、第四和第五代。DAB代表l,4-二氨基丙烷核,Am代表胺端基,給定的數字代表端基的數目。使用的溶劑通常具有p.a.性質。使用的溶劑和試劑包括曱醇(Biosolvep.a.)、曱苯(Biosolvep.a.)、二氯曱烷(Biosolvep.a.)、水(經柱軟化)、三乙胺(Fluka,>99%,儲存在KOH-小球上)、乙酸酐(Acrosp.a.)、草酰氯(Acros)和碘甲烷(Merck,保存在冰箱中)。已經使用了具有容積〉1.2meq/ml(Acros)的Dowex1x8-50(Acros)Cr陰離子交換樹脂和Dowex550A0H(25-35目)強堿性OT陰離子交換樹脂(Aldrich)。可以通過進行試驗來檢查從碘化物到氯化物的離子交換成功。首先,將幾mg的樹枝狀聚合物產物溶于約1mL水中,加入幾滴濃的H2〇2(35%-溶液,Merck)。在該階段,含r的樹枝狀聚合物應歸于形成12)。在加入約1mL新制備的淀粉溶液后,含r的樹枝狀聚合物溶液變成深藍色,而含Cl—的樹枝狀聚合物沒有引起所述溶液有顏色。通過加入可溶性淀粉粉末(lg,Merck)至良好攪拌的沸水(100mL)中獲得淀粉溶液。在一分鐘后,冷卻所述溶液,并立即用于該試驗。表II:改性的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表II列出了已經合成的改性聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物。作為透析膜,使用SpectrumLaboratoriesSpectra/Por管(已經施用了多種切去(cutoff)MWCO物質)。在氬氣的惰性氣氛下常規地進行反應。在VarianMercuryVx400MHz或VarianGemini300MHz光i普4義上進行NMR分析。在分離后,將制備的樹枝狀聚合物通常儲存在-20'C或4"C的黑暗中。1.2.DAB-樹枝狀-(NHCOCH^—或"G2(G2V~N~^將第二代胺封端的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(6.50g;8.40mmol;FW二773)溶于甲醇(50mL)和三乙胺(6.8g;67.24mmol)中。在1分鐘期間加入乙酸酐(8.24g;80.8mmol)(回流;沒有外部冷卻)。在攪拌2.5小時后,在旋轉蒸發器上蒸發所述溶液,并且用曱醇洗提一次。用Dowex550AOH(25-35目)填充柱,先用水洗滌,然后用曱醇(這是有些放熱性的)洗滌所述離子交換樹脂。以滴加的方式洗脫在曱醇中的粗樹枝狀聚合物,以便給予所述交換過程足夠的時間。通過旋轉蒸發分離產物,用甲醇洗提,然后使用油泵真空排空。得到透明的無色油。^iVM(TDj)OZ),S=&7似似25/.9似丄7—義/.5廣m義"CM/i(TZ^OZ)入S=7"./,5丄J,".3,".7,27.7,2.7.五5/MS1.3.0八8-樹枝狀-0^11。0(:1^)&+6Mel或"G2(Mel)"將酰化的第二代聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(725mg)溶于甲醇(2mL)和碘曱烷(4.6g)中。在氬氣氛下,在5(TC的油浴溫度下攪拌所述溶液20小時。蒸發揮發物后,得到淡黃色脆性粉末。JflW雄(TD3OZ),5=似丄P,,么5,么2,2力520f^."CiVMRfCDjOZV:5=〃3.5,:50.0,23,9,,2U,1.4.DAB-樹枝狀-(NHCOCH二V十6MeCl或"G2(MeCl)"理論上所有6個都為內部4又胺理i侖上所有6個都為內部A又胺將酰化的和碘甲基季銨化的第二代聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(309mg)溶于曱醇(2mL)中,并施加到裝有Dowex1x8-50離子交換樹脂的柱上,所述樹脂已經采用水和曱醇洗滌過。用甲醇進行洗脫。蒸發濾液,得到MeCl-加成物(0.21g)。WiVMT(TDjOZ)"S=3.7J.6-Kfm),2.4么<p義1.5.DAB-樹枝狀-(NHCOCHO"或"G4"將第4代胺封端的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(2.02g;0.57mmol;FW=3514g/mol)溶于二氯曱烷(50mL)和三乙胺(2.05g;20.3mmol)中。在一分鐘期間,滴加入乙酸酐(2.15g;21.06mmol)(放熱反應,無外部冷卻)。在攪拌過夜后,加入甲醇(20mL),得到透明溶液,將其再攪拌3小時。蒸發所述溶液,用甲醇洗提三次。在Dowex550AOH(25-35目)離子交換樹脂的預洗滌柱上洗脫所述產物的甲醇溶液。在旋轉蒸發儀上蒸發所述洗脫液,用曱醇重復洗提三次,真空干燥,得到粘性油狀物(2.7g)。^W細rCD3OD入S=(U么5"似義"—J."CM/Z(t^O":5=773.0,5丄5-5",則,22.5.1.6.DAB4HjM^(NHCOCH1)32+30Mel或"G4(Mel)"將酰化的第4代聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(FW-4859/mol;1.0g;0.206mmol;6.17mmo1內部叔胺)溶于曱醇(2mL)和碘曱烷(7mL)中。在45。C的油浴溫度下攪拌所述混合物60小時。蒸發所述雙層混合物的易揮發物,得到黃色粉末。將該產物溶于甲醇中,并且沉淀在良好攪拌的醚中。得到細碎的黃色粉末。理論上所有30個都為內部胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>理論上所有30個都為內部胺將酰化的和碘甲基季銨化的第4代聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物溶于甲醇中,并施加到裝有Dowex1x8-50離子交換樹脂的柱上,所述樹脂已經采用水和甲醇洗滌過。用曱醇進行洗脫。蒸發濾液,得到MeCl-力口成物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>1.8.二醇沒食子酰氯結構嵌段,Cl(0)C-Ph(TEO)4OMe)3將二醇沒食子酸酯(HOOC-Ph((EO)40Me)3)(2.05g,2.68mmol,FVy^741)貯存在真空中的粉末狀P205上。在使用前,用曱苯洗提兩次(共蒸發)。然后,將其溶于60ml蒸餾的二氯甲烷中,加入2.8ml的草酰氯,之后加入3滴DMF。一'J、時后加入另一份0.2mL的草酰氯,因為IR分析仍顯示在1714cm"有峰值(COOH-基)。再攪拌10分鐘,得到完全轉化成酰氯(IR:1745cm—1)。通過在旋轉蒸發器上蒸發溶劑分離產物Cl(0)C-Ph((EO)4OMe)3,用曱苯共蒸發。將其立即用于與聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物的偶聯反應。1.9.DAB-樹枝狀-(NHCOPh(TEOyDMe^y—或"G4-PEG,用曱苯洗提第4代胺封端的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(276mg;FW=3514g/mol)四次,將其溶于6mL的二氯甲烷和1mL的三乙胺中。在半分鐘內將該溶液加至酰氯Cl(0)C-Ph((EO)4OMe)3在60mL的二氯曱烷(使用1.1當量的酰氯)的溶液中。得到透明的溶液。在過夜攪拌后,加入30mL的水和550mg的KOH粉末,將全部混合物轉移到分液漏斗中。分離有機層,用50mL的二氯曱烷萃取水層。先用200mg的KOH在25mL水中的溶液,接著用兩份25mL的水洗滌合并的二氯甲烷層。用無水硫酸鈉干燥所述二氯曱烷溶液,過濾,并濃縮至得到1.85g的油狀產物。先用甲醇/水/三乙胺500:60:10(v/v/v),最后用曱醇/水500:25(v/v)透析該產物兩次。蒸發后,用甲醇共蒸發以除去上次的三乙胺,在真空爐中干燥,得到略淺黃色油狀產物(1.24g)。^W爐fOX^.'S=S力(3^),7./"f^,40刷,3.J5似3.3似25-22W,W."CJVMR(CDC^.'S=M7./,"2,3,/".7,72.4,72/,70.&7ft7,矽,&5&9,53-5/1.10.0八8曙樹枝狀-(^1^011(^£0、0]^^^))11+Mel或"G4-PEG+30oob'b'b,理論上所有30個都是內部4又胺在裝有回流冷凝器的圓底燒瓶中在40-45。C(油浴溫度)在5mL的甲醇和2mL的碘甲烷中攪拌用二醇沒食子酸酯基改性的第4代聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(590mg)40小時。在旋轉蒸發器上蒸發所述溶液。隨后用曱醇洗提該產物三次。產率0.69g的粘性黃椋色油狀物。7冊細5="~,"似40-3.《3.35似3.3似似似1.11.DAB-樹枝狀-〖NHCOPhmO)iOMe)2)12+MeCl或"G4畫PEG(MeCl)"+30OO'o'6''。z理論上所有30個都是內部叔胺用軟化水和曱醇洗滌具有3.0g的Dowex1X8-50(Acros)離子交換樹脂的柱以除去污染物。將具有用Mel季銨化的二醇沒食子酸酯基的G4-樹枝狀聚合物(r形式;290mg)溶于5mL的甲醇中并上柱。用曱醇連續洗脫直至級分不在二氧化硅-60TLC板上顯示出任何UV-活性。在旋轉蒸發儀上蒸發該甲醇溶液,得到247mg的產物(粘性淺黃色油狀物)。(Ti)ay..3=SJW,044JW./丄5-,K3."^j,U0」,2丄2力》」."CM/R(C£>a3);5="2J,/擬&"9.化7么3,70.5,,,,似5&義W.5-柳似3"似".5似〃J似1.12.DAB-樹枝狀-(NHCOPh((EO)40Me)丄4或"G5-PEG"用曱苯洗提第五代胺封端的聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(251mg,包含約20wt。/。的曱醇)以除去曱醇,然后將其溶于二氯曱烷(40mL)和三乙胺(250mg)的混合物中。在一分鐘內,將20mL新制備的酰氯(Cl(0)C-Ph((EO)4OMe)3;1.2當量每份伯胺)加入到強力攪拌的樹枝狀聚合物溶液中。該溶液立即變得渾濁。在氬氣氛下攪拌過夜后,在旋轉蒸發儀上濃縮該混合物。將所述產物溶于水(5mL)和氪氧化鈉溶液(300mg在5mL水中)中。通過先對MeOH/水/三乙胺(400/40/40mL)透析,然后對MeOH/水(500/50mL)透析進行純化。蒸發并干燥(油泵),得到1.44g的油狀產物。(OCW.'S=&2,7./(Zw義47W,3"W,丄&K丄"W,_U似25-2jW,j向."CWMKfCZX:W:5=M7./,73-6&59,55-57,27.化W力.1.12.DAB-樹枝狀-(NHCOPh(TEO、OMeV^+62Mel或"G5-PEG將用二醇沒食子酸酯基改性的第五代聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物(150mg)溶于2mL的甲醇中。加入碘甲烷(360mg)在甲醇(0.5mL)中的溶液,在惰性氬氣氛下,在40。C(油浴溫度)攪拌該得到的混合物20小時。在旋轉蒸發儀上蒸發揮發物,得到黃棕色產物。^ATM/S=7J(Zw,,"似3."似"似義S-24似2刷."CM/7fCD3C^.'S=/幼.P,"3.7,"2.2,"ft3,/(7.P,".7-7/.3,似5",50.7似j&5似2"似7"似2.使用^NMR、"CNMR和SEC測定在含水混合物中的穩定性將樹枝狀化合物溶于D20中,將該溶液轉移至NMR管。將所述管置于保持在35至39。C的油浴中4天。每天記錄^NMR譜,在其之前或之后進行13CNMR。在測定期間也記錄pH值在測定期間,DAB-樹枝狀-(NHCOCH3)8保持堿性(pH=約9),DAB-樹枝狀-(NHCOCH3)32+30MeI保持酸性(pH=約2)和DAB-樹枝狀-(NHCOCH3)8+MeCl保持弱酸性(pH=約5-6),而DAB-樹枝狀-(NHCOCH3)8+Mel從弱酸性(pH二約5-6)變得酸性更強&11=約2)。包含碘曱烷季銨化的樹枝狀聚合物的溶液的酸性可能由存在的一些HI引起,HI是在MeOH/Mel中季銨化反應步驟期間形成的。每天僅僅通過(Mel)"G5力理論上所有62個都是內部叔胺使用常用的pH試紙評價溶液的pH。對于SEC-測定,使用類似的步驟。使用TSK-GELG3000PWxi柱,施用0.5mL/min的0.1M檸檬酸和0.05。/。疊氮化鈉在水中的洗脫液流;使用RI-檢測。3.使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的樹枝狀聚合物和DNA的結合實驗使用BIO-RADMini-PROTEAN3細胞進行PAGE。通過混合5.7mL30%的丙烯酰胺和2.67%的二丙烯酰胺溶液與1.0mL的1£沖溶液(10x)、3.3mL的H20制備17%交聯密度的微凝膠,并隨后將該凝膠澆鑄到空玻璃平,、60juL新制備的10。/。的過硫酸銨(APS)溶液和10juL的TEMED之間。對于pH=4.4的凝膠,施用雙倍量的TEMED和APS溶液。使該溶液膠凝至少一小時,之后使所述凝膠流動。在所有的情況下,使用18MQ的水。在pH為7下進行的實-瞼中使用包含108克Tris(890mM)、55克H3B03(890mM)和7.5克EDTA(20mM)每升的Tris/硼酸/EDTA緩沖液(TBE緩沖液;10x)。對于在pH=4.4下的測定,使用包含12克乙酸(197mM)和71.2克P-丙氨酸(800mM)每升(10x)的|3-丙氨酸/乙酸緩沖液。所述負載的緩沖液包含0.2mL在h20中的1%溴酚藍溶液、25mL緩沖液(1x)和15mL甘油。該負載的樣品由適當選擇容積的DNA-水溶液、樹枝狀聚合物水溶液和負載的緩沖液組成。用IOmL或12.5ML的負載樣品負載所述凝膠的每道,以使負載DNA的每道為約0.4jug(除非另有說明),如此使得對于多種檢驗的樹枝狀聚合物/DNA組合而言,樹枝狀聚合物/DNA的電荷比(CR)為約2:1、3:2、1:1或1:2。通過用所述樹枝狀聚合物中正電荷的量(即在樹枝狀聚合物中叔胺和季銨的總量)除以所述DNA中磷酸基的含量來計算電荷比。使用的DNA為單鏈未標記的33-鏈節。在每種凝膠上,作為參考,保留一個道用于未標記的ss-DNA,而一個道用于該ss-DNA33-鏈節和FITC-標記的ss-DNA33-鏈節的混合物。某些道未使用。在200伏的電壓下,運行所述微凝膠約45分鐘。使用具有標準BIORAD試劑盒和標準BIORAD協議的Ag-染色來顯影所述凝膠。在所有的情況下,得到在淺棕色背景上的白線;處理該凝膠的所有圖片的對比度和亮度,以便得到在白色或淺灰色背景上的黑線。在圖A中,可以評價在pH=7下,樹枝狀聚合物G2(MeCl)、G4(Mel)、G4-PEG(MeCl)、G5-PEG和G5-PEG(Mel)與DNA-酶33-鏈節的結合量。在圖B中,顯示了在pH=7下的濃度結合研究DNA-負載從O.l至0.2至0.4至0.8微克每道(具有12.5微升的負載量)升高,使用指定電荷比的樹枝狀聚合物G4-PEG(Mel)。4.纟田月包、動物和材津牛在該研究中使用下述所有的人類細胞系乳房癌MCF7細胞系和惡性黑色素瘤Malme-3M細胞系,兩者都在達爾伯克最小必需培養基中培養。在RPMI1640中培養卵巢癌A2780細胞系、結腸直腸腺癌細胞系HT29和白血病細胞系K562-C1000。用5。/o的胎牛血清(FCS)、50Mg/ml的慶大霉素和2mM的L-谷氨酰胺補充這些培養基。也用1mM的丙酮酸鈉補充MCF7細胞培養基和Malme-3M培養基。在含有5%C02的濕潤培養箱中,在37。C培養細胞。所有的培養基和補充劑購自Invitrogen(Paisley,UK)。雄性NMRI小鼠購自Janvier(LeGenest-St-Isle,France)。所有動物實驗均在動物倫理委員會批準下進行。隨后的倫理準則滿足UKCCCR準則所要求的標準。x^3'dG5'的5'-熒光素標記的和非標記的ss-DNA酶33-鏈節(5'-標記物-TGAGGGGCAGGCTAGCTACAACGACGTCGCGGx-3')購自Eurogentec(Seraing,Belgium)。為了改善穩定性,在3'-末端引入3'-3'鳥。票呤倒位。5.改性的PPI-樹枝狀聚合物的細胞毒性使用MTT-試驗在4個細胞系(Malme-3M、K562、HT29和MCF7)上表征不同代(G2、G2(Mel)和G2(MeCl)、G4、G4(Mel)和G4(MeCl)及G5-PEG和G5-PEG(Mel))的改性PPI-樹枝狀聚合物的毒性。為了該目的,使用細胞毒性測定,其中在轉染前,將細胞以2000個細胞/孔放置在96孔平皿上24小時。根據樹枝狀聚合物的代,將所述樹枝狀聚合物以各種濃度加入到細胞中。第二代樹枝狀聚合物以500^M至1|LiM的濃度加入。第4代和第五代樹枝狀聚合物分別以100^M至0.2|LiM和12.5|LiM至50nM的濃度范圍加入。用所述樹枝狀聚合物處理細胞4小時,然后用完全培養基使其恢復,再培養4天。在該培養期后,檢查細胞的線粒體脫氫酶,其僅僅存在于活細胞中。當存在時,用該酶還原加入的黃色MTT鹽以形成藍色甲臘晶體,可以將其溶于DMSO中,并使用分光光度計(入max在540nm)測定。然后,用測定的吸收率除以率:得;m::生存力,與在所有圖中顯示;i于照相比。、、p當更詳細地檢驗一些改性的第4代PPI-樹枝狀聚合物的細胞毒性時,也按照MTT協議進行。使用一定濃度范圍(從1^M、2iliM、5pM、10pM至20pM)來測定季銨化的(用Mel或MeCl)或非季銨化的乙酰化的或PEG基化的樹枝狀聚合物,同時也研究血清的增加量(10%、20%、30%、40%)。在A2780細胞上進行這些MTT-試驗,所述A2780細胞是根據它們在我們部門的體內模型中的適合性選擇的。6.熒光標記的DNA酶的體外遞送使用第4代樹枝狀聚合物作為轉染劑進行熒光活化細胞分類器(FACS)分析,以測定FITC-標記的DNA酶的細胞攝取。在轉染前24小時,在6孔平皿中種下2*10E+6A2780細胞/孔。將所述樹枝狀聚合物和DNA酶都稀釋在培養基中至最終濃度為liuM,當絡合時獲得約1的電荷比。15分鐘的培養期能使所述兩種組分復合。隨后,將該復合物加入到細胞中,在培養4小時后,用PBS洗滌細胞兩次,通過胰蛋白酶作用收集,在FACS緩沖液和CellScrub緩沖液中洗滌兩次(基因治療系統,SanDiego,CA)。將碘化丙啶以20jug/ml的最終濃度加入到每種樣品中以測定死細胞的數量比例。最后,通過流動細胞儀(FACScan,BectonDickenson)分析所述細胞的DNA酶攝取。將非轉染的細胞用作基線對照以測定所述細胞的自發熒光。將單獨用DNA酶處理的細胞用作陰性對照。因此,單獨的所述DNA酶的自發熒光和轉染用于解釋在所有圖中的轉染效率的值。7.熒光標記的DNA酶的體內遞送7.1.顯微鏡檢查使用整體成^象(WBI)系統來研究熒光標記的DNA酶的體內腫瘤遞送。該成像系統由熒光立體顯微鏡(01ympus)SZX12組成,所述立體顯微鏡裝有綠色熒光性蛋白質(GFP)(激發波長485-501nm;發射波長510nm)和紅色焚光性蛋白質(RFP)(激發波長540-552nm;發射波長568-643nm)過濾器裝置(詳細參見BakkerA,FlorenW,VoetenJ,JanssensB,SmetsG,WoutersW和JanicotM(2001),AutomationofwholebodyimagingofGFP-expressingtumorsinlivinganimals.G.I.T.ImagingandMicroscopy03/2001:52-54)。使用(Jai)CV-M903-CCDRGB彩色照相機以每秒的1/60獲得圖像(752x582像素)并使用基于IMAQVision軟件元件和LabVIEW(NationalInstruments)的內部開發的應用軟件分析。使用熒光顯微鏡研究在腫瘤切片上的細胞內DNA酶的遞送。簡言之,在每個動物實驗結束時,取出發熒光的胂瘤,冷凍固定并切片。使用偶聯至AxioCamHR(Zeiss)CCD攝像機的AxioPlan2(Zeiss)焚光顯微鏡觀察12jum的切片,俘獲高分辨率圖片(1300x1030像素),使用AxioVision軟件(Zeiss)進一步分析。使用核染料TOPR03(紅色)研究FITC(綠色)標記的DNA酶的細胞內分配。^^用氟硼熒鬼筆環肽(bodipyphalloidm)(藍色)獲得P-肌動蛋白染色。7.2.體內DNA酶纟會藥使用26GA注射器(BD,26GA3/8lml)將107A2780卵巢癌細胞/200ju1不含血清的培養基注射入雄性NMRI小鼠的腹股溝區。14天后,腫瘤達到用于WBI測定的足夠尺寸。在第一組小鼠中,靜注1mg的FITC-共輒的c-真菌DNA酶(FITC-DNA酶)來處理對照組小鼠(r^5),而用包含1mgFITC-DNA酶和約3mg的G4-PEG(MeI)的樹枝狀聚合物-DNA酶復合制劑來處理試-險小鼠(11=5),獲得CR為1(即DNA和樹枝狀聚合物在所述小鼠中的最終濃度為50pM,如果假定稀釋進入小鼠的血量為約2mL)。以~200ju1/10秒的注射速率經由尾靜脈給藥靜脈內(i.v.)注射劑。在45,(分鐘)處死所述小鼠(>=10),立即將腫瘤冷凍固定在TissueTek(TriangleBiomedicalSciences)中。除了這些處理的小鼠(11=10),將幾只未處理的小鼠用作陰性對照。給第二組小鼠(n-10)注射相同的DNA酶-樹枝狀聚合物復合物,在24小時的時期后,使用WBI檢查肺瘤中的熒光。24小時后,處死該第二組小鼠,檢查內部的熒光。在注射后5,(分鐘)、"'、30,和45,(對于第一組小鼠)和在24小時(對于第二組小鼠)通過WBI監測靜脈注射后的DNA酶清除率。結果和討論1.用于核酸的樹枝狀4黃切面試劑的合成和表征在圖2中總結了聚(丙烯亞胺)轉染劑的合成,其中圖解了第2代樹枝狀聚合物的轉化步驟。按相似的方式轉化其它代的PPI-樹枝狀聚合物。在第一步中,通過與活化的羧酸衍生物"RCOOH"(本文已經使用的乙酸酐或者沒食子酰氯衍生物;其它類型的活化的羧酸也是可能的,參見例如KreiderJL等人,2001)反應而酰胺化伯胺端基。在第二步中,通過與碘甲烷反應季銨化內部叔胺。在第三步中,用碘化物抗衡陰離子交換氯化物。所有制備的樹枝狀聚合物均可溶于水和醇,并且大多數還可溶于更多非極性溶劑比如氯仿中。報道的^NMR和"CNMR數據與指定的結構一致。在CDC13和CD3OD中,來自所述樹枝狀聚合物內部的所有質子和碳是相當寬泛的,尤其對于較高代的樹枝狀聚合物。當甲基化(季銨化)時,接近叔胺的亞曱基質子的寬信號約2.2-2.5ppm遷移至乙酰化樹枝狀聚合物的3.5-4.0ppm和PEG基化的樹枝狀聚合物的約2.7-2.9ppm。在"CNMR中,可見兩種類型的樹枝狀聚合物,這些亞曱基碳從約50-55ppm遷移至約60ppm,而對于引入的甲基,另外的信號出現在約50ppm。在D20中,接近叔胺或季銨的亞甲基的信號較不寬。所有的NMR數據與之前對其它季銨化的樹枝狀聚合物的報道結果一致。應注意,NMR數據證實季銨化進行得非常好,但是它們沒有證實曱基化進行得完全,即未必所有的叔胺都轉化成了季銨化的陽離子位點。在較低代的未季銨化的樹枝狀聚合物上有可能獲得質譜(mass)數據,但是所述季銨化的樹枝狀聚合物的MS分析迄今為止都失敗了,可能是由于在所述樹枝狀分子上有許多電荷。為方便起見,在本文中所有繪制的結構都是完美的全部曱基化的類型(圖2)。作為最后的表征工具,有可能使用尺寸排阻色譜法(SEC),—種通常用于研究大分子的分子量(分布)的技術來分析所制備的樹枝狀聚合物。使用TSK-GELG3000PWx柱和使用在選擇的pH下的水性洗脫液(例如在較低pH值下的0.1M的檸檬酸緩沖液),可以分析未季銨化的和季銨化的所有制備的PPI-樹枝狀聚合物。使用該技術來評價所制備的樹枝狀聚合物的穩定性(參見下一部分)。2.改性的PPI-樹枝狀聚合物在水中的穩定性所設計和制備的樹枝狀聚合物可以僅用作轉染劑,如果能確保它們在生理條件下的穩定性。因此,在4天內通過每日監測保存在約37。C下的這些樹枝狀聚合物的D20溶液的^NMR和^CNMR語測試選擇的樹枝狀聚合物。記錄第2代樹枝狀聚合物G2、G2(Mel)和G2(MeCl)及第4代樹枝狀聚合物G4(Mel)的光鐠。在4天測試期之前、期間和之后,所有的樹枝狀聚合物顯示出類似的光譜特性,因此所述樹枝狀聚合物在模擬的生理條件下沒有顯示出明顯的水解。通過使用SEC監測保持在37。C下的第4代樹枝狀聚合物G4-PEG和G4-PEG(MeCl)獲得證實(季銨化的)樹枝狀聚合物穩定性的更強證據。所有SEC數據均圖解在圖3中。在實驗的幾天期間,樣品的SEC色語根本沒有改變它們的形狀,所以沒有發現將導致形成較低分子量的物質的降解的證據。SEC-跡線顯示出在所述色語的較高分子量(左)側有一個肩峰(shoulder)。可能,該肩峰指示存在有限量的二聚樹枝狀聚合物物種。應注意所述肩峰也存在于作為合成起點的第4代胺封端的樹枝狀聚合物的SEC中。3.使用PAGE的樹枝狀聚合物-DNA酶結合實驗聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是一種通常用于分析蛋白質和核酸的技術。所研究的物質的洗脫取決于其尺寸和其電荷。例如,SDS-PAGE(向凝膠緩沖液中加入十二烷基硫酸鈉)被用于評價(未折疊的)蛋白質的分子量。本文中,進行PAGE來研究幾種聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物結構與DNA酶分子的結合性質(詳細參見實驗部分)。在洗脫和染色后,游離的DNA酶在凝膠上出現單個帶。如果當混合DNA酶和另一種物質時出現結合,則與所述游離的DNA酶相比,DNA酶在混合物中的洗脫行為改變了,因為所述DNA物質的容積和/或電荷改變了。這導致在相同位置的DNA帶,但是其具有較低的強度(一部分DNA是復合的),導致在凝膠另一個位置的帶,或導致所述帶完全消失。為了評價該組制備的樹枝狀聚合物的結合能力,將所述DNA酶和所述樹枝狀聚合物胺加;銨的:量i以在所述D:上帶負電的磷酸鹽基團々二數量。''已經研究了在表2中給出的DNA酶分子與不同的樹枝狀聚合物的結合。本文中,選擇三種凝膠,并且顯示在下述圖4中以闡述所述發現;制備所述凝膠,并且使其在pH=7的TBE緩沖液中運行。在附加信息中,收集更多記錄的PAGE凝膠。凝膠A顯示了酰化的和碘曱烷季銨化的樹枝狀聚合物G2(Mel)和G4(Mel)之間的比較。顯而易見,第4代樹枝狀聚合物比第二代相應物結合DNA酶更好,所述第二代樹技狀聚合物在所研究的濃度下似乎不誘導結合。該觀察可通過G4(Mel)樹枝狀聚合物負載多達兩倍的陽離子位點每分子(30對14)的事實來解釋,因此其設計與在所述DNA酶中的33個負電荷更匹配。凝膠B比較了季銨化(G4(MeCl))或未季銨化的(G4)的酰化的第4代樹枝狀聚合物。這兩種樹枝狀聚合物都能相當有效地結合所述DNA酶,但是季銨化的G4(MeCl)物質更有效,如即使在1/2的樹枝狀聚合物-DNA電荷比,幾乎所有的DNA被結合。最后,凝膠C比較了季銨化的(G4-PEG(Mel))或非未季銨化的(G4-PEG)的乙二醇沒食子酸酯(glycolgallate)改性的第4代樹枝狀聚合物。再次,顯然季銨化的物質結合DNA酶更好,但是該結果也表明酰化的G4-樹枝狀聚合物(參見凝膠B)與DNA的結合比PEG基化的G4-樹枝狀聚合物的更好,因為較高過量的PEG基化的樹枝狀聚合物是有效地結合DNA酶所必需的。也研究了使用乙酸/P-丙氨酸緩沖液在4.4的pH值下的樹枝狀聚合物的結合性質(沒有凝膠顯示)。與在pH=7下的測試相比,所研究的未季銨化的樹枝狀聚合物似乎結合得更好,而季銨化樹枝狀聚合物結合DNA的程度略微少些。該結果可通過未季銨化的樹枝狀聚合物在較低pH-值下的質子化來解釋,以便這些樹枝狀聚合物也在它們的內部具有多個陽離子位點,促進與DNA酶的結合。最后,選擇G4-PEG(Mel)用于濃度范圍結合研究。使用負載每道在12.5微升中0.1、0.2、0.4、0.8和1.6微克的DNA,而電荷比從2:1至3:2至1:1(樹枝狀聚合物過量)改變。當然,PAGE-研究表明結合在較低的濃度下減少在0.1微克的負載下,所述DNA幾乎完全不結合,而在0.8微克或更高的負載下,甚至在1:1的最低電荷比下,所有的DNA結合(參見用于獲得該濃度結合研究而獲得的PAGE-凝膠的附加信息)。該結果證實在它們的內部具有多個陽離子位點的合成的樹枝狀聚合物可以按約40微克DNA每mL(相當于約4juM的摩爾濃度)的濃度和約2:1-1:1的電荷比(稍過量的樹枝狀聚合物)結合ss-DNA酶33-低聚物。在文獻中報道的轉染劑通常需要更高的濃度和/或更高的電荷比,以使得與DNA客體有效地復合(參見例如HaenslerJ1993,其中在200yg/ml的DNA濃度下進行某些結合測試)。而且,在G4-PEG(MeI)物質上的濃度范圍結合研究顯示出在樹枝狀聚合物和DNA酶之間的結合是可逆的,能分離所述復合物和釋放所述DNA酶。5.改性的PPI-樹枝狀聚合物的體外毒性為了評價它們作為基因轉染劑的適合性,在4種不同的細胞系MCF7、Malme-3M、HT29和K562-C1000上使用MTT試驗研究選沖奪的改性PPI-樹枝狀聚合物的毒性。第2代酰化的樹枝狀聚合物G2、G2(Mel)和G2(MeCl)在低于100)tiM的濃度下,不會對所有的4種細胞系產生毒性,而第4代酰化的樹枝狀聚合物G4、G4(Mel)和G4(MeCl)在低于用于這些細胞的20pM的水平下沒有顯示出毒性的信號。最后,第5代樹枝狀聚合物G5-PEG和G5-PEG(Mel)在最高的研究水平(2.5pM)下是無毒的。這些濃度比用相應的第2代、第4代和第5代樹枝狀聚合物的標準體外轉染實驗使用的水平高20、20和5倍。已經特別地研究了第4代樹枝狀聚合物的毒性,因為發現第4代樹枝狀聚合物比它們的第二代相應物結合所述DNA酶更有效(參見如上所述的PAGE試驗)。對于六種所研究的樹枝狀聚合物(即G4、G4(Mel)、G4(MeCl)、G4-PEG、G4-PEG(Mel)和G4-PEG(MeCl))中的每種,使用MTT試驗評價細胞毒性,同時施用可變量的樹枝狀聚合物(lluM、2iliM、5iliM、10pM和20inM)和血清濃度(10。/Q、20%、30%和40%的胎牛血清)。如在圖5中可見,在1-5(LiM的濃度下,所有六種樹枝狀聚合物沒有產生特定的毒性,在4天處理后,>70%的細胞幸存。然而,在較高的濃度下,特別是G4-PEG(Mel)顯示出明確的毒性,如細胞存活率明顯下降低于50%。其它的樹枝狀聚合物在10pM的濃度下仍顯示出約30%的低細胞死亡,并且在20nM的濃度下顯示出30-60%的部分毒性。G4-PEG(MeCl)即使在20)iM水平也保持其低毒性。圖6以其它方式表示相同的MTT-試驗數據,對每種樹枝狀聚合物分類,并顯示出在較高濃度下增加的毒性。在圖5和圖6顯示的數據中使用10%的血清水平。在增加量的血清存在下,使用10%至40%的水平,也測定六種G4-樹枝狀聚合物中每種的毒性。當使用較高量的血清時,所有的樹枝狀聚合物產生較低的毒性(圖7)。明顯地,當使用20%-40%的血清時,樹枝狀聚合物的毒性似乎(幾乎)與使用的濃度無關;即使在20|iM水平下,對于所有的樹枝狀聚合物,細胞存活率顯然高于50%,除了樹枝狀聚合物G4-PEG(Mel)在高于10的濃度下變得有毒性。可以從本文描述的MTT毒性試驗得出結論,幾乎所有設計的和制備的PPI-樹枝狀聚合物顯示出低水平的毒性。根據本發明的化合物的這一性質非常重要,因為低毒性或無毒性對于成功地用于人類,特別是用于基因治療是相當重要(sinequanone)的條件。可能在季銨化的樹枝狀聚合物中的抗衡陰離子在某些程度上決定了物質的毒性,并且看來使用氯化物抗衡陰離子代替碘化物是有利的。6.使用改性的G4PPI-樹枝狀聚合物的DNA酶的體外轉染已經使用FACS分析在A2780卯巢癌細胞上研究了使用第4代改性的PPI-樹枝狀聚合物作為遞送劑的DNA酶的轉染。在所有轉染試驗中使用電荷比CR=1和濃度為1nM的樹枝狀聚合物-DNA酶以保持低水平的毒性(參見以上給出的MTT毒性試驗),并保留在所述濃度域內,其中預期在DNA和樹枝狀聚合物之間存在結合(參見以上給出的PAGE結合試驗)。已經研究了在培養基中增加水平的血清(10%、20%、30%和40%FCS)來才莫擬體內條件。所有6種樹枝狀聚合物顯示出高的轉染效率,通常超過80%,乙酰化的季銨化樹枝狀聚合物G4(Mel)和G4(MeCl)顯示出最好的結果(圖8)。明顯地,在PEG基化的樹枝狀聚合物種類中(圖8B),當未季銨化的體系G4-PEG與季銨化的體系G4-PEG(Mel)和G4-PEG(MeCl)比較時,功效幾乎不存在差異。最后,轉染試驗顯示出血清在培養基中的含量幾乎不影響體外遞送的效率。游離的DNA酶,即沒有使用樹枝狀聚合物轉染劑,轉染效率僅僅為5-10%,如在對照實驗中確定的。在毒性試驗的確定中,在這些體外遞送試驗中已經發現了約15%的細胞毒性,如通過碘化丙啶染色顯示的。當使用陽離子脂質體轉染劑DOTAP(Roche)(MW=^々700)時,對于所述樹枝狀聚合物體系,發現的轉染效率與在相同的組織中發現的類似。然而,該脂質體只可以中和一個負電荷/分子,從而需要達到CR為1的量使得所述轉染混合物的毒性很高。結論是,使用DOTAP遞送方法在體內似乎不可行。7.使用改性的G4PPI-樹枝狀聚合物的DNA酶的體內遞送驗。為了該目的,已經拒絕顯示:最有力的體外轉染能力的乙酰化^J季銨化的樹枝狀聚合物G4(Mel)和G4(MeCl),因為當將它們與DNA酶以制備用于體內研究的樣品所需的濃度混合時,它們產生不溶性沉淀物(例如,當以約700yM的濃度,即比在上述結合、毒性或體外轉染試-瞼中使用的高得多的濃度混合時,G4(Mel)和DNA酶產生白色沉淀)。在用樹枝狀聚合物/FITC-標記的DNA酶復合物靜脈處理小鼠后,使用整體成像(WBI)顯像熒光。5分鐘后,熒光在體內隨處可見。在45'后,使用WBI,在五只小鼠的三只中,熒光不再外部可見,盡管熒光在十二指腸起始段局部聚集,如在死后解剖后可見的。然而,五只小鼠的兩只顯示出靠近腫瘤的弱外部可見的熒光。使用共聚焦顯微鏡分析這兩種樣品來確定用WBI觀察的熒光是否實際上共存(co-localized)在細胞內。在注射24小時后,不能看到熒光,無論在外部還是解剖后的體內。在顯示出FITC標記物的外部可見聚集后,切片腫瘤并經由共聚焦顯微鏡分析,得到類似FITC標記物在組織中聚集的密集斑點(intensivespotty)。該斑點樣圖案和在核中廣泛聚集的原因仍然不清楚。存在高的與T0PR03(紅色)染料的共存,顯示出FITC標記物存在于核中。進行另一種染色(氟硼熒鬼筆環肽(藍色))以觀察細胞的P-肌動蛋白水平。在從處理的小鼠切除的胂瘤制備的切片中,可見類似孔的大腔,并且似乎存在于大多數聚集的FITC標記物的附近。從未處理的小鼠的肺瘤中得到的切片沒有這些類似腔的結構。而且,至于這些腔是怎樣和為何存在的仍然是不清楚的。它們是否作為用于寡DNA的陷阱工作或如果它們由樹枝狀聚合物-DNA酶復合物或一旦分離的所述復合物(單獨的樹枝狀聚合物)的一部分產生需要進一步研究。沒有處理的樣品在核周圍具有更好的P-肌動蛋白染色。然而,在處理的樣品中,在包含FITC標記的區域,這是幾乎不可能檢測到的。結論由于后轉錄基因領域的靜寂不斷被新的另外的參與者例如短干擾性(si)RNA和微(mi)RNA推進,藥物遞送領域在提供更好和更安全的轉染劑以適應寡核苷酸治療劑的需要方面承受著越來越大的壓力。盡管市場上的多數遞送劑自稱能在很多細胞類型中獲得高的轉染效率和低毒性,但目前沒有一種表明它們自己可適宜作為在體內的藥物遞送工具。在本申請中,已經描述了改性的PPI-樹枝狀聚合物一其中的某些在以前從未報道過一其可以容易地制備,并且可以作為在基因治療中的轉染劑。證實設計和制備的PPI-樹枝狀聚合物在水性環境中是穩定的,并且這些樹枝狀聚合物能體外遞送ss-DNA酶低聚物進入卵巢癌細胞,同時僅誘導低的細胞毒性。該遞送是有效的,因為DNA酶的結合和轉染可以在低濃度和低電荷比下進行(即低過量的樹枝狀聚合物仍然能轉染)。而且,初步的體內實驗表明遞送是可行的。最后,最初的PAGE結合研究表明雙鏈的siRNA(44個核苷酸)也結合到本文描述的PPI-樹枝狀聚合物上,因此核酸的結合和轉染似乎不會只限于在本申請中作為才莫型的ssDNA酶。附圖目錄圖1:第二代PPI-樹枝狀聚合物的分子結構。圖A:在pH=7下樹枝狀聚合物G2(MeCl)、G4(Mel)、G4-PEG(MeCl)、G5-PEG和G5-PEG(Mel)與DNA-酶33-鏈節的結合量。圖B:在pH=7下濃度結合研究。圖2:聚(丙烯亞胺)轉染劑的合成,圖解了第2代樹枝狀聚合物的轉化步驟。圖3:改性的PPI-樹枝狀聚合物在水中的穩定性(SEC數據)。圖4:使用PAGE的樹枝狀聚合物-DNA酶結合實驗。圖5:改性的PPI-樹枝狀聚合物的體外毒性MTT-試驗數據,按每個電荷比分類。圖6:改性的PPI-樹枝狀聚合物的體外毒性MTT-試驗數據,按每種樹枝狀聚合物分類。圖7:在增加濃度的血清存在下,改性的PPI-樹枝狀聚合物的體外毒性MTT-試驗數據,按每個電荷比和每種樹枝狀聚合物分類。圖8:改性的PPI-樹枝狀聚合物的體外轉染效率FACS分析,按每種樹枝狀聚合物分類。參者文獻目錄1.Bakker,A.,Floren,W.,Voeten,J.,Janssens,B.,Smets,G.,Wouters,W.,和Janicot,M.(2001):AutomationofwholebodyimagingofGFP-expressingtumorsinlivinganimals.G.I.T.Imaging&Microscopy,03/2001:52-54頁。2.Bielinska,A.,Kukowska-Latallo,J.F.,Johnson,J.,Tomalia,D.A.,和Baker,丄R.,Jr.(1996):RegulationofinvitrogeneexpressionusingantisenseoligonucleotidesorantisenseexpressionplasmidstransfectedusingstarburstPAMAMdendrimers.NucleicAcidsRes.,24:2176-2182頁。3.Bielmska,A.U.,Chen,C,Johnson,J.,和Baker,J.R.,Jr.(1999):DNAcomplexingwithpolyamidoaminedendrimers:implicationsfortransfection.Bioconjug.Chem,10:843-850頁。4.Bosman,A.W.,Janssen,H.M.,和Meijer,E.W.(1999):AboutDendrimers:Structure,PhysicalProperties,andApplications.ChemRev,99:1665-1688頁。5.Cheng,H.,Zhou,R.,Liu,L.,Du,B.,和Zhuo,R.(2000):Cycliccoredendrimerasanewkindofvectorforgenetransferintomammaliancells.Genetica,108:53-56頁。6.ChoiJ,JooDK,KimCH,KimK,和ParkJS(2000):SynthesisofaBarbell-likeTriblockCopolymer,Poly(L-lysine)Dendrimer-block-Poly(ethyleneglycol)-block-Poly(L-lysine)Dendrimeranditsself-assemblywithplasmidDNA.JAmChemSoc122,474-480頁。7.deBrabander隱vandenBerg,E.M.M.,Meijer.E.W.(1993)Poly(propyleneimine)dendrimers:Largescalesynthesisbyheterogenouslycatalyzedhydrogenations.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,32,1308-1311頁。8.Delong,R.,Stephenson,K.,Loftus,T.,Fisher,M.,Alahari,S.,Nolting,A.,和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