專利名稱：：用于純化抗體的方法
技術領域：
：本發明涉及多肽純化領域。本文描述了使用離子交換樹脂純化免疫球蛋白的新方法。本文同時提供了快速確定純化條件的方法。
背景技術：
：蛋白質，尤其是免疫球蛋白在當今的醫學領域中起著重要作用。對于人的應用，每一種藥物必須滿足獨特的標準。為確保生物藥劑對人的安全性，尤其要除去可導致嚴重傷害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白質。為滿足質量管理規格標準，必須在生產過程之后進行一個或多個純化步驟。其中，純度、生產量和產率在確定合適的純化方法中起著重要作用。已良好地建立不同的方法并且已將其廣泛地用于蛋白質的純化，例如使用微生物蛋白質的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如，陽離子交換(羧曱基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式的交換)、親硫吸附(例如使用p-巰基乙醇和其他SH配體)、疏水性相互作用或芳香族化合物吸附層析(例如使用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電脈、毛細管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。Necina，R.等人，Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698，報導了通過表現為高電荷密度的離子交換介質從細胞培養物上清液直接捕獲人單克隆抗體。在WO89/05157中，報導了通過直接對細胞培養基進行陽離子交換處理純化產物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.等人,J.Immun.Meth.115(1988)，79-88描述了從小鼠腹水一步純化單克隆IgG抗體的方法。Raweerith，R.等人(J.Immun.Meth，282(2003)63-72)使用方法的組合，即，辛酸沉淀法(caprylicacidprecipitation)和離子交換層析的組合作為分級分離胃蛋白酶消化的馬抗蛇毒素F(ab')2抗體的方法。在WO2003/102132中報導了用于純化蛋白質的非親和純化步驟和高效切向流過濾的組合。在WO92/19973中報導了兩種親和層析步驟的組合。Follman，D.K.和Fahrner，R丄.報導了使用無A蛋白的三個層析步驟的抗體純化方法的析因篩選(factorialscreening)(J.Chrom.A1024(2004)79-85)。Mhatre,R,等人(J.Chrom.A707(1995)225-231)4笨究了使用陽離子交換層析和pH梯度洗脫對抗體Fab片段進行純化。WO94/00561^^導了人單克隆抗獼猴抗體和產生該抗體的細胞系。在WO2004/024866中報導了通過離子交換層析純化多肽的方法，在所述方法中，使用梯度洗滌從一種或多種污染物中分離出目的多肽。Schwarz，A.等人(Laborpraxis21(1997)62-66)報導了使用CM-HyperD-柱對單克隆抗體的純化。WO2004/076485報導了使用A蛋白和離子交換層析進行抗體純化的方法。在EP0530447中報導了通過組合三個層析步驟純化IgG單克隆抗體的方法。在US4,983,722中報導了從抗體制品中除去A蛋白。WO95/16037報導了通過A蛋白陽離子交換層析進行的從雜種雜交瘤純化抗EGF-R/抗-CD3雙特異性單克隆抗體。在EP1084136中報導了通過使用離子交換層析從抗體多聚體分離其單體。US5,429,746涉及^f吏用疏水作用層析組合層析純化抗體分子蛋白質。發明概述因此本發明的目的是提供用于純化重組產生的免疫球蛋白和用于分離單體和多聚體免疫球蛋白種類的另一種方法。本發明提供了用于純化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括下列步驟a)提供包含免疫球蛋白、緩沖物質和任選的鹽的溶液；b)在免疫球蛋白借以與弱離子交換材料結合的條件下，使溶液和該弱離子交換材料接觸；c)通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液，以單步驟從弱離子交換材料回收免疫球蛋白。本發明還提供了用于確定在單步驟純化方法中從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度的方法，其包括下列兩個步驟a)步驟l包括下列亞步驟al)提供包含多肽、緩沖物質和任選的鹽的溶液；a2)在多肽借以與離子交換材料結合的條件下，使包含該多肽的溶液的第1等分試樣與該離子交換材料接觸；a3)通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液從離子交換材料回收多肽，其中所述鹽的濃度線性增加；a4)確定當多肽的第l級分開始從離子交換柱上洗脫時鹽的起始濃度；b)步驟2包括下列亞步驟bl)在多肽借以與離子交換材料結合的條件下，使包含該多肽的溶液的第2等分試樣與該離子交換材料接觸；b2)通過使用三步洗脫方法從離子交換材料回收多肽，其中i)將第1洗脫步驟的鹽濃度計算為下列的總和步驟a4)中確定的起始鹽濃度與該鹽分子式中指示的非氫單價陽離子總數的乘積，以及緩沖鹽濃度與該緩沖鹽分子式中指示的非氫單價陽離子總數的乘積；ii)第2洗脫步驟的鹽濃度是第1洗脫步驟的鹽濃度與1.25和1.35之間的因子的乘積；iii)第3洗脫步驟的鹽濃度是第1洗脫步驟的鹽濃度與1.50和1.70之間的因子的乘積；其中如下確定步驟ii)和iii)的因子當10mM和40mM之間的起始濃度時，因子分別為1.35和1.70，當40mM和70mM之間的起始濃度時，因子分別是1.30和1.60，以及當超過70mM的起始濃度時，因子分別是1.25和1.50。b3)確定多肽從離子交換柱洗脫時處于步驟b2)的三步驟洗脫法中的哪個亞步驟，從而確定單步驟純化法中用于從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度。發明詳述按照下列定義在本申請中使用這些術語本申請中所用的術語"離子交換樹脂"或"離子交換材料"是指攜帶共價結合帶電荷的取代基的固定高分子量基質。為了獲得總體電中性，將非共價結合的平衡離子結合至其上。"離子交換材料"具有將其非共價結合的平衡離子與周圍溶液的帶相似電荷的離子交換的能力。根據其可交換的平衡離子的電荷，"離子交換樹脂"被稱為陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。根據帶電荷基團(取代基)的性質，"離子交換樹脂"例如在陽離子交換樹脂的情況下是指磺酸樹脂(S)或羧甲基樹脂(CM)。根據帶電基團/取代基的化學性質，可將"離子交換樹脂，，另外分類為強或弱離子交換樹脂，這取決于于共價結合的帶電荷的取代基的強度。例如，強陽離子交換樹脂具有磺酸基團作為帶電荷的取代基，弱陽離子交換樹脂具有J^&基團(優選羧甲基基團)作為帶電荷的取代基，并且弱陰離子交換樹脂具有二乙氛乙基基團作為帶電荷的取代基。可以以不同的名稱從許多公司獲得陽離子交換樹脂，例如Bio-Rex、Macro-PrepCM(可從BioradLaboratories,Hercules,CA，美國獲才尋)、弱陽離子交換劑WCX2(可從Ciphergen，Fremont,CA，美國獲得)、DowexMAC畫3(可從Dowchemicalcompanyliquidseparations,Midland,MI，美國獲得)、MustangC(可從PallCorporation,EastHills,NY，美國獲得)、纖維素CM-23、CM-32、CM-52、hyper-D和partisphere(可從Whatmanpic,Brentford,UK獲得)、AmberliteIRC76、IRC747、IRC748、GT73(可從TosohBioscienceGmbH，Stuttgart,德國獲得)、CM1500、CM3000(可從BioChromLabs，TerreHaute,IN，美國獲得)和CM-SepharoseTMFastFlow(可從GEHealthcare-AmershamBiosciencesEuropeGmbH,Freiburg,德國獲得)。優選地，弱離子交換材料的帶電荷取代基是至少約90%的羧酸基團，超過卯％羧酸基團或超過95%的羧酸基團。可在本申請中互換使用的術語"單步驟洗脫"和"單步驟梯度洗脫"是指這樣的方法，其中例如引起洗脫(即從材料分離出結合的化合物)的物質濃度立即上升或下降，即在單步驟中直接從起始值/水平到終值/水平。"多肽"是天然或合成產生的，通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。少于大約20個氨基酸殘基的多肽稱為"肽"。"蛋白質"是包含一個或多個多肽鏈的大分子或超過100個氨基酸殘基的多肽鏈。蛋白質也可包含非肽組分，例如糖基。糖類和其他非肽取代基可通過在其中產生蛋白質的細胞加入至該蛋白質，并且將隨細胞類型的變化而變化。此處根據其氨基酸主鏈結構定義蛋白質；通常不指定取代基如糖基，但是它們是存在的。可在本申請中互換使用的術語"抗體"和"免疫球蛋白，，包含至少兩條輕多肽鏈和兩條重多肽鏈。各重多肽鏈和輕多肽鏈包含含有與抗原相互作用的結合結構域的可變區(通常為多肽鏈的氨基端部分)。每條重多肽鏈和輕多肽鏈也包含恒定區(通常為羧基端部分)，其可介導抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞、一些吞噬細胞和經典補體系統的第一組分(Clq))的結合。一般地，輕多肽鏈和重多肽鏈是完整鏈，各自基本上由可變區(即Vl或Vh)和完整的恒定區(即在輕多肽鏈的情況下為Cl或在重多肽鏈的情況下為CH1、CH2、CH3和任選的Ch4)組成。可將本發明抗體的可變區嫁接至其他同種型的恒定區。例如，可將編碼l-同種型重鏈可變區的多核苷酸嫁接至編碼另一重鏈類型(或亞類)恒定區的多核苷酸上。本文所用的術語"抗體"或"免疫球蛋白"是指由一個或多個基本上由抗體基因編碼的多肽組成的蛋白質。公認的抗體基因包括不同的恒定區基因和多種抗體可變區基因。抗體可以以多種形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(例如Huston，J.S.等人，PNAS美國85(1988)5879-5883;Bird等人，Science242(1988)423-426;和，一般地，Hood等人，Immunology,BenjaminN.Y.，第2版(1984)以及Hunkapiller和Hood,Nature323(1986)15-16)。在一個實施方案中，本發明的抗體包含單克隆抗體及其片段，例如分離的重鏈或輕鏈，或只由恒定區及其片段組成的重鏈或輕鏈。一般的層析方法及其用途對于本領域技術人員來說是已知的。參見例如，Chromatography,第5版，A部分FundamentalsandTechniques,Heftmann,E.(編著)，ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork,(1992);AdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciences,Deyl，Z.(編著)，ElsevierScienceBV，Amsterdam,TheNetherlands,(1998);ChromatographyToday,Poole,C.F.，和Poole,S.K"ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork,(1991);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(1982);Sambrook,J.,等人(編著)，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989;或CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel,F.M"等人(編著)，JohnWiley&Sons,Inc"NewYork。本發明提供了純化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括下列步驟a)提供包含免疫球蛋白、緩沖物質和任選的鹽的溶液；b)在免疫球蛋白借以與弱離子交換材料結合的條件下，將該溶液與該弱離子交換材料接觸；c)在單步驟中通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液從弱離子交換材料回收免疫球蛋白。免疫球蛋白的純化方法一般包括多步驟層析部分。在第1步驟中通過親和層析(例如使用A蛋白的親和層析)將非免疫球蛋白多肽和蛋白質與免疫球蛋白級分分離。然后可進行離子交換層析，以使各免疫球蛋白類型分離并除去已從第一柱共洗脫出的微量A蛋白。最后對于將免疫球蛋白單體從多聚體和相同種類的片段中分開來說，第3層析步驟是必需的。有時集合物的量很高(5%或更多)，因而不可能在第3個純化步驟中將其有效地分離，從而需要進一步的純化步驟。對于特定免疫球蛋白的重組產物，用于分離不同免疫球蛋白類型的分離步驟不是必需的。因此重組產生的免疫球蛋白的總體純化方法可減少至兩個層析步驟。通常在低于各個免疫球蛋白等電點的pH值下，在陽離子交換材料上層析條件A蛋白洗脫物。在進行本發明時，在我們的實驗室中可獲得足夠量的抗IL-1R抗體(WO2005/023872)和Herceptin⑧(抗HER2抗體(WO99/57134))，因此用這兩種免疫球蛋白舉例說明本發明。同樣一般可使用免疫球蛋白實施本發明。該示例性描述只是作為例子而并非是對本發明的限制。提供這些示例性例子有助于理解本發明，所附權利要求中顯示了本發明的真正范圍。本發明描述了用于從集合物和片段分離免疫球蛋白單體以及除去其他多肽雜質的純化方法。如可從實驗可看到的，通過使用弱離子交換樹脂，優選通過使用弱陽離子交換樹脂實現該純化。如通過對比強和弱離子交換材料所舉例說明的，弱離子交換材料提供了免疫球蛋白的單體和集合物形式的分離(參見實施例1和2以及實施例9和12)。在本發明的一個實施方案中，緩沖材料(物質)的pH值是pH3.0至pH10.0,優選pH3.0至pH7.0,更優選pH4.0至pH6.0以及最優選pH4.5至pH5,5。在一個實施方案中，在單步驟中保持pH值恒定，即將其在單步驟中保持在相同的值。本發明的另一個優選方面是可將本發明的方法用于免疫球蛋白，所述免疫;求蛋白具有6.0或更高(pl>6.0)的等電點(pl),因此在始于pH6.0至pH14的pH范圍內具有凈正電荷。本發明的優選實施方案是IgG或IgE類型的免疫球蛋白的純化。將弱陽離子交換材料用于本發明的優選實施方案中。如所舉例的，優選以5mM至100mM之間的濃度范圍使用緩沖材料。為了從弱離子交換材料回收結合的免疫球蛋白，可增加緩沖液/溶液的導電率。這可通過增加的緩沖鹽濃度或通過向緩沖溶液中加入其他鹽(所謂的洗脫鹽)來實現。優選的洗脫鹽是檸檬酸鹽、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、其他檸檬酸鹽和礴酸鹽，以及這些成分的任何混合物。尤其優選的是檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及其混合物。引起洗脫的鹽濃度優選在5mM和500mM之間，更優選在5mM和400mM之間，尤其優選在5mM和250mM之間。本發明的另一個優選實施方案是引起洗脫同時又作為緩沖物質的鹽(尤其是用檸檬酸及其鹽，或磷酸及其鹽)的用途。本發明的方法優選是層析法或分批法，尤其優選的是包括分批洗脫的方法。本發明的另一個優選實施方案是為單步驟純化方法的純化。"單步驟"是指這樣的方法，其中一個或多個條件，例如pH、離子強度、鹽濃度和/或層析流動突然從起始值變成終值，即與線性改變相反，所述條件是步進改變的，即逐步的。本發明的另一優選實施方案是這樣的方法，其包括在該方法的步驟a)之前通過A蛋白親和層析純化免疫球蛋白的額外步驟。本發明還進一步提供了用于確定在單步驟純化法中從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度的方法，其包括下列兩個步驟a)步驟l包括下列亞步驟al)提供包含多肽、緩沖物質和任選的鹽的溶液；a2)在多肽借以與離子交換材料結合的條件下，使包含該多肽的溶液的第1等分試樣與該離子交換材料接觸；a3)通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液從離子交換材料回收多肽，其中所述鹽的濃度線性增加；a4)確定當多肽的第l級分開始從離子交換柱上洗脫時鹽的起始濃度；b)步驟2包括下列亞步驟bl)在多肽借以與離子交換材料結合的條件下，使包含該多肽的溶液的第2等分試樣與該離子交換材料接觸；b2)通過使用三步洗脫方法從離子交換材料回收多肽，其中i)將第1洗脫步驟的鹽濃度計算為下列的總和步驟a4)中確定的起始鹽濃度與該鹽分子式中指示的非氫單價陽離子總數的乘積，以及緩沖鹽的濃度與該緩沖鹽分子式中指示的非氫單價陽離子總數的乘積；ii)第2洗脫步驟的鹽濃度是第1洗脫步驟的鹽濃度與1.25和1.35之間的因子的乘積；iii)第3洗脫步驟的鹽濃度是第1洗脫步驟的鹽濃度與1.50和1.70之間的因子的乘積；其中如下確定步驟ii)和iii)的因子當10mM和40mM之間的起始濃度時，因子分別為1.35和1.70，當40mM和70mM之間的起始濃度時，因子分別是1.30和1.60，以及當超過70mM的起始濃度時，因子分別是1.25和1.50;b3)確定多肽從離子交換柱洗脫時處于步驟b2)的三步驟洗脫法中的哪個亞步驟，從而確定單步驟純化法中用于從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度。步驟b2)的因子定義了已通過實驗確定的范圍。這些值不是絕對值，其只是耙值。可維持10%的偏差。本發明描述了用于確定在單步驟純化法中從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度，以用于從其他蛋白質材料純化多肽的方法。在從離子交換樹脂開始洗脫多肽(優選免疫球蛋白)時的濃度提供了第二優化步驟b)(三步驟洗脫法)的基礎。如下計算用于分步洗脫的近似緩沖液/鹽濃度-第一洗脫步驟中的鹽濃度等于下列的總和作為第一被加數，其為從離子交換樹脂開始洗脫時的鹽濃度(通過線性增加鹽梯度確定的)與引起洗脫的鹽的分子式中所示的非氫單價陽離子的總數的乘積，以及作為第二被加數，其為緩沖鹽濃度與該緩沖鹽分子式中所示的非氫單價陽離子總數的乘積；-第二洗脫步驟的鹽濃度等于第一洗脫步驟的鹽濃度與1.25和1.35之間的因子的乘積；-第三洗脫步驟的鹽濃度等于第一洗脫步驟的鹽濃度與1.50和1.70之間的因子的乘積。在濃度計算步驟中所包括的因子說明了濃度水平之間的差別并且其調整取決于起始濃度。當低起始濃度(即在IOmM和40mM之間)時，因子分別是1.35和1.70，當40mM和70mM之間的中等起始濃度時，因子分別是1.30和1.60，當超過70mM的高起始濃度時，因子分別是1.25和1.50。這些因子定義了已通過實驗確定的范圍。這些值不是絕對值而僅僅是革巴值。可保持10%的偏差。在計算中必須考慮緩沖鹽，因為如實施例3中所述，在層析期間，緩沖鹽濃度的改變可能可影響蛋白質從離子交換樹脂的洗脫。如果在層析期間緩沖鹽濃度保持恒定，或與引起洗脫的鹽的起始濃度相比很小，那么它在計算中可被忽略以減少復雜度。在一個實施方案中，引起洗脫的鹽不是緩沖鹽，并且步驟b2i)的鹽濃度是在從離子交換柱開始洗脫時的鹽濃度與引起洗脫的鹽的分子式中所示的非氫單價陽離子的總數的乘積，所述鹽濃度是用在步驟a4)中線性增加的鹽梯度所確定的。可基于實施例4使用抗IL-1R抗體舉例說明計算。對于由10mM緩沖液濃度和由線性梯度提供的5mM組成的15mM檸檬酸鈉的起始濃度(如實施例3中確定的)來說，如下計算所述3個步驟畫步驟1的靶濃度經計算為30mM(5mM*2+10m!VP2)檸檬酸鈉，具體地5mM(起始濃度)乘以2(檸檬酸是三價酸，用作二鈉鹽；因此在分子式中存在2個非氫單價陽離子)加上10mM(緩沖鹽濃度)乘以2(檸檬酸是三價酸，用作二鈉鹽；因此在分子式中存在2個非氫單價陽離子)-步驟2的耙濃度經計算為40.5mM(30mM".35)檸檬酸鈉，具體地將作為步驟1的濃度的30mM檸檬酸鈉乘以1.35(起始濃度為15mM，因此選擇l.35作為因子)畫步驟3的靶濃度經計算為51mM(30mMn.70)檸檬酸鈉具體地將作為步驟1的濃度的30mM檸檬酸鈉乘以1.70(起始濃度為lSmM,因此選擇l/70作為因子)如可從實驗中看到的，在優選實施方案中通過使用弱離子交換材料(尤其優選弱陽離子交換材料)實現該純化。本發明的優選實施方案是多肽為免疫球蛋白，尤其優選為IgG或IgE類型的免疫球蛋白。在本發明的一個實施方案中，緩沖材料/物質的pH值為pH3.0至pH10.0，優選為pH3.0至pH7.0,更優選為pH4.0至pH6.0，以及最優選為pH4.5至pH5.5。本發明的另一個優選方面是本發明的方法可用于這樣的免疫球蛋白，其具有的等電點(pl)為6.0或更大(pl^6.0),并且因此在始于pH6.0至pH14的pH范圍內具有凈正電荷。優選將緩沖材料/物質用于例示的5mM和100mM之間的濃度范圍。為了從離子交換材料回收結合的免疫球蛋白，可增加緩沖液/溶液的導電率。這可通過增加的緩沖鹽濃度或向緩沖溶液中加入其他鹽(所謂的洗脫鹽)來實現。優選的洗脫鹽是檸檬酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、其他檸檬酸鹽和磷酸鹽，以及這些成分的任何混合物。尤其優選的是檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及其任何混合物。引起洗脫的鹽濃度優選在5mM和500mM之間，更優選在5mM和400mM之間，尤其優選在5mM和250mM之間。本發明的另一優選實施方案是引起洗脫同時又用作緩沖物質(尤其是用檸檬酸及其鹽，或磷酸及其鹽)的鹽的用途。本發明的方法優選是層析法或分批法，特別優選的是包括分批洗脫的萬法。本發明的另一個優選實施方案是為單步驟純化方法的純化。本發明的另一優選實施方案是這樣的方法，其包括在方法的步驟a)之前增加通過A蛋白親和層析純化免疫球蛋白的額外步驟。提供下列實施例和圖以幫助理解本發明，而本發明真正的范圍示于所附的權利要求中。要理解可在所示的方法中產生改變而不背離本發明的精神。圖1抗IL-1R抗體從強陽離子交換樹脂SP-Sepharose的單步驟洗脫；受體抗體的單體和集合物形式未分開并且作為一個峰被洗脫。圖2抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Toyopearl的單步驟洗脫；受體抗體的單體和集合物形式被部分分開，并且作為一個包含免疫球蛋白單體形式的主峰，和作為包含免疫球蛋白單體形式和集合物形式以及A蛋白的第二峰洗脫。圖3在使用檸檬酸鈉，pH5.0的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Toyopearl的線性梯度洗脫；受體抗體的單體和集合物形式被部分分開，并且在15mM的檸檬酸鈉起始濃度下作為主峰和作為第二峰洗脫，所述主峰包含免疫球蛋白的單體形式，所述第二峰包含免疫球蛋白的單體形式和集合物形式，以及A蛋白的混合物。將兩種級分的SEC分析插入離子交換層析鐠。在主峰中，集合物不存在。相反地，在笫二峰中存在免疫球蛋白的集合物形式。圖4在使用檸檬酸鈉、pH5.0的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Toyopearl的三步驟梯度洗脫；受體抗體的單體和集合物形式被部分分開，并且作為主峰和第二峰洗脫，所述主峰在34mM的檸檬酸鈉濃度下包含免疫球蛋白的單體形式，所述第二峰在44mM的檸檬酸鈉濃度下包含免疫球蛋白的單體和集合物形式以及A蛋白。圖5在使用150mM氯化鈉、pH5.5的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫；受體抗體的單體和集合物形式被分開，并且作為主峰和第二峰洗脫，所述主峰包含免疫球蛋白的單體形式，所述第二峰包含免疫球蛋白的單體和集合物形式以及A蛋白。圖6aCM-S印harosefastflow上的洗脫^瞽；可鑒定兩個峰對應于抗IL-1R抗體單體的主峰，和主要包含集合物和其他雜質的較小的第二峰。圖6bSP-Sepharosefastflow上的抗IL-1R抗體的洗脫鐠；可鑒定包含單體免疫球蛋白、集合物和在該柱子上未被分離的其他雜質的一個峰。圖7a在使用100mM氯化鈉、pH5.5的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫。圖在使用150mM氯化鈉、pH5.5的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫。圖7c在使用200mM氯化鈉、pH5.5的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫。圖8a在使用150mM氯化鈉、pH4.0的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫。圖8b在使用150mM氯化鈉、pH6.0的情況下，抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫。圖9a抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟洗脫；起始材料的大小排阻層析(SEC)顯示免疫球蛋白的單體和集合物形式。圖9b抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟洗脫；受體抗體的單體和集合物形式被部分分開，并且作為包含免疫球蛋白單體形式的一個主峰和作為包含免疫球蛋白單體和集合物形式以及其他蛋白質的第二峰洗脫。在該圖中顯示了第一(主)峰的大小排阻層析。從SEC柱只洗脫出一個峰，該峰為單體免疫球蛋白。圖9c抗IL-1R抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟洗脫；受體抗體的單體和集合物形式被部分分開，并且作為包含免疫球蛋白單體形式的一個主峰和作為包含免疫球蛋白單體和集合物形式以及其他蛋白質的第二峰洗脫。在該圖中顯示了第二峰的大小排阻層析。在層析譜中可看到至少三個峰，相當于免疫球蛋白的單體和集合物形式和其他蛋白質。圖10抗HER-2抗體從強陽離子交換樹脂SP-Sepharose的單步驟洗脫；抗體的單體和集合物形式未被分開且作為一個峰洗脫。圖11在使用在檸檬酸鈉緩沖液中的氯化鈉，pH5.5的情況下，抗HER-2抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的線性梯度洗脫；抗體的單體和集合物形式被部分分開，并且在使用80mM氯化鈉的起始濃度的情況下作為包含免疫球蛋白單體形式的一個主峰洗脫；單體和集合物形式與A蛋白一起作為主峰拖尾中的混合物被洗脫。圖12在使用在檸檬酸鈉緩沖液中的氯化鈉，pH5.5的情況下，抗HER-2抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的三步驟梯度洗脫；抗體的單體和集合物形式被分開，并且在氯化鈉濃度為80mM的情況下作為包含免疫球蛋白單體形式的一個主峰，和在氯化鈉濃度為100mM的情況下作為包含免疫球蛋白單體形式和集合物形式以及A蛋白的第二峰洗脫。圖13在使用80mM氯化鈉，pH5.5的情況下，抗HER-2抗體從弱陽離子交換樹脂CM-Sepharose的單步驟梯度洗脫；洗脫的單體形式不含集合物形式；在至120mM的第二氯化鈉步驟之后集合物形式作為第二確定峰被洗脫。圖14在使用80mM氯化鈉，pH5.5的情況下，抗HER-2抗體從強陽離子交換樹脂SP-Sepharose的單步驟梯度洗脫；獲得兩個峰峰l只包含單體Herceptin,在至120mM的第二氯化鈉步驟后洗脫的峰2包含大量的單體Herceptii^和集合物；以其單體形式存在的Herceptin⑧的產率低于60%。實驗部分材料在第一步驟中用A蛋白親和層析純化IgG4免疫球蛋白抗IL-1R抗體(在下文中稱為免疫球蛋白，WO2005/023872)。在酸性條件(IOmM檸檬酸鈉緩沖液，pH值3.0士0.5)下進行從A蛋白柱的洗脫。在過濾步驟之前，用濃縮的例如1M、pH9.0的緩沖溶液(例如三-羥甲基-氨基-甲烷(TRIS)或磷酸鹽緩沖液)將包含免疫球蛋白的級分的pH值調節至pH5.0。A蛋白洗脫物是具有5mg/ml和15mg/ml之間的蛋白質濃度的溶液，并且用檸檬酸鈉進行緩沖。在下文中該材料被稱為條件A蛋白洗脫物，將其制備上樣到陽離子交換樹脂上。實施例1在此比較實施例中，描述了使用強陽離子交換樹脂和單步驟洗脫的離子交換層析。層析條件樹脂SP-Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌步驟lOmM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0。洗脫具有100mM氯化鈉的25mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0將條件A蛋白洗脫物用于包含強陽離子交換樹脂(SP-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟洗脫方法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使pH值保持恒定，通過加入氯化鈉改變(增加)導電率。在圖1中，顯示了抗IL-1R抗體在強陽離子交換樹脂SP-Sepharose上的陽離子交換層析的洗脫層析語。洗脫是使用氯化鈉的單步驟置換洗脫，不改變層析系統的pH值。單體和集合的免疫球蛋白分子未^1分開，因而使用該方法不能通過減少洗脫物中集合物含量(與上樣材料相比)而獲得純化。實施例2在此實施例中，描述了使用弱陽離子交換樹脂和單步驟洗脫的離子交換層析。為實現單體和集合物形式的免疫球蛋白的分離，使用弱陽離子交換樹脂。通過使用此類樹脂，通過分步洗脫的導電率增加，并伴隨著樹脂上特定pH的變化(即使當洗脫緩沖液的pH保持恒定亦如此)。這一效應有助于分辨例如單體免疫球蛋白和集合物形式的免疫球蛋白。此外，可將其他雜質，如痕量宿主細胞蛋白或A蛋白從單體平均級分中有效分離，而不顯著損失產率。層析條件樹脂CM-Toy叩earl流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0。洗脫具有100mM氯化鈉的25mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0將條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Toyopearl)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟洗脫方法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值保持恒定，并通過加入氯化鈉來改變導電率。在圖2中，顯示了使用與實施例1中相同的層析條件(但這次使用弱陽離子交換樹脂CM-Toyopearl)的洗脫譜。此處出現作為主峰的肩峰的第二峰。這一分離行為與使用強陽離子交換樹脂例如SP-Sepharose的不同。對應于主峰和對應于第二肩峰的級分分析顯示大量的集合物存在于肩峰級分中。在主峰級分中沒有檢測到集合物(也參見圖9a至c)。實施例3層析方法的優化-第一步線性濃度梯度。為優化弱陽離子交換材料上的陽離子交換層析，進行由三個步驟組成的優化方法第1步驟是使用緩沖鹽(檸檬酸鈉)的線性濃度梯度進行的層析。幸好可能保持緩沖鹽濃度恒定并且可能混合成《1起免疫球蛋白洗脫的鹽的線性增加的濃度。在兩種情況下都使溶液的導電率增加而不改變流動相的pH值。適合用于洗脫的鹽是例如氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、檸檬酸及其鹽，以及這些成分的混合物。按照將導電率設置在大約1milliS/厘米至大約50milliS/厘米的范圍內，將使用的濃度調整為10mM至500mM。層析條件樹脂CM-Toyopearl流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0。洗脫線性梯度；從調節至pH5.0的10mM檸檬酸鈉緩沖液至調節至pH5.0的100mM杵檬酸鈉緩沖液。將條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Toyopearl)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用線性梯度洗脫方法洗脫結合的免疫球蛋白，其中4吏流動相中的pH值保持恒定。將緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度在40倍柱體積內從10mM線性提高至100mM。在達到檸檬酸鈉終濃度后，繼續進行另外40倍柱體積的洗脫。在圖3中顯示了抗IL-1R抗體的線性緩沖梯度洗脫的層析譜。免疫球蛋白的單體和集合物形式洗脫在半分離式峰(semi-detachedpeak)中，所述半分離式峰開始于15mM檸檬酸鈉的濃度，并且終止于55mM檸檬酸鈉的濃度。從陽離子交換樹脂回收結合的免疫球蛋白依賴于所用溶液的導電率。因此，在回收步驟中必須考慮到存在于洗脫溶液中的緩沖鹽的陽離子對免疫球蛋白從陽離子交換樹脂上洗脫的影響。流動相的導電率和離子強度受到溶液中離子總數的影響。因此，在此必須考慮所用的緩沖鹽和所用的引起洗脫的鹽的一個分子式中非氬單價陽離子的數目。實施例4層析法的優化-笫二步驟三步驟濃度梯度洗脫。在從離子交換樹脂開始洗脫免疫球蛋白時的濃度(如實施例3中確定的)提供了第二優化步驟(三步驟洗脫法)的基礎。如下計算用于分步洗脫的近似緩沖液/鹽濃度-第一洗脫步驟中的鹽濃度等于下列的總和作為第一被加數，其為從離子交換樹脂開始洗脫時的鹽濃度(通過線性增加鹽梯度確定的)與引起洗脫的鹽的分子式中所示的非氫單價陽離子的總數的乘積，以及作為第二,皮加數，其為緩沖鹽濃度與該緩沖鹽分子式中所示的非氫單價陽離子總數的乘積；-第二洗脫步驟的鹽濃度等于第一洗脫步驟的鹽濃度與1.25和1.35之間的因子的乘積；畫第三洗脫步驟的鹽濃度等于第一洗脫步驟的鹽濃度與1.50和1.70之間的因子的乘積。在濃度計算步驟中所包括的因子說明了濃度水平之間的差別并且其調整取決于起始濃度。當低起始濃度(即在IOmM和40mM之間)時，因子分別是1.35和1.70,當40mM和70mM之間的中等起始濃度時，因子分別是1.30和1.60，當超過70mM的高起始濃度時，因子分別是1.25和1.50。因子定義了已通過實驗確定的范圍。這些值不是絕對值而僅僅是革巴值。可保持10%的偏差。在計算中必須考慮緩沖鹽，因為如實施例3中所迷，在層析期間，緩沖鹽濃度的改變可影響蛋白質從離子交換樹脂的洗脫。如果在層析期間緩沖鹽濃度保持恒定，或與規定濃度相比很小(<15%鹽濃度)，那么在計算中可被忽略以減少復雜度。對于由10mM緩沖液濃度和由線性梯度提供的5mM組成的15mM檸檬酸鈉的起始濃度(如實施例3中確定的)來說，如下計算所述3個步驟國步驟1的耙濃度經計算為30mM(5mM*2+10mM論2)檸檬酸鈉，具體地5mM(起始濃度)乘以2(檸檬酸是三價酸，用作二鈉鹽；因此在分子式中存在2個非氫單價陽離子)加上10mM(緩沖鹽濃度)乘以2(檸檬酸是三價酸，用作二鈉鹽；因此在分子式中存在2個非氫單價陽離子)-步驟2的靼濃度經計算為40.5mM(30m!VP1.35)檸檬酸鈉，具體地將作為步驟1的濃度的30mM檸檬酸鈉乘以1.35(起始濃度為15mM，因此選擇1.35作為因子)-步驟3的耙濃度經計算為51mM(30mM*1.70)檸檬酸鈉具體地將作為步驟1的濃度的30mM檸檬酸鈉乘以1.70(起始濃度為lSmM,因此選擇l/70作為因子)層析條件樹脂CM-Toyopearl流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌lOmM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0洗脫步驟l:34mM種檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0步驟2:44mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0步驟3:54mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.0將條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Toyopearl)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用分步梯度洗脫法(-其中將洗脫鹽的濃度從起始值/水平逐步改變至終值/水平的方法)洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值保持恒定。在第1步驟中將緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度從起始條件的10mM升高至34mM，在第二步驟中升高至44mM,并在終步驟中升高至54mM。在每次鹽濃度增加后，在下一步驟之前將10倍柱體積的洗脫緩沖液通過柱子。在達到檸檬酸鈉終濃度后，繼續用額外的IO倍柱體積進行洗脫。在圖4中，顯示了抗IL-1R抗體的三步驟梯度洗脫的洗脫譜。單體免疫球蛋白洗脫物在第1步驟級分中，而集合物洗脫物在第2步驟級分中。實施例5層析法的優化-第三步使用氯化鈉的單步驟洗脫優化方法的最終步驟是對單步驟洗脫法(=其中將洗脫鹽的濃度立即從起始值改變至終值的方法)的改良。為此，將層析的pH從5.0升至5.5。由于A蛋白具有低于5.5的等電點，從而該pH的變化促進了與A蛋白的分離。另外將洗脫鹽從另外用作緩沖鹽的檸檬酸鈉改變為氯化鈉。在該層析進行后用級分進行其他分析(DNA、宿主細胞蛋白質、A蛋白含量和使用LC-MS的糖基化模式)。層析條件樹脂CM-Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝g質洗滌10mM檸檬酸鈉，調節至pH5.5。洗脫具有150mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉，調節至pH5.5將條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟梯度洗脫法(-其中將洗脫鹽的濃度立即從起始值改變至終值的方法)洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值保持恒定。使緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度保持恒定并混合150mM氯化鈉。在鹽濃度增加后，將15倍柱體積的洗脫緩沖液通過柱子以洗脫結合的免疫球蛋白。在圖5中顯示了使用氯化鈉的單步驟洗脫的洗脫層析諳。單步驟梯度層析實現了主要的單體級分和集合物/A蛋白級分的分離。單體免疫球蛋白的產率大于80。/。。甚至可能大于95%的產率。實施例6使用強陽離子交換樹脂(SP-Sepharosefastflow)和弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharosefastflow)進行的分離之間的比較。進行強SP-S印harose快流交換劑和CM-Sepharose快流之間的比較。根據實施例5，一式兩份進行實驗(在圖6a和b中只顯示來自每個柱子的一次實驗)并進行額外的分析(DNA、宿主細胞蛋白質、A蛋白含量和使用LC-MS的糖基化模式)。分析方法大小排阻層析樹脂TSK3000(Tosohaas)柱子300x7.8mm流速0.5ml/分鐘緩沖液包含250mM氯化鉀的200mM辨酸鉀，調節至pH7.0DNA-閾值-系統參見例如Merrick，H.和Hawlitschek，G.，BiotechForumEurope9(1992)398-403A蛋白ELISA:用來源于雞的多克隆A蛋白-IgG包被微量滴定板的小孑L在結合后，通過用樣品緩沖液洗滌來除去未反應的抗體。對于A蛋白的結合，向小孔中加入確定的樣品體積。存在于樣品中的A蛋白被雞抗體結合且保留在平板的小孔中。在溫育后，移出樣品溶液并對小孔進行洗滌。為進行檢測，隨后加入來源于雞的多克隆抗A蛋白-IgG-生物素綴合物和鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶綴合物。在進一步的洗滌步驟后，加入底物溶液，從而導致顯色反應產物形成。顏色的強度與樣品中A蛋白含量成比例。在確定的時間后，終止反應并測量吸光度。宿主細J包蛋白質(HCP)ELISA:用血清白蛋白和鏈霉抗生物素蛋白的混合物包被微量滴定板的小孔壁。將來源于山羊的抗HCP多克隆抗體結合至微量滴定板的孔壁。在洗滌步驟后，將微量滴定板的不同小孔與不同濃度的HCP校準序列和樣品溶液一起溫育。在溫育后，通過用緩沖溶液洗滌來除去未結合的樣品材料。為進行檢測，用抗體過氧化物酶綴合物溫育小孔以檢測結合的宿主細胞蛋白質。通過與ABTS一起溫育和在405nm處檢測來檢測被固定的過氧化物酶的活性。層析條件樹脂CM-S印harose;SP-Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗涂10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5。洗脫具有150mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5在圖6a和圖6b中顯示了弱陽離子交換樹脂和強陽離子交換樹脂的洗脫層析鐠之間的比較。使用弱陽離子交換樹脂(圖6a),實現了單體抗IL-1R抗體與其他雜質的分離。對于用強陽離子交換樹脂(圖6b),在相同條件下可能不產生分離。收集并分析對應于峰的級分。列于表l中的分析結杲顯示，使用弱陽離子交換樹脂，可有效地將集合物和其他雜質從免疫球蛋白制品中除去。表1中的數據顯示可能用弱陽離子交換樹脂將單體抗IL-1R抗體與抗體的集合物形式分離。此外可除去DNA和A蛋白雜質。表l:洗脫物的分析比較了SP-Sepharose和CM-Sepharose，顯示了兩種不同分離的結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例7比較實施例-在不同導電率下的洗脫。層析條件樹脂CM-Sepharose流速160厘米/小時平衡lOmM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌lOmM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5洗脫具有100mM、150mM或200mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5將條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟梯度洗脫法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值保持恒定。使緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度保持恒定并在三個不同的柱中分別混合100mM、150mM和200mM的氯化鈉。在鹽濃度增加后，將15倍柱體積的洗脫緩沖液通過柱子以洗脫結合的免疫球蛋白。洗脫層析鐠示于圖7a至圖7c。使用150mM氯化鈉和200mM氯化鈉作為洗脫鹽濃度獲得良好的分離。實施例8比較實施例-在不同pH值下的洗脫。層析條件樹脂CM-Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌lOmM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5洗脫具有150mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH4.0或6.0將條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟梯度洗脫法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值分別保持pH4.0和pH6.0。使緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度保持恒定，混合150mM的氯化鈉。在鹽濃度增加后，將15倍柱體積的洗脫緩沖液通過柱子以洗脫結合的免疫球蛋白。洗脫層析語示于圖8a和圖8b。在pH4.0，形成此免疫球蛋白的集合物的傾向增加。但CM-Sepharose能夠在兩個峰中分離該更高量的集合物。實施例9使用強陽離子交換樹脂(SP-Sepharose)進行的單克隆抗HER-2抗體(WO99/57134)的層析分離在下面用Herceptii^(單克隆抗HER-2抗體)進一步舉例說明本發明。在SP-Sepharose(強陽離子交換樹脂)上使用陽離子交換層析進行Herceptii^的純化。在本發明的標準條件(即使用例如氯化鈉的分步洗脫)下，抗體的單體和集合物形式的分離未受影響(圖10)。層析條件樹脂SP-Sepharose流速160厘米/小時平衡25mM2-嗎啉代乙磺酸，50mM氯化鈉，調節至pH5.6上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌25mM2-嗎啉代乙磺酸，50mM氯化鈉，調節至pH5.6洗脫25mM2-嗎啉代乙磺酸，95mM氯化鈉，調節至pH5.6在第一步驟中使用A蛋白親和層析純化單克隆抗HER-2抗體(在下文中稱為Herceptin)。在酸性條件(IOmM檸檬酸鈉緩沖液，pH值3.0±0.5)下進行從A蛋白柱的洗脫。在過濾步驟之前，用濃縮的三-羥甲基-氨基-曱烷(TRIS)將包含抗體的級分的pH值調節至pH5.6。A蛋白洗脫物是蛋白質濃度在5mg/ml和15mg/ml之間的溶液，并且用種檬酸鈉進行緩沖。將條件A蛋白洗脫物用于包含強陽離子交換樹脂(SP-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟洗脫法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使pH值保持恒定，通過(分步)增加氯化鈉濃度來改變導電率。洗脫層析鐠示于圖10中。未實現抗體的單體和集合物形式的分離。實施例10層析法的優化-第一步線性濃度梯度為改良兩種級分的分離，按照對于抗IL-1R抗體所描述的方法對分離條件進行優化。與抗IL-1R抗體的優化方法相反，使用(洗脫)鹽即氯化鈉的線性梯度取代緩沖物質的梯度。圖11中顯示了對應于優化方法的第1步驟的線性氯化鈉梯度洗脫的層析鐠。分析確證了主峰的尾部富集了抗體的集合物形式。層析條件樹脂CM國Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝膠J^質洗滌10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5洗脫線性梯度；從調節至pH5.5的10mM檸檬酸鈉緩沖液，至調節至pH5.5的包含400mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液將實施例9中描述的條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(IO倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用線性梯度洗脫法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值和緩沖鹽的濃度保持恒定。使洗脫鹽氯化鈉的濃度在40倍柱體積內從0mM線性升至400mM。洗脫層析鐠示于圖11。用弱陽離子交換樹脂取代強陽離子交換樹脂導致作為第一主峰的肩峰的第二峰的分離。這一觀察與在抗IL-1R抗體的情況中的觀察相似。在80mM的氯化鈉濃度處免疫球蛋白開始從柱上洗脫。實施例11層析法的優化-第二步三步驟濃度梯度洗脫免疫球蛋白開始洗脫時的起始濃度(如實施例10中確定的和從圖11中所示的層析語推導的)為80mM氯化鈉。對于三種濃度步驟的計算中，第二個優化步驟中可以忽略緩沖液濃度，因為其很低且在層析過程中保持恒定。氯化鈉的起始濃度是80mM且氯化鈉在其分子式中具有一個非氫陽離子。因此，用于三步驟洗脫的濃度經計算分別為80mM、100mM(=80mM乘以1.25)和120mM(=80mM乘以1.50)氯化鈉。層析條件樹月旨CM-Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝膠基質洗滌lOmM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5洗脫步驟1:具有80mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5步驟2:具有100mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液，調節至pH5.5步驟3:具有120mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉緩沖液,調節至pH5.5將實施例9中描述的條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(IO倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用分步梯度洗脫法洗脫結合的免疫球蛋白，其中使流動相中的pH值和緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度保持恒定。在第一步驟中將洗脫鹽(氯化鈉)的濃度從作為起始條件的0mM升高至80mM,在第二步驟中升高至100mM，以及在終步驟中升高至120mM。在每次鹽濃度增加后，在下一濃度步驟之前將10倍柱體積的具有特定氯化鈉濃度的洗脫緩沖液通過柱子。在達到檸檬酸鈉終濃度后，繼續用額外的IO倍柱體積進行洗脫。洗脫層析谞示于圖12中。在三步驟洗脫法中，在使用80mM的氯化鈉濃度的步驟中洗脫單體抗體。大小排阻分析確證只有單體抗體被洗脫。在將氯化鈉濃度在第二步驟中增加至100mM后，洗脫集合物形式的抗體(圖12)。實施例12層析法的優化-第三步使用氯化鈉的單步洗脫層析條件樹脂CM-Sepharose;SP-Sepharose流速160厘米/小時平衡10mM檸檬酸鈉，調節至pH5.5上樣最大20g蛋白質/L凝g質洗滌10mM檸檬酸鈉，調節至pH5.5洗脫具有80mM氯化鈉的10mM檸檬酸鈉，調節至pH5.5將實施例9中描述的條件A蛋白洗脫物用于包含弱陽離子交換樹脂(CM-Sepharose)的層析柱。在上樣步驟后用平衡緩沖液(10倍柱體積)以160厘米/小時的流速洗滌柱子。用單步驟梯度洗脫法洗脫結合的免疫球蛋白，其中流動相中的pH值和緩沖鹽濃度保持恒定。使緩沖鹽(檸檬酸鈉)的濃度保持恒定并混合80mM氯化鈉。在鹽濃度增加后，將15倍柱體積的具有氯化鈉的洗脫緩沖液通過柱子以洗脫單體形式的結合的抗HER-2抗體。為驗證抗體的單體和集合物形式的分離，進行氯化鈉濃度達到120mM的第二步驟，該步驟不是制備單體抗體所必需的。在該第二次增加后，從柱子上洗脫抗體的集合物形式。洗脫層析譜示于圖13。如果使用強陽離子交換樹脂進行相同的方法，盡管可看到抗體的單體和集合物形式的分離，但觀察到單體抗體的顯著損失(與在弱陽離子交換柱上的95%和更多的產率相比，只有大約60%的產率)(圖14)。將適合于在弱陽離子交換材料上進行分離的條件用于強陽離子交換樹脂SP-S印harose是沒有益處。雖然可分離兩個級分，但單體抗體的產率減少至60%或甚至更低。表2:洗脫物的分析比較了SP-S印harose和CM-Sepharose,顯示了兩種不同分離的結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權利要求1.用于純化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括a)提供包含免疫球蛋白、緩沖物質和任選的鹽的溶液；b)在免疫球蛋白借以與弱離子交換材料結合的條件下，使溶液與所述弱離子交換材料接觸；c)通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液，以單步驟從弱離子交換材料回收免疫球蛋白。2.根據權利要求l的方法，其特征在于弱離子交換材料是弱陽離子交換材料。3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于緩沖物質是檸檬酸或其鹽，或磷酸或其鹽。4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其特征在于所述方法是層析法或分批法。5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其特征在于步驟c)中的鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鹽、磷酸鹽以及這些成分的混合物。6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其特征在于免疫球蛋白M疫球蛋白G類或E類的成員。7.根據權利要求1至6中任一項的方法，其特征在于回收步驟c)中的溶液具有pH3.0至pH7.0的pH值。8.用于確定在單步驟純化法中從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度的方法，其包括以下兩個步驟a)步驟l包括下列亞步驟al)提供包含多肽、緩沖物質和任選的鹽的溶液；a2)在多肽借以與離子交換材料結合的條件下，使包含所述多肽的溶液的笫1等分試樣與所述離子交換材料接觸；a3)通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液從離子交換材料回收多肽，其中所述鹽的濃度線性增加；a4)確定當多肽的第l級分開始從離子交換柱上洗脫時鹽的起始濃度；b)步驟2包括下列亞步驟bl)在多肽借以與離子交換材料結合的條件下，使包含所述多肽的溶液的第2等分試樣與所述離子交換材料接觸；b2)通過使用三步洗脫方法從離子交換材料回收多肽，其中i)將第1洗脫步驟的鹽濃度計算為下列的總和步驟a4)中確定的起始鹽濃度與所述鹽分子式中所示的非氫單價陽離子總數的乘積，以及緩沖鹽的濃度與所述緩沖鹽分子式中所示的非氫單價陽離子總數的乘積；ii)第2洗脫步驟的鹽濃度是第1洗脫步驟的鹽濃度與1.25和1.35之間的因子的乘積；iii)第3洗脫步驟的鹽濃度是第1洗脫步驟的鹽濃度與1.50和1.70之間的因子的乘積；其中如下確定步驟ii)和iii)的因子當10mM和40mM之間的起始濃度時，因子分別為1.35和1.70,當40mM和70mM之間的起始濃度時，因子分別為1.30和1.60，以及當超過70mM的起始濃度時，因子分別為1.25和1.50;b3)確定多肽從離子交換柱洗脫時處于步驟b2)的三步驟洗脫法中的哪個亞步驟，從而確定單步驟純化法中用于從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度。9.根據權利要求8的方法，其特征在于離子交換層析材料是弱離子交換層析材料。10.根據權利要求8或9的方法，其特征在于多肽是免疫球蛋白。全文摘要本發明描述了通過離子交換層析純化免疫球蛋白的方法。該層析法使用弱離子交換樹脂和單步驟洗脫法純化免疫球蛋白。本發明另外描述了用于確定免疫球蛋白從離子交換樹脂單步驟洗脫的鹽濃度的方法。文檔編號C07K16/00GK101180317SQ200680017966公開日2008年5月14日申請日期2006年5月23日優先權日2005年5月25日發明者B·科爾布,M·西博爾德,R·法爾肯施泰因申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司