親和配體的制作方法

專利名稱：親和配體的制作方法
技術領域：
本發明涉及親和純化的技術和材料，特別是親和色譜，以及用于 這個技術的特定新配體。更特別地的是，本發明涉及用肽親和色譜在變性條件下捕獲和純化以包涵體形式表達的Npro和Npro突變，Npro融合蛋白或捕獲和純化具有高度聚集傾向的蛋白。
背景技術：
親和色譜是從粗制的復雜混合物中進行特異分離的最有效技術之 一。由于抗體的高選擇性和高親和性，它已經被成功地用作親和配體。 這些親和基質的缺點是它們的相對不穩定性，這可能導致從支持基質 上把抗體濾到產物中。此外，用堿性緩沖液再生(一種生物制藥學上 的普通工序)可能導致不可逆變性并且失去結合能力。短肽可以代替 抗體作為親和配體。這些小分子具有高化學穩定性、有效性、選擇性 并且價格低而且通常都是無毒的。在應用于生物制藥學時，這些特性 比起蛋白配體來說是個優勢。可以從組合肽庫或生物學庫鑒定針對靶 分子的肽。化學合成組合庫包括pin-synthesis,茶袋法(teabag)， SPOT等等；生物系庫包括噬菌體展示技術、細菌展示、核糖體技術 等。
在另一方面，大量蛋白在生理條件下表現一種很強的聚集傾向或 它們具有聚集的內在生物學活性，比如朊蛋白或淀粉樣肽。為了研究 這些蛋白，需要把它們在離液序列高的(chaotropic)條件下溶解，通 過添加去污劑，應用極端pH (酸或堿)的水溶液，加入有機溶劑比如 乙晴、乙醇、異丙醇、丙醇、嘧啶等。這常常是有問題的，這不是不 可能的，特別是如果在溶解或純化后要進一步研究的話，就不應該破 壞蛋白質的活性。
用于親和色譜的普通基質通常是在kosmotrophic或生理條件下但 是不在離液序列高的(chaotropic)條件下結合潛在的結合配偶體(partner)。因此，經常通過應用離液序列高的條件從親和色譜基質 上洗脫親和純化組分。

發明內容
因此，本發明的目的是提供能夠在離液序列高的(chaotropic)條件下結合親和配偶體的親和配體或親和材料。優選的，這種材料應該 能用于從離液序列高的(chaotropic)條件下的樣品中或起始材料中親 和純化蛋白，特別是NPpro、 NPpro突變、NPpro融合蛋白以包涵體形式在變 性條件下表達或者在生理條件下顯示聚集的高度傾向的蛋白質。
因此，本發明提供了親和基質，其包含固相和個以肽鍵連接這個 固相的親和配體，其中包含肽鍵的親和配體是選擇下列配體組
a) 包含分子式X1X2X3X4的肽，其中Xx到X4是氨基酸殘基，并且 至少Xi到X4中的兩個是W、 Y或F;
b) 包含分子式X5XeX7X8的肽，其中X5到X8是氨基酸殘基，并且 至少X5到X8中的一個是W，并且至少X5到X8中的一個是E或D; 且
c) 聚氨基酸(poly-amino acids)由來自由R、 K、 E、 D組成的群 組的氨基酸單體和由Y、 F、 W組成的群組的氨基酸單體組成，優選 poly－KY、 poly-KF、 poly-KW、 poly－R丫、 poly-RF、 poly-RW、 poly-EY、 poly-DY、 poly-EF、 poly-EW、 poly-DF或poly－DW，另外還有個附加條件a)和b)的肽的氨基酸殘基數最長為35個并且 c)的聚氨基酸殘基數最短為20個。
優選的，a)和b)的肽(這里也指"寡肽")長度為5到12，特 別是6到8個氨基酸殘基。優選的，這些寡肽至少含一個帶正電荷的 氨基酸。c)的聚氨基酸優選長度為至少35個氨基酸殘基，更優選的是 至少50個氨基酸，特別是至少100個氨基酸殘基。特別優選的聚氨基 酸是如用于細胞培養的商業上可得到的聚氨基酸如poly-KW， 4:1 (分 子量20.000到50.000道爾頓，SIGMA的產品號P9285) 、 poly-KY， 4:1 (分子量20.000至U 50.000道爾頓，SIGMA的產品號P4695) 或poly-KF， 1:1 (分子量20.000至U 50.000道爾頓，SIGMA的產品 號P3150).
本發明的親和配體可被化學修飾，特別是乙酰化、酯化、酰胺化、 氧化、減少或提供一個連接子分子。
親和配體優選的通過共價鍵連于固相基質上。本發明的親和配體
和基質對于這里所描述的自我蛋白酶具有高親和力，特別是結合Npra、
它的衍生物和融合蛋白(它們可以包涵體的形式表達)。特別地，這
些配體或親和基質在離液序列高的(chaotropic)條件下和在 kosmotmpic (非離液序列高的的、生理的，正常的)條件下結合Npra、 它的衍生物和融合蛋白，至少是例如融合蛋白的NT。的部分。本發明 的親和配體在變性條件下結合Np「°、 NP「。的衍生物和融合多肽具有高度 的特異性。在本發明的范圍內，這樣的親和配體直接識別本發明的融 合多肽中具有自身蛋白水解功能的部分。
對于固相材料而言，所有已經用于本領域的材料都是合適的。優 選地，固相選自以下色譜材料，支持物特別是基于纖維素、瓊脂糖、 丙烯酰胺、聚(苯乙烯一二乙烯苯)或乙烯乙二醇甲基丙烯酸酯共聚 物、微滴定板(microtiter plates)、硝酸纖維膜、微芯片、玻璃板、 或金屬包被的支持物。
根據本發明可以用不同類型的固相支持物，如基于以下物質的支 持物纖維素、瓊脂糖(S印harose或Macro-Pr印凝膠)、葡聚糖 (S印hadex凝膠)、丙烯酰胺(S印hacryl, Trisacryl凝膠)、硅膠 (TSK、 SW凝膠)、多聚苯乙烯一二乙烯基苯(Source或Poros 凝膠)、乙烯乙二醇甲基丙烯酸酯共聚物(Toyopearl HW、 TSK、 PW、 fractogel EMD凝膠)或混合物，特別是瓊脂糖或葡聚糖的混合物(Su-perdex gel)。經美國主管當局(competent American authorities)(負 責食品和藥物管理的FDA)或歐盟機構(European Union agencies) 核準的人或獸醫可用的支持物是優先選用的。此外，本發明(支持物 被認為是功能化的)選擇的支持物必須能結合，特別是共價結合親和 配體。固相基質可包含，基質骨架，任何己知的被應用在蛋白質和其 它生物分子的固相分離的天然的或合成的和有機的或無機的基質，如 天然或合成的多聚糖如瓊脂和瓊脂糖；纖維素、纖維素醚類如羥基纖 維素、羧甲基纖維素；淀粉；樹脂如胍爾豆膠(也稱樹膠糖guar gum)、 阿拉伯樹膠、印度樹膠(gum ghatti)、黃氏樹膠(也稱耆膠、刺梧桐樹膠gumtragacanth)、刺槐豆月交(locust bean gum)、黃原膠樹 脂(xanthangum);果膠；粘液素；葡聚糖；幾丁質；聚氨基葡萄糖； 藻酸鹽；角叉(萊)膠；肝素；凝膠；合成的聚合物如聚酰胺如聚丙 烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚酰亞胺；聚脂；聚醚；聚合的乙烯基復 合物如聚乙烯醇(polyvinylal- cohols)和聚苯乙烯；聚烯烴
(polyalkenes);無機材料如二氧化硅包括無定形二氧化硅和石英； 硅石；金屬硅酸鹽、可控有孔玻璃和陶瓷(controlled pore glasses and ceramics);金屬氧化物和硫化物，或這些天然的或合成的和有機的 或無機的材料的結合物。
基質骨架優選的選擇瓊脂、瓊脂糖、纖維素、纖維素醚如羥丙基 纖維素、羧甲基纖維素、聚酰胺如聚(甲基)丙烯酰胺、聚乙烯醇
(polyvinylalcohols)、硅酸鹽(silicas)和可控有孔玻璃(controlled pore glasses)。
特別需要的用作基質骨架的固相材料如瓊脂或瓊脂糖珠如瑞典
Pharmacia Biotech公司的Sepharose禾卩Superose珠，美國Biorad 公司的Biogel A;基于珠的葡聚糖，如Sephadex (Pharmacia Biotech 公司)；基于珠和膜的纖維素，如捷克斯洛伐克的Secheza公司的 Perloza纖維素；合成珠如Pharmacia Biotech公司的Sephacryl禾口 Superdex;合成的有機聚合體珠，如美國Toso-Haas公司Fractogel; 美國Perceptive Biosystems的POROS介質、Biorad公司的 Bio-Rex、 Bio-Gel P禾n Macro Prep， TESSEK公司的HEMA和 Separon以及美國BioSepra公司的Hyper D禾口 Trisacryl介質，美國 3M公司的Enzacryl禾卩Azlactone;硅酸鹽材料的珠子如英國 Bioprocesing公司的可控有孔玻璃一PROSEP和BioSepra公司的 Spherocil;以珠子或膜的形式存在的包被了硅的合成物如美國Arbor Technologies公司的ACTI-DISK、 ACTI-MOD禾tl CycloS印。
典型的，固相基質骨架還有所致功能化的固相基質可以以下形式 存在如不規則粒子或球形的珠子、膜或薄片、鑄型的表面(moulded surfaces)或棒狀。此外固相材料可全部或部分透過或完全不可透過蛋 白質的。本發明的一個特別有趣的實施方案是用于制備目的的基質的 形狀為范圍在1到10000 Mm大小的不規則或球形的珠子，優選的是10到1000μm;如10到60μm是用于更高要求的應用，比如從50 到500μm，優選的是50到300μm。
一種特定的基質形式是以包含密度控制顆粒的聚集塊(conglomerate) 形式存在的一種密度可控基質。這些聚集塊特別適合大規模操作，比如液化或膨脹床色譜，也用于在非裝柱的不同的分批次色譜 技術例如在攪拌桶里的單批次吸附。
本發明的親和配體可吸附于固相材料，是通過任何類型的己知用 于該目的的共價鍵，或者通過本發明的親和配體和固相材料間的直接化學反應或通過用合適的已知本身可以用來連接基質骨架和配體的試 劑來使固相材料或配體在先激活。這種合適的激活劑的實施例是表氯醇、表溴醇(epibromohydrin)、烯丙基縮水甘油醚；雙環氧化物如丁二醇二縮水甘油醚(butanedioldiglycidylether);鹵代的脂肪族化合物如二氯丙醇、二乙烯基砜；羰基二咪唑、醛類如戊二醛、苯醌/溴 化氰；高碘酸鹽如間位高碘酸鈉；碳化二酰亞胺；氯三嗪如氰尿酰氯； 磺酰氯如甲苯磺酰氯和tresyl氯；N-羥基琥珀酰亞胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸鹽；唑酮；馬來酰亞胺(也稱順丁烯二酰亞胺)；二硫吡啶和酰肼。在這些中，留下不同于單鍵的空間基團SPI的激活試劑是優選的如表氯醇、表溴醇、烯丙基縮水甘油醚、雙環氧化物、鹵 代脂肪族化合物、乙烯基砜、醛、苯醌、溴化氰、氯三嗪、唑酮、馬 來酰亞胺(也稱順丁烯二酰亞胺)、二硫吡啶和酰肼。
特定的激活試劑是環氧化合物，如表氯醇、烯丙基縮水甘油醚和丁二醇二縮水甘油醚(butanedioldiglycjdylether)。
對于本發明范圍內的肽親和色譜來說，任何對肽配體固定有用的 基質都可以使用。優選使用德國達姆施塔特的Merck公司的Fractogel epoxy(M)或同樣優選"單片色譜介質"(monolithicchromatography medium) CIM-epoxy。配體可直接固定到化學激活的色譜基質的骨架 或通過一個間隔子或連接子固定。在后面的情況下間隔子連接到色譜基質上，隨后為了結合配體，所述的間隔子被化學激活。優選用 Fractogel epoxy基質和間隔子結合。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，間隔子是由色譜基質先 和二氨基二丙胺(diaminodipropylamine) (DADPA)反應隨后再和琥珀酸酐(succinicanhydride) (SA)反應產生的。這樣使得間隔子末端的羧基被化學激活并且優選連到一個氨基末端。配體通過其所包括的反 應基團固定在基質或間隔子上。在肽配體的情況下這樣反應基團可以 是氨基、羧基或巰基。本發明的肽在基質或間隔子上的錨定特別優選 的是通過酰胺鍵。
優選地，本發明的親和基質(特別作為色譜材料提供的)就如上 面a)和b)定義的寡肽配體或上面c)定義的多聚氨基酸。
就象這里用到的術語"寡肽"應該指類似蛋白(proteinaceous) 的復合物，至少包括三個氨基酸。通常這種寡肽的長度為35個氨基酸， 優選4到20個氨基酸殘基。
因此，在本發明的一個優選的實施方案中親和色譜系統使用寡肽 配體的長度為5到12個氨基酸，優選6到8個氨基酸，特別是包含色 氨酸殘基。在離液序列高的(chaotropic)條件下上述配體有選擇的結 合到融合多肽具有自我蛋白水解功能的部分并且在轉為或在 cosmotropic條件下保持結合。
這種親和色譜的形式是利用某種多肽特異結合到其它多肽，就象 例如從抗體所知道的。寡肽也能夠作為親和配體。這些分子具有高化 學穩定性、有效性、選擇性、低的價格并且它們通常無毒性。特別是 當應用于生物制藥學過程時這些特性被認為是優點。就象本領域的人 都知道的那樣，直接結合靶分子的肽配體在某種程度上可從組合肽庫 或生物學文庫中鑒定出來。本發明是在離液序列高的(chaotropic)條 件下掃描肽配體。
本發明的這些親和配體己經證明在變性條件下(如4 M尿素)可 特異地結合NP「Q和NP「。-融合蛋白(和其中突變的蛋白或包含突變的蛋白)
本領域已知的肽合成的方法適合于制備本發明的寡肽配體。優選 的肽配體是通過SPOT合成法、PIN合成法、茶袋法合成(teabag synthesis)、混合禾口分離法(mix and split method)(在Ruiwu Liu 等在Experimental Hematology 31 (2003) 11-30有描述)或PELICAN 方法(Joseph A. Buettner等在Int.丄Peptide Protein Res. 47 (1996)， 70-83有描述)合成的。 一些連接子在化學上能被應用于錨定第一個氨基酸。在本發明的一個優選的實施方案中，分別產生配體，然后固定 在色譜基質上。在本發明另一個優選的實施方案中肽配體是直接在色 譜基質上合成的。
寡肽配體具有高度特異性。在本發明范圍內合成的寡肽的特點是具有在變性條件下有選擇的結合Npro、 Npro衍生物和融合多肽的能力。在本發明的范圍內這種寡肽配體直接結合本發明融合多肽具有自我蛋 白水解功能的部分。
在本發明的另一個優選的實施方案中寡肽配體的氨基酸序列是選自包含下歹廿序歹U的纟且VSIFEW、 AVSIEW丫、 AVSFIWY、 VSFIWYK、 ASRFWYA、 AF丫TWYA、 AFYRWYK、 AFY眼Y、 AFYRWYA、 AVSIFEWY、 AVSRW丫、 ASRFWY、 AFYRWYAA、 AFYRWY、 ASRFWYAA、 AFYRW丫AA和AF丫SWYAA.
在本發明范圍內的寡肽配體的N末端可以是游離的或是封閉的， 封閉是可以被激活的，如通過乙酰化(ac(et)ylation)。
本發明最優選的一個實施方案是其中天然的序列為SEQ ID NO 5 中的CSFV Npro的衍生物(因這個突變的氨基酸序列有個在殘基53到 57的"EDDIE"模體(而不是野生型的"RGDIR"))，這個突變體(和 包含這個模體的其它突變)在這里命名為"EDDIE"突變)用來和寡肽配 體結合，該寡肽配體選自包含ASRFWYA、 AFYTW丫A、 AFYRW丫K、 AFYRWY和AFYR-WAY的組。
因此，優選的親和配體選自VSDDWY、 VSEDWY、 VSIDW丫、 VSYDWY、 VSVDW丫、 VSWDWY、 VSYDW丫、 VSFDWY、 VSDEWY、VSEEWY、VSIEWY、VS丫EW丫、 VSVEWY、 VSWEW丫、 VS丫EW丫、 VSFEWY、DDDDWY、 DDEDW丫、 DDIDWY、 DD丫DWY、 DDVDWY、 DDWDWY、 DDYDWY、 DDFDWY、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSL隨、VSLIDW、 VSLIEW、 VSL匿、FSLEEW、 VSDLDW、 VSDLEW、 VSYIDW、 VSYIWE(所有的這些肽在pH5.5時結合NPr。)、 VSIDWY、 VSIEWY、 VSI-WWY、 VSYIIWY、 VS丫IW丫、 VSVIWY、 VSFIWY、 VSFIWE、 VSIFEW、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSLIWY、 VSLIDW、 VSLIEW、 VSLIWE、 FSLIEW、 WSLIEW、 FSYFEW、 FSFYEW、WSFYEW、FSYIEW、WSYIEW (所有的這些肽在pH7.3時結合 Npro)、AFYTWYA、AFYRWYK、AFYRWY、AFYRWYA、AFFRWYA、AFGRWYA、AFHRWYA、AFAYA、AFLRWYA、AFMRWYA、AFNRWYA、AFPRWYA、AFQRWYA、AFRRWYA、AFSRWYA、AFTRWYA、AFVRWYA、AFYRWYA、AFYFWYA、AFYGWYA、AFYLWYA、AFYMWYA、AFYNWYA、AFYPWYA、AFYTWYA、AFYVWYA、AFYWWYA、AFYYWYA、AKWFRYA、VSRNWY、ASRAYA、ASRFWYA、FSRAYA、VFRAYA、VWRNWYA、VYRNWYA、VSRAWYA、VSRFWYA、VSRWWYA、VSRYWYA、VSRNFYA、VSRNYYA、VSRAFA、VSRNWWA(所有的這些肽對于在53到57位氨基酸殘基處的EDDIE模體的Npra 突變具有特異的高親和性)、Ac-AFYTWYAK、 Ac- AFYRWYKK、Ac-AFYRWYK、Ac-AFYRWYAK、Ac-AFFRWYAK、Ac-AFGRWYAK、Ac-AFHRWYAK、Ac-AFIRWYAK、AC-AFLRWYAK、AC-AFMRWYAK、AC-AFNRWYAK、AC-AFPRWYAK、AC-AFQRWYAK、AC-AFRRWYAK、AC-AFSRWYAK、AC-AFTRWYAK、AC-AFVRWYAK、AC-AFYRWYAK、AC-AFYFWYAK、AC-AFYGWYAK、AC-AFYLWYAK、AC-AFYMWYAK、AC-AFYNWYAK、AC-AFYPWYAK、AC-AFYTWYAK、AC-AFYVWYAK、AC-AFYWWYAK、AC-AFYYWYAK、AC-AKWFRYAK、AC-VSRNWYK、AC-ASRNWYAK、AC-ASRFWYAK、AC-FSRNWYAK、AC-VFRNWYAK、AC-VWRNWYAK、AC-VYRNWYAK、AC-VSRAWYAK、AC-VSRFWYAK、AC-VSRWWYAK、AC-VSRYWYAK、AC-VSRNFYAK、AC-VSRNYYAK、 AC-VSRNWFAK、 AC-VSRNWWAK、 YWKA、 AC-YWKAK、 YKYA、AC-YKYAK、YWRA、Ac-YWRAK、ARWY、Ac-ARWYK、YWRA、Ac-YWRAK (所有這些肽由于N端的乙酰化和C端的賴氨酸化提高了固定到底物的能力)。
本發明的親和基質的一個特性是它特異地結合到瘟病毒(Npro)或Npro突變和Npro融合蛋白的自我蛋白酶Npro這些蛋白和本基質的結合是如此有效以至于這些蛋白通常也在非離液序列高的
(non-chaotropic)條件下結合。因此，本發明的基質是特異設計的可
以在離液序列高的或非離液序列高的條件下使固相和親和配體有效的 結合瘟病毒(NP「。)或NP「Q突變和NPro融合蛋白兩者的自我蛋白酶Np「。。
根據另一方面，本發明涉及從液相起始制劑中蛋白質的親和結合 方法，其中所述的蛋白質在離液序列高的條件下與本發明的親和基質 相互作用，借以所述蛋白質結合所述基質并且從所述的液相起始制劑 中分離。
術語"kosmotrope"(秩序制訂者(order-maker))禾卩"離液劑 (chaotrope)"(秩序破壞者(disorder-maker))最初分別指得是 穩定或不穩定蛋白質和膜的溶質。后來分別指得是增加和減少水結構 的表觀相關特性(apparently correlating property)。這些特性隨環境 變化、定性方法和研究的水和層(solvation shell)而變化。對于 kosmotrope， 一個可選的術語是"補償性溶質"，因為它們可以彌補 滲透性應激的細胞中高鹽成分引起的不利效應，該高鹽成分破壞了水 的天然氫鍵網絡。氫鍵結合的程度和強度可能分別被溶質獨自改變， 但是其中任何一個可能被或者已經被用作秩序形成的標準。然而，氫 鍵形成的質量是至關重要的。Kosmotropes的秩序效應可能與它們的 漫射旋轉是相悖的，這就導致產生了比較低水合的chaotropes更廣泛 的紊亂連接區域，這些區域是在周圍有大量水的更多的紊亂。大多數 kosmotropes不引起大規模的水網狀結構形成。
離子性的kosmotropes (或"抗離液劑(antichaotropes)"，以將它 們與非離子性kosmotropes區別)應該與非離子性kosmotropes區別對 待，主要是因為周圍水分子的方向和極化排列。通常，離子行為符合 霍夫曼序列。低電荷密度的大的單電荷離子(例如SCN—、 H2P04 —、HS04—、 HC03—、 廠、C廠、N03—、 NH4+、 Cs+、 K+、 (NH2)
3C+(胍鹽)或(CH3)4N^四甲基銨)離子；與水的相互作用比水一水相互
作用更弱，因此不干擾周圍水的氫鍵結合)是離液劑；然而，高電荷 密度的小的或多電荷離子是kosmotropes (例如S042—、 HP042_、 Mg2+、 Ca2+、 Li+、 Na+、 H+、 OH—或HP042—，與水的相互作用 比水一水相互作用更強，因此可以破壞水一水氫鍵)。對于陽離子，單
電荷離液序列高的離子半徑大于1.06A;對于陰離子，大于1.78A。因 此，在離子性kosmotropes附近的水分子之間的氫鍵比在離子性離液劑 附近更容易被破壞。對于鹵化物離子F—、 Cl-、Br—或I—周圍水氫鍵 的拉曼分光鏡研究顯示水氫鍵結合的總的程度會隨著離子大小的增加 而增加；在HDO: D20中的IR研究顯示這些鹵化物離子周圍的氫鍵 再定位緩慢，而且隨著分子增大會越來越慢。溶質使其周圍的一些氫 鍵增強(結構形成；例如kosmotropic陽離子將加強由內層水分子給 予的氫鍵)，同時破壞一些其它氫鍵不是不合理的(結構破壞；例如 kosmootropic陽離子將削弱內層水分子接受的氫鍵)。等同于其它一些 因子，帶有凈電荷的分子可以比沒有帶凈電荷的分子更強的結合水分 子；就像兩性離子和陽離子氨基酸之間的差異所顯示的一樣。
通過強離子水合到弱離子水合轉變的強水—水相互作用可以將弱 的水合離子(離液劑，K+， Rb+， Cs+， Br"， 1"，胍鹽+)"推至" 弱水合表面，在這里的離子—水水合作用強度大約與在大體積溶液(具 有在強的一邊Na+作為邊界和在弱的一邊Cr作為邊界)中的水一水相 互作用強度相同。兩種重要的離液劑(胍鹽和硫氰酸根離子)的中子 衍射研究發現其具有很弱的水合作用，這支持了其優選與蛋白質而不 是水發生相互作用的假設。不同于(In contract to) kosmotropes，由 于前者的低電荷密度，離子和非離子的離液劑的特性之間沒有明顯的差異。
借助鹽保證生物大分子的穩定性要求kosmotropic陰離子和離液 序列高的陽離子的混合物。
離液劑可破壞水的氫鍵結合網絡，因此高分子有更大的自由并且 促進蛋白質的延伸和變性。Kosmotropes是穩定化溶質，其可增加水 的有序性(比如多羥基醇、海藻糖、三甲胺氮氧化物、甘氨酸三甲 銨乙內酯、ectoine、脯氨酸或其它兩性離子)；而離液劑可以生成較 弱的氫鍵結合，降低水的有序性，增加其表面張力并使大分子的結構 不穩定(比如高濃度的鹽酸胍和尿素)。最近的研究表明尿素可以 弱化氫鍵結合和疏水相互作用，但是葡萄糖作為kosmotrope可以增強 這些特性。因此，在缺乏足夠水的情況下，當尿素分子少于最佳水合 (每分子尿素結合約6—8摩爾水)的尿素自身氫鍵和蛋白質(顯然涉
及肽連接)時，蛋白質會更加疏水并且因此更加容易與蛋白質其它位 點相互作用，并導致局部的脫水變性。胍鹽是平面離子，可能在其邊 緣周圍形成弱的氫鍵，但是可能與蛋白質羧酸鹽形成強的氫鍵離子對， 類似于通常的四元結構的精氨酸一羧酸鹽連接。另外，胍鹽具有相當 強的疏水表面，可能與類似的蛋白表面相互作用并導致蛋白質的變性。 兩種變性劑可能通過疏水位點之間的滑行引起蛋白質腫脹和變性并且 隨之插入氫結合水中完成變性。
通常溶質的kosmotropic/離液序列高的特性決定于水的物理特性， 經常是在必要的高濃度。應用諸如NMR或振動波譜可以發現結構程度 的變化。穩定蛋白質的溶質(kosmotropes)可增加氫鍵結合的程度(減 少質子和170自旋晶格馳豫的次數(Spin lattice relaxation times))， 然而NMR化學位移可能增加(表現為較弱的結合，例如兩性離子 kosmotrope，三甲胺氮氧化物)或減少(表現為強的結合，例如多 羥基的kosmotrope，海藻糖)。海藻糖顯示了在化學位移和馳豫時間 (relaxation time)的減少，而蛋白穩定劑(NH4J2S04)表現一個更 低程度的減少，而NaCL顯示在化學轉變上的減少時，蛋白去穩定劑 KSCN顯示了馳豫時間的增加和化學轉變的減少。振動波譜可能應用 5200 cm—1 (v2 + V3聯合)附近的近IR波長，當氫鍵結合很強時，其轉 變向波長更長的方向(較少的波數)。
最重要的kosmotropes之一是非還原糖a， a-海藻糖。或許受關 注的是海藻糖有一個比還原性糖更穩定的結構，因為其缺乏旋光改變， 或者其它通用的非還原二糖，蔗糖，其缺乏呋喃環。
因此，術語"離液序列高的條件"必須個別的考慮液體起始制劑 的的特性(例如溶液、懸液、乳狀液、兩或三相液體系統等)，尤 其是當制備中有超過一相的情況時，對于制劑的水相的特性要關注。 優選的本發明的離液序列高的條件是指那些相應的1_7M的尿素，尤 其是2—6M(優選在緩沖鹽溶液中，比如8.0g NaCI， 0.2g KCI， 1.44g Na2HP04， 0.24g KH2P04 ad 1000 ml with A. dest.， pH 7.4 with HCI)。對應的離液序列高的條件可用上述的方法確定，也可應用霍夫 曼序列的理論。在起始液體中添加不同的物質時必須要分別的檢測以獲得優化的結合/非聚集的條件。例如還原劑的使用應該被優化，可用0.05至U 50 mM的二硫蘇糖醇(DTT)，尤其是0.1至U 10 mM的二硫 蘇糖醇(DTT)。而且，如上所述，去污劑的添加也可影響起始制備的離 液序列高的特性。
優選的，當結蛋白質結合在所述的基質上時，結合到基質的蛋白 質進一步被加工。這樣的進一步加工可能優選的是化學衍生、絡合、 降解等，尤其(在具有自身催化部分的融合蛋白的情況下)是自我蛋 白水解。這進一步的加工可能也優選在比起始體系中更低的離液序列 高的條件下進行。通常情況下，這些進一步的加工步驟以來于加工反 應的優化條件，其要與將親和基質上的蛋白質結合到親和配體上的親 和力保持的需要之間平衡。
為了提供可溶的被結合和可選擇的被加工的蛋白質來說，其必須 從載體上洗脫下來，如果融合蛋白包含自我蛋白水解部分和目的蛋白 部分，則至少融合蛋白的目的蛋白部分要洗脫下來。有許多方法可以 做到這點。在融合蛋白具有自身催化部分的情況下，通過自我蛋白水 解反應進行洗脫。在這種情況下，自我蛋白酶部分保留在親和基質上。 在其它情況下，結合到基質上的蛋白質或所述的被加工的蛋白質保留 在基質上，優選的是在用較低離液序列高的洗脫緩沖液作為起始制備 的液相。優選的，至少融合蛋白的自我蛋白水解部分保留在基質上。
在另一方面，蛋白質能被保存在親和基質上并作為一個固定部分， 例如固定化的酶。但是，由于是非共價結合，所以蛋白質對固體表 面的結合力并不是很強。如果固定蛋白質具有酶活性的話，在工業化 方法中，固定的酶是可用的，其可以提供活性(酶解的，催化的)表 面。
根據本發明的優選實施方案，蛋白質是異源的重組多肽，包含自 我蛋白水解部分和目的蛋白部分，目的蛋白部分在非離液序列高的條 件下可以被所述的自我蛋白水解部分切割，特別是融合蛋白其自我水 解部分是在變性條件下以包涵體形式表達的瘟病毒(NPpro)的自我蛋白酶 或(NPpro)突變和(NPpro)融合蛋白。
根據以上描述方法的優選實施方案，融合多肽包含CSFV的自我 蛋白酶(NPpro)的衍生物，其中除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取 代外，至少有一個堿性氨基酸被一個酸性氨基酸殘基取代。
對于一個CSFV的自我蛋白酶NPro衍生物進一步優選的是，其中除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，還有至少一個下列氨基酸被改變H5、 K16、 N35、 R53、 G54、 R57、 L143、 K145或 R150。在一個優選實施例的衍生物中，改變的氨基酸有谷氨酸(E) 取代53位精氨酸(R)、天冬氨酸(D)取代54位甘氨酸(G)、谷氨酸(E) 取代57位精氨酸(R)或谷氨酰氨(Q)取代143位亮氨酸(L)。
因此，在另一個方面，本發明涉及以上描述的方法的進一步優選， 其中融合多肽包含一個CSFV的自我蛋白酶NP「。的衍生物，該衍生物 中除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，下列氨基酸被取代 谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 53、天冬氨酸(D)取代甘氨酸(G) 54、谷氨 酸(E)取代精氨酸(R) 57或谷氨酰氨(Q)取代亮氨酸(L) 143。
在本發明另一個優選的實施方案中，CSFV的自我蛋白酶NP「。的 衍生物包含下列氨基酸序列。
SEQ ID NO 3:
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEV HPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYH lYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)。
因此，在另一方面，本發明也涉及上述方法，其中融合多肽包含 具有SEQ ID NO 3序列的CSFV的自我蛋白酶Npra的衍生物。
在另一方面，本發明涉及瘟病毒的天然發生Np「°的衍生物，其與 瘟病毒天然發生的Np「°比較，除了聚合性降低，更接近中性的等電點 (pl)進一歩增強了可溶性。
如上所述確定可溶性。
因此，本發明涉及一個CSFV的自我蛋白酶NPro的衍生物，其中，除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，至少一個親水氨基酸 殘基取代一個疏水殘基。
因此，在另一個方面，本發明也涉及以上描述的方法，其中融合 多肽包含一個CSFV的自我蛋白酶NT。的衍生物，在這個衍生物中除 了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，至少一個親水氨基酸殘 基取代一個疏水殘基。
在本發明中，優選的是一個CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物， 其中除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，而且至少下列氨基酸中的一個被取代V24、 A27、 L32、 G54、 L75、 A109、V114、 V121、 L143、 1155和F158。 一個優選的實施例是在衍生物中，下列氨基酸被蘇氨酸(T)取代丙氨酸(A) 109、纈氨酸(V)114、異 亮氨酸(l) 155和苯丙氨酸(F)158。
因此，在另一方面，本發明優選的涉及以上所述的方法，其中融 合多肽包含CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物，其中除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，下列氨基酸被蘇氨酸(T)取代丙氨 酸(A) 109、纈氨酸(V)114、異亮氨酸(l) 155和苯丙氨酸(F)158。另 外，在本發明中更優選的CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物包含下列氨基酸序列。
SEQ ID NO 4:
(I)-MELNHFELL丫KTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)。
因此，在另一方面，本發明更優選的涉及以上所述的方法，其中 融合多肽包含具有SEQ ID NO 4序列的CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物。
在本發明中，更優選的是一個CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物， 其中除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，下列氨基酸也被 取代蘇氨酸(T)取代丙氨酸(A) 109、纈氨酸(V)114、異亮氨酸(l) 155或苯丙氨酸(F)158，谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 53，天冬氨酸(D) 取代甘氨酸(G)54，谷氨酸(E)取代精氨酸(R)57，谷氨酰氨(Q)取代亮 氨酸(L) 143。
因此，在另一方面，本發明更優選的涉及以上所述的方法，其中 融合多肽包含CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物，其中除了至少一個 半胱氨酸殘基如上所述被取代外，下列氨基酸也被取代蘇氨酸(T) 取代丙氨酸(A) 109、纈氨酸(V)114、異亮氨酸(l) 155和苯丙氨酸(F)158，谷氨酸(E)取代精氨酸(R)53，天冬氨酸(D)取代甘氨酸(G) 54， 谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 57，谷氨酰氨(Q)取代亮氨酸(L) 143。
根據本發明，最優選的CSFV的自我蛋白酶NPpro的衍生物包含下
列氨基酸序列
SEQ ID NO 5:
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEV HPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKP GPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)。
因此，在另一個最優選的方面中，本發明也涉及以上所述的方法， 其中融合多肽包含具有SEQ ID NO 5序列的CSFV的自我蛋白酶Npra 的衍生物。
在另一個同樣優選的方面中，本發明涉及如以上所述的異源蛋白 質生產方法，其中融合多肽包含具有SEQ ID NO 5序列的CSFV的自 我蛋白酶NP「o的衍生物，其中除了蘇氨酸(T)取代天冬酰氨(N) 35外， 用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T) 158。
在另一個優選的方面，本發明涉及以上所述的異源蛋白質的產生 方法，其中融合多肽包含具有SEQ. ID NO. 32序列的CSFV的自我蛋 白酶NP「Q的衍生物，該衍生物除了谷氨酸(E)取代丙氨酸(A)28外，也 有苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S) 71和組氨酸(H)取代精氨酸(R) 150。
優選的，在本發明的方法中，CSFV的自我蛋白酶N^的衍生物 融合的蛋白質包含至少三個胰島素原的起始氨基酸，更優選的是胰島 素原，進一步更優選的是人胰島素原，最優選的是人重組胰島素原， 這可以用來生產胰島素原。
根據本發明優選，如果CSFV的自我蛋白酶N^的衍生物具有除 了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，有至少下列一個氨基酸 被取代精氨酸(R)53、甘氨酸(G)54、精氨酸(R)57、蘇氨酸(T) 109, 114, 155， 158和亮氨酸(L) 143。本發明中CSFV的自我蛋白酶Npra 優選的衍生物具有除了至少一個半胱氨酸殘基如上所述被取代外，有 下列氨基酸被取代谷氨酸(E)取代精氨酸(R)53，天冬氨酸(D)取代甘 氨酸(G)54，谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 57，絲氨酸(S)取代蘇氨酸109、114、 155、 158，谷氨酰氨(Q)或天冬酰氨(N)或天冬氨酸(D)或絲氨酸 (S)或組氨酸(H)取代亮氨酸(L) 143。
在另一個實施方案中，在非離液序列高的條件下，當本發明中的 融合蛋白結合在親和基質上時，融合蛋白的自我蛋白水解部分應該是 失活的或者以一個未切割形式存在。因而，僅僅應用了其親和特性而 不是其自我蛋白質水解特性；不過，CSFV的的N^的那些衍生物， 或者是它們自身或者是由于它們連接到融合蛋白的耙分子部分，在結 合到本發明的親和基質上時，也沒有表現出自我蛋白水解的活性；甚 至在非離液序列高的條件下(生理性的，"正常的")也沒有，這些 衍生物也被表述為自我蛋白質水解部分。
優選的，自我蛋白質水解部分選自
SEQ ID NO 1: (Npr0)
<sequence>see original document page 22</sequence>
SEQ ID NO 2:
<sequence>see original document page 22</sequence>
SEQ ID NO 3 :
<sequence>see original document page 22</sequence>
SEQ ID NO 4:
<sequence>see original document page 22</sequence>GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)
SEQ ID NO 5: ("EDDIE"-mutant)
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168),
SEQ ID NO 6:
(I)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKPG PVY丫QDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTL隨TRNSTNCPLWVTSC-(168)，
SEQ ID NO 7:
O)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168),
SEQ ID 8:
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDG日LLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)和
SEQ ID 9:
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVY丫QD丫TGPV丫HRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNSTNCPLWVTSC-(168).
在生理條件下，許多蛋白質高度傾向于聚合或者它們內在的生物
學活性就是聚集，比如朊蛋白或淀粉樣肽的聚集原理。為了研究這
些在離液序列高的條件下必須是可溶性的蛋白質，可在極端pH (酸或
堿)的水溶液存在時，添加去污劑和有機溶劑，比如乙腈、乙醇、 異丙醇、丙醇或嘧啶等。高度傾向于聚集的淀粉樣肽涉及大量疾病。 主要的淀粉樣物質和包括蛋白或肽如下總結(影響中樞神經系統的條 件用斜體書寫)
臨床綜合癥 纖維組分阿爾茨海默病αβ肽(1-40、 1-41、 1-42、 1-43); 微管相關蛋白
海綿狀腦病 朊病毒(全長或片段)帕金森病突觸核蛋白(野生型或突變體)
Fronto-temporal dementias 微管相關蛋白(野生型或突變體)
Familial Danish dementiaADan肽
Familial British dementia ABri肽
Hereditary cerebral haemorrhage with 半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin C)amyloidoses
肌萎縮性(脊髓)側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis) 過氧化物岐化酶(野生型或突變體)
齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮 ( Dentatorubro-pallido-luysian atrophy) Atrophin 1(多聚谷氨酰胺鏈)
亨廷頓病 Huntingtin(多聚谷胺酰胺鏈)
小腦性共濟失調(Cerebellar ataxias) Ataxins(多聚谷胺酰胺鏈)
Kennedy disease雄激素受體(多聚谷胺酰胺鏈)
Spino cerebellar ataxia 17 TATA盒結合蛋白(多聚谷胺酰胺鏈)
初級系統性淀粉樣病變 Ig輕鏈(全長或片段)次級系統性淀粉樣病變 血清淀粉樣蛋白A(片段)家族性地中海熱 血清淀粉樣蛋白A(片段)
老年全身性淀粉樣變性(Senile systemic amyloidosis)轉甲狀腺素蛋白(野生型或其片段)家族性淀粉樣多神經病I (Familial amyloidotic polyneuropathy) 轉甲狀腺素蛋白(超過45個變體或其片段)血液透析相關淀粉樣疾病 (Hemodialysis-related amyloidosis) β2-微球蛋白家族性淀粉樣多神經病川(Familial amyloid polyneuropathy ) 阿樸脂蛋白A-1(片段)芬蘭遺傳系統性淀粉樣變性(finnish凝膠蛋白(突變蛋白的片段) hereditary systemic amyloidosis)
ll型糖尿病 前胰島淀粉樣多肽(片段) 甲狀腺髓樣癌(Medullary carcinoma of前降鈣素(全長或片段) the thyroid)
Atrial amyloidosis 心房禾ll鈉因子 溶菌酶系統性淀粉樣變性(Lysozyme溶菌酶(全長、突變) systemic amyloidosis)
胰島素相關淀粉狀蛋白(Insulin-related胰島素(全長) amyloid)
人纖維蛋白原a鏈淀粉樣病變 纖維蛋白原(a鏈變體及片段)
另一類蛋白質，膜蛋白涉及所謂的膜脂雙層。生物膜的功能是作 為與外界相隔的界面、細胞之間的分割和細胞內腔隙的邊界。因此， 生物膜涉及多種疾病，比如高胰島素血癥、腎性尿崩癥、充血性心 衰、肝硬化、囊腫性纖維化、高和低血壓、非水腫、癲癇癥和白內障。
大約30℃已測序的基因編碼膜蛋白。然而，僅僅30個膜蛋白的結構 在原子分辨率水平被解析，而可溶性蛋白質已經有3000個晶體結構， 這是因為通過去污劑溶解的膜蛋白很難產生適合于X衍射的三維晶 體。在蛋白質數據庫中現存的67個膜蛋白結構中，52個是來源于細 菌蛋白，這說明細菌膜蛋白比植物或動物膜蛋白更容易表達、純化和 結晶。目前的挑戰是解決較高等生物膜蛋白的晶體結構并進行功能、 動力學和與配體相互作用的研究。對于多種疾病來說，膜蛋白是重要 的藥靶。優選的，這些蛋白質("靶蛋白")以融合蛋白形式結合于 親和基質上。如果靶蛋白以固定形式出現時，融合分子的自我蛋白質 水解部分應該是失活的或為非切割形式。因而，自我蛋白質水解部分 是作為一個標簽在非離液序列高的條件下固定靶蛋白于親和基質上。
朊病毒病，比如人不同的Creutzfeldt-Jakob疾病(vCJD)和羊瘙 癢病的特征就是在腦組織中有異常淀粉樣蛋白PrP&沉積。通過PrPe 的構象改變，Prpse經由感染的人和動物的腦組織傳播引起神經退化和 死亡。幾年來，許多特異識別Prpe或可同時識別PrPe和Prpse的抗 體在基礎研究中已經被發展起來。然而，PrPSe的特異抗體卻沒有出現。
膜蛋白(跨膜蛋白(內在蛋白))P —桶膜蛋白出現在革蘭氏陰 性菌、線粒體和葉綠體的外膜中。P —桶膜蛋白的跨膜序列疏水性低于 a—螺旋膜蛋白，這可能是兩類膜蛋白折疊和膜裝配通路完全不同的主 要原因。 一些(3 —桶膜蛋白可以在體外自發再折疊成脂質雙分子層。盡 管脂類和蛋白分子伴侶可以幫助其在合適的靶膜上組裝，這些蛋白也 具有這種能力。其他重要的膜蛋白是超抗原。
本方法非常適合于(和非必須的被固定)那些高度傾向于聚集(在 生理條件下)并且不能應用標準的方法，尤其是親和純化技術進行純 化的完整蛋白質。既然本發明中的親和基質能夠在離液序列高的條件 下結合蛋白質，則本方法就可能通過親和色譜純化這些困難的蛋白質， 尤其是那些與人類疾病相關的蛋白質。因此，在本發明的一個優選的 實施方案中，結合到本發明中的親和基質上的蛋白質是或者包含在生 理條件下具有高度傾向于聚集的一個蛋白質或蛋白質一部分，尤其是
以下一些蛋白質，包括A(3肽、微管相關蛋白(Tau)朊蛋白、突觸 核蛋白(a曙synuclein)、微管相關蛋白(Tau) 、 ADan肽、ABri肽、 半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin C)、A卩肽、過氧化物歧化酶、Atrophin 1、 Huntingtin、 Ataxins、雄激素受體、TATA盒結合蛋白、lg輕鏈、 血清淀粉樣蛋白A、轉甲狀腺素蛋白、(S2—微球蛋白、阿樸脂蛋白A-l、 凝膠蛋白、前胰島淀粉樣多肽、前降鈣素、心房利鈉因子、溶菌酶、 胰島素、纖維蛋白原、其全長蛋白或特異片斷、突變體、剪接體或多 聚谷氨酰胺鏈(polyQ-expansion)。
根據根本發明的一個優選實施方案，本方法可用來制備異源多肽， 也包括結合本發明中親和基質的操作。優選的，這個方法進一步包含 所述多肽的純化。
在本發明的一個優選實施方案中，提供是目的異源蛋白的親和結 合的方法，其中所述的多肽以融合瘟病毒自我蛋白酶Npro。或其衍生物 的融合多肽表達，其中所述的融合多肽在離液序列高的條件下與一個 肽接觸，這個肽在這種的條件下可以特異結合瘟病毒自我蛋白酶Npra 或其衍生物，并且其所述的肽是結合于固相上的。
本發明的親和配體在離液序列高的條件下可以選擇性的結合瘟病 毒(Npro)或Npra—突變體和前兩者的NPro。融合多肽的自我蛋白酶Npro，并
且在改變為kosmotropic條件時或在kosmotropic條件下也可保持這種 特異性的結合。本發明的親和配體的特性是蛋白質的結合特異性，尤 其是在離液序列高的條件下對Npro、 Npro突變體、融合多肽和高度 聚集蛋白質的結合。這個特性表明它們可以用于在離液序列高的條件 下要求蛋白質的特異結合的任何實驗。另外，特異結合在改變為 kosmotropic條件時或在kosmotropic條件下也可保持。因此，以上描 述的肽可以用在要求結合變性目的分子和在再折疊和重建 (renaturisation)過程中保持結合的實驗中。因此，以上所述的肽能 用于諸如變性條件下NPrc的捕獲和純化、肽親和色譜、其它形式的 親和純化或涉及配體和蛋白質在離液序列高的條件下相互作用的親和 分析。
例如高度傾向于聚集的蛋白質可融合NPro或NPro-突變體，然后 融合蛋白被純化；或者將離液序列高的條件下表達的蛋白粗提物與固化了本發明中親和配體的表面孵育。然后，離液序列高的條件逐漸被適合進一步反應的過程或分析的條件取代。例如
A. 離液序列高的條件被生理緩沖液取代，并且免疫反應通過抗體或抗體片斷直接與蛋白質特定結構域反應而進行。這種策略可以使高 度傾向于聚集的蛋白質的免疫反應順利進行。
B. 離液序列高的條件被取代并且進行一個特定的化學反應以修飾蛋白質結構。實施例包括氨基酸側鏈的氧化、磷酸或硫酸基的加入、合成的天然形式聚合體的加入(例如PEGIyation)、肽鏈加入使蛋 白分子產生分支、對于在生理性溶液或緩沖液中不溶的蛋白質添加染 料。
C. 通過融合NPr。或NPr。-突變體，膜蛋白可以單分子重構。分子標簽固化在針對這個融合蛋白的本發明的親和配體，并且在4M尿素存 在時，也可以結合。隨后通過去污劑和脂質雙層除去尿素。當融合多肽結合至色譜系統中時，未結合的污染成分很容易被洗 脫下來。這些污染成分可能是，諸如宿主細胞多肽和核酸，其包裹于 或吸附于包涵體，溶解后混于多肽溶液中，也有一些是酶解破碎的細 胞中的殘余成分。洗滌之后，融合多肽仍舊結合在柱子上，以便在純化系統中進行如下步驟
融合多肽在離液序列高的的失活條件下結合基質。為了誘導再折疊，改變為kosmotropic條件。
在一個優選的實施方案中，融合多肽的再折疊是通過改變緩沖液 來實現從離液序列高的條件到kosmotropic條件的轉變的。
緩沖液可以逐漸或瞬間改變到kosmotropic條件。在本發明一個 優選的實施方案中，離液序列高的緩沖液和kosmotropic緩沖液之間 的轉變是通過緩沖體系的應用瞬時實施的。在本發明另一個同樣優選 的實施方案中，緩沖液的轉變是逐漸實施的。
如果緩沖液轉變伴隨一個溫度調節器，則融合多肽在柱子上的結合和/或所述融合多肽的再折疊和切割可能很方便。例如這能通過一個冷/熱溫控套實現。因此，在一個優選的實施方案中，冷/熱溫控套就是溫度調節器；更優選的，在使用前，緩沖液可以預熱到所需溫度。 通過這種方法就得到了如此的溫度調節器。
在一個填料床中，隨著條件的改變，融合多肽開始再折疊，并且具有自我蛋白水解功能的部分開始激活。結果導致融合目的蛋白的C 端多肽從被自我蛋白水解特異性的特定位點切割下來，從而產生了目的多肽的同源性N端。根據融合多肽再折疊所需的時間，kosmotropic緩沖液流動相的速率要被降低，或者當全部離液序列高的從填料床中 流出后就停止。當再折疊完成之后，kosmotropic緩沖液進一步洗滌， 使游離的目的多肽從填料床中流出來。融合多肽的N端自我蛋白水解 部分，以及未切割的融合多肽通過傳統的方法洗脫，比如高鹽濃度、 pH改變或NaOH以再生色譜填料。填料床要用可從吸附物上洗脫自我 蛋白酶的緩沖液洗滌以再生。這些緩沖液包含酸或堿或有機溶劑。在 用起始緩沖液/離液序列高的緩沖液重新平衡之后，填料床可以用于下 一個循環。
另一方面，在正確再折疊的時候，融合蛋白保持自我催化的失活 狀態，例如采用在自我蛋白水解部分和融合蛋白的目的蛋白部分之 間引入合適的連接序列或者采用失活突變體來實現，自我蛋白酶突變 體沒有或具有低的自我蛋白水解活性。例如，在這兩個部分之間可以 引入三肽連接序列(氨基酸1、 2和3)，其在位置1和也是優選的在 位置2和3是堿性氨基酸((R、 K、 H)、酸性氨基酸(D、 E)、大的疏水氨基酸(V、 L、 I、 M)或芳香族氨基酸(F、 Y、 W)，以阻止自身蛋白
切割。失活自我蛋白酶衍生物的實施例是
Npro R53E, G54D, R57E, T59M, D92N' A109S, C112E， V114S V121K， C134E， C138E, L143N， 1155S， F158S
("MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETMLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVYYQNYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDG日LLKNAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168),
Npro R53E， G54D， R57E， P87L, A109S, C112E， V114S' V121N, T122A，C134E， C138E' L143E， M55S, F158S
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPG LVYYQD丫TGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRNAGSDGKLYHI YVEVDGEILLKEAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC- (168)和
Npro R53E, G54D, R57E, A109S， C112E， V114S， V121N， C134E' C138E'L143Q, I155S, F158S
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRNTGSDGKL丫HI 丫VEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC- (168)。
在這個實施方案中，目的蛋白以具有類似天然結構的被固定的功 能活性形式出現，當然沒有不希望的聚集發生的風險。這種被固定或
被捕獲的目的蛋白可能用來進行科學研究，比如免疫學的研究、內 源性研究、熒光分析或其它生理性的或藥學上感興趣的分子的相互作 用研究。
因為切割效率沒有所需要的那樣高，如果必要的話，可以將從再 生步驟中洗滌下來的未切割融合多肽二次上樣于本發明的另一個色譜 循環體系中。
部分或完全再折疊的游離目的多肽非必需通過不同緩沖液的選擇 來獲得。在本發明的范圍中，流出液中的目的多肽是部分或優選完全 再折疊。在本發明的一個實施方案中，融合多肽的自我蛋白水解活性 部分的再折疊可能是完全的，但是目的多肽仍有部分未再折疊。這種 情形的發生，例如當目的多肽具有非常復雜的構象，比如二聚體或三聚體，或者包含輔酶或輔因子。這種目的多肽的完全再折疊可能 要求特定的條件。因此，在這種情況下，再折疊的完成是一個多步驟 的過程，需要特殊的條件，比如質子強度和pH或再折疊過程中添加 的去污劑的完全去除。
只要保證融合多肽結合在柱子上，任何條件的改變均包含在本發 明的范圍之中。
本發明也揭示了寡肽配體和以上描述的CSFV的N^衍生物在本 發明中的應用。本發明也涉及寡肽和以上描述的CSFV的NPro衍生物 在本發明中的應用。
根據另一方面，本發明涉及這里定義的用于親和結合的親和配體 的應用，尤其是瘟病毒(NPro)自我蛋白酶NPro或NPro-突變體和NPr。融 合蛋白的結合。
本發明的另一方面涉及結合瘟病毒(NPro)自我蛋白酶NPro或Npro-
突變體的親和配體或親和基質，以及NPr。融合蛋白在變性條件下以包
涵體形式表達，優選的上述的配體符合a)和b)的條件，尤其是以上 列出的這些寡肽特定的實施方案；或者結合瘟病毒(NPro)或NPro-突變體 自我蛋白酶NPro的親和基質，并且NPro融合蛋白在變性條件下以包涵 體形式表達，優選的基質通常在這里被說明。
參考下列實施例進一步描述本發明，它們僅僅是例子并且沒有限 制。特別是本實施例涉及本發明的優選實施方案。
具體實施例方式
實施例1一親和色譜 1.1.1色譜設備
在實施例1中，色譜在AKTA 100 Explorer色譜系統(Amersham Biosciences)中進行。預制的肽親和吸附劑裝填在HR 5柱子中(5 mm j.d, Amersham Biosdences)。膠體積約1ml。
1.1.2寡肽配體的制備
在實施例1中應用的寡肽通過下述方法生產
固相肽合成在433A肽合成儀上進行(Applied Biosystems， Vienna, Austria),用1 —羥基一1H—苯丙三氮唑/N， N'— 二環己基碳二亞胺 (HOBt/DCC )作為Fmoc保護氨基酸(Bachem, Bubendorf, Switzerland)的激活。肽在4-羥甲基-苯氧基聚苯乙烯-1 %二乙烯基苯樹 脂上合成(HMP樹脂，Wang樹脂)。側鏈的保護基團是酪氨酸、絲氨 酸和蘇氨酸的叔丁基(t-Bu)，谷氨酸和天冬氨酸的OtBu，賴氨酸和 色氨酸的叔丁氧羰基(Boc)，半胱氨酸、組氨酸、天冬酰氨和谷氨酰氨 的三苯甲游基(Trt)。為了第一個氨基酸的耦聯，用4一二甲基氨基 吡啶(DMAP)作為催化劑。耦聯第一個氨基酸之后，通過使用安息香酐 完成加帽步驟。用20^piperidin去除Fmoc基團的保護。側鏈的去保 護和從樹脂上切割是通過與含有95X三氟乙酸(TFA)、 2.5%水和2.5 ^三異丙基硅烷(TIS)的切割混合物反應而實現的。用二氯甲垸(DCM) 洗滌之后，粗制的肽通過重復的乙醚沉淀結合凍干法進行純化。肽應 用P 3500泵(Amer- sham Biosciences, Uppsala, Sweden)在Luna 15 p C18(2) 250 x 21.2 mm柱子(Phenomenex， Torrence， CA, USA) 上通過RP-HPLC進一歩純化，使用5-50%的乙腈水溶液(0.1% TFA) 線性梯度，速度為30 ml/min。純度通過在HP 1090液體色層分析儀 (Hewlett Packard, USA)上進行分析型RP-HPLC來確定，應用Luna 3口 C18(2) 100 x 4.6 mm柱子(Phenomenex)，每分鐘1%乙腈線性 梯度。同源性和同一性由基質輔助激光解吸附離子化一飛行時間質譜 (ThermoBioanalysis, Hempstead, UK沐確定。
1.1.3親和基質的制備
在實施例1中使用的親和基質通過下述方法制備
將10g Fractogel epoxy (M) (Merck, Darmstadt' Germany)與 50ml 1M的二氨基二丙胺(DADPA)室溫反應48小時。反應之后，將膠 用50ml 10mM HCL洗滌，再用50ml水洗滌3次。將膠重懸在水中， 用0.1MNaOH調節pH值到7.0，再加入2g的琥珀酸酐。輕柔的搖蕩 混勻30分鐘之后，用10 M NaOH調節pH值到7.0，然后再加入2g 的琥珀酸酐。30分鐘搖蕩之后，用50 ml 0.1 M NaOH和50ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌膠，再用50ml的水和20%乙醇洗滌3次。真空干燥后，膠保存在4℃。
1.1.4羧基激活和肽固定
實施例1中的親和基質按照如下方法激活
按照在1.1.3中描述的方法，用DADPA-SA spacer修飾1 g濕 Fractogel，并且用5ml乙腈洗滌2次。用3 ml 0.1 M琥珀酸醯亞氨一 三氯碳酸乙酯(Succinimidyl-trichloroethylcarbonate)和0.1 M三乙胺溶解在乙腈中3小時進行激活。隨后用乙腈和1 mMHCL洗滌。肽 AFYRWYA溶解在PBS中，濃度為3 mg/ml。迅速將5ml肽溶液加入 膠中并反應24小時。肽VSFIWYK溶解在含0.1 M三乙胺的二甲基甲 酰胺中(DMF) 。 5ml肽溶液迅速加入膠中并反應24小時。耦聯產量 通過耦聯前后樣品的RP-HPLC來確定。
肽固定在CIM-epoxy基質上。
肽溶解在含0.15 M NaCI， pH為10.0的100 mM Na2C03緩沖液中。CIM基片被廠家按照在一個筒里邊，通過一個Pl泵(Amersham Biosciences)將肽溶液緩慢的泵入循環系統，室溫循環48小時。耦聯 產量通過耦聯前后樣品的RP-HPLC來確定。耦聯之后，剩余的環氧基團可以用pH10.0的0.5 M乙醇胺作用48小時來封閉。
1.1.5融合多肽的表達
重組E. coli HMS174 (DE3)在10L的發酵罐中表達的融合多肽包含帶有6個組氨酸標簽的N端自我蛋白酶Npro和融合有GFPmut3.1從C端。融合多肽包含如下的氨基酸序列
1 MHHHHHHELN HFELLYKTSK QKPVGVEEPV YDTAGRPLFG NPSEVHPQST LKLPHDRGRG 60
61 DIRTTLRDLP RKGDCRSGNH LGPVSGIYIK PGPVYYQDYT GPVYHRAPLE FFDEAQFCEV 120
121 TKRIGRVTGS DGKLYHIYVC VDGCILLKLA KRGTPRTLKW IRNFTNCPLW VTSCSGTMRK 180
181 GEELFTGWP ILVELDGDVN GHKFSVSGEG EGDATYGKLT LKFICTTGKL PVPWPTLVTT 240
241 FGYGVQCFAR YPDHMKQHDF FKSAMPEGYV QERTIFFKDD GNYKTRAEVK FEGDTLVNRI 300
301 ELKGIDFKED GNILGHKLEY NYNSHNVYIM ADKQKNGIKV NFKIRHNIED GSVQLADHYQ 360
361 QNTPIGDGPV LLPDNHYLST QSALSKDPNE KRDHMVLLEF VTAAGITHGM DELYK
細菌宿主細胞，比如表達菌株采用常規微生物培養的方法進行 培養。菌株通常是在營養培養基中從一個單克隆開始生長，但是也可能用冷凍保存的細胞懸液(細胞庫)。菌株通常要進行多級培養以獲 得足夠量的菌體來提供進一步的使用。
小規模培養可以在搖瓶中進行，通常使用復合培養基(比如LB 肉湯)。然而，也可以用規定的培養基(比如檸檬酸鹽培養基)。 宿主菌用單克隆接種或者從冷凍培養的細胞懸液，小體積預培養的溫 度對于隨后表達的結果通常并不是關鍵的，所以按照慣例可以在一個相對高的溫度下進行(例如30℃或37℃)。大體積培養(比如500ml)時，特別關鍵的是要保證好的通風條件(與內容物相比更大體積的搖 瓶，高速的搖蕩)。如果希望以包涵體的形式表達，則通常在較高溫度下進行(例如30℃或37℃)。 一些誘導體系特別適合產生包涵體 (例如采用trp， lac, tac或phoA啟動子)。當細菌生長至對數生長 期后期(通常在搖瓶中的光密度為0.5到1.0)時，即可加入誘導劑 (例如吲哚丙烯酸、異丙基-P-D-硫代半乳糖苷—PTG)繼續培養1-5小時。在這段時間內，大多數的Npro融合多肽以包涵體形式存在 于細菌細胞質中。隨后收菌并進行進一步的操作。
大規模培養時，多級系統包含多級生物反應器(發酵罐)，優選 利用規定的營養培養基以改善本方法的工程控制。另外，在特定的營 養培養基(補料分批)中可能極大的增加菌體的數量和最終的產物量。 另外，本方法類似于搖瓶。例如發酵的初始階段和主要階段采用的 培養溫度與在搖瓶中相似。初始的發酵從由一個單克隆或冷凍培養的 菌液經搖瓶擴增后得到的所謂發酵種子加入發酵罐后開始。在發酵中 必須保證好的通風和足夠量的誘導劑濃度，尤其是在其主要發酵階段。 然而，在一些情況下，發酵的誘導階段明顯要比在搖瓶中誘導更長。 最終的細胞再用于進一步的處理。
1.1.6包涵體分離
收菌之后，用2500 ml、pH為8.0的50mM Tris/HCI， 5 mM EDTA、 1 %Triton X-IOO的溶液重懸菌體(850g濕重)。冷凍的懸液的通過 APV-2000高壓均質器3次(壓強值設定為800巴)以破碎菌體。通 過均質器的懸液在冰上冷卻并且再通過超聲儀進一步破碎。將破碎后 的勻漿進行低速離心(JLA 10.500， 7500 rpm， 30 min)得到包含重組融 合多肽的包涵體。
1.1.7包涵體溶解
沉淀重懸在50 mM Tris/HCI， 5 mM EDTA， 1 。/。Triton X-100,pH 8.0的溶液中并離心。重復該步驟。水洗滌步驟之后，沉淀重懸在 水中。獲得的包涵體儲存在一2CTC中備用。包涵體在室溫按照1: 5比 例用50 mM Tris/HCI， 10 M尿素，50 mM DTT， pH 7.3的溶液稀釋。 離心去除不溶成分。得到濃度約15 mg/ml的多肽。多肽溶液用50 mM Tris/HCI， 100mMNaCI， 4M尿素，pH7.3的溶液稀釋，使其濃度 為2 mg/ml。
1.1.8融合多肽結合色譜柱
0.5 ml多肽溶液上樣于Fractogel- DADPA-SA-VSFIWYK (0.5 x 5cm)基質，該基質上不同肽的制備和耦聯按照1.1.2和1.1.3中的描述 進行。柱子用50mMTris/HCI， 100mMNaCI， 4M尿素，pH 7.3的 溶液平衡，應用50 cm/h的線性流速。樣品注入之后，流速增加到150 cm/h。
1.1.9未結合污染物的洗滌
未結合的組分用5倍柱體積的平衡緩沖液洗滌。然后用4.5柱體 積的再折疊緩沖液(0.5 M Tris/HCI,， 2 mM EDTA， 3 % glycerol, 5 mMDTT， pH7.3)進行洗滌。
1.1.10再折疊、切割和洗脫
從離液序列高的條件改變為cosmotropic條件之后，停止流動， 使融合多肽在色譜樹脂上再折疊25小時。用有活性的自我蛋白酶切割 C端融合的GFPmut3.1。再用再折疊緩沖液以50cm/h的低速洗脫， 得到純化的有天然的GFPmut3.1，并用熒光測定和SDS-PAGE鑒定。
1.1.11再生
用0.1 M NaOH以50cm/h的低速再生色譜樹脂。
實施例2—親和基質的制備
2.1通過耦聯C端賴氨酸一碘乙酸酐衍生物與帶有巰基的基質來 制備肽親和基質。
300mg的N乙酰肽Ac-AFYRWYAK溶解在3ml含65u I 二異丙 基胺的二甲基甲酰胺(DMF)中。溶液在冰上冷卻。然后，將130mg的 碘乙酸酐溶解在1.5 ml DMF中并且加入至肽溶液中。1分鐘后，加入 1ml蟻酸終止反應。然后用水稀釋溶液使DMF的終濃度為30。X。然 后溶液通過前述的準備好的RP-HPLC純化。 一部分凍干并用質譜分 析。如上所述制備10g的Fractogel-DADPA。隨后用PBS緩沖液洗滌 膠3次。然后將膠與溶解在PBS緩沖液終的10 mg/ml imminothiolan (IT)反應2小時。250 mg肽碘乙酸衍生物溶解在15 ml 20 mM MES (pH 6.0 ，含30% DMF)緩沖液中。然后將該溶液與膠反應3小 時。耦聯產量用RP-HPLC分析耦聯前后的樣品來確定。膠上剩余的 巰基用1 mg/ml碘乙酸溶液作用2小時來封閉。這樣制備的基質就是 Fractogel畫DADPA-IT-AFYRWYAK。
2.2帶有多聚賴氨酸和色氨酸的配體的親和基質制備
用pH 11.0并含有150 mM氯化鈉和10 mM三乙胺的20mM碳 酸鈉耦聯緩沖液洗滌10 g Fractogel epoxy 3次。100mg多聚(賴氨 酸，色氨酸)，按照4: 1(PolyKW, Sigma)溶解在10ml耦聯緩沖液中
并且與膠反應48小時。耦聯效率通過測定耦聯前后多聚(賴氨酸，色 氨酸)溶液在280nm處的光吸收來確定。然后膠與0.5 M乙醇胺反應 以封閉剩余的環氧基團。這樣制備的基質就是Fractogel-polyKW。
這里描述的方法可選擇用Acti- gel B i)ltraflow 4環氧基來進行。 這樣制備的基質就是Actigel-polyKW。
而且，這里描述的方法可以用環氧Sepharose6B來進行。這樣制 備的基質就是Sepha- rose-polyKW。
實施例3:親和色譜
3.1 NproEDDIE-6His包涵體提取物NproEDDIE-6His的制備
1 MELNHFEIiY KTSKQKPVGV EEPVYDTAGR PLFGNPSEVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL 60
61RDLPRKGDCR SGNHLGPVSG IYIKPGPVYY QDYTGPVYHR APLEFFDETQ E"EETTKRIGR 120
121 VTGSDGKLY HIYVEVDGEI LLKQAKRGTP RTLKWTRNTT NCPIjWVTSCS VDKLAAALEH 180
181 HHHH 185
溶解在50 mM Tris ， 100 mM NaCI ， 4 M尿素，10 mM a-monothioglycerol (MTG)， pH 7 . 3中的NproEDDIE-6His包涵體粗 提物上樣于用50 mM Tris ， 100 mM NaCI， 4 M尿素，pH7 . 3的 緩沖液以25和150 cm/h的線性流速分別洗滌并預平衡好的 Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK ( 0. 5 x 5 cm)中。應用體積為5ml， 蛋白濃度約為2 mg/ml的樣品上樣。以150 cm/h的線性流速，用5倍 柱體積的平衡緩沖液洗滌未結合組分，然后用10倍柱體積的50 mM Tris， 1 M NaCI， 8M尿素，pH 7.3的溶液在相同的流速下洗脫。 用10倍柱體積的0.2 M NaOH流過以再生柱子。宿主菌的成分用 SDS畫PAGE確定。
3.2 NproEDDIE-6His包涵體提取物的純化
溶解在50 mM Tris， 100 mM NaCI， 4 M尿素，10 mM MTG， pH 7.3溶液中的粗制NproEDDIE-6His包涵體提取物上樣于用50 mM Tris, 100mMNaCI， 4M尿素，pH 7.3的緩沖液以25禾卩150 cm/h 的線性流速分別洗滌并預平衡好的Fracto- gel-poly-KW (0.5 x 5 cm) 中。應用體積為5ml，蛋白濃度約為2 mg/ml的樣品上樣。以150 cm/h 的線性流速，用5倍柱體積的平衡緩沖液洗滌未結合組分，然后用10 倍柱體積的50 mM Tris， 1 M NaCI， 8 M尿素，pH 7.3的溶液在相 同的流速下洗脫。用10倍柱體積的0.2 M NaOH進行再生柱子。宿主 菌的成分用SDS-PAGE確定。
3.3 NproEDDIE-6His包涵體提取物的純化
從E. coli HMS 174 (DE3)細胞勻漿中獲得的帶有GFPmut3.1的 粗制NproEDDIE-6His包涵體提取物用以上描述的方法在 Fractogel-DADPA-IT-AF丫RWYAK中進行親和色譜。流過和洗脫的樣 品被收集起來并用SDS-PAGE進行靶蛋白和污染物的分析。
實施例4—檢測系統。
這個檢測系統是通過一個肽配體結合以共價鍵形式固定到膜上的 Npro-EDDIE來實現的Npro-EDDIE融合蛋白的通常檢測體系。融合蛋 白結合在包含肽的膜上，而且融合蛋白可以通過其內在特性來檢測， 例如GFP自發熒光、針對融合蛋白的抗體、融合蛋白的結合特性。 這種膜(本發明親和基質的優選實施例)特別適合結合那些在水溶液 中不溶或溶解性差并且很難檢測的蛋白質。優選尿素溶解本發明中的 蛋白質。
在這種情況下，本發明的自我蛋白酶被用到，其活性可能被連接 子、失活突變體或失活緩沖液或緩沖液成分(在需要的時候及時加入 的成分)所抑制。
固化有肽AFR*WAY (*表示20個蛋白原氨基酸中的每一個)的 膜與濃度為1 mg/ml的粗制6xHis-NproEDDIE-GFPmut3.1包涵體提 取物在50mMTris， 300 mM NaCI， 4M尿素，12.5 mM 二硫蘇糖醇 (DTT)， pH7.3的溶液中孵育1小時。5分鐘后用孵育緩沖液洗滌，條 件改變為1 M Tris， 0.25 M蔗糖，2 mM EDTA， 10 mM DTT， pH 7.3，這可以使融合GFPmut3.1再折疊。肽的GFP熒光用Typhoon 掃描器檢測(Amersham Biosciences),激發光譜為488 nm，發射光譜 為520 nm，采用了 315、 350或400 V的不同光電倍增器電壓。
實施例5—應用生物素標記抗Npro肽的檢測系統
這個檢測系統是通過將具有生物素標記的肽結合膜上的 Npro-EDDIE融合蛋白來實現的Npro-EDDIE融合蛋白的一般檢測體 系。這種檢測是通過辣根過氧化酶標記的抗生蛋白鏈菌素來進行的。
包含Npro-EDDIE和C端融合多肽的融合蛋白在大腸桿菌中的過 表達是通過直接標記Npro-EDDIE的肽來檢測的。發酵產生的大腸桿 菌細胞勻漿溶解在10 M尿素中。勻漿點樣在硝酸纖維素膜上。然后將 膜晾干并用溶解在磷酸緩沖液中的3 。/。溶菌酶封閉1小時。然后將膜 與含有10|jg/ml的生物素標記AFYRWYAK的溶液孵育1小時。再將 溶解在含1 M氯化鈉的PBS緩沖液中的辣根過氧化酶標記的抗生蛋白 鏈菌素加入并反應15分鐘，隨后用孵育緩沖液洗滌3次，接著用Super Signal West Pico化學發光檢測系統(Pierce, Rockford， IL，美國)和 Lumilmager (Boehringer, Mannheim,德國)進行檢觀(J。
實施例6—Npro突變體融合蛋白的制備 10ml
上述的從IBs中提取的融合蛋白6HisNPro-SGT-GFPmut .3.1溶
液，
上述的從IBs中提取的6HisNPro溶液，和 上述的從舊s中提取的6HisNPro-EDDIE溶液，
被上樣到
-Fractogel-DADPA-SA-VSIFEW柱子，
-Fractogel-DADPA-SA-AVSIEWY柱子，
-Fractogel-DADPA-SA畫AVSFIWY柱子,和
-Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK柱子，
每一個用50 mM Tris， 100mMNaCI， 4M尿素，pH 7.3的緩沖 液預平衡。上樣之后，用15倍柱體積平衡緩沖液洗滌柱子。用加入 500 mM NaCI的平衡緩沖液進行洗脫。在色譜中收集的組分用 SDS-PAGE檢觀"用BSA和溶菌酶作為對照蛋白質。
包涵體的制備
表達包含N端自我蛋白酶Npro和6His-tag和GFPmut3.1 (見以 上的1.1.5)的的融合蛋白的重組E. coli HMS 174 (DE3)在一個10L的 發酵罐中培養。收菌之后，菌體(濕重850 g)重懸在2500 ml的50 mM Tris， 5mMEDTA， I %Triton X-100， pH 8.0的溶液中。冷凍的懸
液的通過APV-2000高壓均質器3次(壓強值設定為800巴)以破碎 菌體。通過均質器的懸液在冰上冷卻并且再通過超聲儀進一步破碎。 將破碎后的勻漿進行低速離心(JLA 10.500， 7500 rpm， 30 min)得到包 含重組融合蛋白的包涵體。沉淀重懸在50 mM Tris， 5mM EDTA， 1% Triton X-100， pH 8.0的溶液中并離心。重復該步驟。水洗漆之后，沉 淀重懸在水中。8.9 %干重的580ml包涵體懸液儲存在一20。C備用。 用50 mM Tris， 10 M尿素，50 mM DTT， pH 7.3的緩沖液將包涵體 懸液在室溫按照1: 5稀釋。通過離心去除不溶物。獲得15mg/ml的 濃度。蛋白溶液用50 mM Tris， 100 mM NaCI， 4 M尿素，pH 7.3 的緩沖液稀釋至濃度為約2 mg/ml。
權利要求
1.包含固相的親和基質和包含連到該固相的肽鍵的親和配體，其中包含肽鍵的親和配體是選自下列配體的組a)包含式X1X2X3X4的肽，其中X1到X4是氨基酸殘基，并且至少X1到X4中的兩個是W、Y或F；b)包含式X5X6X7X8的肽，其中X5到X8是氨基酸殘基，并且至少X5到X8中的一個是W，并且至少X5到X8中的一個是E或D；且c)聚氨基酸，由R、K、E、D組成中的氨基酸單體和由Y、F、W組成的氨基酸單體組成該聚氨基酸，優選poly-KY、poly-KF、poly-KW、poly-RY、poly-RF、poly-RW、poly-EY、poly-DY、poly-EF、poly-EW、poly-DF和poly-DW，上述配體的附加條件為a)和b)的肽的氨基酸殘基數最長為35個并且c)的聚氨基酸殘基數最短為20個。
2. 根據權利要求1的親和基質，其中a)和b)的肽長度為5到12， 特別是6到8個氨基酸殘基。
3. 根據權利要求1或2的親和基質，其中該親和配體被化學修飾， 特別是被乙酰化、酯化、酰胺化、氧化、減少或提供連接子分子。
4. 根據權利要求1到3的親和基質，其中固相是選自色譜材料， 特別是基于纖維素、瓊脂糖、丙烯酰胺、聚(苯乙烯一二乙烯苯)或 乙烯乙二醇甲基丙烯酸酯共聚物、微滴定板、硝酸纖維膜、微芯片、 玻璃板、或金屬包被的支持物。
5. 根據權利要求1到4的親和基質，其親和配體選自VSDDWY、 VSEDWY、 VSIDWY、 VSYDWY、 VSVDWY、 VSWDW丫、 VS丫DW丫、 VSFDWY、 VSDEW丫、 VSEEWY、 VSIEWY、 VS丫EWY、 VSVEWY、 VSWEWY、 VSYEWY、 VSFEWY、 DDDDWY、 DDEDW丫、 DDIDWY、 DDYDWY、 DDVDWY、 DDWDWY、 DDYDWY、 DDFDWY、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSLIWY、 VSLIDW、 VSLIEW、 VSL匿、 FSLEEW、 VSDLDW、 VSDLEW、 VSYIDW、 VSYIWE、 VSIDWY、 VSIEWY、 VSIWWY、 VSIIWY、 VSYIWY、 VSV'iWY、 VSFiWY、 VSF匿、VSIFEW、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSL隨、 VSLIDW、 VSLIEW、 VSLIWE、 FSLIEW、 WSLIEW、 FSYFEW、 FSFYEW、 WSFYEW、 FS丫IEW、 WSYIEW、 AFYTWYA、 AFYRWYK、 AFYRWY、 AFYR- WYA、 AFFRWYA、 AFGRW丫A、 AFHRWYA、 AFIRWYA、 AFLRW丫A、 AFMRWYA、 AFNRW丫A、 AFPRWYA、 AFQRWYA、 AFRRWYA、 AFSRWYA、 AFTRWYA、 AFVRWYA、 AF丫RWYA、 AFYFW丫A、 AFYGW丫A、 AFYLWYA、 AFYMWYA、 AFY隨YA、 AFYPWYA、 AF丫TW丫A、 AF丫VWYA、 AFYWWYA、 AFYYWYA、 AKWFRYA、 VSR隨Y、 ASRNWYA、 ASRFWYA、 FSR隨YA、 VFR隨YA、 VWRNWYA、 VYR隨YA、 VSRAWYA、 VSRFWYA、 VSRWW丫A、 VSR丫WYA、 VSRNFYA、 VSRNYYA、 VSRNWFA、 VSRNWWA、 Ac- AFYTWYAK 、 Ac-AFYRWYKK 、 AC-AF丫RWYK 、 AC-AF丫RW丫AK 、 AC-AFFRWYAK 、 AC-AFGRW丫AK、 Ac-AFHRWYAK、 AC-AFIRW丫AK、 AC-AFLRW丫AK、AC-AFMRW丫AK AC-AFQRWYAK AC-AFTRWYAK AC-AFYFWYAK AC-AFYMWYAK AC-AF丫TWYAK AC-AFYYWYAK AC-ASRNWYAK AC-VFRNWYAK AC-VSRAWYAK AC-VSR丫WYAKAC-AFNRWYAK AC-AFRRWYAK AC-AFVRWYAK AC-AFYGW丫AK AC-AFYNW丫AK AC-AF丫VWYAK AC-AKWFR丫AK AC-ASRFWYAK AC-VWRNWYAK AC-VSRFWYAKAC-AFPRW丫AK 、AC-AFSRW丫AK 、AC-AF丫RWYAK 、AC-AFYLW丫AK 、AC畫AFYPWYAK 、AC畫AF丫WWYAK 、AC-VSR隨YK 、AC-FSRNWYAK 、AC-VYRNW丫AK 、AC-VSRWWYAK 、AC國VSRNYYAK 、 AC- YWKAK、 YKYA、、 AC-VSRNFYAK 、 AC-VSRNWFAK、 AC國VSRNWWAK、 YWKA、 Ac-YKYAK、 丫WRA、 Ac-YWRAK、 ARW丫、 Ac-ARWYK、 丫WRA和 Ac-YWRAK 。
6. 根據權利要求1到5的任何一個的親和基質，其中親和配體是 共價連接到固相上的。
7. 用于從液體起始制劑親和結合蛋白的方法，其中所述的蛋白在 離液序列高的條件下與權利要求1到6的任一項所述的親和基質接觸， 借以所述的蛋白結合到所述的基質并且從所述的液體起始制劑中分離。
8. 根據權利要求7的方法，其中結合到基質的所述的蛋白當結合 到所述的基質時被進一步處理。
9. 根據權利要求7或8的方法，其結合到基質的所述的蛋白或所 述的處理后的蛋白從基質中洗脫，優選通過應用具有較低的離液序列 高的洗脫緩沖液作為液體起始制劑。
10. 根據權利要求7到9任一項的方法，其中所述的蛋白質是異 源的重組多肽，其包含自我蛋白水解部分和由目的蛋白組成的部分， 目的蛋白部分在非離液序列高的條件下被所述的自我蛋白水解部分剪 切，特別地，其中自我水解部分是瘟病毒(NP「o)的自我蛋白酶或NP「。突 變和Np「°融合蛋白的融合蛋白在變性條件下以包涵體形式表達。
11. 根據權利要求10的方法，其中所述的自我蛋白水解部分是選自SEQ ID NO 1:GKLYHIYVCVDGCIIiLKLAKRGTPRTIjKWIRNPrNCPLWVTSC- (168 ) seq id no 2:gklyh工yvevdgei:l:lklakrgtprt:lkw工rnftncp;lwvtsc- (168) SEQ ID NO 3 -(l) me:lnhfe:l:lyktskqkpvgveepvydtagrp:lfgnpsevhpqst:lkIiPhdrgedd工ett:lrDliPRKGDCRSGNHIjGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPIjEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSD GKIiYHIYVEVDGEIIjIjKQAKRGTPRTIiKWIRNFTNCPIiWVTSC- (168), SEQ ID NO 45(1) MELNHFEIiljYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPIiFGNPSEVHPQSTiLKIiPHDRGRGDIRTTIjRGKLYHIYVEVDGEIIjIjKIiAKRGTPRTIjKWTRNTTNCPIiWVTSC- (168 ), SEQ ID NO 5:GKLYHIYVEVDGEIliKQAKRGTPRTIiKWTRNTTNCPLWVTSC- ( 168) SEQ ID NO 6:GKLYHIYVEVDGEII^KQAKRGTPRTiLKWTRNSTNCPIjWVTSC- (168) SEQ ID NO 7:gklyhiyvevdgeikl罪krgtpht:lkwtrnstncp:lwvtsc- ( 168 ) SEQ ID 8:GKIiYHIYVEVDGEIKLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPIiWVTSC- (168) and SEQ ID 9:gklyhiyvcvdgci;l:lk;lakrgtprt:lkwirnstncp:lwvtsc- ( i68).
12.根據權利要求7到10任一項的方法，其中所述的蛋白是或包 含在生理條件下具有高度聚集傾向的蛋白或蛋白部分，特別是選自以下蛋白Ap肽、微管相關蛋白朊蛋白、突觸核蛋白、微管相關蛋白、ADan肽、ABri肽、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、A(3肽、過氧化物歧化酶、 Atrophin 1、 Huntingtin、 Ataxins、雄激素受體、TATA盒結合蛋白、 lg輕鏈、血清淀粉樣蛋白A、轉甲狀腺素蛋白、轉甲狀腺素蛋白、(32 一微球蛋白、阿樸脂蛋白A-I、凝膠蛋白、前胰島淀粉樣多肽、前降鈣 素、心房利鈉因子、溶菌酶、胰島素、纖維蛋白原、其全長蛋白或特 異片段、突變體、剪接體或多聚谷氨酰胺鏈。
13. 制備異源多肽的方法，包括實施根據權利要求7的結合。
14. 根據權利要求13的方法，其中進一步包含所述的多肽的純化。
15. 親和結合目的異源肽的方法，其中所述的多肽表達為瘟病毒 自我蛋白酶Npra或其衍生物的融合多肽，并且其中所述融合多肽在離 液序列高的條件下與在這樣條件下特異結合瘟病毒自我蛋白酶Np「°或 其衍生物的肽接觸，并且其中所述的肽結合到固相上。
16. 權利要求1到6中的任一項限定的親和配體用于親和純化的 用途，特別是用于結合瘟病毒(Np「。)的自我蛋白酶NP「。或NT突變體 和N^融合蛋白。
17. 用于結合瘟病毒(Np「°)的自我蛋白酶NP「Q或NP「o突變體和 NP「。融合蛋白的親和配體，優選的配體如權利要求1 a)和b) 、2和5 中所限定的。
18. 用于結合瘟病毒(Np「°)的自我蛋白酶NP「。或NP「。突變體和 NP「。融合蛋白的親和基質，優選的是權利要求1到6的基質。
全文摘要
本申請公開了包括固相和包括耦合到固相上的肽鍵的親和配體的親和基質，其中該包括肽鍵的親和配體選自下述配體a)包含式X₁X₂X₃X₄的肽，其中X₁到X₄是氨基酸殘基，并且至少X₁到X₄中的兩個是W、Y或F；b)包含式X₅X₆X₇X₈的肽，其中X₅到X₈是氨基酸殘基，并且至少X₅到X₈中的一個是W，并且至少X₅到X₈中的一個是E或D；且c)聚氨基酸，由R、K、E、D組成中的氨基酸單體和由Y、F、W組成的氨基酸單體組成該聚氨基酸，優選poly-KY、poly-KF、poly-KW、poly-RY、poly-RF、poly-RW、poly-EY、poly-DY、poly-EF、poly-EW、poly-DF和poly-DW，上述配體的附加條件為a)和b)的肽的氨基酸殘基數最長為35個并且c)的聚氨基酸殘基數最短為20個。
文檔編號C07K17/06GK101208357SQ200680014329
公開日2008年6月25日 申請日期2006年4月25日 優先權日2005年4月26日
發明者A·榮格鮑爾, B·奧爾, C·啊赫謬勒, M·賽弗特, P·威時納, R·哈恩, W·卡爾 申請人:桑多斯股份公司;奧地利勃林格殷格翰有限公司