專利名稱：：非蛋白水解起源的新型可溶性epcr蛋白質及其用途的制作方法非蛋白水解起源的新型可溶性EPCR蛋白質及其用途
背景技術：
：所述C蛋白系統(PC)的最后蛋白是內皮C蛋白/激活C蛋白受體(EPCR)(1,2)。EPCR表達在內皮細胞膜上并以高親和力(Kd~30nM)結合PC和激活C蛋白(APC)。它的生理學使命是使PC集中在內皮表面上并將其呈遞給凝血酶-血栓調節蛋白復合物，從而促進PC的有效激活(3)。在對非人靈長類進行的研究中，已證實用單克隆抗體阻斷EPCR使APC的生理學生產減少90%，并且近期研究提出EPCR的遺傳缺陷可能易于罹患靜脈和動脈血栓形成(4-7)。這些事實證實EPCR可能在凝固調節和血栓形成中起重要作用。此外，EPCR似乎是負責PC的有效抗炎作用的分子之一。PC/APC與EPCR的相互作用可能在由革蘭氏陰性菌感染的過程中發展的凝血病和炎癥應答調節中起關鍵作用(8)。近來，已證實APC對內皮細胞具有抗炎和抗細胞凋亡作用，并且EPCR的存在是這種作用變得明顯所必需的(9，10)。EPCR是大約46kDa的糖蛋白。成熟蛋白在除去信號肽后包括221個氨基酸，所述信號肽由17個殘基組成(11)。它由位于染色體20的長臂(20qll.2)中的基因編碼，由3個內含子打斷的4個外顯子形成(12)。外顯子I編碼5'非翻譯區和信號肽，外顯子IV編碼跨膜結構域、3個殘基的胞質內尾以及3'非翻譯區。外顯子ii和m編碼EPCR的大部分胞外區，其與屬于I類主要組織相容性復合物的CD1超家族的蛋白質的結構域ocl和a2具有同源性。近來，顯示EPCR如何具有由折疊的P折疊形成的平臺的三維結構已設法被結晶和分析，在所述平臺上2個具有a螺旋構象，其形成穩定分子的其中容納磷脂的口袋U3)。同樣地，通過丙氨酸掃描，涉及與PC/APC結合的主要殘基已被鑒別，在鈣和鎂離子的存在下它經由它的GLA結構域與所述主要殘基結合(14)。但是，除了內皮細胞膜上錨定的EPCR之外，還存在血漿可溶形式(sEPCR)，其至少部分地來自EPCR通過經由刺激物例如;疑血酶誘導的金屬蛋白酶的消化U5，16)。文章(15)J.Clin.Invest.第100巻,no.2July1997,411-418,涉及在血漿中發現的可溶形式的EPCR。它說明血漿中的EPCR似乎是獨特的種類，并且純化蛋白質的氨基末端片段測序給出血漿EPCR的獨特序列，其與重組sEPCR的氨基末端序列一致。它說明在其他受體的情況下，所述可溶性EPCR的起源可能是蛋白水解破裂，或可變切割-剪接機制，并且具體地牛EPCR的基因組結構包含可變切割位點，其編碼其中跨膜結構域由內含子編碼的序列代替的蛋白質，所述內含子位于外顯子III后(17)。這個文件指出將需要更多的研究以證明來源于可變切割的EPCR形式的可能性。此外，申請WO-9900673涉及人血漿中的sEPCR的分離和表征，并且它說明sEPCR可能來自蛋白水解，其中EPCR的胞外結構域被釋放并且使蛋白其余部分結合膜，或來自mRNA的可變切割-剪接機制，這產生altsEPCR的序列。本申請的圖l顯示圖解，其中觀察到蛋白水解起源的可溶性EPCR(psEPCR)、通過可變切割-剪接獲得的申請WO-9900673中公開的EPCR(altsEPCR)、以及本發明的新EPCR對象(sEPCRvar)之間的差異。本申請因此指出至少人EPCR可以經歷可變切割-剪接過程，從而產生可溶性截短的EPCR，其包括只在來源于所述可變切割-剪接機制的可溶性EPCR(sEPCRvar)中存在的獨特插入片段。所述sEPCRvar可以充當大血管和癌癥中的疾病過程標記。當APC結合sEPCR時，它失去它的抗凝血性但維持它的酶促能力，由于這個原因認為sEPCR改變APC特異性，可能將其導向目前未知的底物，其可以連接至歸因于APC的抗炎性質(18)。sEPCR與膜上存在的EPCR竟爭C蛋白并以這種方式抑制APC產生。還已描述sEPCR通過蛋白酶-3(PR3)(19)和Mac-1(CDllb/CD18)能夠與活化的嗜中性粒細胞相互作用，所述蛋白酶-3是存在于嗜中性粒細胞顆粒中的蛋白酶，且Mac-1是存在于嗜中性粒細胞和單核細胞表面上的誘導型表達的整聯蛋白。PR3可能涉及作用于膜結合的TNF-a和IL-l卩前體的組織破壞機制。Mac-l干涉細胞信號傳導和胞間粘附現象，與粘附分子例如內皮ICAM-1相互作用，由于這個原因它在炎癥過程的嗜中性粒細胞募集中起作用。推測起來，sEPCR與PR3和Mac-1的結合將減少它們的活性。由人基因組DNA(cDNA)開始，本發明人已能夠克隆并表達新蛋白質。它的序列與其他已知序列的分析和比較，以及其功能表征已證實所述蛋白質是通過可變剪接過程產生的未知形式的可溶性EPCR蛋白質。另一方面，所述蛋白質具有作為鑒別特征的由最初視為EPCR基因3'非翻譯區的區域編碼的多肽區，其在目前已知的EPCR形式中不存在。發明描述本發明首先涉及新型可溶形式的EPCR，我們稱其為可溶性EPCR變體(sEPCRvar)，更具體而言涉及來源于內皮C蛋白受體的多肽，其包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。在具體實施方案中，所述片段具有至少9個氨基酸。根據本發明的具體實施方案，所述片段選自包括SEQIDNO:l的殘基213-227、229-242、212-226、227-241、242-256的片^殳。特異性抗體^操作中是特別有用的。U;、、"'本發明進一步涉及分離或重組蛋白質，其包括由序列SEQIDNO:l的殘基201-256形成的多肽，所述蛋白質是EPCR蛋白質。根據本發明的優選實施方案，所述分離或重組EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:1。本發明的另外目的是包括由序列SEQIDNO:l的殘基201-256、或所述殘基序列的片段形成的多肽的重組蛋白質。本發明的另外目的是包括編碼由序列SEQIDNO:l的殘基201-256或所述殘基序列的片段形成的多肽的序列的多核苷酸。在具體實施方案中，所述多核苷酸來自對應于SEQIDNO:2的cDNA序列。這種cDNA涉及由mRNA逆轉錄的DNA。在具體實施方案中，本發明的多核苷酸可以包含在DNA構建體中。因此，本發明的另外目的是編碼包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的蛋白質或多肽的DNA構建體。優選地，所述片段具有至少9個氨基酸。在所述構建體的具體實施方案中，它包括來自對應于SEQIDNO:2的cDNA序列的多核苷酸。所述DNA構建體可以整合可操作地結合所述蛋白質或多肽的控制序列。關于核酸或多核苷酸，"可操作地結合"意指一個核苷酸區域置于與另一個核苷酸序列的功能關系中。"控制序列"是由某一宿主細胞特異識別的表達信號，其調節功能，例如某一編碼序列的轉錄和翻譯。啟動子、表達增強子、轉錄終止子、核糖體結合位點等是控制序列。剪接所需序列以形成DNA構建體可以通過在合適的限制位點切割和剪接來進行。如果這些結合位點不存在，那么可能通過常規基因工程方法使用合成寡核苷酸作為銜接頭或間隔區來產生它們。本發明的多核苷酸或DNA構建體可以通過通常在實驗室手冊中記錄的常規基因工程方法來獲得。本發明的多核苷酸或構建體可以被插入合適的表達載體中。因此，本發明的另外目的是包括所述多核苷酸或DNA構建體的表達載體。在本發明不同實施方案中表達載體的選擇將取決于所述表達載體準備插入其中的宿主細胞。例如，本發明的多核苷酸或DNA構建體插入其中的載體可以是質粒或病毒，其一旦引入宿主細胞中，就可以整合或不整合到細胞基因組中。這種表達載體還可以通過常規方法獲付。本發明的另外目的是轉化的宿主細胞，其包括編碼多肽的多核苷酸或DNA構建體，所述多肽包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列具有至少9個氨基酸的片段。根據本發明，轉化的宿主細胞可以是原核細胞，例如大腸桿菌(五"/7en'c/n'aco//)，或真核細胞，例如酵母(尤其是巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/zz'a尸o^on^)和啤酒斗唐酵母(5Vcc/zanm_ycescerevz.s/ae)),昆蟲纟田月包或p甫l'L動4勿纟田月包系、。在本發明的具體實施方案中，具有SEQIDNO:2的本發明的多核苷酸被引入巴斯德畢赤氏酵母中以產生SEQIDNO:l的重組sEPCR蛋白質，對應于本發明中公開的通過可變切割和剪接產生的新型sEPCR形式(sEPCRvar)。用于產生DNA構建體、表達載體以及生產重組蛋白質所需的轉化的宿主細胞的方法稍后詳細描述，包括關于其純化的方法。在本發明的具體實施方案中，包括本發明的多核苷酸或DNA構建體的表達載體被設計用于其在體內基因轉移或治療的組合物和方法中使用。在更具體的實施方案中，這種表達載體是病毒載體。用于這個目的的合適病毒載體包括腺病毒、腺伴隨、逆轉錄病毒、慢病毒、曱病毒、皰滲病毒、冠狀病毒衍生的載體等。本發明的另外目的是包括包含多核苷酸的表達載體的表達系統，所述多核苷酸編碼包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的多肽，以及用所述多核苷酸或所述構建體轉化的宿主細胞。優選地，所述片段包括至少9個氨基酸。本發明的另外目的是生產蛋白質或多肽的方法，所述蛋白質或多肽包括SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段，優選具有至少9個氨基酸，所述方法的特征在于它包括在允許所述蛋白質、多肽或片段表達的條件下培養包括本發明的多核普酸或DNA構建體的宿主細胞。最優化培養的條件將取決于使用的宿主細胞。需要時，這種方法還可包括分離和純化表達的蛋白質或多肽的某些步驟。可替代地，本發明的蛋白質或多肽可以通過其他常規方法獲得，例如通過使用固相技術的化學合成；通過高效液相層析(HPLC)純化；以及需要時它們還可通過常規，技術進行分析，例如通過測序和質譜法、氨基酸分析、核磁共振等。本發明的另外目的是編碼蛋白質的mRNA，所述蛋白質包括序列SEQIDNO:l，或所述殘基序列的片段。本發明的另外目的是對于包括SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列具有免疫原性質的片段的多肽的特異分離的抗體。在具體實施方案中，所述片段具有至少9個氨基酸。在具體實施方案中，所述抗體對于多肽或片段是特異的，所述多肽或片段的序列選自殘基201-256、213-227、229-242、212-226、227-241和242-256,所述殘基都參照SEQIDNO:l。在另一具體實施方案中，所述抗體對于SEQIDNO:l是特異的，并且當它不結合區域201-256時不識別區域1-200。根據優選實施方案，所述抗體是單克隆抗體。本發明的另外目的是用于體外選擇性檢測生物學樣品中的EPCR蛋白質的方法，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基20]-256,例如SEQIDNO:l的新EPCR蛋白質，或所述殘基序列的片段，所述方法包括-獲得生物學樣品，-分析EPCR蛋白質的量，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。所述生物學樣品可以是包括生物學材料的任何樣品。在優選實施方案中，所述生物學樣品是尿、血漿、血清、組織或組織液樣品。所述方法可以是4壬<可已知方法，包4舌例如質:^普法、免疫測定、化學測定、液相層析和不同的間接和直接光度法。例如，某些分析型方法可以應用于使用質語法定量標記。一般來說，標記可以從生物學樣品中分離，例如通過液相層析或二維凝月交電泳。標記通過質i普法定量，例如與液相層析關聯的串聯質譜法(LC-MS)、MALDI-TOF-MS("基質輔助激光解吸/電離質譜法飛行時間MS")等。靶標記可以通過與已知量的純化標記標準比較，或通過與從健康對照獲得的相同類型生物學樣品中存在的所述標記的量比較進行定量。在本發明的另一實施方案中，方法可以是免疫測定。一般地說，在免疫測定中使用一種或多種標記配體。如本發明中使用的，"配體"是能夠特異性結合靶標記的任何化合物或分子。這些配體可以分開或組合使用(例如，抗體可以與適體組合使用)。在本發明的實施方案中，免疫測定可以是均相測定、非均相測定、酶免疫測定(EIA、ELISA)、竟爭測定、免疫測定(夾層)、濁度測定、比濁測定或其他類似測定。同樣地，免疫測定可以手動或用自動分析儀進行。在本發明的方法中，所述蛋白質的量與疾病相關，所述疾病選自與血管損傷相關的炎性疾病、炎癥、與異常凝固相關的疾病和癌癥。所述疾病還可以是自身免疫性疾病，例如狼瘡、膿毒癥、休克、先兆子癇、糖尿病、不穩定心絞痛、移植物的監控、再狹窄、血管成形術和肝或腎疾病。根據本發明的方法，檢測的EPCR蛋白質的量還可以與校準標準進行比較。本發明的另外目的是用于檢測和定量EPCR蛋白質的試劑盒，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,例如SEQIDNO:l的新EPCR蛋白質，或所述殘基序列的片段，優選具有至少9個氨基酸，所述試劑盒包括a)對于包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的多肽特異的抗體，或對于SEQIDNO:l蛋白質特異的抗體，當所述抗體不結合區域201-256時不識別區域1-200。b)檢測抗體a)和生物學樣品中存在的EPCR蛋白質之間的反應的試劑，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。優選地，試劑盒還包括使產生的反應的量與EPCR蛋白質的正常和異常水平關聯的標準，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256。本發明的另外目的是編碼包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的的多肽的多核苷酸用于檢測和定量對應于EPCR蛋白質的mRNA的用途，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,例如SEQIDNO:1的新EPCR蛋白質，或所述殘基序列的片段，優選地所述片段具有至少9個氨基酸。所述EPCR蛋白質以與疾病相關的量存在，所述疾病選自與血管損傷相關的炎性疾病、炎癥、癌癥和與異常^^固相關的疾病。此外，非蛋白水解起源的新可溶形式的EPCR可以用于開發選擇性單獨且專有地;險測這種形式的可溶性EPCR(sEPCRvar)的存在的分析方法，優點是它可以引入特定疾病的檢測，所述方法與其中檢測其他形式的可溶性EPCR或膜EPCR的那些不重疊。附圖簡述圖1:它顯示不同類型的EPCR,取決于其中RNA被加工以產生成熟的信使RNA(mRNA)的方式，可以產生3種可變形式的mRNA,其依次將產生3種不同形式的蛋白質1:與將翻譯為膜EPCR(mEPCR)的蛋白質有4個外顯子不同的mRNA。2.只包括外顯子ExI、ExII和ExIII隨后為內含子3以及這個內含子后的全部序列，并且將翻譯為由Esmon在WO-9900673中公開的可溶形式的EPCR(altsEPCRs)的mRNA。3.通過本發明中公開的新形式的可變切割和剪接將產生包括外顯子Exl、ExII和ExIII的mRNA，但在加工中，外顯子ExIV丟失，由于這個原因，跨膜結構域和胞質尾都不轉錄，并且在其位置中，在外顯子III后，位于3'非翻譯區中的隱蔽外顯子的序列出現，在這種情況下mRNA將翻"i斧為本發明的新可溶性EPCR形式(sEPCRvar)。可溶性EPCR還可以通過可能來自金屬蛋白酶(仍未表征)的蛋白水解活性產生，所述金屬蛋白酶在膜高度切割EPCR，從而使得它產生新可溶形式的EPCR(sEPCR),其由細胞外受體級分組成并缺乏跨膜結構域和胞質內尾。圖2:用特異性EPCR基因引物擴增HUVECcDNA后獲得的帶型除了對應于野生型EPCRcDNA的條帶(1221bp,箭標1)夕卜，還觀察到新的擴增片段，對應于通過可變切割-剪接產生的新變體同種型的cDNA(箭標2)。圖3.用野生型EPCR(圖A)或用同種型(圖B)轉染的COS-7細胞，兩種EPCR都與綠色熒光蛋白融合。圖A顯示野生型蛋白質趨向在細胞膜上積聚(箭標)，同時對于同種型3，沒有觀察到這種定位模式(圖B)。圖4.舉例說明了在巴斯德畢赤氏酵母中的sEPCRvar表達。如說明書中指出的，sEPCRvar從穩定轉化的巴斯德畢赤氏酵母細胞的上清液中純化。圖A:顯示通過SDS-PAGE分離并使用GELCODEBlue染料檢測的不同蛋白質；道St:分子量標記，指出以kDa表示的每個條帶的分子量；道l:重組sEPCR。觀察到大約42kDa的擴散帶(由于強烈的蛋白質糖基化(glycosilation));道2:sEPCRvar。觀察到47kDa的擴散帶(由于強烈的蛋白質糖基化)。圖B:蛋白質通過蛋白質印跡使用單克隆抗-EPCR抗體進行檢測；道St:分子量標記，指出以kDa表示的每個條帶的分子量；道l:空白；道2:sEPCRvar。觀察到大約47kDa的擴散帶(由于可變的蛋白質糖基化其在35-60kDa之間)。圖5.由來自不同組織和腫瘤的cDNA擴增EPCR基因。圖A)1:分子量標記，2:心臟，3:肝，4:腎，5:胰，6:肺，7:胎盤。圖B)1:分子量標記，2:骨骼肌，3:腦，4:胸腺，5:小腸，6:脾。圖C)1:標記，2:前列腺；3:睪丸，4:卵巢，5:結腸。圖D)是來自肺腫瘤的腫瘤系的樣品2:H446,3:H510,4:H1264,5:H549,6:H4化7:HTB51，8:H676，9:H727,10:H720,11:H385,12:H1299。包含分子量標記的道在圖中用縮寫St(來自標準)指出。標記下方的條帶對應于100bp的大小；每個新條帶表示相對于先前條帶的100bp增量(100bp，200bp，300bp……)。本發明的實施方案由內皮細胞cDNA擴增EPCRcDNAHUVEC細胞從人臍帶靜脈中獲得，根據標準程序(JaffeEA，NachmanRL,BeckerCG，MinickCR.Cultureofhumanendothelial!cellsderivedfromumbilicalveins.Identificationbymorphologicandimmunologiccriteria.JClinInves.1973Nov;52(11):2745-56)進行i咅養，并才艮才居如(Perez-RuizA，MontesR,VelascoF,Lopez-PedreraC,AntonioParamoJ，OrbeJ,HermidaJ,RochaE.Regulationbynitricoxideofendotoxin-inducedtissuefactorandplasminogenactivatorinhibitor-1inendothelialcells.ThrombHaemost.2002Dec;88(6):1060-5)中描述的標準技術提取總RNA。將所得到的RNA逆轉錄為cDNA，將其與轉錄酶于37。C溫育60分鐘，隨后于65°C5分鐘用于滅活酶。為了^:到這點，向最終體積為10|liL的1)iigRNA中加入120單位(U)M-MuLV逆轉錄酶(GibcoBRL)，其包含4逆轉錄酶緩沖液、2mmol/L脫氧核普酸(dNTPs,Invitrogen)、0.3昭/mL隨才幾六聚體(GibcoBRL)、0.5mmol/L二石克蘇凈唐醇(diothiotreitol)和35URNA酶抑制劑(48,000U/mL來自人胎盤的RNAsin,RNAguard,GEHealthcareBio-Science)。EPCR基因的表達通過聚合酶鏈反應(PCR)進行分析。使用的引物(Genset,法國)是對應于序列SEQIDNO:3的5'引物和對應于序列SEQIDNO:4的3'引物。PCR以25pL的體積進行。使用先前通過逆轉錄1pgRNA獲得的cDNA等分試樣，向其中加入1UtaqDNA聚合酶(Roche)、2.5反應緩沖液(Roche)、0.5laL每種引物(來自10pmol/L溶液)、0.25At氧才亥苷酸(dNTPs,GEHealthcareBio-Science)和0.25|al1mg/mLBSA。反應混合物用水調整至25pL。擴增循環由94°C30秒的變性階段、以及72。C3.5分鐘的另一個退火和延伸階段組成。該循環重復5次，這之后進行32個循環，使用相同的變性階段以及68°C3分鐘的另一個退火和延伸階段。終止擴增，使混合物于68。C維持5分鐘作為最終延伸階段。PCR擴增的區段具有1221堿基對(bp)的長度。當EPCR基因在這些條件下擴增時，另外的條帶出現在大約850bp的高度處(圖2)。擴增的EPCR的另外條帶的測序將條帶2使用相同擴增條件再擴增，但從圖2的850bp條帶作為模板開始。在瓊脂糖凝膠電泳后使用商業試劑盒-QIAquickGelExtractionKit根據制造商的說明書純化擴增產物。如此純化的產物用作才莫斗反用于序列反應(ABIPrismBigDyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit)。使用對應于序列SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物進行2次序列反應，一次在5，-3，方向并且另一次在相反方向。反應的結果在ABIPrism377DNAS叫uencers自動測序4義中分析。結論是新條帶對應于由序列SEQIDNO:7限定的片段。這個片段的中央部分以及SEQIDN0:2的序列對應于缺乏外顯子4和部分3'非翻譯區的新EPCR的cDNA。這種cDNA的起源可能是EPCRRNA的可變切割-剪接現象。這種新cDNA種類編碼氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽。所述序列的殘基1-17對應于信號肽；殘基18-200對應于EPCR的共有胞外結構域；殘基201-256對應于這種新形式的EPCR的新差別結構域并代替EPCR的跨膜結構域。這種新結構域不符合成為跨膜結構域的標準。與綠色熒光蛋白融合的EPCR和sEPCRvar在哺乳動物細胞中的表達為了研究EPCR同種型的亞細胞定位，將它的cDNA在pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO載體中克隆以將其表達為與綠色焚光蛋白的融合蛋白。^口it匕制備的載體^f吏用Lipofectamine2000(Invitrogen)用于瞬時轉化培養中的哺乳動物COS-7細胞；使用其中野生型EPCR的cDNA已克隆、與綠色熒光蛋白融合的相同載體作為對照。野生型EPCR和同種型的亞細胞定位通過焚光顯微鏡術檢測。如圖3中所示，野生型EPCR主要定位于細胞膜上，在其中觀察到綠色熒光；然而，依照本發明人的々支設sEPCRvar同種型不定位于細胞膜上。EPCR同種型的克隆、表達、純化和表征。克隆和表達為了表達鑒別的EPCR變體(EPCRvar),已通過聚合酶鏈反應(PCR)使用下列起始物擴增不含其信號肽的sEPCRvar序列(殘基17-256):5'-agcttggcatatcgattagccaagacgcctcagatg-3'和5'-agctatcgtagcggccgcctaccctattatatcagc-3'使用內皮細胞作為cDNA模板，其在5，和3'末端分別加入Clal和另一個Notl限制位點。這些修飾允許EPCR變體序列結合啤酒糖酵母的因子cc分泌信號后的pPICZocC(Invitrogen)質粒的Clal和Notl位點，這允許許多蛋白質從酵母中有效分泌至細胞外培養基。由于克隆過程，在sEPCRvar的氨基末端添加絲氨酸殘基和另一個異亮氨酸(isoleukin)殘基。使用直接測序檢查插入序列和載體是正確的。使用先前制備的表達載體并用Pmel限制性內切酶使其線性化后，將巴斯德畢赤氏酵母細胞^吏用化學法(EasyComp,Invitrogen)轉化，結果產生在曱醇應答內源啟動子中通過同源重組的sEPCRvar編碼序列化的巴斯德畢赤氏酵母菌落，所述載體包;:EPCRvar編碼序列，所述sEPCRvar編碼序列依次包含zeocin抗性基因。簡言之，將轉化的酵母在4ml補加了1%(v/v)甘油的BMY培養基[1%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)蛋白胨、100mM磷酸鉀(pH6.0)、1.34%(w/v)含石危酸銨的酵母氮源、4x10-5%(w/v)生物素](BMGY)中培養并在28-30。C下伴隨攪拌溫育大約18小時。通過在2,000g在室溫下離心5分鐘收集細胞。棄去上清液并由1%甲醇誘導sEPCRvar表達18小時。為了做到這點，將細胞重懸浮于3ml補加了0.5%(w/v)甲醇的BMY中并在大約28-30。C下伴隨劇烈攪拌溫育18小時。溫育后，將來自條件培養基的樣品裝載到12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上并通過蛋白質印跡使用RCR-2單克隆抗體(由Dr.KenjiFukodome友情贈予，SagaUniversity,日本)檢測sEPCRvar(圖4)。對于大規模生產，選擇分泌最高濃度的sEPCRvar的菌落。在由于其高sEPCRvar生產能力選擇的菌落中，研究其曱醇代謝(快或慢代謝者(metaboliser)),這允許確立對于大多數合適菌落的最佳表達條件。一旦培養條件和曱醇誘導被最優化，就增加規模以生產大量的sEPCRvar。純化巴斯德畢赤氏酵母培養上清液濃縮并針對不含NaCl的20mMTris-HC1(pH7.6)透析后，執行2個連續的純化步驟離子交換層析和凝膠過濾。在離子交換純化中，使用ResourceQ柱(GEHealthcareBio-Science)并使用等于20柱體積的0.0-300mM梯度的NaCl進行洗脫。包含sEPCRvar的洗脫級分被合并且通過離心超濾濃縮，并且P逭后施力口到Superdex75-HR10/30牙主(GEHealthcareBio-Science)以執行凝膠過濾。純化蛋白質的濃度使用BCA總蛋白測定(Pierre,Rockford，IL)和BSA標準進行測定。為了檢測純化的sEPCRvar,將樣品裝載到12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，并在還原條件下進行電泳，隨后用考馬斯藍染色。對電泳凝膠實施電印跡并使用RCR-2單克隆抗體檢測sEPCRvar。為了估計sEPCRvar的分子量，在每次凝膠電泳中都包括分子量標準。表征新型可溶性EPCR變體的活性的生物化學分析sEPCRvar對PC的親和力APC在培養的內皮細胞中的產生。使用的細胞系是EA.hy926-轉化的人內皮細胞系，其已保留表達血栓調節蛋白和EPCR的能力(Steams-KurosawaDJ,KurosawaS，MollicaJS,FerrellGL，EsmonCT.TheendothelialcellproteinCreceptoraugmentsproteinCactivationbythethrombin-thrombomodulincomplex.ProcNatlAcadSciUSA.1996;93:10212-6)。將96孔板上每孔5xl04細胞與0.02U/ml凝血酶(0.17nM)(ERL，Swansea,英國)以及溶于20mMTris緩沖液，pH7.4的50-1,000nM濃度漸增的PC(Baxter,Deerfield,IL.美國)溫育，所述Tris緩沖液補加了150mMNaCl，5mMCaCl2,0.6mMMgCl2,1%BSA,0.001%Tween-20和0.02%NaN3。在室溫下45分鐘后，加入最終濃度為0.2ial的來匹盧定(ScheringAG,Berlin,德國)以抑制凝血酶，并在3-4分鐘后加入最終濃度為0.4mM的顯色底物S-2366(Chromogenix，Milan,意大利)以監控其經由APC的蛋白水解。在孩i量培養板閱讀器(正MSReader,Labsystems,芬蘭)中動態記錄405nm處吸光度的增加。使用計算在這些條件下的PC激活Km值的Enzfitter程序(Biosoft,Cambridge,英國)進行針對米畫曼方程的曲線數據調整。為了研究sEPCRvar的抑制作用，與凝血酶和PC同時加入2|imol/L。因此，可以分析sEPCRvar對PC激活的作用并與sEPCR對激活的作用進行比較，這反映其對PC的親和力。表1顯示在sEPCR和sEPCRvar的存在或不存在下在培養的內皮細胞表面上經由凝血酶的C蛋白激活的生物化學表征。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>sEPCR和sEPCRvar對PC的親和力活化部分凝血激酶時間的測定。活化部分凝血激酶時間(APTT)使用DiagnosticaStagoBoehringerMannheimSTACompact設備(Roche)和Pathromtin試齊'j(DadeBehring，美國)使用來自健康受試者的5份血漿混合物進行測定。如眾所周知的，正常血漿混合物中APC的存在導致APTT延長。在使用的實驗條件下，在APC不存在下的APTT是33.1士0.4秒(平均值士SD),同時當APC以1nmol/L的最終濃度加入時，APTT延長至43.9±0.4秒。當加入sEPCR時，APC的作用被減少，從而卩吏得在1mmol/LsEPCR的存在下APTT為37.2±0.2秒。sEPCR對APC抗凝作用的這種抑制作用是劑量依賴性的。加入正常血漿混合物中的sEPCR對APTT沒有直4^作用(不存在下的33.1士0.4秒與sEPCR存在下的33.9土0.4秒比較)。所有實一瞼重復4次。當代替sEPCR加入相同濃度的sEPCRvar時，結果與使用sEPCR觀察到的那種結果可重疊，這證實sEPCRvar如sEPCR—樣結合APC。表2顯示sEPCR和sEPCRvar對APC抗凝功能的作用。向其中加入1nmol/LAPC和不同濃度sEPCR的正常血漿混合物的凝血時間(APTT)。表示了4次實驗的平均值士SD。在APC不存在下的APTT是33.1±0.4秒。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在不同組織和腫瘤系中的sEPCRvar表達分析為了鑒別其中表達sEPCRvar的組織，通過PCR使用允許同時擴增對應于EPCR和sEPCRvar的cDNA的引物研究不同人組織的cDNA文庫(多組織cDNA(MTC)組I和II，Bioscience,美國)。使用的引物(Genset,法國)是引物5，5，-GCAGTATGTGCAGAAACATATTTCCGC畫3,和引物3，:5'-CATCCCAAGTCTGACACACCTGGAAGT-3，PCR以25)iL的體積進行。使用cDNA等分試樣，向其中加入1UtaqDNA聚合酶(Roche)、2.5iuL反應緩沖液(Roche)、0.5|aL每種引物(來自10pmol/L溶液)、0.25脫氧核苷酸(dNTPs，GEHealthcareBio-Science)和0.25|dl1mg/mLBSA。反應混合物用水調整至25pL。擴增循環由94。C30秒的變性階段、以及56°C1分鐘的另一個退火階段和72。C1.5分鐘的延伸組成。該循環重復35次。終止擴增，使混合物于72。C維持5分鐘作為最終延伸階段。擴增的EPCR的cDNA區段具有578bp的長度，同時sEPCRvar的那種是189bp(圖5)。sEPCRvar形式在胰、心臟、肝、腎、肺、胎盤、胸腺、小腸、脾和結腸中豐富表達。sEPCRvar形式在某些腫瘤系特別是H549、H441和H720中豐富表達。某些肺瘤系特別是H446和H676進一步表達另一種仍未鑒別的形式，其依照其電泳遷移率具有1000bp。抗體產生免疫接種至少1個月大的BALB/C雄性依照下列模式使用sEPCRvar進行免疫3次皮下、皮內或腹膜內免疫接種或其組合，免疫原的量為在弗氏佐劑或另一種佐劑中的10-200昭，隔開至少2周；第三次免疫接種后2周，施用2次新的加強劑量，隔開2天并使用相同量的免疫原但這次溶于鹽水血清中。其他動物同樣用SEQIDNO:l的肽213-227、229-242、212-226、227-241和242-256的混合物進行免疫接種。選擇這些肽是因為根據KyteJ.,DoolittleR.F.(J.Mol.Biol.,1982;157:105-132)的算法依照Protscale程序它們是高度親水的。融合。最后一次加強劑量后2天,生產雜交瘤；這是在聚乙二醇1500或4000的存在下由動物脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0-Agl4;P3X63-Ag8.6.5.3;P3-NS-l-Ag4-l;等)融合組成的技術。這種試劑使得膜融合，從而使得雜交體將在各種細胞類型之間產生動物B淋巴細胞和骨髓瘤細胞之間的雜交體將形成新細胞類型-雜交瘤，它將產生抗體并且在培養中還將是無限增殖的。向細胞培養物中加入HAT培養基以選擇這些雜交瘤并除去其余雜交體HAT包含氨基蝶呤-鳥苦從頭合成途徑(從頭途徑)的抑制劑。因為骨髓瘤細胞缺乏核酸合成補救途徑所需的功能性HPRT酶，所以當唯一可用的途徑從頭途徑被氨基蝶呤阻斷時，它們不能合成核酸；因此，培養2周后，培養物中存活的唯一細胞將是脾細胞-骨髓瘤雜交體脾細胞將給予雜交體通過可替代途徑合成鳥苷的能力，并且骨髓瘤細胞給予在體外培養中無限培養的能力。產生抗-sEPCRvar和抗-sEPCR抗體的雜交瘤的檢測。HAT培養基中的細胞將分布在至少10個96孔微量培養板中。融合后9-14天，集落的大小將足以分析上清液中抗體的存在。為了選擇分泌目的抗體，即針對sEPCRvar的抗體的雜交瘤，上清液樣品將取自包含克隆的5個微量培養板的所有孔，以對其實施免疫測定執行ELISA和蛋白質印跡測定。對于ELISA，板用sEPCRvar包被，0.3嗎/孔；在4。C下溫育15小時并用合適蛋白質相應封閉后，將加入培養上清液，進行相應洗滌并隨后加入第二小鼠抗免疫球蛋白抗體。以這種方式，洗滌并用過氧化物酶和鄰苯二胺(o-phenylendiamine)使孔顯色后，其中檢測到顏色或吸光度(492nm)增加的那些孔可能包含分泌sEPCRvar抗體的雜交瘤克隆。對于蛋白質印跡，使用重組蛋白質和/或表達sEPCRvar蛋白質的組織或細胞提取物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將它轉移至經由格子類型裝置分為獨立區帶的硝酸纖維素或PVDF膜以證實上清液中特異性抗體的存在。封閉并與特異性抗體溫育后，將它洗滌3次并與綴合至過氧化物酶的第二抗體溫育。使用通過酶轉化后在它已結合特異性抗體的位置中產生光的底物進行顯色。如果發光帶對應于具有預期分子量的蛋白質，那么上清液來自于其的孔的抗體生產性細月包將生長并冷凍于液氮中。因為sEPCRvar包含完整的sEPCR部分，所以將分析sEPCRvar陽性雜交瘤的重組EPCR的胞外區的反應性。以這種方式可以選擇產生針對sEPCRvar特定區域的抗體的那些雜交瘤。雜交瘤的單克隆性(monoclonality)。為了確保分泌抗-sEPCRvar抗體的每種細胞培養物都是單克隆的，應用克隆或限度稀釋技術來自原始培養或來自在第一次蛋白質印跡或ELISA測試中陽性的干細胞的分離細胞將在新微量培養板上生長。一旦由一種或多種細胞產生的新集落獲得足夠大小，那么將再次從這些中獲取上清液以對其實施新ELISA或蛋白質印跡。對再次陽性的集落實施限度稀釋并重復該過程直至第3次限度稀釋后分析的上清液的100%包含針對sEPCRvar的抗體。抗體純化。在特定條件下培養雜交瘤以獲得更大的抗體濃度得率后(培養并瓦^f吏用來自IntegraBiosciences的CELline系統或來自BectonDickinson的CELline系統)，將通過液相層析4吏用一種或幾種下列方法對包含IgGs的上清液實施純化免疫親和層析、親和層析(在A蛋白/G蛋白/L蛋白中，固定的金屬，生物親和性)、陽離子交換、羥磷灰石、疏水相互作用、凝膠過濾等，其中使用AKTAFPLC設備，GEHealthcareBio-Science)。參考文獻1.BangaloreIT,Drohan麗,Orthner.CL.'Highaffinitybindingsitesfor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特征在于所述方法包括-獲得生物學樣品，-分析所述EPCR蛋白質的量，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段。26.根據權利要求25的方法，其特征在于所述生物學樣品選自尿、血漿、血清、組織和組織液。27.根據權利要求25-26之一的方法，其特征在于所述方法選自免疫學方法、層析方法和分光光度方法。28.根據權利要求25-27之一的方法，其特征在于所述蛋白質的量與疾病相關，所述疾病選自與血管損傷相關的炎性過程、炎癥、癌癥以及與異常凝固相關的疾病。29.根據權利要求25-27之一的方法，其特征在于它包括通過與校準標準比較來比較檢測到的所述EPCR蛋白質的量。30.—種用于檢測和定量EPCR蛋白質的試劑盒，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段，其特征在于它包括a)如權利要求20-24之一中限定的特異性抗體，b)檢測抗體a)和生物學樣品中存在的所述EPCR蛋白質之間的反應的試劑，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256。31.根據權利要求30的試劑盒，其特征在于它還包括使產生的反應的量與EPCR蛋白質的正常和異常水平關聯的標準，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDN0:1的殘基201-256。32.編碼包括序列SEQIDN0:1的殘基201-256的多肽的多核苷酸用于檢測和定量對應于EPCR蛋白質的mRNA的用途，所述EPCR蛋白質包括序列SEQIDN0:1的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。33.根據權利要求32的多核苷酸的用途，其特征在于所述EPCR蛋白質以與疾病相關的量存在，所述疾病選自與血管損傷相關的炎性疾病、炎癥、癌癥以及與異常卩疑固相關的疾病。全文摘要本發明涉及起源于可變剪接機制的新型可溶形式的EPCR，并且更具體而言，涉及包括序列SEQIDNO1的殘基201-256或所述序列的片段的多肽。本發明還涉及包括所述多肽的重組或分離的EPCR蛋白質，編碼所述多肽的分離的多核苷酸，編碼包括所述多肽的蛋白質的mRNA，及其在疾病檢測中的用途。本發明進一步涉及包括所述多核苷酸的表達載體或宿主細胞，包括表達載體和所述細胞的表達系統，對于所述多肽特異的分離抗體，以及用于體外選擇性檢測生物學樣品中包括序列SEQIDNO1的EPCR蛋白質的方法和試劑盒。文檔編號C07K14/705GK101189260SQ200680016945公開日2008年5月28日申請日期2006年3月17日優先權日2005年3月17日發明者E·莫利納布伊,E·馬蒂納茨安索,J·赫米達桑托斯,R·蒙特斯迪阿茨申請人:西馬生物醫學計劃公司