A型腦膜炎疫苗的免疫原的制作方法

專利名稱：：A型腦膜炎疫苗的免疫原的制作方法
技術領域：
：本發明涉及可用于A型腦膜炎疫苗的化合物。具體而言，該化合物是包括穩定化的含磷鍵——優選膦酸酯鍵(phosphonatelinkage)的寡糖。更優選地，該化合物含有甘露糖單元，并且在該甘露糖單元的C-l處還含有成a構型的間隔區。本發明也包括制造該寡糖的方法，和制造含甘露糖的化合物和中間體的改進方法。
背景技術：
：腦膜炎是腦脊膜感染，所述腦脊膜為包圍腦和脊髓的薄膜(thinlining)。幾種細菌可引起腦膜炎，腦膜炎奈瑟氏菌(A^mem'"g"W的是最重要的一種。其它細菌是肺炎鏈球菌Cs&印tococcw;wewnom'ae)禾口乙型流感桿菌(Z/flemo;/n7wsz力y/we"za)。有幾種腦膜炎奈瑟氏菌的亞型，其通過包圍細菌的莢膜多糖的結構加以區分。病毒和細菌都可引起腦膜炎。弓l起腦膜炎的細菌的兩種主要類型為流感桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌。在流感桿菌的情況下，僅一種血清型——乙型是重要的，然而對于腦膜炎奈瑟氏菌已經鑒定了12個血清群(serogroup)，其中A、B、C和W135組己知引起流行病。各種血清型在不同的地區流行，例如B型和C型主要在歐洲和北美，A型在非洲和南美。血清分型是基于包圍細菌的莢膜多糖(CPS)的結構和抗原性，并且CPS也可被用作對抗細菌的疫苗。通過將糖結合到載體蛋白，可制造特別有效的疫苗(復合糖疫苗)。參見Plotkin,S.A.和OrensteinW.A.,Vaccines,4thed.,Saunders,959-987頁(2004)，其通過引用被引入本文。這些復合糖誘導具有記憶性的T-細胞依賴性免疫應答，并也對于幼年孩子起作用，而一般而言，非結合CPS既不能在成年人中提供記憶效應(memoryeffect),也不能在嬰兒中提供任何實質性免疫原性效應。A型疫苗的開發被認為特別困難，原因在于作為CPS—部分的異頭磷酸二酯鍵的固有不穩定性。A型的重復單位是單糖一一通過磷酸二酯鍵橋1—6連接的2-乙酰氨基-2-脫氧-o;-D-吡喃甘露糖(圖1)。在天然多糖中，3-OH被乙酰化大約80。/。的程度。該乙酰化的免疫學重要性還沒有被徹底研究，但是跡象表明其不具有顯著意義。腦膜炎奈瑟氏菌血清群A引起腦膜炎的流行病突發，主要在撒哈拉南部的非洲部分所謂的腦膜炎帶。在該腦膜炎帶，估計在1970-1992期間的發生率大約800,000例。參見Plotkin,S.A.和Orenstein,W.A.,Vaccines,4thed.,Saunders,959-987頁(2004)。腦膜炎流行病的突發正在毀掉該區域，所以迫切需要有效的疫苗。當然，希望優良疫苗的開發，加上類似于WHO在二十世紀六十年代和七十年代進行的對抗天花所作的努力，可同樣地消除腦膜炎奈瑟氏菌血清型A引起的腦膜炎。接種疫苗比用抗生素和其它治療方法控制疾病是成本更有效的方式，而在研發領域，成本是特別重要的。從細菌上多糖包被——其莢膜多糖制備的疫苗，在成年人中有效。暴露于該多糖引起成年人發展免疫應答，其保護免于腦膜炎奈瑟氏菌引起的腦膜炎。然而，這類疫苗的一個重要限制是大約兩歲以下的孩子的免疫系統不對大多數多糖抗原應答。遺憾的是，這是對于細菌腦膜炎最大危險的年齡組。因此，多糖疫苗在年幼孩子中是無用的。而且，即使在較大的孩子和成年人中，這些疫苗也僅僅誘導短期的免疫性。在接種疫苗大約兩年后，保護迅速降低，并且通常消失。多糖如腦膜炎奈瑟氏菌CPS是T細胞非依賴性抗原，這意味著在沒有T細胞(胸腺產生細胞)參與的情況下，它們可產生免疫應答。這種應答缺乏幾種表征T細胞依賴性免疫應答的重要性能，例如免疫記憶、從IgM到IgG的類別轉換以及親和力成熟。然而，如果將多糖部分結合到載體蛋白，那么其引發產生記憶效應的細胞免疫應答，并且也在年幼兒童中提供保護。這類接合到載體蛋白的多糖通常被稱為復合糖，并且其作為疫苗特別有用。因為它們的產生涉及多糖抗原或其它糖抗原與載體蛋白的結合，所以稱為復合糖疫苗。復合糖疫苗中的糖部分通常是官能化的細菌CPS,但是也可以是合成的。合成的碳氫化合物結構相比基于自然來源的碳氫化合物的結構具有大量的潛在優勢。自然源的碳氫化合物是異源混合物，其可包括少量的天然雜質和污染物。相反地，合成的碳氫化合物可作為同源單一化合物以受控的方式產生，具有很少或沒有批次之間(batch-to-batch)的差異。合成結構的另一個優點是可使它們包含用于碳氫化合物部分衍生或修飾的官能團，這些衍生或修飾在天然物質上難以或不可能進行。在免疫原性調節中，載體蛋白是重要因素。多種載體已被用于結合，并且使用強免疫原性蛋白如白喉毒素和破傷風毒素的去毒版本，已經取得了最好的結果，其已被允許在人中使用。參見美國專利4,354,170。也已顯示，當患者已經用特定的載體蛋白免疫后，免疫系統更有效地反應。通常將細菌的天然莢膜多糖結構結合到適當的載體蛋白，制造復合糖疫苗。然而，由于包裹腦膜炎奈瑟氏菌的多糖的性能，此種方法存在問題。在將多糖結合到蛋白質所必需的條件下，其磷酸二酯鍵可能降解，甚至在制備以后，天然CPS的復合糖傾向于在儲存期間降解。磷酸二酯鍵通常是十分穩定的，但是在腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜多糖中，磷酸二酯鍵被連接到碳氫化合物殘基的異頭中心(anomericcenter)。因此磷酸二酯鍵的一個氧也是縮醛鍵的一部分，其使縮醛鍵易于被親電體例如酸或金屬離子水解切割。該鍵的切割將多糖分解成小片段。遺憾的是，在形成復合糖或者甚至在疫苗配制中所需要的操作期間，A型腦膜炎奈瑟氏菌的CPS經歷這種降解，致使難以制造或儲存包括該特定CPS的有效疫苗。使磷酸二酯鍵更穩定的一種方式是消除磷和異頭氧之間的氧，以便鍵的部分不再易于被親電水解所切割。在異頭中心的外環氧可被等構碳原子(CH2)所取代，將磷酸二酯鍵轉化為它的C-膦酸酯類似物。這應該產生抗原多糖的穩定版本。涉及這種方法的一種研究近來己經被公布。Torres-Sanchez,M.L等，^"/e"(2005)7:1147-1151。然而，作者并沒有評估它們的化合物的活性或者公開超過兩個甘露糖單元的寡聚物。而且，它們的合成方法僅在寡糖擬被結合到蛋白的位置提供/3異頭物，而且腦膜炎奈瑟氏菌的天然CPS僅包含a鍵。因此仍舊需要在甘露糖單元之間具有穩定鍵的a連接的復合糖，以及合成它們的方法。另一個方法利用臨近取代基的誘導作用減少異頭氧處的電子密度，來穩定磷酸二酯鍵；這樣也應當減慢預期的親電子降解機制。可保持取代基的吸電子性能，同時構建寡糖，并且或許也同時將其結合到蛋白質，然后一旦分子不再需要暴露于破壞性的條件時，將其除去。本發明包括這些方法的每一個，以及它們的組合。因此，本發明的一方面提供疫苗開發所需的腦膜炎奈瑟氏菌A型莢膜多糖重復單元的寡聚形式的C-膦酸酯類似物的有效合成。參見Bundle,D.R.等，乂所o/aew.(1974)249:2275-2281。具體而言，本發明提供了引入間隔區部分的方法，通過間隔區部分，本發明的寡糖可被結合到蛋白質以制造復合糖疫苗，并且將間隔區部分定位于a異頭構型中。圖2闡明在該中心具有期望a構型的化合物，和具有/3構型的化合物。因為目標生物體的天然CPS是甘露糖單元的完全a-連接的寡聚物，因此特別期望在合成的免疫原中提供相同的a-連接構型。即使復合糖的合成寡聚物部分中的甘露糖單元之間所有的鍵都是在a構型中，當復合糖的寡糖部分含有大約IO個以下甘露糖單元時，寡糖通過它被連接到蛋白質的中心的構型可特別影響免疫原性效應。因此，本發明提供了這類的化合物和制備這些化合物的方法。通常使用C-膦酸酯單酯和Mitsunobu條件施行關鍵的偶聯步驟。雖然制備大小與天然CPS相當的多糖是不切實際的，但這也是不必要的甚至在長度上只有幾個甘露糖單元的寡糖也可以誘出免疫應答。而且，合成的寡糖提供了體內選擇性連接機制(selectivelinkagemechanism)和穩定性增加的優點，這些優點中的每一個應增強其體內免疫原性效果。本發明的另一方面提供了穩定甘露糖單元的方法，以便可以使用磷酸二酯鍵——該鍵存在于天然的莢膜多糖中。其包括提供穩定化的化合物和方法，以有助于制備寡糖的蛋白復合體。通過吸電子基團提供穩定化，所述吸電子基團為多糖中至少一個甘露糖單元的C-2處的氮化物，這增加了多糖的穩定性，以便其可被結合到蛋白質。在結合之后，穩定性不那么重要了，此時，氮化物一般被還原為胺并且被乙酰化，提供2-乙酰氨基基團，該2-乙酰氨基基團為腦膜炎奈瑟氏菌A型莢膜多糖中重復甘露糖單元的一部分。如果合適，也可混合所述兩種穩定方法；因此本發明的寡糖可包括含氮化物的甘露糖單元以及膦酸酯連接的甘露糖單元，所述含氮化物的甘露糖單元通過臨近異頭中心的磷酸二酯連接。該組合可提供另外的穩定性，這取決于膦酸酯的取向；或者該組合也提供合成的優點，例如產率增加，并且其可以避免乙酰胺取代基可能引起的復雜化。在其它方面，本發明提供合成這些化合物重要前體、含有它們的藥學組合物的方法，以及使用它們制造藥物的方法。可施用這些化合物、組合物和藥物給對象，以在對象中誘導免疫原性應答，所述對象一般是人。
發明內容本發明提供包括多糖或寡糖的免疫原性化合物和制造這些化合物的方法，以及使用它們作為疫苗提供保護以免于腦膜炎奈瑟氏菌A細菌感染的方法。所述方法允許制備包括至少兩個通過1，6-鍵連接的甘露糖單元的多糖。該鍵通常為1,6-a鍵，并且甘露糖單元有時為N-取代的甘露糖基團，例如在一個或多個甘露糖單元上具有2-NHAc或2-N3的N-取代的甘露糖基團。所述鍵可以采用不同的形式，但是其通常包括膦酸酯或磷酸酯。在一些實施方式中，寡糖包括依次連接的至少三個甘露糖單元，其每一個一般是N-取代的。雖然化合物可包括任意數量的甘露糖單元，但在優選的實施方式中，分子的寡糖部分具有2000以下的分子量。因此，優選地，本發明的化合物包括大約2到IO個串連的甘露糖單元，優選大約3到7個。對本發明的化合物進行改變以結合到蛋白質，因為復合糖形式是有效得多的用于接種疫苗目的免疫原其在嬰兒中誘導免疫原性應答，并且其誘導提供延長接種疫苗效用的記憶效應的細胞應答。因此，化合物包括連接于甘露糖單元鏈上第一個甘露糖單元的間隔區部分(或間隔基部分)。間隔區單元被具體設計以提供將寡糖連接到蛋白質的方法，或者提供帽化末端糖單元的方法，使得其對例如進一步的鏈延長/修飾反應無活性。典型地，該間隔區部分具有胺、羧酸酯或羥基，以與蛋白載體上的互補基團相偶聯，但是也包括本領域已知的提供將寡糖結合到蛋白質的方式的其它基團。可選地，間隔區部分擁有保護或加帽基團，例如垸基、芳基或酰基，以及在本領域公知的和/或本文公開的其它基團。在本發明的化合物中，該間隔區部分成a構型，以便其最嚴格地類似腦膜炎奈瑟氏菌的天然CPS中的鍵，并且其不會干擾期望的免疫原性效應，即使在本發明的短寡糖中。本發明的化合物通常包括分子式(l)所示的結構(1)其中，每一個Az表示氮雜取代基；每一R3和W獨立地表示H或保護基；W表示H、保護基或連接到另一個糖單元的連接體；W和X中的一個是O，并且W和X中的另一個是CH2;n是1或2;當n是l時，Yn是OR，當n是2時，一個Y是O并且另一個Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳垸基，或者R是M，這里M是陽離子；和Z是OR，、SR，、NR，2或鹵素，這里每一R，獨立地是H或任選地取代的烷基、酰基、芳基、芳垸基、雜垸基、雜酰基、雜芳基或雜芳烷基；或者Z表示結合到另一個糖單元的連接體或者結合到蛋白質的間隔區部分。通常在這些化合物中，X是O，W是CH2，并且Az通常是N3、NH2或NHAc;并且通常n為2。本發明的化合物部分通過本領域已知的方法合成，但是形成這些分子的大量新方法也是本發明的一部分。例如，可通過本文描述的Mitsunobu反應構建式(l)化合物中的1，6-a鍵。N-取代基例如Az也可通過本文描述的方法作為氮化物插入，然后可被還原以提供胺或取代胺，這通常在甘露糖單元的位置2，如式(l)所示。用于還原氮化物的一般方法包括催化加氫和氫硼化物還原，一般使用催化量的鎳鹽。本發明也提供制造膦酸酯-取代甘露糖單元的方法，以裝配本發明描述的寡糖。例如，分子式(2)的化合物，其可從葡萄糖得到，可被轉化為膦酸酯的前體，所述膦酸酯可用于形成分子式(l)所示的包含膦酸酯的1,6-a-鍵，這里W是CH2，X是O。本方法包括用親電體環化分子式(2)的化合物，以形成分子式(3)的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中R2、R3、R"和W的每一個獨立地為H或保護基；并且E1表示親電體殘余部分(residue)。親電體殘余部分E1是用于引起環化的親電試劑的一部分，其保持與碳連接。然后El可直接或間接被含磷基團例如膦酸酯基團通過本文描述的方法取代。這提供葡萄糖衍生物而不是N-取代的甘露糖單元，即其在C-2處具有錯誤的立體化學；因此本發明進一步提供，通過用氮化物取代OR2的O的活性形式，將分子式(2)或分子式(3)中OR2轉化為具有恰當立體化學的Az基團的方法。該方法包括Mitsunobu反應，其一般使用磷酰氮化物作為氮化物來源。本發明也提供制備2-疊氮-2-脫氧-D-吡喃甘露糖的方法，該方法包括在l,3,4,6-四-保護的吡喃葡萄糖衍生物的位置2形成三氟甲磺酸酯(triflate);并且用氮化物親核體取代三氟甲磺酸酯。在一些實施方式中，1,3，4，6-四-保護的葡萄糖衍生物是1,3,4,6-四-0-酰基-吡喃葡萄糖，這是容易獲得的。參見，例如Helferich,B.等，D加/CAew.G仏(1962)95:2604-2611。有時，優選1，3，4,6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖。包括本文描述的寡糖的化合物和組合物的免疫原性活性通常通過將寡糖結合到蛋白質而得到增強。因此，在許多實施方式中，本發明包括通過連接到鏈上第一個甘露糖單元的C-l碳的間隔區部分，將寡糖結合到蛋白質。在一些實施方式中，根據其增強人免疫原性應答的能力而選擇蛋白質，并且通常使用白喉和破傷風的去毒毒素類。因此，本發明的化合物通常包括間隔區部分，其可以是分子式(l)中的Z，或者可以被結合到甘露糖單元上的任何可用的羥基或N-取代基；并且其有助于結合到蛋白質。典型地，連接到蛋白質是通過Z，因此Z通常是間隔區部分，其能被結合到蛋白質。在本發明的許多化合物中，Z是被保護形式。適當的保護基取決于Z的準確屬性，這類保護基的選擇和使用是在本領域普通技術范圍內的。這類保護基的實例和其使用的細節例如可從Greene,T.W.和Wuts，RG.M.，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2ded.(1991)獲得。相似地，本發明提供使用Z將寡糖結合到蛋白質以生產免疫原性組合物的方法。本發明也提供含本發明寡糖的疫苗組合物，其被用于在哺乳動物中誘導免疫原性應答。哺乳動物一般是人對象，因為腦膜炎奈瑟氏菌被認為僅在人中致病，但是在其它哺乳動物中誘導免疫應答也是有價值的，并可被用于提供免疫成分例如抗體。因此，本發明提供免疫原性組合物和使用這些免疫原性組合物在哺乳動物中誘導免疫原性應答的方法。附圖簡述圖1示出了A型腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜多糖的結構。圖2是中心位置的"和i8的異頭物的說明，通過它們，寡糖被結合到蛋白質以增強免疫原性。圖3示出合成寡糖的模塊式裝配方法(modularassemblystrategy)。圖4示出不同疫苗劑量時合成復合糖和寡糖復合體對照物誘導的特異性抗體應答之間的關系。本發明的實施方式在一方面，本發明提供含有第一甘露糖單元和第二甘露糖單元的寡糖，其中第一甘露糖單元在C-l處包括成a構型的間隔區。該間隔區可結合到蛋白質，并且第一甘露糖單元通過1,6-鍵連接到第二甘露糖單元，所述1，6-鍵將第一單元的C-6與第二甘露糖單元的C-l連接。在一些實施方式中，1，6-鍵包括膦酸酯。在一些實施方式中，1,6-鍵在a構型中。在這些實施方式的一些中，第一甘露糖單元是2-脫氧-2-氮雜取代的甘露糖衍生物，以及在一些實施方式中，第二甘露糖單元是2-脫氧-2-氮雜取代的甘露糖衍生物。某些實施方式具有二個或三個，或者三個以上的這些2-氮雜取代的甘露糖單元。在本發明的一些實施方式中，1,6-鍵具有[第二個甘露糖單元的C-l]-CH2-P-0-[第一個甘露糖單元的C-6]的形式，即膦酸酯的碳被結合到第二甘露糖單元的C-l，膦酸酯氧被結合到第一甘露糖單元的C-6。任選地，這些甘露糖單元被保護，并且在許多實施方式中，這兩個甘露糖單元的一個或兩個包含2-氮雜取代基，其選自NH2、NHAc和N3。當這些實施方式包括第三個甘露糖單元，它有時通過包含磷的鍵結合到第二甘露糖單元，并且其中所述鍵將第二甘露糖單元的C-6結合到第三甘露糖單元的C-1。該鍵通常包括膦酸酯，其通常通過膦酸酯鍵與第二甘露糖單元排成一列，通過膦酸酯的P-C鍵與第三甘露糖單元排成一列。在其它方面，本發明提供分子式(l)的寡糖:其中，每一個AZ表示氮雜取代基；每一W和W獨立地表示H或保護基；RS表示H、保護基或連接到另一個糖單元的連接體；W和X中的一個是O，并且W和X中的另一個是CH2;n是1或2;當n是l時，Yn是OR，當n是2時，一個Y是O并且另一個Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，這里M是陽離子；和Z是OR，、SR，或NR'2，這里每一R，獨立地是H或任選地取代的垸基、酰基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜酰基、雜芳基或雜芳烷基；或者Z表示結合到另一個糖單元的連接體或者結合到蛋白質的間隔區部分。在一些實施方式中，包含分子式(l)的化合物通過酰胺鍵或酯鍵被結合到蛋白質。通常在分子式(l)的化合物中，W是CKb，X是O，并且在許多這類實施方式中，Az是NHAc，n為2。也在該方面的許多實施方式中，R是M，Z包括-0-(CH2)n-NH-，其中n是2-6。在基于分子式(l)的這些化合物的實施方式中，每一個W和R"獨立為H或Ac。通常W是Ac，并且任選地，je和W都是H或Ac。在其它方面，本發明提供制造寡糖的方法，該方法包括通過包含膦酸酯的1,6-鍵，將包含至少一個氮雜取代甘露糖單元的第一部分連接到包含至少一個氮雜取代甘露糖單元的第二部分。在這些實施方式中，第一部分通常包括間隔區部分，該間隔區部分被連接到a構型中的甘露糖單元的C-l。在這些方法的一些實施方式中，使用Mitsunobu反應將第一部分的甘露糖單元的C-6連接到第二部分的甘露糖單元的C-1。在這些方法的許多實施方式中，1，6鍵是l，6-of鍵。在這些方面的一些中，連接的氮雜取代甘露糖單元包括分子式G)R00其中，每一個Az表示氮雜取代基；每一R3和R4獨立地表示H或保護基；W表示H、保護基或連接到另一個糖單元的連接體；W和X中的一個是O，并且W和X中的另一個是CH2;n是l或2;當n是l時，Yn是OR，當n是2時，一個Y是O并且另一Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M,這里M是單價陽離子；和Z表示可被結合到蛋白質的部分，其可是保護形式。在本方法的一些實施方式中，在包含分子式(l)的化合物中，X是CH2，W是O。在這些實施方式中，通常甘露糖單元上至少一個氮雜取代基是通過還原氮化物(N3)取代基得到的胺或取代胺。在優選的實施方式中，胺或取代胺在甘露糖單元的位置2上。在這些方法的一些實施方式中，寡糖包括可以是分子式(l)化合物中的Z的間隔區部分，其位于甘露糖單元的異頭中心。該間隔區單元可包括氨基取代的烷氧基，任選地其為被保護的形式。例如，其可以具有分子式-0-(CH2)n-NH-PG，這里PG表示H或保護基；保護基通常是烷氧基羰基例如甲氧基羰基；叔-丁氧基羰基；或者節氧基羰基。因此NH-PG通常是氨基甲酸酯基團。在這些方法的一些實施方式中，該方法進一步包括通過在分子式(l)中的OW的氧和另外的糖之間形成的鍵將第二甘露糖單元連接到另外的糖。該糖可以是甘露糖單元或者包含甘露糖單元，并且在許多實施方式中，另外的糖通過l，6-a鍵被結合到第二甘露糖單元。在這些實施方式中，通常W是H或Ac，并且存在的每一個甘露糖單元的異頭中心成"構型，以最嚴格類似于天然腦膜炎奈瑟氏菌的CPS。在其它方面，本發明提供分子式(r)的寡糖:其中，每一個Az獨立地選自NH2、NHAc和N3;Z表示能被結合到蛋白質的間隔區部分，其可是被保護形式或未保護形式，并且其可被結合到蛋白質；每一個R'是獨立的H，任選地取代的C1-C6烷基、或M，這里M是陽離子；X是O或CH2;每一R3和R4獨立地選自H、Ac、Bn和其它保護基；以及W是H、或保護基、或磷酸酯、或連接另外糖單元的鍵。在本發明的這方面，一些實施方式包括通過第一甘露糖單元的C-l處a構型中的間隔區部分結合到寡糖的蛋白質。有時，蛋白質是選自白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌(E."/z')LT、大腸桿菌ST、銅綠甲單胞菌外毒素(尸set^omomwflerwg!'"cwfl(rEPA))、或者破傷風類毒素的滅活細菌毒素，或者蛋白質可以是CRM197。在這些實施方式中的蛋白質可通過間隔區部分連接到分子式(l)中的寡糖，所述間隔區部分包括羥基或胺，其中任何一個任選地被保護或任選地結合到蛋白。在該方面的一些實施方式中，W是酰基，并且W是H。分子式(i)的可選的或優選的實施方式也適用于分子式(r)。在某些方面，本發明提供合成o;-連接的甘露糖單元的寡糖的方法，其包括在Mitsunobu反應條件下，將含有分子式(2)的甘露糖單元與分子式(3)的延長單體相結合，在分子式(2)中，W是C1-C6酰基或H，R1、R3、R4、Az和Z按照權利要求15所定義；在分子式(3)中，RX表示C1-C6酰基，且M表示H或陽離子；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>以生產含有由1，6-a鍵連接的至少兩個氮雜取代的甘露糖單元的寡糖。在該方法的一些實施方式中，Mitsunobu條件包括使用二異丙基偶氮二羰酸酯(DIAD)或二乙基偶氮二羰酸酯(DEAD)和三苯基膦或取代的三苯基膦例如三(對-氯苯基)膦。在一些實施方式中，使用DIAD和三(對-氯苯基)膦，并且過量使用三乙胺。在某些實施方式中，Mitsunobu反應條件被維持一段延長的時間，并且產物是分子式(4)的寡糖，其中，p是從l到20的整數。在許多這些實施方式中，每一個Az表示NHAc或者N3。在這些實施方式的一些中，p是l-10，而在另一些中，p是大約l-5或者p是2-4。在這些實施方式的某些中，本發明的方法進一步包括將分子式(4)的寡糖結合到蛋白質的方法。任選地，這通過Z進行，所述Z通常為被選擇可與這類蛋白質結合的間隔區部分。在這些實施方式的一些中，蛋白質是選自白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、銅綠甲單胞菌外毒素(rEPA)、或者破傷風類毒素的滅活細菌毒素。在其它實施方式中，蛋白質是CRM197。在其它方面，本發明提供通過前述方法制備的寡糖。通過這些方法制備的寡糖化合物是免疫原性化合物，并且一般在被治療的哺乳動物中誘導免疫原性應答，該免疫原性應答提供了對腦膜炎奈瑟氏菌引起的感染的至少部分免疫性。在進一步其它的實施方式中，本發明一般通過給予哺乳動物，提供使用本發明的任何寡糖化合物誘導免疫原性應答的方法。在許多實施方式中，這些化合物被用作A型腦膜炎疫苗成分；因此，該方法通常包括將有效量的疫苗成分施用給對象，從而提供免疫原性應答。所述免疫原性應答在對象中提供對A型腦膜炎奈瑟氏菌引起的腦膜炎的至少部分抗性或免疫性。本發明也提供了藥學組合物，其包括與至少一種藥學可接受的賦性劑混合的至少一種本發明的寡糖，以提供免疫原性的藥學組合物。在一些實施方式中，這些組合物因此是包括含有本發明任意化合物的A型腦膜炎疫苗的疫苗。在許多實施方式中，疫苗包括至少一種結合到蛋白質的寡糖。又在其它方面，本發明提供制造可用于制備免疫原性寡糖的甘露糖衍生物的方法，其包括本發明那些方法。這些方法包括用親電體環化分子式(2)的化合物來形成分子式(3)的化合物，其中R2、R3、R"和I^的每一個獨立地為H或保護基；并且El表示源自親電體的殘余部分。在某些實施方式中，該方法包括另外的步驟，該另外的步驟包括用磷基團取代E1的步驟。所述磷基團一般為膦酸酯，在一些實施方式中，本發明也提供用氮化物取代分子式(2)或分子式(3)的化合物中的Oie的方法。在優選的實施方式中，0112的取代包括Mitsunobu反應。在一些這樣的實施方式中，磷酰基氮化物提供了用于Mitsunobu反應的氮化物。在進一步其它的方面，本發明提供改進的方法以制備2-疊氮-2-脫氧-D-吡喃甘露糖，該方法包括在1，3,4，6-四-0-酰基-吡喃葡萄糖衍生物的位置2形成三氟甲磺酸酯；和用氮化物親核體取代三氟甲磺酸酯。也可使用制造這些化合物的其它方法，該改進的方法在產物逐步生產(work-up)和分離過程中提供最小化暴露于濕氣的預防措施。這導致比已知方法極大提高的產率，例如，Popelova等.,CaAoA>^ra&A仏(2005)340:161-166。在優選的實施方式中，1,3,4,6-四-O-酰基-吡喃葡萄糖衍生物是1，3，4,6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖，并且產物為2-疊氮-l，3,4，6-四-0-酰基-吡喃甘露糖。在其它方面，本發明提供可誘導針對A型腦膜炎的保護性抗體的免疫原性組合物，其包括具有至少兩個糖單元的寡糖，所述糖單元一般為甘露糖單元，其通過穩定化的含磷鍵彼此共價結合。在許多這樣的實施方式中，可以為甘露糖單元的至少一個糖單元，在其異頭中心包括ce-連接的間隔區部分。所述穩定化的含磷鍵可包括膦酸酯。在某些實施方式中，這些寡糖包括至少兩個通過穩定化的含磷鍵彼此共價結合的甘露糖單元。在許多實施方式中，寡糖被結合到蛋白質。可使用許多蛋白質，例如前面描述作為適當的載體蛋白的那些蛋白質，但是在優選的實施方式中，蛋白質不是清蛋白。在一些實施方式中，本發明的免疫原性組合物包括至少兩種不同的寡糖部分。在許多實施方式中，在兩個糖之間的穩定化含磷鍵包括膦酸酯。在許多這類的實施方式中，膦酸酯鍵是通過Mitsunobu反應形成的1,6-鍵，在某些實施方式中，任意前述組合物的寡糖包括至少一個甘露糖單元，其包括在異頭中心的a-連接的間隔區部分。在本發明的一些免疫原性組合物中，組合物包括至少兩種不同的寡糖，它們對至少兩種腦膜炎球菌免疫型是特異性的。該組合物也包括其它的抗原化合物，在一些實施方式中，組合物進一步包括月巿炎鏈球菌(5^e;^ococc"s尸"ewwom-ae)抗原。該抗原在一些實施方式中是多糖，并且在許多這些實施方式中，該多糖被結合到蛋白質。在一些實施方式中，本發明的組合物也包括至少一種源自血清型A、B、C、W135或Y的腦膜炎的抗原。在一些優選的實施方式中，該抗原源自血清型C、W135或Y的腦膜炎。本發明的組合物通常進一步包括佐劑，并且在一些實施方式中，佐劑是明礬。在本發明的許多組合物中，寡糖成分通過含有二羧酸或其衍生物的雙官能試劑被結合到蛋白質。在許多實施方式中，該二羧酸包括己二酸或辛二酸或它們的衍生物。在其它實施方式中，該雙官能試劑包括方酸酯。本發明范圍內的膦酸酯連接的化合物的制備可通過制造受體單體和延長單體(elongatingmonomer)完成，所述受體單體和延長單體的每一個可以是被適當地修飾的吡喃甘露糖環，其被稱為甘露糖單元。延長單體通過膦酸酯鍵被結合到受體以制造二糖。可修改延長單體以使其C6羥基被選擇性地去保護；因此，如果需要更長的寡糖，二聚糖中的延長單體可成為受體。其可被去保護，而沒有對C3和C4羥基去保護，所以C6羥基可被連接到另一延長單體的膦酸酯。這種過程可被重做必要的許多次，以提供期望長度的寡糖。圖3描述如何連接受體單體和延長單體以形成具有兩個甘露糖單元(即二糖)的寡糖，以及該二糖如何可通過C6羥基的去保護然后通過連接其它延長單體而進一步擴展。任選地，可將受體單體通過可切割的連接體結合到固體支持體，以有助于控制和分離。在這種情況下，寡糖可通過多次重復延長過程，保持連接于固體支持體，并且可最終被切割以釋放期望長度的相對純的寡糖產物。有時，間隔區部分Z被用于在合成期間將寡糖連接到固體支持體，然后被用于將寡糖結合到蛋白質，任選地通過修飾。本發明提供了制造含有兩個或多個修飾的甘露糖單元的免疫原性寡糖、以及更長的寡糖或多糖分子的方法，和通過將寡糖和域多糖結合到蛋白質，把它們制成更多的免疫原性物質的方法。甘露糖單元是具有甘露糖環基礎結構的吡喃糖環，但是其具有至少一些結構修飾。在許多實施方式中，本發明包括至少一個取代基，其中氮原子或其它雜原子被結合到環碳，代替甘露糖的一個羥基；如本文使用，考慮這類取代環為甘露糖單元，只要吡喃糖環上的取代基的排列與甘露糖上的立體中心的排列具有相同的相對立體化學。注意，甘露糖構型不限定在C-1的立體化學；C-l為甘露糖單元的異頭中心，可以在Q!構型或e構型中。因此甘露糖單元可具有代替一個甘露糖羥基的連接的C、N或S原子，或者可具有兩個或多個這類的修飾。這里提供D-甘露糖的結構和碳原子的編號，作為參考。D-甘露糖本發明的方法可使用具有D-甘露糖或L-甘露糖的絕對立體化學的甘露糖單元；在許多實施方式中，絕對立體化學是D-甘露糖的絕對立體化學。然而，本發明的寡糖可包括一種或多種具有L-甘露糖構型的甘露糖單元。當然，其也可連接到另外的糖或肽部分，例如，只要包括如本文描述連接的至少兩個甘露糖單元。本發明的寡糖包括至少兩個連接在一起的吡喃糖環，如果僅包括兩個環，分子可被描述為二聚體；對于依次連接的三個環，可被稱為三聚體，等等。然而，如本文使用的總稱寡糖包括這些較小的實施方式，以及依次具有三個或更多、五個或更多、七個或更多、十個或更多、十五個或更多、二十或更多以及超過二十五個單體的更長聚合體類型。具有大約5個以上糖環的類型在本文中有時稱為多糖。在許多實施方式中，寡糖包括至少三個甘露糖單元。不管包括的甘露糖單元的數目如何，有時期望將寡糖連接到其它的分子特征上，所以可用多種基團取代甘露糖單元，并且可通過一個或多個甘露糖單元、一般通過一個末端甘露糖單元將寡糖連接到另一部分。在一些實施方式中，將寡糖結合到蛋白是有益的，并且這些復合糖形式特別包括在本發明內。一般地，通過將目標蛋白質結合到在寡糖的第一甘露糖的C-l處連接的間隔區部分上的官能團，形成復合糖，并且間隔區部分在a構型中。在許多實施方式中，期望將保護基或其它官能度結合到甘露糖單元上的一個或多個雜原子取代基上。在一些優選的實施方式中，雜原子取代基選自OH、0Ac、NH2、N3、NHAc和被連接到保護基或蛋白質的O、N或S。—般地，甘露糖單元通過1,6-鍵連接。1,6-鍵指，通過不包括間插糖環的鍵(linkage),將第二甘露糖單元的C-l碳——異頭中心，直接或間接連接到第一甘露糖單元的C-6碳。一般地，兩個甘露糖單元之間的鍵將包括至少兩個原子，通常是在甘露糖單元碳原子之間的兩個或更多非碳原子。在許多實施方式中，該鍵具有下述通用形式:這里，D、E和F的每一個表示選自O、N、S、Si和P的雜原子，并且每一個四氫吡喃環表示甘露糖單元的環。在一些實施方式中，E表示磷原子，其通常處于磷酸酯或膦酸酯的氧化態。典型地，該式中的D和F的至少一個是氧(O)，在一些實施方式中，D和F都是氧。具體的實施方式包括其中D-E-F表示0-P(0)-0或C-P(0)-0或O-P(O)-C的那些。有時，D-E-F優選為含有-CH2-P(0)-0-的鍵。在一些實施方式中，相鄰甘露糖單元之間的鍵是1，6-o(l,6-alpha)鍵。對于甘露糖單元，1,6-a鍵指，相應于甘露糖異頭中心碳的C-l上的非氫取代基，與C-2處非氫取代基為"反(anti)"相對立體化學關系。可選地，寡糖中一個或多個甘露糖單元可通過P鍵被連接。(在異頭中心具有相對于甘露糖中C-2取代基為"順式(syn)"的鍵的構型被稱為/3鍵。)然而，化合物一般以Q!關系被連接在一起，而不管鍵本身的性質如何。下列結構闡明a鍵和^鍵取向之間的差異。本發明的許多實施方式包括氮雜取代的甘露糖單元，這意味著至少一個甘露糖羥基已用本文稱為"氮雜"取代基的取代基所取代。這是這樣的取代基，其中至少直接連接到甘露糖單元的原子是氮。氮雜取代基包括NH2和多種取代胺，包括烷基化胺和二院基化胺，以及酰化胺和二酰化胺，其中酰基包括雜酰基例如芐氧基羰基和甲氧基羰基，以及這類酰基，如乙酰基、甲酰基和苯甲酰基。氮雜取代基的其它實施方式包括N02和N3。本發明氮雜取代的甘露糖單元的一些實施方式具有在甘露糖環C-2上的氮雜取代基，并且優選的實施方式包括其中甘露糖單元上的氮雜取代基是NH2、N3或NHAc的化合物和方法。因此，在一些實施方式中，本發明的化合物和方法包括分子式(l)的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其中，每一個Az表示氮雜取代基；每一R3和R4獨立地表示H或保護基；W表示H、保護基或連接到另一糖單元的連接體；W和X中的一個是O，并且W和X中的另一個是CH2;n是1或2;當n是l時，Yn是OR，當n是2時，一個Y是K)并且另一Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，這里M是陽離子；和Z是OR，、SR，、NR，或卣素，這里每一R，獨立地是H或任選地取代的垸基、酰基、芳基、芳烷基、雜垸基、雜酰基、雜芳基或雜芳垸基；或者Z表示結合到另一糖單元的連接體或者結合到蛋白質的間隔區部分。優選的氮雜取代基是其中氮原子直接結合到甘露糖單元的那些氮雜取代基。這類取代基的實例包括N3、NH2、NH-垸基、NH-酰基、NH-芳基和類似取代基。任選地，這些取代基中的每一個N可以包括選自烷基、芳基和酰基的一個或兩個基團，這里，每個烷基、酰基和芳基任選被取代。關于羥基、胺基和巰基，術語"被保護的"或"保護基"指這樣的官能團形式——其用本領域技術人員己知的保護基被保護免于不期望的反應，例如在有機合成中的保護基(ProtectiveGroupsinOrganicSvnthesis沖所述的那些保護基，其可使用該文列出的方法添加或除去。被保護羥基的實例包括但不限于甲硅焼基醚，例如TBDMS或TBS，例如通過羥基與試劑反應而得到的那些，所述試劑例如但不限于，叔-丁基二甲基-氯硅垸、三甲基氯硅烷、三異丙基氯硅垸和三乙基氯硅烷；取代的甲基和乙基醚，例如但不限于甲氧基甲醚、甲硫基甲醚、卞氧基甲醚、叔-丁氧基甲醚、2-甲氧基乙氧基甲醚、四氫吡喃醚、1-乙氧基乙醚、烯丙醚和芐醚；酯，例如但不限于苯甲酰基、苯甲酰甲酸酯、甲酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。被保護胺基的實例包括但不限于芐基或二芐基，酰胺例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯甲酰胺；二酰亞胺例如鄰苯二甲酰亞胺和二硫代琥珀酰亞胺；和其它被保護胺基。在一些實施方式中，醇的保護基是芐基或乙酰基，并且本文中胺的典型保護基是乙酰基或芐基或叔丁基氨基甲酸酯。如本文使用的"保護基"包括本領域認為作為雜原子N、O和S的保護基的那些部分，例如在Greene,T.W.和Wuts,P.G.M.的參考書ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2ded"WileyandSons(1991)中描述的，其通過引用被引入本文。乙酰基(Ac)是一個這類保護基，并且因為腦膜炎奈瑟氏菌的天然CPS通常是乙酰基化的，特別是在C-3位置，所以在本發明的一些實施方式中，一種或多種保護基是Ac;在一些優選的實施方式中，在至少一個甘露糖單元上的W代表Ac。在這些化合物的一些中，X和W的一個是CH2，而另外一個是O;例如，在一些實施方式中，X和W都是O，而在其它實施方式中，W是CH2，X是O。在是寡聚的并含有三個或更多甘露糖單元的本發明給定化合物中，可以存在鍵的不同實施方式；因此，兩個通過含有膦酸酯的鍵連接在一起的甘露糖單元可經膦酸酯二酯鍵連接到第三個甘露糖單元，而不背離本發明。通常期望，將本發明的寡糖與另一分子、一般為蛋白質相結合。這些方法制成的結合物在本發明的范圍內。因此糖與蛋白質的結合通常通過將活性雙官能分子加入蛋白質，然后將衍生化的蛋白質暴露于糖而實現，這樣，糖通過雙官能試劑提供的連接體共價連接，該雙官能試劑通常被結合于糖的一個羥基。然而，在本發明的化合物的受控合成中，包括特別設計用來將寡糖結合到蛋白的間隔區部分，是特別方便的。這樣的間隔區部分可被結合到寡糖中任意一個甘露糖單元；然而，一般在末端甘露糖單元，或者在第一"受體"單體，或者在最后的"延長"單體。經常是在受體的C-l位置或延長單體的C-6位置，并且在分子式(l)的化合物中，其可以為Z表示的基團或者R6表示的基團。將寡糖結合到蛋白質的間隔區部分可包括多原子間隔區部分，以使寡糖的免疫原性表位更可用，因此更有效。可選地，例如，化合物例如分子式(l)表示的那些化合物中的Z可以是單個原子例如O或N或S，并且寡糖和蛋白質之間的間隔可由用于將寡糖和載體蛋白連接在一起的雙官能試劑提供。適于用于本發明的復合糖的雙功官試劑包括本領域已知的那些。這類雙功官試劑實例包括二羧酸例如丙二酸、丁二酸、己二酸和辛二酸或其活化形式，以及方酸衍生物。試劑的這些類型特別方便于將其中間隔區部分包括胺的化合物連接到蛋白質。在一些實施方式中，間隔區部分長度上至少為兩個或三個原子，盡管任選地其可以是單個原子或者其可以長得多；一個實例是分子式(l)的化合物，其中Z表示2-氨基乙氧基。該2-氨基乙氧基或其同源物可在結合延長單體之前被引入受體單體，并且任選地以被保護形式引入，所以其不參與接下來的反應。間隔區部分必須包括至少一個能被用來將寡糖結合到蛋白質的官能團，一般地，其包括用于該目標的雜原子N、O或S，雖然也考慮其它的基團，例如用于通過Diels-Alder反應結合的雙烯或親雙烯體，或者用于通過酯或酰胺將蛋白質結合到寡糖的羧酸酯基團。在許多實施方式中，例如上面討論的2-氨基乙氧基，間隔區部分包括用于該目標的氮；當該氮被引入時和在構建寡糖期間，其可以是被保護的，但是在寡糖構建完之后，在不破壞寡糖的條件下，其能夠被可選擇性地去保護。然后，間隔區部分的胺易于乙酰基化或垸基化，例如使用雙官能試劑，其另一端被相似地結合于蛋白質。這樣連接的順序，即復合糖的部分先結合到雙官能試劑，是不重要的，并且由從業者的判斷所確定。間隔基的一些典型但是非限制性的實例包括-Het-(CH2)n-A、-Het-Ph-A、-Het-(CH2)n-Ph-(CH2)n-A和它們的取代形式，其中每一Het表示雜原子，通常為O、S或N;每一Ph表示苯基，任選被取代；每一n表示l-10的整數；A表示官能團或其殘基，其能將間隔區連接到蛋白質，例如N、O或S，或者酯、酰胺、或其它含羰基的基團、二烯或親二烯體。優選地，間隔區包括OR，、SR，或NR，2，這里每一R，獨立地為H或任選地取代的垸基、酰基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜酰基、雜芳基或雜芳垸基，并且可進一步包括A。分子式(l)中的M可表示堿金屬陽離子——選自Li、Na、K和Cs，或者銨鹽NR/，這里每一R獨立為H或C1-C6烷基或C1-C6雜烷基。可選地，其可表示任何其它的藥學可接受的陽離子種類，如MgX或CaX，這里X表示鹵素、羥基、乙酸基、三氟乙酸基、硫酸氫鹽、碳酸氫鹽或任意其它適當種類。在一些實施方式中，M是二價陽離子，并且被分子式(l)的兩個分子所共享。本發明的方法提供合成本發明的寡糖化合物的方式。方法包括例如，以期望的方式將兩個甘露糖單元結合到一起的方式，例如在兩個甘露糖單元之間通過形成1,6-a鍵的方式。在1，6-a鍵是磷酸酯或膦酸酯的情況，例如分子式(l)的化合物，其中X是O，可通過Mitsunobu反應產生該鍵。Mitsunobu反應被描述于例如Campbell,D.A.,/(1992)57:6331-6335，并且涉及用試劑例如偶氮二羧酸酯——如DEAD或DIAD——和膦(如三苯基膦或三(對-氯苯基)膦)活化醇，然后用親核體種類取代活化的O。在分子式(l)的化合物、其中X是O的情況下，親核體通常為P-O種類，一般為膦酸酯或磷酸酯陰離子。在該發明的其它方面，使用Mitsunobu反應將氮雜取代基引入到糖基，在這種情況下，條件是相似的，只是親核體為氮化物，氮化物可作為氮化物陰離子或作為三垸基甲硅垸基氮化物或磷酰基氮化物而被提供。本發明的方法也提供在例如分子式(1)的那些化合物的甘露糖單元上安裝和修飾N-取代基(氮雜取代基)的方式。因此在一些實施方式中，本方法提供以適當的立體化學將氮雜取代基插入甘露糖單元的方式。一個這樣的方法包括用N-取代基——典型為N3取代吡喃糖環上C-2羥基。用親核取代反應可將其插入，但是在一些實施方式中，通過Mitsunobu型反應，在活化基例如偶氮二羧酸酯如DEAD或DIAD的幫助下將其插入。膦酰基氮化物例如二苯基膦酰基氮化物可提供該Mitsunobu反應的親核體。在該反應中，本發明提供的具體改進包括使用膦酰基氮化物作為氮雜取代基的來源，并且引入基本無水的工作條件以避免產物的分解。在本文描述的條件下，甘露糖單元的2-疊氮基衍生物的產率相對于現有技術的方法得到實質性的提高。在一些優選實施方式中，本發明的寡糖的至少一個甘露糖單元是具有胺或乙酰化胺的氮雜取代的甘露糖，該取代通常在甘露糖單元的C-2位置。在本發明方法的一些實施方式中，為N3的氮雜取代基被插入，其可被還原，提供胺，并且在例如Greene和Wuts的前面關于保護基的參考書中描述的條件下，可乙酰化所述胺。將氮化物(N3)還原為NH2通過一般的方法容易實現，例如使用氫硼化鎳，氫硼化鎳可由氯化鎳六水合物和氫硼化鈉原位產生，如本文所描述。在一些實施方式中，本發明提供寡糖和制造寡糖的方法，其中寡糖包括氮雜取代甘露糖單元的重復系列；在許多實施方式中，每一個甘露糖單元具有氮雜取代基，典型為N3、NH2或NHAc，位于每一甘露糖單元的C-2位置——例如在分子式(l)的化合物中，Az將為N3、NH2或NHAc。任選地，在至少兩個甘露糖單元之間的鍵是膦酸酯鍵，其可以是l，6-a鍵，例如分子式(l)的化合物中的1,6-of鍵，其中W是CH2，X是O。包括磷酸酯或膦酸酯的1,6-o;鍵，例如分子式(l)的化合物，其中W是CH2或者0，X是O，可通過上面描述的Mitsunobu反應形成。優選地，Mitsunobu在前面作為參考的Campbell描述的改進條件下進行。在另一方面，本發明提供改進的方法，以制造某些糖分子，所述糖分子可用于前面描述的寡糖的合成。因此，本發明提供合成某些膦酸酯-取代的單糖的方法。例如，可從葡萄糖獲得的、分子式(2)的化合物，可被轉化為用于形成分子式(l)所示的含膦酸酯的1,6-Q!鍵的膦酸酯的前體，其中W是CH2，X是O。本方法包括用親電體環化分子式(2)的化合物，以形成分子式(3)的化合物。其中R2、R3、W和R6的每一個獨立地為H或保護基；并且E1表示親電體殘余部分。用來進行環化的親電體可以是汞鹽，在這種情況下，在環化為分子式(3)的化合物之后，親電體殘余部分一般為HgX，這里X為鹵素、乙酸基或類似物。通過用碘處理，汞可被取代，得到分子式(3)的化合物，其中El是I。然后可用磷親核體取代碘化物；例如，用三烷基亞磷酸鹽處理，直接取代碘化物，并且產生二烷基膦酸酯。其它親電體也可以用來進行環化；例如，鹵化環化是已知的，將直接提供鹵化物作為El，其可被取代。相似地，可使用方法，從而烯烴可被環氧化而具有正確的立體化學，使得環氧化物開環可產生吡喃環，和分子式(3)的化合物，其中E1是0H。然后該OH可被轉化為鹵化物或可取代的磺酸酯，例如三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或甲磺酰酯，以及可用三乙基亞磷酸鹽按前面描述的引入磷，或者可通過使用陰離子P種類例如二乙基亞磷酸鈉陰離子的直接親核取代，將其引入。這提供了分子式(3)的葡萄糖衍生物，而不是N-取代的甘露糖單元；因此本發明進一步提供將分子式(2)或分子式(3)中的OW轉化為具有期望"軸"取向的氮雜取代基的方法。氮取代基的引入通常通過分子式(3)的化合物與活化劑反應，形成其中W是可取代基團的化合物例如三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或甲磺酰酯而實現。因為在(2)中的這種取代將導致烯丙基的重排，所以這種轉化通常在分子式(3)的化合物中進行。雖然可能通過普通的親核取代進行這類反應，但在本發明的一個實施方式中，這種用氮雜取代基取代0RM吏用Mitsunobu反應進行。在優選的實施方式中，Mitsunobu反應使用磷酰基氮化物作為雜氮取代基的來源。因此，該反應提供非常有效的方式將容易得到的葡萄糖源化合物例如(2)轉化為2-脫氧-2-雜氮-取代的甘露糖衍生物，其中2-雜氮-取代基是氮化物。然后可將氮化物還原為胺，例如用氫硼化鎳進行處理，并且可根據需要將胺官能化或保護。在本發明的許多實施方式中，用保護基立刻將胺乙酰基化，通常用乙酰基(Ac)，因為乙酰基可作為保護基并且也存在于腦膜炎奈瑟氏菌的CPS的甘露糖單元中。在另一方面，本發明提供了制造保護形式的2-雜氮-取代的甘露糖衍生物的極大改進的方法。該方法包括通過將2-羥基轉化為三氟甲磺酸酯，然后用氮化物取代三氟甲磺酸酯，來取代以其它方式被保護的吡喃葡萄糖的2-羥基。親核取代使中心轉向，因此將吡喃葡萄糖轉化為吡喃甘露糖。雖然取代本身已被報道，但其使用標準的條件，產生非常差的分離產率。在本發明中，已發現，使用容易獲得的1,3，4,6-四_0_酰基_吡喃葡萄糖可得到期望產物的高產率，只要反應的進程在基本無水下進行。因此，在極性非質子溶劑例如DMF或NMP中，用氮化物陰離子取代三氟甲磺酸酯；然后，在直接運用到色譜柱之前，可以部分濃縮該反應濃縮物，而不是使用普通的水性/有機萃取過程去除大多數溶劑和鹽。使用這樣非水過程，產物可以以高產率從柱洗脫。下面的描述提供制造本發明的某些化合物的方法的更多細節。起始單體受體的一個實例——下面示出的化合物XIV，被描述于Berkin,A.等，C/訓.(2002)8:4424-4433中。作為選擇，可使用下列次序<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>當在異頭中心使用二芐基保護的化合物引入間隔區時，得到大約l:l的異頭物混合物。如果改用乙酸酯取代芐醚，那么僅得到痕量的/異頭物，并且產生分離產率為86%的期望的《異頭物。因此，該方法提供在該中心產生期望a構型的有效方式，該中心通常為與將寡糖結合到載體蛋白的間隔區相連接的中心。a構型是期望的，因為其與目標生物的天然CPS的所有o;骨架最匹配。也發現，0異頭物在乙硫基-糖苷取代步驟具有較小的活性。然而，乙酸酯有時引起后來的系列困難，所以在一些實施方式中，在這一步使用芐醚。使用NaBH4/催化劑NiCl2-6H20將完全保護的2-氮雜甘露糖中間體的疊氮基再還原為胺，并用乙酸酐乙酰化胺，兩個步驟的產率為85%。最后，用TBAF除去甲硅烷基醚，得到99%產率的起始結構單元受體。所需延長單元的方便合成在下面方案1-3中示出，例如，這允許制備具有不同保護基的延長單元。方案l(i)MeOH/可力丁(ii)BnBr/KOH,HOAc(70%)，NaOMeMeOH(iii)BuLi/甲基三苯基溴化錟(iv)Hg(OAc)2,KC1獲得化合物I并將其用作異頭物的混合物，并且在七個步驟中從葡萄糖得到。其通過與甲基溴代三苯基膦的Wittig反應被延長，例如，得到91%產率的鏈烯烴。從D-阿糖制備該鏈烯烴的另外方法使用兩個碳延長，其涉及加入二乙烯基鋅。化合物II的汞環化只得到o;-C-糖苷，盡管相應的四-O-芐基保護的烯烴產生異頭物的混合物。可以使用環化這些種類的可選方法，例如鹵醚化和環氧化/親電體開環。將乙酸汞化合物轉化為相應的氯化汞衍生物，其被分離。接下來，用碘取代氯化汞，通過用I2處理得到極好的產率。方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>(i)12(ii)TBDMSCl/pyr/咪唑(iii)P(OEt)3為了避免在接下來的步驟中形成環磷酸酯，首先保護C2羥基為甲硅烷基醚。通過用三乙基亞磷酸酯處理一代碘化物V，得到C-膦酸酯VII，獲得77。/。產率的VI。然后使用氟化四丁基銨(TBAF)從C2羥基上切割下甲硅烷基醚，產率為99%。通過與氮化物的取代反應，然后通過如方案3中所示的還原和乙酰化，引入軸向乙酰氨基基團。該取代使C-2中心轉向，提供在天然莢膜多糖中發現的C-2乙酰胺取代基的軸取向。通過制備C-2羥基的三氟甲磺酸酯和用氮化物陰離子將其取代，將該氮化物以低產量引入。然而，通過使用Mitsunobu條件，和二苯基磷酰氮化物(DPPA)作為氮化物來源，得到高產率(86%)的疊氮基衍生物IX。為了在0-6處引入可選擇性去除的保護基，用乙酸酯取代VIII的第一芐基醚，使用標準的乙酸水解條件，得到84%的產率；可省略該步驟，在這種情況下，所有芐基醚可被立即切割。省略乙酸水解縮短了合成，但是更難以使用C-6羥基進行進一步的延長或其它的官能化作用，盡管將芐基換為乙酰基也可在延長步驟之后進行。當乙酸酐和乙酸(1/1)的混合物被與硫酸一起使用時，乙酸水解反應進行得更好。在存在氯化鎳六水合物下用氫硼化鈉還原氮化物，并用乙酸酐乙酰基化所形成的胺，得到69%產率的化合物乂。方案3闡述本發明內的延長單體的完成，其為2-氮雜甘露糖單元。對于延長C-膦酸酯單體的構建，使用已公開方法的修改形式。參見Casero,F.等，Org.(1996)61:3428-3432。在前體VI脫甲硅基以提供2-OH化合物VII之后，使用Mitsunobu條件進行氮化物取代，得到2-疊氮基-2-脫氧-卩比喃甘露糖苷VIII(86%)。通過乙酸水解以提供6-0-乙酸酯IX(84。/。)，引入正交的保護基，以便后來的6-0延長。氮化物還原、然后乙酰化給出X(76。/。)，從X除去乙酯，產生帶有游離膦酸的延長單體XI。對于許多實施方式，優選偶聯膦酸的單酯，以便產物仍然受保護為膦酸酯。這些化合物可在兩步中制成，如下面示出的XI到XIII的轉化。注意，如果需要更長的寡糖，那么可推遲氮化物的還原，直到另外的甘露糖單元被裝入，這樣所有的氮化物可被還原并且同時乙酰化所產生的胺。方案3如在上面方案3所示，使用甲基取代膦酸衍生物上的乙基保護基，以在寡糖被構建后便于去除。在形成連接的二糖之后，在切割膦酸乙酯所需要的條件下該連接(或鍵)為相對易分解的。因此通過用溴代三甲基硅烷(TMSBr)處理，乙基被定量除去，并且使用乙酸和三甲基原乙酸酯將膦酸產物轉化為相應的膦酸二甲酯，產率為84%。該反應必須被仔細監控，因為在延長的反應期間，脫乙酰作用是競爭副反應。用三乙胺(TEA)和苯硫酚處理膦酸二甲酯，有效地獲得單膦酸甲酯xm，產率為82%。方案4闡述在兩個甘露糖單元之間形成膦酸酯鍵的偶聯反應。DCC和Mitsunobu條件都已被報道將膦酸酯偶聯到醇如受體單體上，產率在50-70%范圍內。Pozsgay等(參見，A.Berkin,B.Coxon和V.Pozsgay,C/em./，2002,8,4424.)。然而，當受體已經包含膦酸酯時，產率急劇下降，這可能限制這類條件提供所需三聚體、四聚體和其它更長多糖的能力。在目前情況下的Mitsunobu條件，使用Ph3P和DIAD，得到XV的良好產率(47。/。)。然而，使用Mitsunobu條件的修改形式，如在Campbell,Og.CA亂(1992)57:6331-6335描述的，可實現好得多的產率。Campbell的條件，使用三(4-氯苯基)膦和大量過量的三乙胺，得到88。/。產率的XV。在該反應中，當仔細排除可與弱親核膦酸鹽陰離子競爭的其它親核類型時，可得到最好的產率。方案4索弓l:i)(pCIPh)3P,DIAD，Et3N，THF;ii)KOH，MeOH;iii)PhSH,DBU，CH3CN。使用上面描述的Mitsunobu條件，發現三聚體形成的產率可比得上甚至高于二聚體形成的產率。通過脫乙酰作用將二聚體XV轉化為新的受體(—XVI)。然后，在XVI和XIII之間該修改的Mitsunobu反應提供92%產率的三聚體XVII。通過MS和NMR證明產物的成分，后者NMR具有一定的復雜性，原因在于由磷的手性產生的非對映異構體膦酸酯。化合物XVII被去乙酰基化，這產生可結合到其它延長單體的新的受體XVIII。在這步和接下來除去膦酸甲酯之后，破壞磷中心的手性，并且化合物XIX的NMR數據反映不存在磷非對映異構體。也發現，通過延長受體XIV和延長單體XIII的混合物在Mitsunobu條件的暴露時間，并且在存在一些過量XIII下，反應提供更長的單體。因此，在該反應條件下，從引入的延長單體切割C-6乙酰基在某一速度下在原位進行；這提供新的受體分子。因此在某些程度下，例如，通過延長暴露于Mitsunobu反應，進行將XVI轉化為XVI，并且在那些條件下在存在過量xm下，形成xvn;等等，以產生更高的寡聚物。因此，該反應提供了制造含有保護形式的多個甘露糖單元的寡聚物的方式，而不需要逐步的去保護/分離過程，并且使本發明合成的免疫原性寡糖具有大小分布。在一些實施方式中，這已表明，主要提供四-和五-甘露糖寡糖，具有少量的更長寡聚物。因此，在本發明中提供合成更長寡聚物化合物的高度有效的方法。本發明也提供從容易獲得的前體1,3,4，6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖，合成2-疊氮基-2-脫氧-D-吡喃甘露糖的簡單又改進的方法，如方案5闡述。該中間體可用于合成許多本發明的甘露糖單元。方案5XX!I.XXIHXXIVi,(TfO)Apyrii,NaN3在合成保護的2-疊氮基甘露糖化合物的嘗試中，使用三氟甲磺酸酐(triflicanhydride)將1,3,4，6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖轉化為其2-0-三氟甲磺酸酯，并且用NaN3處理三氟甲磺酸酯。根據TCL和MALDI-TOF-ms，2-疊氮基產物以高產率形成，但是明顯地，在典型的含水生產期間，其大量分解，分離的產率僅20%。然而，當反應在沒有使用水下進行時，產率急劇上升。因此，用于取代的溶劑的大多數DMF在減壓下被除去，并且將殘留物轉移到干燥柱中，該干燥柱含有預干燥的二氧化硅在干燥甲苯中的漿體。使用在甲苯中增加的乙酸乙酯梯度洗脫產物。在純化后，產物是相對穩定的。1，3,4,6-四-0-乙酰基吡喃葡萄糖原料很容易用一鍋合成法(onepotsynthesis)從葡萄糖大規模合成，并且使用標準的條件以97%的產率獲得中間體三氟甲磺酸酯。從所述的轉化物的分離產率強烈依賴于工作條件的無水程度通過使用預干燥的玻璃器皿和前面描述的預干燥的二氧化硅除去水，對于最優化的產率是必需的。通過在生產期間和硅膠層析法期間，最小化在濕氣中的暴露，獲得的可重復產率為60%或更好。四乙酸酯產物顯示出在儲存期間分解的一些傾向。然而，通過用EtSH/BF3-Et20處理轉化為其1-乙硫基糖苷后，其變得十分穩定。接下來用醇鹽處理，以除去乙酸酯基團，如方案6所示，并且用叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBS)基團，選擇性地保護伯羥基。兩個仲羥基被保護為芐酯，但是這里和整個過程的其它許多步驟中可使用各種各樣不同的保護基。然后，用連接體取代一SEt基團，連接體可被用來將最終的寡糖結合到蛋白質。可選地，其可被用來在裝配寡糖時將受體單體結合到固體支撐體。在該情況下，在異頭位置將被保護的氨乙基引入；然而，可以使用多種適于結合寡糖的連接基團，并且本領域的普通技術人員，可容易選擇和使用其它的基團。方案6XXVXXViXXVII二聚體可被用作免疫原，不用進一步的延長，或者可以制備和使用更長的寡聚物。對于二聚體和三聚體，通過標準的水解除去C6位置的乙酰基。使用1,8-二氮雜-7-雙環[5.4.0]十一碳烯(DBU)作為堿以及苯硫酚，切割膦酸酯的甲酯，以實現親核去甲基化作用。然后經由標準的還原氫化，切割芐醚連同芐氧基羰基，這使用活性炭上的鈀作為催化劑。為了使反應進行徹底，加入含水HC1，以便形成的胺被質子化以形成氯化氫，這減少了催化劑中毒的傾向。可將本發明的寡糖施用給哺乳動物，以誘導免疫原性應答；它們可按照前面描述的使用，典型地在至少部分去保護以后使用。它們也可被部分或完全乙酰化，以加寬誘導出的免疫應答譜。目標生物體的CPS基本上在C-3羥基處乙酰化；因此本合成方法的靈活性使其可能制備含有一個或多個乙酰基團的化合物，并且特別可能制備二聚體、三聚體和在C-3羥基處部分或完全乙酰化的更高的寡聚物，或者這些的混合物。代替地或另外地，使用膦酸酯鍵穩定磷酸二酯，如前面描述的，其可能通過在合成處理期間上至和任選地在將寡糖結合到蛋白質的步驟中，加入氮化物基團如C-2氮雜取代基，穩定磷酸二酯至可用的程度。這種穩定是誘導性的，但是足夠提高中間體的工作穩定性超過相應的NHAc化合物的工作穩定性。在氮化物完成其目標之后，可用硼氫化鎳將其還原，并用乙酸酐或相似的酰化劑酰化，如本文所描述。本發明的寡聚物化合物因此可引入磷酸二酯鍵至一定程度，如上描述，并且通過一般的方法和本文描述的那些方法引入磷酸二酯。為了具有使兩個目標分子具有或不具有乙酸酯的選擇，保護基策略基于乙酸酯作為永久保護基。為了穩定異頭磷酸二酯鍵，使用氮化物作為乙酰氨基的前體，盡可能進入合成，如下面方案7中闡述的。氮化物的吸電子性能和缺少參與作用(participatingeffect)強烈地保護該鍵。而且，在使用二甲氧基三苯甲基作為6-0H的臨時保護基的開始問題之后，我們使用TBDMS(叔-丁基二甲基甲硅烷基醚，有時稱為TBS)。TBDMS醚以良好的產率被切割下來，由于乙酰基移動或易分解的磷酸二酯鍵的切割，產生很小的問題。在先前的C-膦酸酯合成中成功用來將TBDMS醚去保護的TBAF不能被使用，原因在于如果使用TREAT-HF，乙酰基移動相當緩慢(特別當在位置2具有氮化物時)但可靠。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>對于一個有效的模塊合成，需要三個單糖結構單元；具有初始單體6-OH受體的間隔區、具有臨時6-OH保護的o;-H-膦酸酯延長單體(供體l)和在伯位置磷酸化的封端a-H-膦酸酯單體(供體2)。為了獲得在C-6位置具有磷酸酯的目標分子，如這里以三聚寡糖為示例，含有二芐基保護的磷酸酯的供體被使用，這是因為使用amidite化學的C-6羥基的連接后(post-linkage)修飾嘗試是不成功的。為了簡化合成，從相同的前體XXVIII合成所有三個單元，如上面方案7所示。使用傳統的方法合成原料。為了制造受體，將原料偶聯到芐氧基羰基保護的乙醇胺間隔區，產率為86%，使用TREAT-HF除去TBDMS-醚得到97%產率的受體XXIX。首先通過使用NIS作為促進劑和水作為受體在-2(TC下糖基化，水解硫代葡糖苷，合成供體l。僅得到期望的a異頭物，產率為82%。如果在室溫下反應，形成大百分比的/5型。然后，使用PCV咪唑，膦羧化該化合物，得到97M產率的XXX。因此，本發明包括在低溫下例如低于室溫下制備a異頭物，優選在低于(TC進行，更優選地在低于-l(TC，例如-2(TC或更低。為了合成具有H-膦酸酯——其可用于加入通過磷酸二酯鍵與本發明寡糖連接的甘露糖單元——的供體甘露糖單元，TBDMS-醚以75%的產率被切割，并使用amidite化學，磷酸化羥基，以在C-6處得到芐基保護的磷酸酯(67%)。以與供體l相同的方式通過偶聯水，水解乙基硫代糖苷(79%)，然后將其膦酸化，得到92%產率的11-膦酸酯供體甘露糖單元XXXI。使用傳統的H-膦酸酯化學，用新戊酰氯促進的濃縮，將延長單體偶聯到受體，如下面方案8所闡述。使用元素碘和水，氧化H-膦酸酯二酯，以提供磷酸二酯。以良好的產率(96%)獲得二聚物。方案8<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>通過用TREAT-HF對C-6羥基去保護和反復加入延長單體，實現延長到三糖；這里保護基策略與在上面用于膦酸酯鍵構建的方案中示例的保護基策略的相容性，使兩種類型的鍵在給定的寡糖中混合或匹配。這里實例闡述了用供體分子XXX和XXXI延長，提供在最后的甘露糖單元上具有C-6羥基，或者在那個位置上具有C-6O-磷酸酯的三聚寡糖。方案9這里R是OH或者二芐基磷酸酯。為了獲得三糖，再次使用TREAT-HF，以91%的產率除去二糖上的TBDMS-醚。接下來用與偶聯二糖所使用的相同條件偶聯兩個供體，導致分別以62%和59%的產率形成兩個三糖。在第二或后來偶聯期間獲得的產率低于從第一步偶聯獲得的產率，如Pozsgay等(參見，A.Berkin，B.Coxon和V.Pozsgay，C/em.2002，8，4424.)觀察到的。因此，在優選的實施方式中，寡糖中兩個相鄰的甘露糖單元之間的至少一些鍵一般包括膦酸酯，而不是磷酸二酯。本發明的兩種形式寡聚物上的氮化物在R'或其相當位置例如膦酸酯寡聚物的二聚物和三聚物中的R"基團處，也可包括另外的保護形式的磷酸酯。這被任選地引入，因為天然CPS中的末端甘露糖單元可被磷酸化，并且使用傳統化學可將相應的磷酰基團引入作為二節基磷酸酯。然后，例如，芐基可以隨C-3和/或C-4位置的芐醚被除去，或者芐基可以隨可用來保護第一甘露糖單元位置1的間隔區部分氨基的芐氧基羰基的還原性切割而被除去。芐基膦酸酯不干擾產生寡聚物所需要的其它反應。例如，使用硼氫化鈉和催化量的氯化鎳六水合物，在某些含有該基團的化合物中的氮化物被成功地還原為胺，并且使用乙酸酐將所形成的胺乙酰化，得到相應的氨酰基衍生物。當三聚磷酸二酯連接的化合物中的甘露糖單元的末端基團為OTBDMS時，這個反應產生89%的產率，當末端基團為二芐基磷酸酯時，產率為64%。1R=OAc2R=OHR，=TBDMSO或磷.1R"=NHZ2R"=NH2兩個三糖以不同的順序去保護。為了得到目標分子1和2，首先使用還原性氫化去保護Z-基團(83。/。)。為了避免還原性氫化期間磷酸二酯鍵的降解帶來的問題，將陽離子交換樹脂加入到混合物，得到良好的結果。再次使用TREAT-HF除去TBDMS-醚，給出85%產率的1。在標準甲醇鈉/甲醇條件下，切割乙酸酯。對于目標分子3，以與先前1去保護相同的方式除去Z(85。/。)，為了得到4，在還原性氫化之前(64%)除去乙酸酯(80%)。在上述方案中描述的方法也可用于制備具有C-膦酸酯的化合物，例如本文描述的分子式(l)或(l')的那些化合物。使用化合物作為抗原通過上述方法制備的寡糖是免疫原性的，并且可用于誘導保護免于腦膜炎奈瑟氏菌感染的免疫應答，如在疫苗中。具體而言，具有上述分子式(l)所示結構的寡糖如果被投藥給哺乳動物，能誘導免疫原性應答，并且因此施用包括分子式(l)的寡糖的組合物可用于誘導抗體的形成和/或提供免疫原性應答，以及提供對A型腦膜炎奈瑟氏菌感染的至少部分抗性或部分免疫性。抗體和/或免疫原性應答提供保護免于A型腦膜炎奈瑟氏菌感染。包括分子式(l)的部分的化合物，特別是W是CH2或0，X是O并且Az是NHAc的那些化合物，可用作如分子式(4)的化合物的疫苗成分。當被結合到蛋白質時，這些化合物是特別有用的，并且任選地，分子式(1)的Z基團可被用來將分子式(1)的寡糖結合到蛋白質。同樣地，在分子式的其它化合物中，本發明寡糖的第一甘露糖單元的C-l位置的相應基團，可以是能被用來將該化合物結合到載體蛋白，以提高其免疫原性性能的部分。盡管選擇通過Z連接，然而，本發明的化合物和具體包括分子式(1)或分子式(4)結構的化合物可被通過其它方法連接到載體蛋白，例如通過一個或多個羥基或者通過代替乙酰基連接在其中一個甘露糖單元的一個乙酰胺上的酰基。這類可選的連接機制在本發明的范圍內，只要寡糖的C-l(異頭)中心保持所需的a構型。優選地，這類寡糖在兩個甘露糖單元之間包括至少一個膦酸酯鍵。因此，本發明的一個方面涉及疫苗，其包含作為活性成分的免疫原性有效量的如本文描述的免疫原性寡糖。可將寡糖(一種或多種)引入宿主，包括人，或者單獨引入，或者結合到載體例如蛋白質而引入，或以甘露糖單元或其它糖類的均聚物或雜聚物而引入。在一些實施方式中，它們被用作復合糖，并且根據其對寡糖抗原的免疫原性應答的增強能力，選擇寡糖所結合的蛋白質有時優選在待被治療的哺乳動物中已誘導免疫應答的蛋白質。復合糖具有免疫活性增強的優點，并且另外具有誘導抗體和/或CTL的能力，所述抗體和/或CTL與病毒或腫瘤細胞的不同抗原決定子反應。本發明的免疫原性組合物包括至少一個本發明的化合物，并且可任選地包括一個以上這類化合物。因此，有時期望將本發明的兩種或多種化合物混合在一起，以擴大誘導出的免疫原性應答。例如，經常期望將化合物——其中ie是H——與化合物——其中ie是Ac——相結合，因為目標生物體的CPS是部分而不是全部地在這個位置被乙酰化。因此，在一些實施方式中，免疫原性組合物包括至少兩種、任選三種或多種這類的免疫原性化合物和/或這類化合物的蛋白質偶聯物。相似地，當作為復合糖被輸送時，載體蛋白可影響免疫原性應答，并且甚至影響抗體的準確屬性，所述抗體是由本發明的一種或多種化合物治療動物時產生的。因此，本發明包括含有一種以上載體蛋白的組合物，無論它們是否含有兩種或多種寡糖。可用的載體蛋白在本領域是公知的，包括，例如甲狀腺球蛋白、清蛋白例如人血清清蛋白、破傷風類毒素、白喉類毒素、聚氨基酸例如聚(賴氨酸谷氨酸)、流感病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒重組疫苗和類似物。也可使用細菌外膜蛋白，例如外膜復合物c(OMPC)、孔蛋白、運鐵結合蛋白、肺松解術(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、或肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)。其它蛋白例如卵清蛋白、匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)或純化的結核菌素(PPD)蛋白衍生物也可被用作載體蛋白。載體蛋白優選非毒性和非反應原性并且可以獲得充足數量和純度的蛋白。載體蛋白應當遵從標準的結合方法。在本發明優選的實施方式中，從白喉棒狀桿菌(Coo^"e^"en'aA;p/^m'ae)培養物純化并且使用甲醛化學去毒的白喉毒素被用作載體蛋白。在其它實施方式中，使用CRM197。將寡糖結合到載體蛋白的方法是常規的，有技術的從業者使用傳統的方法可產生含有本發明化合物的復合糖。指導在很多出版物也可獲得，例如在美國專利4，356，170;4,619,828;5,153,312;5,422,427;和5,445，817中。在一個這類實施方式中，使用2-氨基乙氧基在第一甘露糖單元的C-l位置作為間隔區部分和磷酸二酯鍵，并且使用辛二酸或方酸酯作為雙官能試劑將間隔區部分連接到載體蛋白，并且使用CRM197作為載體蛋白，制備復合糖。根據MALDI-TOF質譜分析，這些偶聯物在每個載體蛋白分子上平均包含大約五個寡糖分子。然而，通常期望寡糖載體蛋白的摩爾比為大約0.1到大約1，大約1-30:1或大約1-10:1的摩爾比在本發明的范圍內，無論使用哪種載體蛋白。寡糖與載體蛋白的比例也可表述為兩者之間的重量比例；通常優選大約1:1到1:500的比例。精確的比例依賴于蛋白質和寡糖的分子量的比例；對于更小的寡糖，有時使用1:5到1:200的重量比。在將莢膜多糖結合到載體蛋白之后，多糖-蛋白質偶聯物可通過各種技術進行純化(針對多糖-蛋白質偶聯物的量進行富集)。純化步驟的一個目標是從多糖-蛋白偶聯物去除未結合多糖。用于純化的一個方法，涉及在存在硫酸銨下進行超濾，其被描述于美國專利6,146,902。可選地，通過任意的許多標準技術，其中包括尺寸排阻色譜法、密度梯度離心法、疏水作用色譜法或硫酸銨分餾法以及其它方法，可從未反應的蛋白質和多糖中純化出偶聯物。參見，例如Anderson,P.W.等，/mmwwo/.(1986)137:1181-1186。也參見Jennings,H.J.等，/畫腳/.(簡)127:1011-1018。本發明的疫苗包括至少一種本發明的免疫原性化合物，也可包括生理學上可耐受的(可接受的)稀釋劑例如水、磷酸鹽緩沖鹽鹽水或生理鹽水，并且進一步一般包括佐劑。美國專利第6,869,607號提供用于蛋白質-結合免疫原的非離子佐劑，并且討論了其它適用的佐劑，并且在此通過引用引入對那些佐劑的描述。物質例如弗羅因德不完全佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬、硫酸鋁、磷酸鋁和它們的組合是本領域公知的作為佐劑的物質。也可用的是BAY、DC-chol、pcpp、單磷脂A、CpG、AS-21、霍亂毒素和甲酰甲硫氨酰肽，以及乳液制劑，其包括MF59、SAF、角鯊垸、吐溫、pluronic-嵌段聚合物L121和成分例如單磷脂A、海藻糖二霉菌酸以及細胞壁骨架。也可包括細胞因子例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、干擾素和腫瘤壞死因子(TNF)。在本發明的一些實施方式中，明礬被用作佐劑。在用本文描述的組合物經由注射、氣溶膠、口服、經皮或其它途徑免疫之后，宿主的免疫系統通過產生大量對期望抗原特異性的CTL，對疫苗應答，并且宿主對后來腦膜炎奈瑟氏菌病原體的感染至少部分免疫。本發明的疫苗和藥學組合物打算用于腸胃外、表面、口腔或局部給藥。優選地，其被腸胃外給藥例如靜脈內、皮下、皮內或肌內給藥。因此，本發明提供腸胃外給藥的組合物，其包括溶解或懸浮于可接受載體的免疫原性部分的溶液，優選為主要含水載體。可使用多種含水載體，例如水、緩沖水、0.8%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質酸和類似物。可通過傳統的滅菌技術將這些組合物滅菌，也可無菌過濾這些組合物。對形成的水溶液可進行包裝以照其原樣使用，或者進行凍干，在給藥之前將凍干的制劑與無菌溶液結合。組合物可包含藥學可接受的輔助物質，其近似生理條件所要求，例如pH調節劑和緩沖劑，滲透壓調節劑、潤濕劑和類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、失水山梨糖醇單月桂酸酯、油酸合三乙醇胺等。這類藥學組合物的制備在本領域的普通技術范圍內，標準參考書例如最新版本的Remington'sPharmaceuticalScience可進行指導，其被引入本文作為參考。在優選的實施方式中，大量水混合物中包含分子式(l)或分子式(4)的至少一個部分的疫苗組合物被配制為無菌、無致熱原的緩沖鹽水或含磷酸鹽的溶液，其也可包括保存劑(或防腐劑)或者也可無保存劑。適當的保存劑包括例如芐醇、對羥基苯甲酸酯、乙基汞硫代水楊酸鈉、氯丁醇和亞芐基苯扎氯銨。溶液優選為接近等壓的，并且可用試劑例如酒石酸鈉、氯化鈉、丙二醇和磷酸鈉調節其滲透壓。藥物制劑中，本發明的免疫原性寡糖的濃度可廣泛變化，即，按重量計從在大約0.1%以下，通常在或至少大約0.1%至多達20%到50%或更多，并且主要根據流體體積、粘性等以及依照所選擇的具體給藥方式進行選擇。化合物和組合物的人單位劑量形式一般包括于藥物組合物中，其包括具有可接受載體、優選含水載體的人單位劑量，并且以本領域技術人員已知的流體體積施用，以將該組合物給藥于人，而且根據對于被治療的具體對象的普遍理解的原則進行調整。因此，在一實施方式中，本發明提供單位劑量的在適當量水溶液中的本發明疫苗成分，所述適當量的水溶液例如0.1-3ml，優選0.2-2ml。本發明的免疫原也可經由脂質體給藥，這可用來在特定的組織中濃縮免疫原，所述特定的組織例如淋巴組織，或者增強免疫原的活性或輸送特性。對于制備脂質體，多種方法是可行的，其被描述于例如Szoka等，j朋.iev.祝o如".5Zoe"g.(1980)9:467，美國專利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369號中。對于固體組合物，可使用傳統的無毒性固體載體，其包括例如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂和類似物。對于口服給藥，通過引入任何的通常使用的賦形劑，例如前面列出的那些載體，和單位劑量的活性成分——即，本發明的一種或多種化合物，無論其是否結合到蛋白質，形成藥學可接受的無毒性組合物。對于氣溶膠給藥，優選以細分的形式，連同表面活性劑和推進劑，提供免疫原性化合物。當然，表面活性劑必須是無毒性的，并且優選可溶于推進劑。這類試劑的代表是含有6到22個碳原子的脂肪酸與脂肪族多元醇或其環式酸酐形成的酯或偏酯，所述脂肪酸例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸(olestericacid)或油酸。可使用混合的酯，例如混合的或天然的甘油酯。按組合物的重量計，表面活性劑可占0.1%到20%，優選地0.25%到5%。組合物的余量通常是推進劑。當需要時，也可包括載體，例如用卵磷脂用于鼻內輸送。對于該用途的有效量依賴于例如寡糖組合物、其是否結合到蛋白質、給藥方式、患者的體重和總體健康狀況以及開處方醫師的判斷，但是一般地，初次免疫(即對于預防給藥)的范圍，對于70kg患者為從大約1.0/ig到大約5,000Mg肽(例如1.0Mg，1.5]Wg,2.0/xg,2.5/ig,3.0/ig,3.5/xg，4.0/xg,4.5/xg,5.0/xg，7.5Mg,10/xg,12.5Mg，15/xg,17.5/zg,20/zg,25/xg,30/xg,35^tg,40/xg,45/xg,50pg，75/xg,100/xg,250/zg，500/xg,750pig,1,000/ig,1,500]Ug,2,000^g,2,500pg，3,000/zg，3,500gg,4,0004，500/xg或5,000pg)。實際施用給對象的劑量通常根據每kg對象體重適當的量確定。例如，有效量可以是大約O.l到5Aig/kg體重。任選地，初次劑量之后，按照數周到數月的加強方案，給予從大約l.Opg到大約1，000/xg肽的加強劑量(例如1.02.0他2.5/ig，3.0jLtg，3.5pig,4.0/xg，4.5ptg,5.07.5/ig，1012.5pg，15pig，17.5jtxg,20jwg，25jLig,30/zg，3540jug,45/xg，50/xg，75#g,100Mg,250/ig，500/zg,750/ig,1,000/zg,1,500/ig，2,000/xg，2，500jiig，3，000jLtg,3,500/xg，4,000/zg,4,500/xg或5,000Mg)，這取決于通過測量患者血內特異性T細胞的活性所確定的患者的反應和狀況。包含本發明的化合物的免疫原性組合物適合使用于成年人或兒童，并且在一些實施方式中，它們被施用給處于感染腦膜炎奈瑟氏菌引起的腦膜炎的危險中的幼兒。任選地，這類組合物可與其它藥學活性物質組合給藥，并且經常地，與其它疫苗組合使用，作為兒童時期疫苗計戈U(chiWhoodvaccinationprogram)的一部分。有益地，施用的組合物可以包括其它類型的免疫原性化合物，例如也誘導免疫應答以提供針對其它腦膜炎病原體的保護的復合糖。因此，在一些實施方式中，本發明的疫苗組合物包括至少一種源自其它腦膜炎血清型的抗原，典型地源自血清型A、B、C、W135和Y的至少一種。優選的實施方式通常包括，至少一種和通常兩種或所有的血清型C、Y和W135的抗原，以及含有本發明寡糖的至少一種和任選2種或多種化合物。實施例下面的實施例闡明本發明的某些實施方式，但是絕不限定其范圍。示例性的反應和劑型的其它變化對本領域的技術人員是明顯的，其也在本發明的范圍內。例如，改變步驟的順序，或者修飾選擇的保護基策略通常為普通從業者所作的一般選擇。下面部分中化合物的編號方式與上面提供的反應方案中化合物的編號方式不相關，提供其是為了讀者的方便。一般方法在Merck預包被的60F254板上使用AMC(鉬酸銨-硫酸鈰(IV)-10。/o硫酸為100g:2g:2L)或8。/。H2SO4實施TLC，以可視化。在硅膠(0.040-0.063mm，Amicon)或反相凝膠(C1860A40-63/mi)上進行柱層析。在25°C、Varian300MHz或400MHz儀器下，在CDCl3(外標Me4Si，5=0.00)或020(內標丙酮13C，S=30.89，&=2.22)中記錄NMR譜。在30°C、減壓下，濃縮有機溶液。實施例1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>索弓l:0TBAF;")Ph3P，DIAD,DPPA,THF;叫HOAc,Ac20，H2S04;/v)a.NaBH4,NiCl2x6H20,b.Ac20;v)Me3SiBr;W)MeC(OMe)3,HOAc;v")PhSH,Et3N.二乙基C-(3,4，6-三-O-芐基-0!-D-卩比喃葡萄糖基)甲烷膦酸酯(2)。將TBAF(2.6g1.3eq)加入到二乙基C-(2-0-三丁基二甲基甲硅烷基-3，4,6-三-0-芐基-0:-0-吡喃葡萄糖基)甲烷膦酸酯(1，5.36g，7.7mmol)的THF溶液(150mL)中。20分鐘后，在減壓下除去溶劑，通過硅膠柱層析法純化產物，得到2(4.44g,7.6mmol,99%)。二乙基C-(2-疊氮基-3,4，6-三-0-芐基-2-脫氧-a-D-批喃甘露糖基)甲垸膦酸酯(3)。將DIAD(2.4ml，12.4mmol)逐滴加入冷卻的(-5。C)的Ph3P(3.1g，11.7mrno1)的THF溶液(50ml)中。30分鐘后，加入2(5.57g，9.5mmol)的THF溶液(20ml)。在另外的10分鐘后，加入疊氮磷酸二苯酯(DPPA;2.4ml，11.31mmo1)，并且使反應混合物達到室溫(rt)。在攪拌過夜后，蒸發溶劑，并且通過硅膠層析法純化殘留物，得到無色油3(5.0g，8.2mmol，86%)。13C-NMR(CDC13)138.17,137.92，137,38,128.6-127.7,78,2，74.3，73.9,73.7,73.5,72.4,69.5,68.8,62.2，62.1,62.0，61.9,61.0，60.9,27.9(d,/=141Hz),16.5,16.4;31P-NMR(CDC13)27.9。二乙基C-(6-0-乙酰基-2-疊氮基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧--0-吡喃甘露糖基)甲垸膦酸酯(4)。將化合物3(3.2g，5.2mmol)溶于HOAc/Ac20(l:l，32mL)。加入10滴1%—H2S04的Ac20溶液。在攪拌過夜后，將混合物倒入含有冰和CH2Cb的分離漏斗中。分離有機相，通過硅石塞過濾并進行濃縮。通過柱層析法純化殘留物，得到4(2.48g，4.4mmol，84%)。l3C-NMR(CDCl3)170.41，137.41,136.95，128.34-127,75,77.77,77.60，74.01，73.39，72.17,71.89,69.26,62.47，61.82,61.73,60.50,60.37,27.57(d,/=141Hz)，20.59,16.27,16.19;31P-NMR(CDC13)27.50;[a]D+37(cl.O,CHC13)。二乙基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3,4-二-0-節基-2-脫氧-0^-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯(5)。將催化量的NiCl2x6H20加入到攪拌的4(2.50g，4.45mmol)的MeOH溶液(125ml)中，然后每隔10分鐘，加入部分NaBH4(總計0.34g，8.9mmol)，直到在TLC(系統)中觀察不到原料。在50分鐘后，加入Ac20(3ml)，并用甲苯稀釋反應混合物，通過硅石塞過濾并進行濃縮。通過硅膠層析法純化殘留物，得到5(1.95g，3.4mmol，76%)。l3C-NMR(CDC13)170.4，169.7，137.3，137.0殘余芳族C128.5-127.7,75.3,72.6，72.4，72.1，72.0,67.1,61.91,61.8,61.8,61.3,61.2，48.8，48.6,28.5(d,/=142Hz),23.0，20.6,16.3,16.2,16.1;31P-NMR(CDC13)29.5。二甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯(7)。向5(0.25g，0.43mmol)的干燥CH2Cl2(5ml)溶液中，在室溫下加入溴三甲基硅烷(0.28111￡，2.2mmol，5eq)。在添加完成后，在室溫下攪拌混合物1小時。將溶液冷卻至0°C，加入Et3N(lmL)，然后加入水(lmL)。10分鐘后，在減壓下除去溶劑，并通過RP-層析法對殘留物進行脫鹽(水-水/MeOH1:1)。甲基化產物C-(6-O乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-吡喃葡萄糖基)甲烷膦酸酯(6)，而沒有進一步純化。向上面描述的反應的產物中，加入AcOH(5.5ml)和三甲基原乙酸酯(11.5mL)。在回流下加熱該混合物30分鐘，然后濃縮。通過硅膠層析法純化殘留物，得到7(0.20g，0.36mmd，84%，兩步)。(反應必須仔細監控，并且當反應完成時，正好停止反應，否則結果為想要的產品和6-OAc被去保護的產品的混合物。)13C-NMR(CDC13)170.6,170.0,137.4,137.1殘余芳族C129.9-127.4，75.3,73.0,72.5,72.4，72.0，66,7，61.8,52.9,52.8，52.2，52.1，49.0，48.7，28.0(d，7=142Hz),23.2,20,8;31P-NMR(CDC13)31.6。甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯(8)。向7(1.35g，2.46mmol)的THF溶液(2mL)中加入苯硫酚(1.0mL，9.83mmol)和Et3N(2.0mL，14.7mmol)。48小時后，將反應混合物直接置于硅膠柱上，并且首先用甲苯洗脫，然后用含有1.5%TEA的9:1的CHCl3/MeOH洗脫，得到8(1.28g，2.01mmol，82%)。13C-NMR(CDC13)169.5,169.1,137.1，137.1，殘余芳族C,127.4-126.7,75.0,72.6，72.1,71.6,71.2,62.0，51.7，50.6,50.5，49.5,28.6(d,/=129Hz)，22.4,22.3,19.9;31P-NMR(CDC13)20.4;[a]D+15(c1.0，CHC13)。將下述方案施用到實施例1的剩余部分和實施例2-6。索弓l:,〕(pClPh)3P,DIAD,Et3N，THF;〃)KOH,MeOH;/")PhSH，DBU，CH3CN;,v)H2,Pd/C,HCl2-羧芐基酰氨乙基6-0-[甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-節基-2-脫氧--0-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯1-2-乙酰氨基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-卩比喃甘露糖苷(10)。向8(50mg，0.093mmo1)、三(4-氯苯基)膦(38mg，O.lOmmol)、2-羧基芐基酰氨乙基2-乙酰氨基_3，4_二-0-芐基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(9.42mg，0.072mmo1)、Et3N(0.050mL，0.36mmol)的THF溶液(0.5mL)中，加入DIAD(0.021mL，10.4mmol)。45分鐘后，在減壓下除去溶劑，并且通過硅膠層析法(EtOAc，然后9:1的CHCVMeOH)純化殘留物，之后在LH-20凝膠柱(4:1的CH2Cl2/MeOH)上進一步純化，得到為非對映異構體混合物的產物10(70.1mg，0.064mmol，88%)。實施例22-羧芐基酰氨乙基6-0-[甲基C-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-芐基-2-脫氧-0^-吡喃甘露糖萄甲垸膦酸酯卜2-乙酰氨基-3，4-二-0-節基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(ll)。向10(73mg,0.066mmol)的MeOH(2mL)溶液中，加入溶解于MeOH的KOH儲液中的KOH(7.4mg,0.13mmol)。25分鐘后，用0112(:12稀釋該反應混合物，通過硅石塞過濾，并且在減壓下除去溶劑。在LH-20凝膠柱(4:1的CH2Cl2/MeOH)上純化殘留物，得到產物ll(70mg，0.066mmo1，100%)。實施例32-羧芐基酰氨乙基6-0-[甲基C-(6-0-[甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3,4-二-0-芐基-2-脫氧-0;-0-吡喃甘露糖基)甲垸膦酸酯1-2-乙酰氨基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧-o;-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯-2-乙酰氨基-3，4-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(12)。向8(27mg，0.051mmo1)、三(4陽氯苯基)膦(19mg，0.052mmo1)、11(38mg，0.036mmo1)和Et3N(0.025mL，0.18mmol)的THF(0.5mL)溶液中，力口入DIAD(0.010mL，0.052mmol)。40分鐘后，濃縮該反應混合物，并且通過硅膠層析法(EtOAc，然后9:1的CHCl3/MeOH)純化反應混合物。在LH-20凝膠柱(4:1的CH2CyMeOH)上進一步純化產物，得到12(52mg，0.033mmo1，92%)。實施例42-羧節基酰氨乙基6-0-[甲基C-(6-0-[甲基C-(2-乙酰氨基-3,4_二_0_節基_2-脫氧-0;-0-吡喃甘露糖基)膦酸酯-2-乙酰氨基-3，4-二-0-節基-2-脫氧-0;4)-吡喃甘露糖基)膦酸酯-2-乙酰氨基-3，4-二-0-節基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(14)。向12(67mg,0.043mmo)的MeOH(2mL)溶液中，加入溶解于MeOH的KOH儲液中的KOH(4.7mg,0.085mmol,2eq)。25分鐘后，用DCM稀釋該反應混合物，通過硅石塞過濾，并且在減壓下除去溶劑。在LH-20凝膠柱(4:1的CH2CVMeOH)上純化殘留物，得到13(65mg，0.042mmo1，100%)。向13(36mg，0.024mmol)的乙腈(0.5ml)溶液中，加入苯硫酚(0.096ml，0.94mmo1，40eq)禾口DBU(0.070ml，0.47mmo1，20eq)。2.5小時后，在減壓下除去溶劑，并且通過硅膠層析法(甲苯，然后9:1的CHCl3/MeOH+1.5。/。的TEA)純化產物。在LH-20凝膠柱(MeOH+1.50/。的TEA)上進一步純化產物，得到14(30mg，0.018mmol，75%)。31PNMR(CDC13):21.2,22.4。實施例52-氨乙基6-0-[C-(2-乙酰氨基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲垸膦酸酯-2-乙酰氨基-2-脫氧會D-吡喃甘露糖苷(15)。向11(35.1mg，0.033mmol)的乙腈(0.5ml)溶液中，加入苯硫酚(0.066ml，0.64mmo1，20equiv.)和DBU(0.048ml，0.32mmo1，lOequiv.)。2小時后，在減壓下除去溶劑，并且通過硅膠層析法(甲苯，然后20:1的CHCl3/MeOH+1.5%的TEA)純化產物。在LH-20凝膠柱(MeOH+1.5n/。的TEA)上進一步純化產物，得到2-(芐氧基羰基)氨乙基6-0-[C-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-芐基-2-脫氧普D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯]-2-乙酰氨基-3，4-二-0-節基畫2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(30mg，2.63mmo1，79%)。13C-NMR(CD3OD)173.55,172.57，158.72,139.94,139.66，139.64，139.39，138.24,殘余芳族C130.36-125.05,100.26,78.86，77.82,76.03，75.90,75.18,74.60，74.19，72.85,72.27，72.20，71.97,67.36，67.25,64.57,61.09，54.66，51.28,51.16,50.56,41.43,29.94(d,/=135Hz)，22.59,22.43。向該產物(10mg)的EtOH(4ml)溶液中，加入溶于水的HC1(0.1M，0.25ml)，然后加入催化量的碳上Pd。攪拌過夜后，在100psi氫氣氛中，用乙酸鈉中和該溶液。通過反相硅膠的塞子過濾該反應混合物，并且"PNMR顯示原料全部轉化為單一產物，凍干之后，其在P2-Biogel柱上進一步純化，得到15(100%)。NMR(D20):31P23.1;l3C22.5,22.6,26.7,28.5，30.9，39.5,47.2,52.8,53.1,53.3,60.0,63.6，63.9,66.8,67.8，69.1,69.6，72.072.1，73.1，74.5,99.3，174.8，175.4。實施例62-氨乙基6-0-[C-(6-0-(C-2-乙酰氨基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯-2-乙酰氨基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯l-2-乙酰氨基-2-脫氧普D-吡喃甘露糖苷(16)。向14(12mg)的EtOH(4ml)溶液中，加入溶于水的HC1(0.1M，0.25ml)，然后加入催化量的碳上Pd。攪拌過夜后，在100psi氫氣氛中，用乙酸鈉中和該溶液。通過反相硅膠塞過濾該反應混合物，并且31PNMR顯示原料全部轉化為單一產物，其在P2-Biogel柱上進一步純化，得到16(100%)。NMR(D20):31P22.72,22.75;3C22.5,22.7，23.9,26.9，28.7,30.9，39.5,47,1，52.8,53.2,53.3,60.9,63.6，64.0,66.9,67.3,67.8,69.2,69.5，69.7,72.1,72.2,73.2,74.2,74.5,99.4，174.8，175.4。實施例7a<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>乙基3，4,6-三-O-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-l-硫代-0!-D-卩比喃甘露糖苷(22)。向1,3,4,6-四-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧普D-吡喃甘露糖苷(21)(5.04g，13.5mmol)的012<:12溶液中，加入EtSH(1.6mL，21.6mmol)和MS(4A)。混合物在室溫、氬氣下攪拌30分鐘。然后在1個小時期間加入溶于CH2Cl2(10mL)中的BFr醚合物(4.8mL，38.1mmol)。7小時后，用012(:12稀釋混合物、用飽和的NaHC03洗滌混合物、過濾(硅石)并且濃縮該混合物。層析法(1:0—1:1甲苯-EtOAc)翻22(3.46g,9.22mmol，68%);13CNMRS14.8(SCH2CH3)，20.6，20.7，20.8(CH3CO),25.6(SCH2CH3),62.3，62.9,66.2,69.0,71.4(C畫2-6)，82.5(C-l),169.6，170.0，170.7(CH3CO)。乙基3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧-l-硫代-or-D-吡喃甘露糖苷(23)。向22(3.71g，9.88mmol)的MeOH(30ml)溶液中，加入NaOMe(lM)。1小時后，用AcOH中和該混合物，并且進行濃縮。將干燥殘留物溶于吡啶(15mL)，并且加入叔丁基二甲基甲硅垸基氯化物(1.94g，12.87mmo1)。在室溫下，過夜攪拌反應混合物。用乙酸酐乙酰化、用甲苯稀釋、過濾(硅石)、濃縮以及用層析法(l:0—1:1甲苯-EtOAc)純化，得到23(4.357g,9.73mmol,99%);[O!]d+109。(c1.0,CHC13);13CNMRS-5.33，-5.28(CH3Si)，14.7(SCH2CH3),18.4((CH3)3CSi),20.7,20.9(CH3CO),25.0(SCH2CH3),25.9((CH3)3CSi),62.6,62.9，67.0,71.7,71.9(C-2-6),81.5(C-l)，169.7,170.1(CH3CO);'H畫R50.05(s,3H),0.05(s,3H)，0.90(s，9H),1.30(t,3H),2.05(s,3H),2,10(s,3H),2.55-2.75(m,2H)，3.60-3.75(m，2H),4.10(m，1H),4.15-4.20(m,1H),5.20-5.25(m，1H),5.30-5.35(m,1H);用HRMS計算C18H33N3Na06SSi[M+Na]+為470.1757，發現為470.1750。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(26)。將NIS(394mg，1.75mmol)和AgOTf(催化劑)加入到23(653mg，1.46mmol)的濕CH2Cl2(10mL)溶液中。在-20。C攪拌反應混合物30分鐘。加入CH2C12，并且用忖325203(10%)洗滌該混合物、過濾(硅石)并且濃縮混合物。用層析法(l:0—1:1甲苯-EtOAc)純化殘留物，得到26(487mg,1.21mmol,82%);13CNMR—S-5.29,-5.22(CH3Si),18.6((CHs)3CSi),20.7,20.9(CH3CO)，26.0((CH3)3CSi)，62.1,63.2，66.971.0,71.6(C-2-6),92.7(C陽l),169.8,170.3(CH3CO);'HNMR5_0.05(s，3H),0.06(s,3H),0.89(s,9H)，2.03(s,3H),2.08(s，3H)，3.65-3.70(m，2H),4.00-4.02(m,2H),5.19-5.23(m，2H),5.42-5.47(m，IH)。3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脫氧-or-D-吡喃甘露糖基氫-膦酸酯，三乙銨鹽(27)。咪唑(915mg，13.45mmol)、PCl3(335)LtL，3.84mmol)和Et3N(2.0mL，14.35mmol)在MeCN(25mL)中的混合物在0。C下，攪拌30分鐘。在0'C下，30分鐘期間，加入化合物26(388mg，0.96mmol)的MeCN(25mL)溶液。然后在室溫下，攪拌該反應混合物10分鐘，用TEAB(0.5M)淬滅并進行濃縮。稀釋該殘留物(CHCl3)、用TEAB(0.5M)洗滌該殘留物、過濾(棉)并且濃縮該殘留物。殘留物的層析法(1:0—10:1CHCl3-MeOH+1.0yoEt3N)得到27(499mg,0.93mmol,97%);[a]D+67。(c1.0,CHC13);'3CNMR—S-5.43,(CH3Si),8.98,18,3((CH3)3CSi),20.6,20.8(CH3CO),25.8((CHs)3CSi),45.7，62.4,62.5,66.5,71.1，72.1(C陽2隱6),93.1(C-l)，169.4，70.0(CH3CO);NMR—5-0.06(s,3H),-0.05(s,3H),0.79(s，9H)51.94(s,3H)，1.99(s，3H),3.59-3.63(m,2H)，3.93-4.00(m，2H)，5.21-5.28(m，1H),5.37-5.41(m，1H),5.51-5.50(m,1H);31PNMR50.28;使用HRMS計算C16H29N309PSi[M]—為466.1411,發現為466.1400。實施例7b2-(節氧基羰基)氨乙基3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷(24)。將化合物23(527g，U8mmol)溶于含有MS(4A)的CH2Cl2(10mL)。加入節基N-(2-羥乙基)氨基甲酸酯(300mg，1.54mmol)，并且在-2(TC、氬氣下攪拌該混合物30分鐘，然后加入NIS(345mg，1.53mmol)和AgOTf(催化劑)。30分鐘后，用Et3N中和該反應混合物，用CH2C12稀釋該反應混合物、用Na2S2O3(10e/。)洗滌該反應混合物、過濾(硅石)并且濃縮該混合物。層析法(1:0—1:1甲苯隱EtOAc)得到24(595mg，1.02mmo1，86%);[a]D+46。(c1.0，CHC13);13C腿RJ-5.38,-5.34(CH3Si),18.4((CH3)3CSi),20.6,20.8(CH3CO),25.9((CH3)3CSi),40.7(HOCH2CH2NH),61.6，62.6,66.6,66.9,67.6，71.3,71.8(C-2-6,PhCH20，OCH2CH2N),98.0(C畫l),128.2,128.3，128.6,136.5(芳族C)，156.4(NHCOOCH2),169.6，170.1(CH3CO);'HNMR50.03(s,3H),0.04(s,3H),0.89(s，9H)，2.03(s，3H)，2.09(s，3H),2.35(s，1H)3.32-3.40(m,1H),3.44-3,52(m,IH)，3.58-3.66(m，3H),3.72-3.80(m，2H),3.98-4.00(m，1H),5.11(s，2H)，5.18-5.23(m,IH)，5.32-5.36(m，1H),7.16-7.36(m,5H)。2-(芐氧基羰基)氨乙基3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-0!-0-吡喃甘露糖苷(25)。向化合物24(575mg，0.99mmol)的THF(5mL)溶液中，加入TREAT-HF(0.81mL,4.97mmo1)。混合物在室溫氬氣下攪拌過夜。濃縮并且層析法(2:1—0:1甲苯-EtOAc)，得到25(448mg,0.96mmol,97%);[a]D+60。(c1.0,CHC13);13CNMR_S_20.7，20.8(CH3CO)，40.7(HOCH2CH2NH),61.4，61.6,66.4，67.0,67.5,70.9,71.0(C-2-6,PhCH20，OCH2CH2N),98.2(C-l),128.3,128.3，128.7,136.5(芳族C)，156.5(NHCOOBn)，170.1,170.5(CH3CO);'HNMR—52.04(s,3H),2.1(s，3H),3.32-3.46(m，2H),3.54-3.60(m,2H)，3.62-3.78(m,3H),4.02-4.04(m,1H),5.06-5.18(m,3H),5.22-5.28(m.1H),5.36-5.40(m，1H),7.28-7.38(m,5H);使用HRMS計算C2()H26N4Na09[M+Na]+為489.1597，發現為489.1574。實施例7c(3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脫氧-0^-卩比喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-(芐氧基羰基)氨乙基3,4-二-O-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-0f-D-吡喃甘露糖苷)三乙銨鹽(28)。化合物25(325mg，0.60mmol)和27(217mg，0.47mmol)的混合物被溶于吡啶(3mL)。加入新戊酰氯(144/iL，1.18mmo1)，并且在室溫氬氣下攪拌混合物1小時。將反應混合物冷卻至-40。C，并且加入l2(143mg，0.56mmo1)的吡啶-水溶液(3mL，49:1)。在0'C完成氧化，并且用CHCl3稀釋混合物，用Na2S2O3(10。/。)和冷的TEAB(0.5M)洗滌該混合物。過濾(棉)、濃縮并且層析法(1:0—10:1CHCl3-MeOH+0.5Q/o的Et3N)，得到28(469mg,0,45mmol,96%);[a]D+52°(c1.0,CHC13);13CNMR_S-5.48，-5.38(CH3Si),9.27，18.4((CH3)3CSi),20.6,20.7，20.8，20.8(CH3CO),25.9((CH3)3CSi),40.7(HOCH2CH2NH)，45.8，61.7,62.2，64.5,66.3,66.6,66.7,67.3,69.8,69.9，71.2,71.3,71.8(C-2-6，2'-6'，PhCH20，OCH2CH2N)94.],97.9(C-l,128.1,128.2,128.6,136.8(芳族C)，156.7(NHCOOBn),169.3,169.7，170.0,170.1(CH3CO);'HNMR—S0.00(s,3H)，0.02(s，3H)，0.88(s,9H)，1.98(s,3H),2.00(s，3H)，2.06(s，3H),2.08(s，3H),3.30-3.38(m,1H),3.42-3.52(m,1H),3.56-3.64(m,1H),3.66-3.68(m，2H),3.74-3.80(m,1H),3.90-4.04(m,5H),4.12-4.14(m,1H),5.1(s，2H),2.16-2.22(m,1H),5.29(m,1H)，5.32-5.47(ni,3H),5.51-5.54(m，1H)，5.63-5.68(m，1H),7.28-7.38(m，5H);3IPNMR5-3.61。實施例7d(3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-or-D-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-(芐氧基羰基)氨乙基3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷)三乙銨鹽(29)。將化合物28(472mg，0.46mmo1)溶于THF(10mL)中，并且加入TREAT-HF(372pL，2.28mmo1)。混合物在室溫下攪拌24小時，然后濃縮并在硅膠上純化(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5。/。的Et3N)，得到29(390mg,0.42mmol,91%);[+340(c1,0，CHC13);13CNMRS10.6,20.6,20.8,20.8,(CH3CO)，40.7(HOCH2CH2NH)，46.1,61.5，61.7,62.2，62,3,64.6,66.6,66.6,66.8,67.4，69.9,70.0,70,9，71.2,71.9,(C-2-6,2'-6'，PhCH20,OCH2CH2N),94.0,98.0(C-l,-l')，128.1，128.2，128.6,136.6(芳族C),156.6(NHCOOBn),169.9,170.3(CH3CO);31PNMR5陽3.51;使用HRMS計算C3。H39N7018P[M]—為816.2089,發現為816.2078。下列方案應用于實施例8-12。實施例7(3,4-二-O-乙酰基-2-疊氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基—2-脫氧-o;-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-(節氧基羰基)氨乙基3,4-二<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-"-0-吡喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(30)。向化合物27(273mg，0.51mmol)和29(357mg，0.39mmol)的吡啶(3mL)混合物中，加入新戊酰氯(119/zL，0.97mmo1)。兩小時后，將該混合物冷卻至-40。C，并且加入l2(119mg，0.47mmol)的吡啶-水溶液(3mL，49:1)。當溫度達到-10'C時，用CHCl3稀釋混合物。用Na2S2O3(10%)、冷的TEAB(0.5M)提取，過濾(棉)并且層析法(l:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5°/c^Et3N)，翻30(351mg,0.24mmol,62%);[a]D+68°(c1.0,CHC13);13CNMRS-5.53,-5.42(CH3Si),10.1,18.3((CH3)3CSi),20.5，20.6,20.6,20.8(CH3CO),25.9((CHs)3CSi)，40.6(HOCH2CH2NH),45.9,61.7,62.1，62.3,64.2,66.2,66.4,66.5,67.1,69.7,70.4,71.0,71.2,71.4,71.6,77.4(C-2-6，2'-6',2"-6",PhCH20,OCH2CH2N),93.8,94.0,97.8(C-l,-l")，128.0,128.2,128.5,136.9(芳族C)，156.8(NHCOOBn)，169.3,169.6,169.7，169.8,169.9,170.0(CH3CO);'HNMR5-0.05(s,3H),-0.03(s，3H)，0.80(s,9H),1.90-2.00(m,18H),3.23-3.31(m，1H),3.36-3.45(m,1H),3.50-3.64(m,4H)，3.69-3.76(m,1H),3.79-3.97(m,7H)，4.02-4.15(m，3H)，5.00-5.06(m，2H),5.12-5.21(m,2H),5.24-5.31(m，IH)，5.33-5.37(m，2H)，5.38-5.45(m,3H),6.04-6.10(m，IH)，7.18-7.30(m,5H);31PNMR5-3.89，-3.56;使用HUMS計算C46H66N10NaO27P2Si[M+Na]—為1303.3241，發現為1303.3197。實施例8(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-脫氧-Q!-D-吡喃甘露糖磷酸酯H1—6)-(2-(節氧基羰萄氨乙基2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(31)。將化合物30(83mg，0.056mmo1)溶于MeOH(3mL)，并且加入NiCl2(H2O)6(催化劑)。通過在0。C，1小時的期間內，以小量加入NaBH4，進行還原。然后用乙酸酐處理該混合物，接下來進行稀釋(MeOH)和濃縮。在硅膠(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5%的Et3N，LH-20凝膠(MeOH+1.5y。的Et3N)上純化該殘留物，得到化合物31(76mg，0.050mmo1，89%);[a]D+63。(c1.0,CHC13);13CN證S-5.44，-5.38(CH3Si),8.46,18.4((CH3)3CSi),20.9,21.0,21.0，21.1,23.0,23.0,23.0，23.3,23.9(CH3CO,CH3CONH),26.0((CH3)3CSi),40.8(HOCH2CH2NH),46.1，50.1,50.4，50.7(C-2，-2',-2"),59.1,61.6,64.5,65.0,65.7,65.9，66.7，67.1，70.0，70,2,70.3,71.3,77.4(C-3-6，3'-6',3—"-6",PhCH20,OCH2CH2N)，94.9,95.1，99.1(C-l，-1',-1"),128.0，128.1,128.6，136.8(芳族C),156.6(NHCOOBn)，169.5,169.6,170.0,170.5,170.6，170.8，171.3(CH3CO,CH3CONH);31PNMRS-3.75,-3.39;使用HRMS計算C52H79N4O30P2Si[M+H]-為1329.4024,發現為1329.3984。實施例92-氨乙基-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脫氧-o;-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脫氧普D-吡喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(32)。向化合物31(37mg，0.024mmo1)的MeOH(1.5mL)溶液中，力G入AmberliteIR-45(OH—)樹脂(40mg)和活性炭上的鈀。在100psi下氫解(hydrogenolyse)該混合物過夜，并進行稀釋(MeOH)、離心和濃縮。在反相凝膠(1:0—0:1H20畫MeOH)上純化，得到32(28mg，0.020mmo1，83%);[a]D+60°(c1.0,MeOH);13CNMR(D20)5-5.9，-5.4(CTI3Si),8.89，18.7((CH3)3CSi)，20.9，21.0,22.4,22.5(CH3CO,CH3CONH),26.0((CH3)3CSi),39.7(HOCH2CH2NH),47.3,50.6,51.4(C-2，-2',陽2")，62.4,64.4，64.7,64.9，65.9,66,2,66.6,70.1，70.8,71.0，71.2，71.5(C畫3-6，3—'-6',3—"-6"，OCH2CH2N)，95.4，95.5，99.1(C-l,誦l',匿l")，173.1,173.3,173.5,173.6,173.8,174.9,175.1，175.2(CH3CO，CH3CONH);31PNMR(D20)5-3.04,-2.87;使用HRMS計算C44H72N4028P2Si[M+H『為1195.3656,發現為1195.3567。實施例102-氨乙基-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脫氧-o;-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-脫氧-or-D-吡喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(33)。TREAT-HF(17/xL，0.10mmol)的THF(1.5mL)溶液用Et3N(17gL，0.12mmol)處理。將該溶液加入到化合物32(28mg，0.020mmol)。在室溫下攪拌30分鐘之后，濃縮該混合物并在反相凝膠(1:0—0:lH2O-MeOH)上純化，得到33(22mg，0.017mmo1，85%);[a]D+45。(c1.0，MeOH);13CNMR(D20)58.87,20.9,20.9,22.3，22.4(CH3CO:CH3CONH),39.6(HOCH2CH2NH)，47.3,50.6，51.3，51.4(C-2，-2',-2"),60.2,64.3,64.5,64.9,66.2,66.4,69.9,70.0,70.5，70.5，70.7,70.8,71.0，71.6(C-3-6,3'誦6',3"-6"，OCH2CH2N),95.3,95.3，99.5(C-l,陽l',-1"),173.3,173.3,173.6,173.7，173.8,175.0,175.1,175.3(CH3CO,CH3CONH);HNMR5(D20)2.03(s，3H),2.08(s,3H),2.09(s,3H)，2.14(s,3H),2.14(s，3H)，2.18(s，3H)，2.24(s,3H)，2.24(s,3H)，2.24(s,3H),3.28-3.36(m,2H),3.68-3.84(m,3H)，4.00-4.18(m,5H),4.27-4.33(m，IH)，4.57-4.64(m,2H)，5.22-5.30(m,IH)，5.31-5.37(m,2H)，5.44-5.49(m,1H);31PNMR(D20)5-3.02，-2.95;使用HRMS計算C38H58N4Na028P2[M+Nar為1103.261,發現為1103.2642。實施例112-氨乙基-(2-乙酰氨基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-("6)-(2-乙酰氨基-2-脫氧-0!-D-吡喃甘露糖磷酸酯H1—6)-(2-乙酰氨基-2-脫氧-or-D-卩比喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(34)。將化合物33(22mg，0.017mmol)溶解于MeOH(lmL)，加入NaOMe(lM)。30分鐘后，濃縮該混合物，并且在反相凝膠(1120—MeOH)上純化殘留物。凍干含有產物的級分，得到34(14mg，O馬匪ol，94%);[a]D+12.4。(c0.5，MeOH);13CNMR(D20)522.6(CH3CONH)，40.1(HOCH2CH2NH)，53.1,53.8,53.9(C-2,鍾2',-2"),60.8，65.3,66.6,67.0,69.1,69.3,69.5,72.2,73.0，74.1(C-3-6,3'隱6'，3"-6",OCH2CH2N),95.8,95.8，99.6(C-l,隱1'，-l")，175.5,175,-5,175.6(CH3CONH);3IPNMR(D20)S-2.36,畫2.22;使用HRMS計算C26H47N4022P2[M+H〗-為829.2157,發現為829.2064。實施例13a'3SRLH,R2-SEt(75%)'36R's(BnO)2P(0)0,R;S3Bt<67%)'37R',iiO)2P(0)0，R2^011(79%)乙基3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-l-硫代-o;-D-吡喃甘露糖苷(35)。向溶解在THF(6mL)的化合物23(305mg，0.68mmol)中，加入TREAT-HF(0.55ml，3.38mmo1)。在室溫下攪拌混合物過夜。濃縮和層析法(10:1—0:1甲苯-EtOAc)，得到35(171mg,0.51mmol,75%);13CNMR514.7(SCH2CH3),20.6，20.8(CH3CO),25.4(SCH2CH3),61.3，63.0,66.6，71.1，71.3(C-2-6),82.2(C-1),170.0,170.6(CH3CO);'HNMR51.26-1.30(t,3H)，2.05(s,3H)，2.08(s,3H),2.32(s,IH)，2.56-2.68(m,2H),3.58-3.67(m,2H),4.09-4.14(m,2H),5.24-5.35(m，3H)。實施例13b乙基3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸二節酯-1-硫代-a-D-吡喃甘露糖苷(36)。向溶解于CH2Cl2(10mL)的化合物35(171mg，0.51mmol)中，加入四唑(125mg，1.78mmol)和N-N-二異丙基氨基磷酸酯(264AtL，0.76mmo1)。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。在(TC加入wCPBA(176mg，1.02mmo1)，并且繼續攪拌30分鐘。稀釋(CH2Cy混合物，用Na2S2O3(10。/。)和NaHCO3洗滌。過濾(Na2S04)、濃縮和層析法(10:1—2:1甲苯-EtOAc)，得到36(200mg,0.34mmol,67%);[a]D+92。(c1.0,CHC13);13CNMP、S14.6(SCH2CH3)，20.5,20.6(CH3CO)，25.3(SCH2CH3),62.9,65.7,66.1,69.4，69.4，69.5,71.4,(C-2-6,PhCH20),82.0(C-1),127.9，128.0，128.5,128.5,128.6,128.6,128.7,135.8，135.9(芳族C)，169.5,169.9(CH3CO);31PNMR5-1.36;使用HRMS計算C26H32N3Na09PS[M+Na]+為616.1495，發現為616.1487。實施例13c3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸二芐酯-a-D-吡喃甘露糖苷(37)。將化合物36(281mg，0.47mmol)溶于濕CH2Cl2(10mL)，并且冷卻到-20。C。加入NIS(137mg，0.61mmol)和AgOTf(催化劑)，并且在-2(TC攪拌混合物30分鐘。混合物被稀釋(CH2Cl2)、用Na2S2O3(10%)洗滌、過濾(Na2S04)和濃縮。層析法(2:1—0:1甲苯-EtOAc)，得到37(201mg,0.37mmol,79%);13C麗RS20.7,20.7，62.5,66.2,66.3,66.4，68.6，68.7,69.6,69.7,69.8，69.8,71.0(C-2-6，PhCH20),92.5(C-l)，128.0，128.1,128.3，128.6，128.7,128.7，135.6，135.7(芳族C),169.8，170.1(CH3CO);j'PNMRS-1.87。實施例13d3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸二節酯-a-D-吡喃甘露糖基-氫-膦酸酯，三乙銨鹽(38)。在0r攪拌咪唑(349mg，5.13mmol)、PCl3(128/zL，1.47mmol)禾QEt3N(765/xL，5.49mmol)在MeCN(10mL)中的混合物30分鐘。在0。C，在30分鐘期間加入化合物37(201mg，0.37mmol)的MeCN(10mL)溶液。然后在室溫下攪拌反應混合物10分鐘，用TEAB(0.5M)淬滅，并且進行濃縮。殘留物被稀釋(CHC13)、用TEAB(0.5M)洗滌、過濾(棉)和濃縮。殘留物的層析法(l:0—10:1CHCl3-MeOH+1.0%的Et3N)，得至U38(243mg,0.34mmol,92%);[+55。(c1.0,CHC13);13CNMRS9.34,20.6，20.7(CH3CO),45.962.4，62.5，65.6，65.7,69.4,69.5，69.9,70.0,70.9(C-2-6，PhCH20),93.0(C-l),128.0，128.0,128.1,128.5，128.5,128.6，135.8(芳族C),169.5,169.9(CH3CO);31PNMR3-1.32,0.29;使用HRMS計算C24H28N3012P2[M]-為612.1148,發現為612.1129。下列方案應用于實施例13e和14-17。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>實施例13e2-(芐氧基羰基)氨乙基(3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸二芐酯-0;-0-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(3,4-二-0-乙酰基國2-疊氮基-2-脫氧-o;-D-吡喃甘露糖基磷酸酯H1—6)-(3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-Q!-D-吡喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(39)。38(96mg，0.13mmol)和29(103mg，0.11mmol)的混合物被溶于吡啶(3mL)中。加入新戊酰氯(34pL，0.28mmo1)，并且在室溫、氬氣下攪拌混合物2小時。將反應混合物冷卻至-40。C，并且加入l2(34mg，0.13mmol)的吡啶-水溶液(3mL，49:1)。在-10。C完成氧化，并且用CHC13稀釋混合物，用Na2S2O3(10M)和冷的TEAB(0.5M)洗滌該混合物。過濾(棉)、濃縮并且層析法(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5o/o的Et3N)，得到39(106mg,0.065mmol，59%);[a]D+80°(c1.0,CHC13);13CNMRS10.2,20.6,20.7，20.8(CH3CO)，40.6(HOCH2CH2NH),45.9,57.9,61.7,62.3,64.4，65.5,65.7，66.1，66.5，66.6,67.2,69.4,69.5,70.3,71.0，71.4(C-2-6,2'-6'，2"-6",PhCH20，OCH2CH2N),93.9，94.0，97.8(C-l,-1"),128.0，128.1，128.2，128.5，128.6,136.0,136.9(芳方矣C),156.8(NHCOOBn),169.6，169.7,169.8，169.9(CH3CO);31PNMR5-4.13,-3.58,-1.52。實施例122-(芐氧基羰基)氨乙基(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸二芐酯-or-D-吡喃甘露糖基磷酸酯H1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-a'-D-吡喃甘露糖苷)雙-三乙銨鹽(40)。將化合物39(76mg，0.047mmol)溶于MeOH(3mL)，并且加入NiCl2(H20)6(催化劑)。通過在(TC，在30分鐘的期間，以小量加入NaBH4，進行還原。然后用乙酸酐處理該混合物，接下來進行稀釋(MeOH)和濃縮。在硅膠(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5%的Et3N)和LH-20凝膠(MeOH+1.5。/。的Et3N)上純化該殘留物，得到化合物40(50mg，0.030腿o1，64%);13CNMR(D20)S8.89,20.7,20.8,22.4(CH3CO,CH3CONH)，40.7(HOCH2CH2NH),47.3,50.7,51.4(C-2,-2',-2"),64.5，65.9,66.1,66.5，66.6,67.2,67.3，69.7，69.8,70.5,70.8,70.9，71.1(C-3-6，3'-6'，3"-6",PhCH20,OCH2CH2N)，95.2，95.3，98.8(C-l，-l'，-1"),128.2，128.9,129.0,129.3,129.5,129.7，135.7,135.8,137.1(芳族C)，158.7(NHCOOBn)，172.8，172.9，173.2,173,3,173.4，173.4,174.8，174.9,175.0(CH3CO,CH3CONH);31PNMR(D20)5-3.05,-2.75，-1.20。實施例132-氨乙基(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸酯-0^-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-O-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-0!-D-卩比喃甘露糖基磷酸酯Hl—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-疊氮基-2-脫氧-a-D-卩比喃甘露糖苷)三-三乙銨鹽(41)。向化合物40(46mg，0.027mmol)的MeOH(2mL)溶液中，加入AmberliteIR-45(Off)樹脂(46mg)和活性炭上的鈀。在100psi下氫解(hydrogenolyse)該混合物過夜，并進行稀釋(MeOH)、離心和濃縮。在反相凝膠(1:0—0:1H20-MeOH)上純化，得到41(34mg，0.023mmo1，85%);[q:]d+43。(c1.0,MeOH);l3CNMR(D20)S8.89,20.9，20.9，22.4,22.4(CH3CO,CH3CONH),39.6,(HOCH2CH2NH)，47.3，50.6,51.3,51.4(C-2,-2',-2"),63.6,64.4,64.8,66.1，66.2,66.4，69.9，70.0,70.6,70.7,71.0(C-3-6,3'-6',3"-6",OCH2CH2N)，95.3,95.4,99.1(C-l,國l',匿l")，173.2,173.3，173.4,173.6，173.7,173.7,175.0，175.1，175.2(CH3CO,CH3CONH);31PNMR(D20)S-3.08,-2.95，0.05;使用HRMS計算C38H59N4031P3[M/2+H]-為580.1188，發現為580.1142。頭她i夕y142-(芐氧基羰基)氨乙基(2-乙酰氨基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸二節酯會D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基2-疊氮基-2-脫氧-0^-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-2-疊氮基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷)二-鈉鹽(42)。將化合物40(50mg，0.030mmol)溶于MeOH(3mL)，并且加入NaOMe(lM)。室溫下攪拌該混合物1小時。濃縮，并在反相硅膠(1:0—0:1H20-MeOH)上純化，得到42(30mg，O據扁ol，80%);13CNMR(D20)S22.6(CH3CONH),40.7(HOCH2CH2NH),53.1,53.8，54.0(C-2，-2'，-2")，65.1,66.4,66.5,66.8,67.5,68.9，69.1，69.6,71.0,71.1，71.9,72.0,72.3,73.1(C-3-6,3-'畫6',3"-6",PhCH20，OCH2CH2N),95.6,95.8,99.4(C-l，-l")，128.1，128.4，129.0,129.0,129.4,129.5,129.8,135.7,135.8，137.1(芳族C)，158.8(NHCOOBn),175.3(CH3CONH);31PNMR(D20)S-2.35,-2.23,-0.96。實施例152-氨乙基(2-乙酰氨基-2-疊氮基-2-脫氧-6-0-磷酸酯-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(l,6)-(2-乙酰氨基-2-疊氮基-2-脫氧-or-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-2-疊氮基-2-脫氧-a-D-吡喃甘露糖苷)三-鈉鹽(43)。將化合物42(30mg，0.024mmol)溶解于MeOH(2mL)溶液中。加入AmberliteIR-45(OH，樹脂(30mg)和活性炭上的鈀。在100psi下氫解(hydrogenoyse)該混合物過夜，并進行稀釋(MeOH)、離心和濃縮。在反相凝膠(1:0—0:1H20-MeOH)上純化，得到43(15mg，0.015mmo1，64%);[q;]d+13.6。(c0.5，MeOH);13cNMR(D20)522.6，22.6,22.6(CH3CONH)，39.7(HOCH2CH2NH),49.5,53.0,53.7，53.8(C-2，-2',-2"),63.8,64.2，65.1,65.2，65.4，66.5，66.7，67.0，68.9，69.2，69.5，72.2，72.3,72.9,73.1，73.2，73.4，73.4(C-3-6,3'-6'，3"-6"，OCH2CH2N)，95.9,99.6(C-l，-l'，-l")，175.4,175.5,175.5(CH3CONH);31P畫R(D20)S-2.35,-2.30,2.2;使用HRMS計算C26H46N4Na2025P3[M+2Na]—為953.1459,發現為953.1440。為了研究C-膦酸酯取代磷酸二酯對MenA糖的免疫原性和穩定性的影響，合成腦膜炎奈瑟氏菌組A多糖重復單元的三聚體的合成寡糖類似物，并將其結合到載體蛋白CRM197。分析該復合糖，以證實物理化學性質和小鼠中的免疫原性。該偶聯物的結構如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>通過用非乙酰化和非磷酸化堿分子中的c-膦酸酯基團取代連接單糖的磷酸二酯基團，得到該化合物。a)CRM-MenA合成復合糖的物理化學性質表征該偶聯物，以得到糖、蛋白、未結合(自由)糖的含量。實施例16而且，針對特異性抗MenA抗體，進行SDS—Page(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)和蛋白質印跡(WesternBlot)。糖和蛋白質濃度用鹽水復原凍干產物(終濃度^.8mg/ml)，通過比色檢測分析該產物，得到總磷和總蛋白含量(MicroBCA分析)。然后使用適當的轉化因子(convertingfactor),將磷含量轉化為總糖含量。因為在儲存該偶聯物期間產生一些沉淀，故加入濃縮的磷酸鹽緩沖液(磷酸鈉，100mMpH7.5)，達到10mM的終濃度。然后，考慮稀釋因子，重新計算濃度。在用磷酸鹽緩沖液稀釋后，該偶聯物具有97.10pg/ml的總糖濃度，和215.63/xg/ml的總蛋白濃度。b)在小鼠中的免疫原性以ELISA和殺菌測定，分析具有合成寡糖的偶聯物的免疫原性。用含有和不含有作為佐劑的磷酸明礬而配制的純化復合糖，使BALB/c小鼠(每組8只)免疫。在表1示出的免疫方案，包括在第0天、14天和28天三次給藥(每次200ng)，在第42天放血。在1次給藥后、2次給藥后和3次給藥后，分析血清，以確定特異性的總IgG和相應的抗體機能活動。MenA-CRM2011是野生型MenA偶聯物。表l:免疫組方案和治療方案<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>在ELISA測定中，分析血清，以特異性確定在小鼠血清中IgG抗體的應答。通過線性回歸曲線，計算針對A、C、W135和Y多糖抗原(MenA、MenC、MenW、MenY)的總IgG效價，并將其表示為ELISA單位/毫升(EU/ml)。通過與標準血清的滴定曲線對比，得到血清效價。用莢膜多糖和甲基化的人血清清蛋白的混合物包被微滴定平板，其每一個在PBSpH7.4中終濃度為5.0/zg/ml。密封該平板，在2°C-8°CT，培養過夜，然后以PBSpH7.4中的含有5。/。胎牛血清的緩沖液作為封閉劑，進行洗滌和浸泡(saturate)。在室溫下溫育1小時后，洗滌平板，并且將稀釋的測試血清加入到第一排的孔中。用兩倍稀釋步驟，通過滴定曲線分析血清。在2匸-8^下培養過夜后，洗滌平板，并且將結合到堿性磷酸酯酶的山羊抗小鼠抗體以1:2000稀釋到飽和緩沖液中，并且加入到平板中。在37t下，溫育該二抗2小時，洗滌后，將顯色底物溶液(溶于1M二乙醇胺緩沖液——pH9.8，0.5mMMgCl2，0.02%NaN3——中的lmg/ml磷酸對硝基苯酯)加入到平板。在室溫下溫育反應30分鐘，在405-620nm波長下，讀出吸收值。第一個點的吸收值高于標準吸收值的血清，被使用更高的初始稀釋度再次檢測。陰性抗體應答(在1:100稀釋時，第一個點的OD值低于0.300)的小鼠被定為2EU/ml效價，并且被歸類為"非-應答者"。血清殺菌抗體(SBAtO測定通過測量腦膜炎奈瑟氏菌體外的補體介導裂解(complement-mediatedlysis)，分析疫苗免疫誘導的功能抗體(Goldschneider等，1969)。使用大量商業幼兔補體作為補體來源(PelfreezelotNo.09958)。測定方案是基于添加有0.25。/。葡萄糖的MuellerHinton培養液(Difco)中的測試菌株的接種體，其開始于在瓊脂巧克力上生長的分離菌落。在37匸下，用5%(:02，溫育細菌培養物，并且當細菌到達早期指數生長期(O.D掘為0.220-0.240)時，停止生長。在具有1%BSA的Gey's平衡鹽溶液中，將該培養物稀釋到10^菌落形成單位/ml(ColonyFormingUnit(CFU)/ml)，并且在37。C、5%C02T，在存在熱滅活的試驗血清池(heatinactivatedtestserapool)和幼兔補體的情況下，溫育1小時。在溫育之前(TO)和溫育1小時后(T1)，將反應混合物鋪于MuellerHinton瓊脂(Difco)上。在37。C、5%0)2下，溫育平板過夜，并且計數對應于TO和Tl的CFU/ml。將血清殺菌抗體效價表示為產生50%殺菌的血清稀釋度的倒數。結果物理化學性質物理化學分析的結果表明，偶聯物的糖基化程度是非常低的。蛋白質印跡獲得的適度信號和偶聯物與CRM參比之間的SDS-Page中注意到的小的差異也表明低偶聯程度。可優化偶聯條件以及偶聯物的純化。ELISA結果獲得的結果報告于表2和圖4中。測量從每單一動物得到的ELISA效價，并以ELISA單位/ml(EU/ml)表示。計算對每一復合糖的特異性抗體應答，作為相應免疫接種組的幾何平均效價(GeometricMeanTitre,GMT)。第二次給藥后，血清在用佐劑配制的合成偶聯物中顯示出低效價，在沒有佐劑處理的免疫組中顯示出任何效價。具有和沒有明礬的情況下，偶聯物沒有顯示出任何效價。如預期的，具有和沒有佐劑處理的對照組顯示出高應答。表2.在第一次給藥后，第二次給藥后，第三次給藥后小鼠血清中確定的對多糖MenA的ELISA抗體效價。報告對每一免疫組計算的幾何平均效價。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>SBAb測定結果在從每一免疫組制備的血清池中確定血清殺菌效價。將殺菌效價表示為，對比于在TO測量的對照CFU/ml，導致反應混合物的CFU/ml下降50%的血清稀釋度的倒數。針對血清群(serogroup)A菌株F8238，測量殺菌效價。SBAb抗體效價報告于表3中。(MenA-CRM是野生型對照)表3.在第二次給藥后和第三次給藥后血清集合體中的殺菌活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>結論制備了偶聯物，并分析其物理化學、免疫化學和免疫學特性。物理化學和免疫化學分析都表明了偶聯物的糖基化程度。在對照組中，在具有或沒有佐劑的情況下，對免疫接種的應答，效價是高的。在第三次給藥后的血清池中，對比于第二次給藥后的血清，效價增加。在用不具有明礬的合成偶聯物治療的組中，效價是測量不到的，在用佐劑化偶聯物的免疫接種中，效價是可測量的但是較低。用寡偶聯物進行對照免疫接種的效價明顯較高。結果證明結合到蛋白載體CRM197的合成MenA寡糖在小鼠中是免疫原性的。偶聯物具有應該比天然磷酸二酯鍵穩定得多的C-膦酸酯鍵。一些免疫原性己被檢測的事實表明是有前景的。應理解，提供前述實施例來闡明本發明，而不是限定本發明的范圍。公開的要素的各種改變和組合是可行的，如一個普通技術人員將意識到的，這些也在本發明的范圍內。例如，用于胺和羥基的許多保護基是公知的，并且這些中的許多能被用來代替在本文中具體敘述的那些，而不背離本發明的精神。權利要求1.寡糖，其包括第一甘露糖單元和第二甘露糖單元，其中所述第一甘露糖單元包括在C-1處成α構型的間隔區，該間隔區可結合到蛋白質，其中所述第一甘露糖單元通過1，6-鍵結合到所述第二甘露糖單元，所述1，6-鍵將所述第一單元的C-6與所述第二單元的C-1相連接，并且其中所述1，6-鍵包括膦酸酯。2.權利要求l所述的寡糖，其中所述l,6-鍵在a構型中。3.權利要求1或2所述的寡糖，其中所述第一甘露糖單元是2-脫氧-2-氮雜取代的甘露糖衍生物。4.權利要求1-3任一項所述的寡糖，其中所述第二甘露糖單元是2-脫氧-2-氮雜取代的甘露糖衍生物。5.權利要求l-4任一項所述的寡糖，包括至少3個甘露糖單元。6.權利要求l-5任一項所述的寡糖，其中所述1,6-鍵具有[第二個甘露糖單元的C-l]-CH2-P-0-[第一甘露糖單元的C-6]的形式。7.權利要求l-6任一項所述的寡糖，其中存在的每一2-氮雜取代基選自NH2、NHAc和N3。8.權利要求1-7任一項所述的寡糖，其中第三個甘露糖單元通過含磷的鍵結合到所述第二甘露糖單元，并且其中所述鍵將所述第二甘露糖單元的C-6連接到所述第三甘露糖單元的C-l。9.權利要求8所述的寡糖，其中將所述第二甘露糖單元的C-6連接到所述第三甘露糖單元的C-l的所述鍵包括膦酸酯。10.權利要求8或9所述的寡糖，其具有下列分子式:其中，每一個Az獨立地選自NH2、NHAc和N3;Z表示能結合到蛋白質的所述間隔區部分，并且其可以是被保護形式或未保護形式，或者其可被結合到蛋白質；每一個Ri獨立地是H、任選地取代的C1-C6烷基、或M，這里M表示陽離子；X是O或CH2;每一113和114獨立地選自H、Ac、Bn和其它保護基；和W是H、或保護基、或磷酸酯、或連接另外糖單元的鍵。11.權利要求1-10任一項所述的寡糖，進一步包括通過所述間隔區部分連接到所述寡糖的蛋白質，所述間隔區部分在所述第一甘露糖單元C-l處成a構型。12.權利要求11所述的寡糖，其中所述蛋白質是選自白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、銅綠甲單胞菌外毒素(rEPA)、或者破傷風類毒素的滅活細菌毒素，或者其中所述蛋白質是CRM197。13.權利要求1-12任一項所述的寡糖，其中所述間隔區部分包括羥基或胺，它們中的任一個任選被保護，或者任選結合到蛋白質。14.權利要求1-13任一項所述的寡糖，其中W是酰基，R"是H。15.權利要求l所述的寡糖，其包括分子式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，每一個AZ表示氮雜取代基；每一R3和R4獨立地表示H或保護基；W表示H、保護基或連接到另一糖單元的連接體；W和X中的一個是O，并且W和X中的另一個是CH2;n是1或2;當n是l時，Yn是OR，當n是2時，一個Y是二O并且另一Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，這里M是陽離子；和Z是OR，、SR，或NR'2，這里每一R，獨立地是H或任選地取代的烷基、酰基、芳基、芳烷基、雜垸基、雜酰基、雜芳基或雜芳垸基；或者Z表示結合到另一糖單元的連接體，或者結合到蛋白質的所述間隔區部分。16.權利要求15所述的寡糖，其中蛋白質通過酰胺鍵或酯鍵連接到所述寡糖。17.權利要求15所述的寡糖，其中W是CH2，X是O，Az是NHAc，和n是2。18.權利要求15-17任一項所述的寡糖，其中R是M，Z包含-0-(CH2)n-NH-，其中n是2-6。19.權利要求15-18任一項所述的寡糖，其中113和114的每一個獨立地是H或Ac。20.制造寡糖的方法，該方法包括通過包含膦酸酯的1,6-鍵，將包含至少一個氮雜取代甘露糖單元的第一部分連接到包含至少一個氮雜取代甘露糖單元的第二部分，其中所述第一部分通常包括間隔區部分，該間隔區部分被連接到a構型中的甘露糖單元的C-1。21.權利要求20所述的方法，其中使用Mitsunobu反應將所述第一部分的甘露糖單元的C-6連接到所述第二部分的甘露糖單元的C-l。22.權利要求20-21的任一項所述的方法，其中所述1,6鍵是1,6-a鍵。23.權利要求20-22的任一項所述的方法，其中所述連接的N-取代甘露糖單元包括分子式(l)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，每一個AZ表示氮雜取代基；每一R3和W獨立地表示H或保護基；RS表示H、保護基或連接到另一糖單元的連接體；W和X中的一個是O，并且W和X中的另一個是CH2;n是1或2;當n是l時，Yn是OR，當n是2時，一個Y是K)并且另一Y是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，這里M是單價陽離子；和Z表示能結合到蛋白質的部分，其可以是被保護形式。24.權利要求23所述的方法，其中X是CH2，W是O。25.權利要求20-24的任一項所述的方法，其中在甘露糖單元上至少一個氮雜取代基是通過還原氮化物(N3)取代基得到的胺或取代胺。26.權利要求25所述的方法，其中所述胺或取代胺在甘露糖單元的位置2上。27.權利要求20-25的任一項所述的方法，其中位于異頭中心的Z或所述間隔區部分包括胺取代的烷氧基。28.權利要求20-27的任一項所述的方法，進一步包括通過在分子式(l)中的OW的氧和另外的糖之間形成鍵，將所述第二甘露糖單元連接到所述另外的糖。29.權利要求28所述的方法，其中所述另外的糖包括至少一個甘露糖單元。30.權利要求28或29所述的方法，其中所述另外的糖通過1,6-a鍵被連接到所述第二甘露糖單元。31.權利要求28-30的任一項所述的方法，其中W是H或Ac，并且存在的每一個甘露糖單元的異頭中心是在a構型中。32.合成o;-連接甘露糖單元的寡糖的方法，所述方法包括將含有分子式(2)的甘露糖單元與分子式(3)的延長單體在Mitsunobu反應條件下相結合，在所述分子式(2)中，其中W是C1-C6酰基或H，R1、R3、R4、Az和Z如權利要求15所定義；在分子式(3)中，其中RX表示C1-C6酰基，且M表示H或陽離子；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(3)從而得到含有由1，6-o;鍵連接的至少兩個氮雜取代的甘露糖單元的寡糖。33.權利要求32所述的方法，其中所述Mitsunobu反應條件被保持一段延長的時間，從而得到分子式(4)的寡糖，其中，p是從l到20的整數。34.權利要求32或33所述的方法，其中每一個Az表示NHAc或者Ns。35.權利要求33或34所述的方法，其中p是l-36.權利要求33或34所述的方法，其中p是2-10。37.權利要求32-36的任一項所述的方法，進一步包括將所述寡糖結合到蛋白質。38.權利要求37所述的方法，其中所述蛋白質是選自白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、銅綠甲單胞菌外毒素(rEPA)、或者破傷風類毒素的滅活細菌毒素。39.權利要求37所述的方法，其中所述蛋白質是CRM197。40.按照權利要求32-36的任一項所述的方法制備的寡糖。41.按照權利要求32-39的任一項所述的方法制備的免疫原性化合物。42.權利要求1-16或40的任一項所述的寡糖，其用于在下述方法中，所述方法包括將有效量的A型腦膜炎疫苗成分施用給對象，從而提供免疫原性應答。43.藥物組合物，其包括至少一種權利要求1-16或40的任一項所述的寡糖，和至少一種藥學可接受的賦形劑。44.免疫原性組合物，其包括至少一種權利要求1-19或40或41的任一項所述的化合物。45.A型腦膜炎疫苗，其包括至少一種權利要求1-19或40或41的任一項所述的化合物。46.權利要求45所述的A型腦膜炎疫苗，包括連接到蛋白質的寡糖。47.制造可用于制備免疫原性寡糖的甘露糖衍生物的方法，所述方法包括用親電體環化分子式(2)的化合物，形成分子式(3)的化合物，其中R2、R3、W和R6的每一個獨立地為H或保護基；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>48.權利要求47所述的方法，進一步包括用磷基團取代El的步驟。49.權利要求47所述的方法，進一步包括用氮化物取代分子式(2)或分子式(3)中的OR2。50.權利要求49所述的方法，其中所述取代步驟包括Mitsunobu反應。51.權利要求50所述的方法，其中所述Mitsunobu反應使用磷酰基氮化物作為氮化物來源。52.制備2-疊氮基-2-脫氧-D吡喃甘露糖的改進方法，該方法包括:在1，3，4,6-四-0-酰基-吡喃葡萄糖衍生物的位置2形成三氟甲磺酸酯；和用氮化物親核體取代所述三氟甲磺酸酯；其中所述改進包括在產物分離和純化步驟過程中，最小化原始反應混合物對濕氣的暴露。53.免疫原性組合物，其能夠誘導針對A型腦膜炎的保護抗體，所述組合物包括具有至少兩個糖單元的寡糖，所述糖單元通過穩定化的含磷鍵彼此共價結合。54.權利要求53所述的組合物，其中所述寡糖包括至少兩個通過穩定化的含磷鍵彼此共價結合的甘露糖單元。55.權利要求53-54的任一項所述的組合物，其中所述寡糖被結合到蛋白質。56.權利要求55所述的組合物，其中所述蛋白質不是清蛋白。57.權利要求53-55的任一項所述的組合物，包括至少兩種不同的寡糖部分。58.權利要求53-57的任一項所述的組合物，其中所述穩定化的含磷鍵是膦酸酯。59.權利要求58所述的組合物，其中所述膦酸酯鍵包括通過Mitsunobu反應形成的1,6-鍵。60.權利要求57所述的組合物，包括至少兩種不同的寡糖，所述至少兩種不同的寡糖對至少兩種腦膜炎球菌免疫型具有特異性。61.權利要求53-59的任一項所述的組合物，進一步包括肺炎鏈球菌抗原。62.權利要求61所述的組合物，其中所述肺炎鏈球菌抗原包括多糖。63.權利要求62所述的組合物，其中所述多糖被結合到蛋白質。64.權利要求53-63的任一項所述的組合物，進一步包括源自腦膜炎血清型A、B、C、W135和Y中至少一種的至少一種抗原。65.權利要求64所述的組合物，其中所述抗原源自腦膜炎血清型C、W135或Y。66.權利要求53-65的任一項所述的組合物，進一步包括佐劑。67.權利要求66所述的組合物，其中所述佐劑是明礬。68.權利要求63-67的任一項所述的組合物，其中所述寡糖通過含有二羧酸或其衍生物的雙官能試劑結合到所述蛋白質。69.權利要求68所述的組合物，其中所述二羧酸包括己二酸或辛二酸或它們的衍生物。70.權利要求68所述的組合物，其中所述雙官能試劑包括方酸酯。71.權利要求53-70的任一項所述的組合物，其中至少一個甘露糖單元包括在其異頭中心的ce-連接的間隔區部分。全文摘要可用于A型腦膜炎疫苗的寡糖，其包括在C-1位置具有成α構型的間隔區的第一甘露糖單元，該間隔區能結合到蛋白質，并且第一甘露糖單元通過1，6-鍵連接到第二甘露糖單元，所述1，6-鍵將第一單元的C-6與第二單元的C-1相連接，其中1，6-鍵包括膦酸酯。制造這類化合物、類似化合物或其中間體的相關方法也被公開。文檔編號C07H7/00GK101282984SQ200680024358公開日2008年10月8日申請日期2006年5月8日優先權日2005年5月6日發明者P·特奧多羅維奇,P·科斯坦蒂諾,S·奧斯卡松申請人:諾華疫苗與診斷股份有限公司;斯德哥爾摩大學