專利名稱：：多糖粘液形成菌的靶基因缺失的制作方法
技術領域：
：本發明涉及鞘氨醇膠多糖制備領域。特別地，其涉及用于改進制備鞘氨醇膠的菌抹的定點基因方法。
背景技術：
：鞘氨醇單胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC53159和ATCC31461產生大量的莢膜多糖。盡管在某些條件下，多糖可以由細胞釋放[5,6]，但在具有豐富碳源的生長過程中(如發酵)，多糖牢固附著于細胞表面。提高丟坦糖膠(diutan)和吉蘭糖膠(gellan)發酵產率的嘗試受到莢膜性質的多糖的限制，所述莢膜性質的多糖可以破壞營養素的吸收。另外，如果用于多糖的生物合成的位點數量有限，就會有由各細胞能產生多糖的最大量。已經觀察到多糖吉蘭糖膠與細胞凝集有關，這是由于不產生任何多糖的突變體在懸浮液中均勻地生長[3]。這些細胞凝集塊可以干擾多種技術，例如通過光密度測定細胞數量，細胞的離心(例如用于分離DNA或蛋白質)，以及用于多糖純化的細胞分離或裂解。先前尚未確定與鞘氨醇單胞菌中多糖附著于細胞表面有關的附著機制和基因。已經分離了以粘液形式產生多糖的鞘氨醇單胞菌菌林ATCC31461、ATCC31555、ATCC31554和ATCC21423的誘導突變體，但是未確定突變基因，且未公開誘導和篩選突變體的方法[IO]。已經分離了用于吉蘭糖膠[3，8]、丟坦糖膠[l]和鞘氨醇膠S-88[9]生物合成的基因。許多這些基因的功能通過生物化學試驗給出或者通過與數據庫例如GenBank中的已知功能的基因的同源性給出。例如，已經鑒定了與四糖重復單元[7,8]的裝配和前體dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有關的基因。預期僅影響多糖附著于細胞表面的基因仍具有產生多糖的表型(即固體培養基和粘性發酵液上的粘液樣菌落)。除了不在基因簇中的用于吉蘭糖膠合成的四種基因外，還描述了if爭越21kb的18種用于吉蘭糖膠生物合成的基因的基因簇。HardingN.E.，Y.N.Patel,andR.Coleman,2004。伊樂藻鞘氨醇單胞菌ATCC31461中具有吉蘭糖膠多糖生物合成所需的基因的結構。JIndMicrobiolBiotech31:70-82，參考文獻3。其DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號AY217008)。基因簇中的基因有gelM、gelN以及gell。構建了大多數相鄰基因gelM和gelN的缺失。通過插入滅活gell基因。gelM-gelN缺失抹和gell突變株顯示產生數量有所減少的吉蘭糖膠和更具流動性的發酵液，且顯示所產生的吉蘭糖膠具有與野生株的吉蘭糖膠相同的組成。多糖至細胞的附著未有報道。伊樂藻鞘氨醇單胞菌的geR、gelS及gelG基因似乎以與S-88sps基因簇中相同的順序存在于操縱子中，但不鄰近18個基因的基因蔟中的基因(參考文獻3)。GelR蛋白較其S-88同源物稍小(659和670個氨基酸相比)，具有49%的同源性，且與表層蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及geiG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號AY220099)。該報道中未構建gelR的突變(參考文獻3)。Yamazaki等報道在基因spsR中具有突變的菌抹仍為粘液樣，表明它們產生多糖，但多糖不具有流變學或附著于細胞的特征([9]和T.J.Pollock等，DNAsegmentsandmethodsforincreasingpolysaccharideproduction.U.S.PatentNo.5,854,034)。Yamazaki描述了四種鞘氨醇單胞菌菌抹的典型突變體，其產生作為粘液而非附著于細胞的多糖。美國專利第6,605,461號。Yamazaki未描述如何篩選粘液表型的誘變培養物。Yamazaki未鑒定出哪個基因或哪些基因被誘變。Sa-Correia綜述了關于吉蘭糖膠合成的基因的分離的工作。Sa-CorreiaI.,A.M.Fialho,P.Videira，L.M.Moreira,A.R.MarquesandH.Albano。GellangumbiosynthesisinSphingomonaspaucimobilisATCC31461:Genes,enzymesandexopolysaccharideproductionengineering.JIndMicrobiolBiotechnol.29:170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分測序，包括urf32和urf26—上述的參考文獻3的gelM和gelN)。這些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank(GenBank登錄號AY242074)。這些基因的功能未有l艮道。在GenBank遞交中，僅分別將基因urfi2和urf26指定為推定的膜蛋白和推定的運輸蛋白。未存放gell或gdR的序列。Coleman描述了用于丟坦糖膠生物合成的基因的分離和某些基因功能的研咒。R.Coleman,2001,CloningandanalysisofSphingomonassp.ATCC53159polysaccharidegenes.Master'sThesis,SanDiegoStateUniversity。4苗述了dpsM和dpsN基因(由Coleman命名為orf3和orf4)，但未指明功能。描述了來自鞘氨醇單胞菌菌抹ATCC31554的用于S-88多糖的生物合成的基因蔟。YamazakiM.,L.Thome,M.Mikolajczak，R.W.Armentrout和T.J.Pollock.1996.LinkageofgenesessentialforsynthesisofapolysaccharidecapsuleinSphingomonasstrainS88.JBacteriol178:2676-2687和美國專利第5,854,034號。未描述基因urG2和urf26的功能(dpsM、gelM和dpsN、gelN的同源物)和spsl(gell、dpsl的同源物)。將spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述為編碼與細菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登錄號U51197)。本領域仍需要改進制備工業上實用的鞘氨醇膠的方法和改進鞘氨醇月交的性質。
發明內容根據本發明的一個實施方案，提供了一種制備細菌的方法。所述細菌是鞘氨醇單胞菌屬，并含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M、N、I或R基因的一種或多種基因的突變。在某些出版物中(例如參考文獻8和9),所述基因M和N還分別稱為urf2、urf26基因(未知的閱讀框)。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段。所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N或I或R的全部或部分。誘導所述片段中的片段以形成突變的片段。將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌。所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細菌的子代，其中突變的片段整合入所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換的野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂藻菌(伊樂藻菌)或者不是伊樂藻菌。根據本發明另一個實施方案，提供了制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的另一種方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇多糖生物合成基因簇的基因M、N、I和R的一種或多種基因的突變。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA的兩個非連續片段。所述片段側鄰或包括鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N。相似地，可分離側鄰基因I或R的片段。將所述兩個非連續片段連接在一起。將所述連接的非連續片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌。所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細菌的子代，其中所述連接的片段整合入所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂藻菌或者不是伊樂藻菌。根據本發明又一個實施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有吉蘭糖膠多糖，所述吉蘭糖膠多糖賦予改進的流變學性質，包括凝膠強度。根據本發明又一個實施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予液體較由ATCC53159菌株產生的等重的丟坦糖膠增加的粘度。根據本發明又一個實施方案，提供了分離和純化的鞘氨醇單胞菌屬的細菌。所述細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M、N、I或R的一種或多種基因的突變。所述細菌可以在適于產生鞘氨醇膠多糖的條件下于培養基中培養而在所述培養基中產生鞘氨醇膠多糖。所述細菌的13培養物發酵液可以直接或在使用乙醇沉淀之后用作增粘劑或膠凝劑。可選地，所述培養物發酵液可進行下述步驟在其用作增粘劑或膠凝劑之前從所述培養物發酵液去除細菌或從所述發酵液回收。所述鞘氨醇單胞菌可以是伊樂藻菌或者不是伊樂藻菌。一經閱讀該說明書，對本領域技術人員來說顯而易見的這些和其他實施方案提供了本領域用于制備增粘劑和膠凝劑的新的方法、菌株以及組合物。附圖簡述圖1.鞘氨醇單胞菌菌林ATCC31554、ATCC31461和ATCC53159中多糖生物合成的基因簇的比較。圖2.S60WTCgelM-gelN突變體的粘液形成特征。圖3.S60WTCgelN和gell突變體的粘液形成特征。圖4.dpsN的缺失位點的DNA序列(SEQIDNO:19),和融合肽的氨基酸序列(SEQIDNO:20)。圖5A-5C.dpsN突變體的粘液形成特征。圖6A-6B.dpsM突變體的粘液形成特征。具體實施例方式在兩種鞘氨醇單胞菌菌抹中，已經鑒定了控制多糖附著于細菌細胞的的基因。gelM(dpsM)和gelN(dpsN)任一者或二者的缺失或gell的失活導致多糖作為粘液釋放至培養基中而非作為莢膜多糖附著于細胞表面。粘液型多糖的形成使得細菌培養物易于處理，改進了在發酵過程中的混合，可以增加產量，且在某些情況下，改進多糖的流變學性質。定點誘變基于多種原因較隨機誘變用于篩選粘液形成突變體更有利，所述多種原因包括速度和無關突變的避免。發現基因gelR的失活可以改進粘液形式的膠凝多糖的流變學性質(凝膠強度)。14可以對任何鞘氨醇單胞菌菌抹中的dpsM、dpsN、gelM、gelN和geil的直向同源物進行滅活以獲得粘液形成表型。可以對gelR的直向同源物進行滅活以防止多糖降解，從而導致改進的流變學性質。合適的鞘氨醇單胞菌包括但不限于產生鼠李糖膠(rhamsan,ATCC31961)、韋蘭糖膠(welan，ATCC31555)、吉蘭糖膠(ATCC31461)和丟坦糖膠(ATCC53159)的那些菌抹，以及產生多糖的菌抹S7(ATCC21423)、S88(ATCC31554)、S198(ATCC31853)和NW11(ATCC53272)。ATCC號指美國典型培養物收藏所(AmericanTypeCultureCollection)的菌才朱的存》文號。這些細菌通過^f尹樂藻菌ATCC31461和鞘氨醇單胞菌ATCC53159來舉例說明，但也可以使用其他菌抹。可使用的合適的鞘氨醇單胞菌包括adhaesiva鞘氨醇單胞菌,aerolata鞘氨醇單胞菌，alaskensis鞘氨醇單胞菌，aquatilis鞘氨醇單胞菌，aromaticivorans鞘氨醇單胞菌，asaccharolytica鞘氨醇單胞菌，aurantiaca鞘氨醇單胞菌，莢膜鞘氨醇單胞菌，chlorophenolica鞘氨醇單胞菌，chungbukensis鞘氨醇單胞菌，下水道鞘氨醇單胞菌，海膽鞘氨醇單胞菌，伊樂藻鞘氨醇單胞菌，faeni鞘氨醇單胞菌，herbicidovorans鞘氨醇單胞菌,koreensis鞘氨醇單胞菌，macrogoltabidus鞘氨醇單胞菌，mali鞘氨醇單胞菌,melonis鞘氨醇單胞菌，游泳池鞘氨醇單胞菌，parapaucimobilis鞘氨醇單胞菌，paucimobilis鞘氨醇單胞菌，pituitosa鞘氨醇單胞菌，櫻桃鞘氨醇單胞菌,玫瑰鞘氨醇單胞菌，sanguinis鞘氨醇單胞菌，鞘氨醇單胞菌，stygda鞘氨醇單胞菌，subarctica鞘氨醇單胞菌，suberifaciens鞘氨醇單胞菌，地下鞘氨醇單胞菌，taejonensis鞘氨醇單胞菌，terrae鞘氨醇單胞菌，trueperi鞘氨醇單胞菌，ursincola鞘氨醇單胞菌，wittichii鞘氨醇單胞菌，xenophaga鞘氨醇單胞菌，yabuuchiae鞘氨醇單胞菌，以及矢野鞘氨醇單胞菌。可根據基因定位和鞘氨醇膠生物合成基因簇中的結構、根據總的同源性和/或根據結構域同源性鑒定直向同源物。通常，與dpsM、dpsN、gelM、gelN、gelI或gelR基因之一的總的同源性的水平將大于44%,常大于55%、66%、77%、88%或98%。直向同源物理想地與這四種基因的至少之一具有大于80%的同源性。定點誘變可用于在所需的已知靶基因或基因組區產生突變。這消除了隨機誘導的誘變或自發誘變的試驗與誤差。缺失的形成確保了突變將不會15復原，例如可能在點(替代)突變和插入突變中可見的。缺失也具有不應用外源性DNA的益處，例如藥物抗性標記或其他環境不需要的標記。基因組DNA的分離片段是不連接在正常情況下與其結合的基因組DNA的DNA,其含有鞘氨醇膠生物合成基因蔟的M和/或N、I或R或側鄰的DNA。作為非限制性實施例，所分離的DNA可通過由天然來源純化、通過合成或通過擴增來獲得。所分離的DNA通常位于體外的DNA片段上，但是所分離的DNA還可以位于載體上，例如質粒或轉導噬菌體，其含有鞘氨醇單胞菌基因組的所需部分。側鄰的DNA通常來自緊鄰M和/或N、I或R的約500bp基因或約l-2kb基因內的基因組區。本領域任何已知的方法可用于將突變引入所分離的片段，所述片段含有鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N、I或R的全部或部分。例如，可使用限制性內切酶和再連接非連續的核苷酸而引入缺失。可通過擴增和連接基因的兩個非連續片段或側鄰靶基因的DNA的兩個非連續片^:來形成缺失。可以使用核酸內切酶消化和連接在所分離的片段中產生插入。化學誘變可用于基因組DNA的分離片段。可選擇任何誘變方法并根據具體情況而使用。在誘導突變之后，基因組DNA的片段可再導入受者細菌。通常情況下，但不是一定，受者將是與片段的供者相同的物種。可使用本領域已知的任何方法用于將外源性DNA導入細菌。合適的方法包括但不限于電穿孔、接合、原生質體形成、氯化鈣沉淀和轉化、脂質體和病毒轉導。可根據具體情況選擇和使用任何核酸導入方法。如果導入受者細菌中的突變基因組DNA片段不具有復制自身的途徑，那么它必須在受者細菌中整合入復制子以得到維護。通常，這種整合事件將整合整個攝入的質粒。可以檢測導入的DNA上的標記，以鑒定所述DNA已經整合。為了檢測整合的實現，可以篩選或選擇所導入的DNA上的標記的喪失。實現該目的的合適的標記為本領域已知，JU壬何標記可用作此處的指示物。為了確定其中所導入的鞘氨醇膠基因取代了受者的野生型基因的分離才朱，可通過例如PCR測定DNA的大小或序列。如下文所證明的，通過鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N產生粘液形式的鞘氨醇膠，突變體可以較附著于細菌細胞上的形式具有改進的流變學性質。所述改進的流變學性質通過相同重量的材料提供更具粘力的能力而得到反映。所述改進可以是輕度的，例如至少5%、10%、15%、20%或25%，或其可為更顯著的，相對于由形成莢膜的親代產生的鞘氨醇膠改進至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。流變學性質可使用本領域已知的任何技術測定。合適的技術包括但不限于自來水溶液中的低切變率粘度(LowShearRateViscosity,LSRV),和高鹽溶液中的海水粘度(SeaWaterViscosity,SWV)。由例如gelN突變體產生的粘液形式的吉蘭糖膠和推定的裂解酶基因gelR的突變相結合導致高凝膠強度的吉蘭糖膠的形成。凝膠強度通常大于1000,而莢膜菌抹通常產生凝膠強度為600至900但小于1000的吉蘭糖膠。根據本發明的純化細菌是已經被微生物學純化的細菌，例如使用液體稀釋技術或于固體培養基上劃線以形成單菌落。微生物學領域已知的標準技術可用于該目的。根據本發明的突變體可使用用于親代菌抹相同或相似的技術來培養和增殖。所述突變體的液體培養物性質可以得到改進，允許增加通風和混合。所述突變體的培養物發酵液也可以提供較附著形式的多糖具有較高效的回收。另外，所述突變體還可以提供較附著形式的多糖具有改進的澄明度的產物。細菌可任選通過過濾、離心或通過沉降從所述突變體產生的多糖去除。所述培養物發酵液可根據需要在去除細菌之前或之后被化學、酶或溫度(熱或冷)處理。涉及吉蘭糖膠附著于細胞表面的伊樂藻菌ATCC31461的基因為gelM和gelN(圖1,SEQIDNO:13)和gell(圖1,SEQIDNO:25)。已經構建了具有大部分基因gelM和gelN缺失從而產生粘液形成表型的菌抹。已經構建了gelN特定缺失，并構建了基因gell的插入。這兩種突變均產生了粘液形成表型。在SEQIDNO:13中，gelM和gelN的編碼序列分別位于核苷酸501-1382和1366-2064。在SEQIDNO:25中,gell的編碼序列分別位于核苦酸501-1403。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:26。發現基因gelR的缺失導致粘液形式的吉蘭糖膠的凝膠強度改進。在SEQIDNO:27中，gelR的編碼序列分別位于核苷酸478-2457。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:28。涉及丟坦糖膠附著于細胞表面的鞘氨醇單胞菌ATCC53159的基因為dpsM和dpsN(圖1，SEQIDNO:14)，并根據與gell的同源性推測dpsl。已經構建了dpsM和dpsN的各基因的缺失，兩者均產生了粘液形成表型。在SEQIDNO:14中，dpsM和dpsN的編碼序列分別位于核苷酸456-1337和1321-2019。編碼的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:8和17。對于本領域技術人員來說顯而易見的是，用于吉蘭糖膠合成的相同或相似的方法也可以用于丟坦糖膠合成。基因dpsl和dpsR的這種突變可容易構建。在SEQIDNO:29中，dpsl的編碼序列分別位于核香酸501-1472。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:30。在SEQIDNO:31中，dpsR的編碼序列分別位于501-2498。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO.32。上述公開內容大體上描述了本發明。本文所公開的所有參考文獻明確地通過引用并入。通過參考本文提供的下述具體實施例，可以獲得更完整的理解，所述實施例僅用于說明目的，不意于限制本發明的范圍。實施例1——吉蘭糖膠粘液形成突變體的制備對于伊樂藻鞘氨醇單胞菌的突變體的構建，使用了名為S60wtc1的ATCC31461的衍生物，其具有改進的DNA攝取。該菌株可容易地由本領域技術人員制備。PCR擴增用于擴增側鄰基因gelM-gelN的區域。見參考文獻3。通過雙交換同源性重組，將擴增的片段克隆至pL02載體中并通過接合導入S60wtc中以置換具有缺失的基因組上的基因gelM和gelN。載體pL02不在S60wtc中復制，所以對于卡那霉素抗性的最初選沖奪選擇了其中質粒通過同源重組整合入染色體的那些菌落。所述載體還含有基因sacB。該基因賦予了對蔗糖的敏感性。這種對蔗糖的選擇性可用于篩選喪失質粒的分離林并保留缺失或野生型基因的一個拷貝。('伊樂藻菌ATCC31461具有低的DNA攝取效率，特別是大質粒(約10)。分離具有增加的DNA攝取效率的ATCC31461的自發突變體。懷疑這些少數的細胞為成功的質粒受者，例如廣泛宿主范圍的質粒pLAFR3，表現受者群體具有增加的攝取該質粒DNA能力的突變。為了使得質粒喪失，在非選項性條件下增殖三種含有pLAFR3的轉接合子(即無四環素抗生素)，連續傳代約30代。檢測了三種獨立的質粒處理的菌抹(即來自每一起始轉接合子的四環素敏感性衍生物)，所有三種顯示的增加的接合率(4.2XIO"3、0.6X10"以及1.5X10"2)，表現與野生型菌林相比具有105倍的增加。該增加的"l妄合率是穩定的且可再生的。這些菌4朱之一被命名為S60wtc。見參考文獻3。)使用提供轉移功能的pRK2013,并使用于YM-Sm(25ug/ml)-Km(7.5ug/ml)培養基上選擇的轉接合子，通過三親代偶配將含有gelM-gelN缺失區域的質粒導入S60wtc。鏈霉素防止大腸桿菌菌林的生長。分離卡那霉素抗性質粒整合體。蔗糖敏感性用于選擇消除載體的第二重組事件。在非選擇性條件下，即無抗生素，將五個分離抹傳代兩次。然后將整分等份鋪于含有8%蔗糖的培養基上。分離蔗糖抗性菌落，并檢測卡那霉素敏感性。分離基因組DNA，并使用PCR測定哪些Kms分離抹保留了缺失。對于缺失的預期大小的擴增片段由四種菌林的基因組DNA產生。于YM培養基上純化這四種缺失菌抹。四種菌抹均顯示比野生型粘性較小、較軟、較平坦且黃色較深。實施例2-gelM-gelN缺失菌抹的特征在搖瓶發酵中評價gelM-gelN缺失分離抹。與較堅固、粘度較大的S60wtc發酵液相比，AgelM-gelN培養物發酵液為液體且光滑。與S60wtc纖維相比，由突變菌4朱使用異丙醇沉淀產生較長、較厚的纖維。然而，缺失突變體的全部可沉淀物質的產量減少22%,且僅產生30%的野生型的發酵液粘度。所產生的吉蘭糖膠具有正常的糖、甘油和乙酰基取代基組成。使用幾種技術評價突變體的粘液形成特征，包括顯孩t鏡評價、細胞凝集、細胞沉淀物形成以及熱沉降試驗，如圖2所示。熱沉降試驗包括在高壓滅菌器中加熱吉蘭糖膠發酵液10分鐘以熔化吉蘭糖膠，然后將熱發酵液轉移至大試管中并在95。C過夜培養(以維持發酵液為液體)。對于莢膜菌林，細胞附著多糖并保持懸浮。對于粘液形成19菌，細胞未附著多糖并在過夜培養過程中沉降。通過該試^r顯示gelM-gdN缺失菌抹為粘液形成菌抹。對于離心試驗，在含有1%葡萄糖的DM2培養基中過夜培養菌抹并在Eppendorf離心機中以最大速度進行離心。基因gelM-N的失活導致細胞表面多糖的附著完全喪失，使得細胞可通過離心而沉淀。通過顯孩t鏡評^介，大部分S60wtcAgelM-N細胞游離并具有動力，而S60wtc處于樹膠基質中。在細胞培養物中，S60wtcAgelM-N細胞在懸浮液中生長，而S60wtc細胞形成凝塊。實施例3~~吉蘭糖膠粘液形成突變體的構建構建了gelN的缺失用于吉蘭糖膠生物合成。將PCR引物設計成擴增gelN基因的上游DNA片段(500bp)和下游DNA片段(401bp)[3]。使用的引物示于表1中。表l.用于構建gdN缺失突變體的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>引物Sacl-GelN引物1和XbaI-GelN引物2用于將基因gelM的500bp片段擴增為Sacl-Xbal片段(共516bp)。引物XbaI-GelN引物3和SphI-GelN引物4用于將atrD基因的40]bp片段擴增為Xbal-Sphl片段(共418bp)。由于gelM基因的末端與gelN基因重疊了17bp,保留了gelM的終止密碼子和gelN的起始密碼子，以及gelN的天然終止密碼子。將PCR片段順序連接于質粒載體pL02的多酶切點的接頭(polylinker)[4]，產生帶有gelN缺失的克隆pL02-gelNdeln糾。然后，通過接合和同源重組將質粒pL02-gelNdeln#l用于將缺失轉移至菌林S60wtc氣S60wtc菌林是作為自發突變體衍生自ATCC31461的菌抹，攝取質粒DNA的能力增加[2]。通過卡那霉素抗性選擇染色體整合體。隨后在無抗生素的情況下培養大約30代使得除去質粒。然后，由于編碼質粒的基因sacB喪失，通過蔗糖(8%)耐性篩選喪失質粒的重組子，然后篩選菌落的卡那霉素敏感性。sacB基因編碼用于由蔗糖合成果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果聚糖對細胞具有毒性。喪失基因sacB的細胞可以在蔗糖條件下生長。耐受蔗糖的分離抹可為野生型或缺失。由幾個分離抹制備基因組DNA,以鑒定較野生型基因而保留gelN缺失的那些分離抹，如通過PCR測定。與野生型gelN+分離抹的硬菌落相比，具有gelN缺失的分離株具有較軟和較稀薄的菌落。實施例4——gelN缺失突變體的特征GelN缺失突變體具有與gelM-gelN缺失突變體相似的性質。通過離心可容易地沉淀細胞。在細胞培養物中，gelN缺失突變體在懸浮液中生長，而野生型細胞形成凝塊。因此，基因gelN的失活可導致粘液表型，如圖3所示。在搖瓶發酵中，評價gelN缺失突變體的五種單個的分離抹。gelN突變體的平均產量(全部可沉淀物質，TPM，1.10g/100ml)與S60wtc對照的平均產量(1.08g/100ml)具有可比性。在20LApplikon發酵罐中使用含有有機氮和無機氮、鹽和玉米糖漿的培養基評價gelN突變體。使用異丙醇沉淀吉蘭糖膠多糖，并干燥和稱重。突變體的全部可沉淀物質的平均產量為野生型對照的平均產量的94%，然而，發酵液粘度減少約40%。發酵液粘度的這一減少促進了發酵罐中的混合。表2.gelN突變體的發酵特征<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在BrookfieldLVF粘度計中^f吏用4號轉子在60rpm下測量粘度。實施例5——產生具有改進質量的吉蘭糖膠粘液的突變體的構建吉蘭糖膠的粘液突變體具有較低的發酵液粘度，如實施例4所述，這促進發酵罐中的混合。膠凝多糖在加熱和冷卻之后形成凝膠，吉蘭糖膠由于其獨特的結構和流變學性質而用于多種食品用途中。因此，評價了由粘液突變體產生的吉蘭糖膠的凝膠強度。使用柱塞破壞或破裂所制備的凝膠表面來測定凝膠強度。(2見腳注1關于攝取DNA能力增加的的突變體的用途。)將吉蘭糖膠發酵液調整至pH4.6(防止去乙酰化)并通過加熱至約100。C持續幾分鐘來滅菌。通過添加三倍體積的異丙醇沉淀吉蘭糖膠產物，并在6(TC下干燥纖維2小時并研磨。通過在去皮重的600ml不銹鋼燒杯中添加2ml0.3MCaCl2.2H20原溶液至295ml去離子水來制備鉤溶液。在700rpm下攪拌溶液的同時，添加3.0g吉蘭糖膠產物并使得分散1至2分鐘。將燒杯置于預熱的94-95。C水浴中，覆蓋并加熱15分鐘，然后攪拌3分鐘。使用加熱的去離子水將溶液重量調整至300g,混合并然后在94-95。C下放置4分鐘。將溶液轉移至六個環形模(ringmolds)(0.5英寸高，1.375英寸外徑,0.125英寸壁厚)，并使用塑料蓋板覆蓋并使得在室溫(20-21°C)下冷卻20至24小時。從模子中取出圓盤，將其放置于有機玻璃盤上。在TA-TX2TextureAnalyzer中使用Kobe柱塞(TA-19)以1.0mm/s測定凝膠強度或斷裂的力(以g/cn^記錄)。粘液突變體的吉蘭糖膠較野生型莢膜菌株的吉蘭糖膠具有較低的凝膠強度，如表4所示。該結果與產生粘液形式的丟坦糖膠的ATCC53159突變體相比，具有改進的流變學性質特征，如實施例11所述。認為粘液形式的吉蘭糖膠可被伊樂藻菌產生的吉蘭糖膠裂解酶降解。因此，構建了具有基因gelR缺失的菌株，其產生與降解多糖的蛋白質如裂解酶具有同源22性的蛋白質。在伊樂藻菌菌抹S60wtc和GBAD-l菌抹中構建了gelR缺失(美國專利申請第20060003051號[11])。將PCR引物設計成擴增基因gelR的上游DNA片段(502bp)和下游DNA片段(435bp)。所使用的PCR引物示于表3。表3.構建gelR缺失的引物引物序列目的Sacl-GelR引物15'ACGAGCTC-AGATCAGCCGCAACCTCCT3'(SEQIDNO:21)擴增gelR的上游486bpXbaI國GelR引物25'GCTCTAGA-CGCCGGCATGTTAATCACC3'(SEQIDNO:22)XbaI-GelR引物35'GCTCTAGA-GATGCGTTCCACGCCTGAC3'(SEQIDNO:23)擴增gelR的下游419bpSphI-GelR引物45'ATGCATGC-CGATCGCGCTCATCAGGGT3'(SEQIDNO:24)引物Sacl-GelR引物1和XbaI-GelR引物2用于將gelR的498bp上游片段擴增為Sacl-Xbal片段(共502bp)。引物XbaI-GelR引物3和SphI-GelR引物4用于將gelR的419bp下游片段擴增為Xbal-SphI片段(共435bp)。使用限制性酶消化PCR片段并將其順序地連接于質粒載體pL02的多酶切點的接頭[4]，產生帶有gelR缺失的克隆pL02-gelRdeletn#4。通過使用提供轉移功能的輔助質粒pRK2013,由大腸桿菌DH5a接合，將不能在鞘氨醇單胞菌中復制的質粒pL02-gelRdeletn斜轉移至伊樂藻菌菌抹S60wtc和GBAD-1[2]。于含有卡那霉素和鏈霉素的YM培養基上通過卡那霉素抗性篩選染色體整合體(反向選擇大腸桿菌)。隨后在無抗生素的情況下培養鞘氨醇單胞菌整合體大約30代，使得去除質粒。由于喪失編碼基因sacB的質粒，通過蔗糖耐性篩選已喪失質粒的重組子，篩選菌23落的卡那霉素敏感性。PCR用于檢測哪些分離抹保留了gdR缺失。然后將gelN缺失轉移至GBAD-1菌林的gelR缺失突變體，如上實施例3所述。質粒pL02-gelNdeln#l用于通過接合和同源性重組將gelN缺失轉移至GBADgelR。通過于含有Km(20ug/ml)和Sm(25ug/ml)的YM瓊脂上篩選染色體整合體的卡那霉素抗性。隨后在無抗生素的情況下培養使得去除質粒。由于喪失編碼基因sacB的質粒，通過蔗糖耐性篩選已喪失質粒的重組子，然后篩選這些菌落的卡那霉素^:感性。gelR缺失突變體較野生型菌株表現有不同的菌落形態。gelR缺失菌林與具有透明邊緣的S60wtc或GBAD-1的gelR+的較光滑的樹膠狀菌落相比具有較小的粗糙樹膠狀菌落。gelN-gelR缺失突變體具有與gelN粘液突變體相似的菌落形態。實施例6-gelN-gelR突變體的特征在20LApplikon發酵罐中使用含有有機氮和無機氮、鹽和玉米糖漿的培養基評價這些菌抹。使用異丙醇沉淀吉蘭糖膠多糖，干燥并稱重。通過實施例5中所述的方法測定凝膠強度。GBAD-lgelNgelR菌株產生的吉蘭糖膠的凝膠強度較gelN粘液突變體或野生型莢膜菌抹產生的吉蘭糖膠的凝膠強度高。表4.突變體的吉蘭糖膠的流變學性質菌抹表型n=野生型的發酵液粘度的平均值平均凝膠強度平均TPM%cPS60wtc莢膜3-7292411GBAD1莢膜1914600629GelN突變體粘液7932900132GBADlgelRgelN粘液39650831447實施例7——gell突變體的構建構建了基因gell的插入突變。將PCR引物設計成擴增基因gell的插入片段(見參考文獻3)。將擴增的片段克隆至pL02質粒載體并通過接合導入S60wtc,在YM-Sm(25ug/ml)—Km(7.5ug/ml)培養基上篩選。篩選那些轉接合子的卡那霉素抗性，所述轉接合子具有通過同源重組而插入基因gell從而使該基因失活的質粒。gell突變體具有改變的菌落形態，與gelM-gelN和gelN缺失菌抹的菌落形態相似，即粘性但較軟的菌落。實施例8-gell突變體菌抹的特征在搖瓶發酵中評價gell突變體。所述突變體與野生型菌抹相比具有粘性較小的發酵液，且全部的可沉淀物質的產量減少約20%。所產生的吉蘭糖膠具有正常的糖、甘油和乙酰基取代基組成(參考文獻3)。使用幾種技術評價gell突變體的粘液形成特征，包括上述的顯微鏡評價、細胞凝集、細胞沉淀形成以及熱沉降試驗。gell插入突變體具有與gelM-gelN和gelN缺失突變體相似的特征。顯微鏡評價顯示細胞游離并且有動力。在細胞培養物中，gell突變體在懸浮液而非凝塊中生長。通過離心，細胞容易從DM2培養基沉淀。在熱沉降試驗中細胞也很好地沉降。因此，基因gell的突變也產生了粘液表型，如圖3所示。實施例9-l:坦糖膠粘液形成突變體的制備鞘氨醇單胞菌ATCC53159(S-657)產生具有與吉蘭糖膠相似的結構的多糖(丟坦糖膠)(即其具有葡萄糖-葡萄糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖重復單位)，但具有附著于一個葡萄糖殘基的兩個鼠李糖殘基的側鏈。丟坦糖膠具有兩個乙酰基取代基，并缺少甘油基團。丟坦糖膠可用作油田和水泥應用中的增粘劑。鞘氨醇單胞菌菌株產生作為莢膜牢固附著于細胞表面的多糖。附著的確切機制尚屬未知。莢膜可通過破壞氧攝取而限制繁殖力。多糖的功能可通過其附著于細胞而非游離于溶液中而受阻礙。菌林構建構建了鞘氨醇單胞菌ATCC53159的相應基因dpsM和dpsN的缺失，其產生丟坦糖膠(S-657)。獨立地使各基因缺失，并測定對莢膜至粘液的影響。簡言之，PCR用于擴增側鄰靶基因DNA的同源的兩個片段。將這些片段克隆至窄宿主范圍的質粒pL02,所述質粒pL02不能在鞘氨醇單胞菌中復制并含有兩個選擇性標記kanR和sacB。對于其中質粒已整合入染色體中的一個同源性區域的細胞進行卡那霉素抗性篩選。然后在非選擇性條件下，培養卡那霉素抗性菌抹，使得通過二次重組喪失質粒。通過對蔗糖的耐性篩選質粒的喪失。sacB基因編碼用于由蔗糖合成果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果聚糖對細胞具有毒性。喪失基因sacB的細胞可以在蔗糖的條件下生長。耐受蔗糖的分離抹可為野生型或缺失。通過PCR確認缺失的存在。檢測突變體的粘液或莢膜產生。在最終的菌林中無外源性DNA、質粒或抗生素抗性基因。dpsN和dpsM缺失菌株的詳細構建使用與所述的伊樂藻菌缺失突變體相似的基因置換策略，在質粒上構建dpsM和dpsN的缺失并將其轉移至ATCC53159的基因組[3]。PCR用于擴增側鄰把基因的DNA區域，然后將片段克隆至質粒pL02中[4]，然后將其用于替換染色體中耙基因的缺失。用于PCR的引物示于表5。將用于克隆的限制性位點(以斜體字顯示)添加至引物的末端。表5.用于構建缺失突變體的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>將缺失構建體設計成保持剩余用于丟坦糖膠合成的基因完整無缺。對于dpsN缺失來說，51物SacI-DpsN引物1和Xbal-DpsN引物2用于將dpsM基因的497bp片段擴增為Sacl-Xbal片段(共513bp)。引物Xbal-DpsN引物3和SpM-DpsN引物4用于將基因atrD的396bp片段擴增為Xbal-Sphl片段(共413bp)。由于基因dpsM的末端與基因dpsN的起始部重疊17bp,保留dpsM的終止密碼子和dpsN的起始密碼子，以及dpsN的天然終止密碼子。因此，該構建體導致形成13個氨基酸的小肽，如圖2所示。將PCR片段順序地連接于質粒載體pL02的多酶切點的接頭[4],產生帶有dpsN缺失的克隆pL02-dpsNdeln#3。通過使用提供轉移功能的輔助質粒pRK2013,由大腸桿菌DH5a接合[2]，將不能在鞘氨醇單胞菌中復制的這種質粒pL02-dpsNdeln弁3轉移至鞘氨醇單胞菌菌抹ATCC53159。于含有7.5ug/ml卡那霉素和25ug/ml鏈霉素的YM培養基上篩選染色體整合體的卡那霉素抗性(反向篩選大腸桿菌)。隨后在無抗生素的情況下培養鞘氨醇單胞菌大約30代，使得去除質粒。然后，由于編碼基因sacB的質粒喪失，通過蔗糖(8%)耐性篩選已喪失質粒的重組子，然后篩選菌落的卡那霉素敏感性。由幾個分離株制備基因組DNA,以鑒定較野生型基因而保留dpsN缺失的那些分離抹，如PCR所測定。相似地，構建dpsM的缺失。引物SacI-DpsM引物1和XbaI-DpsM引物2用于將基因dpsE的474bp片段擴增為Sacl-Xbal片段(共490bp)。引物Xbai-DpsM引物3和SphI隱DpsM引物4用于將基因dpsN的509bp片段擴增為Xbal-Sphl片段(共525bp)。由于基因dpsM的末端與dpsN基因的起始部重疊了17bp，保留了dpsM的終止密碼子和dpsN的起始密碼子。將終止密碼子并入Xbal克隆位點。7氨基酸肽可由dpsM起始位點形成。將PCR片段順序地連接于質粒載體pL02[4]的多酶切點的接頭，產生帶有dpsM缺失的克隆pL02-dpsMdeln糾。將該質粒4妄合至ATCC53159,篩選卡那霉素抗性整合體，隨后在無抗生素情況下培養，并;f企測蔗糖耐受性，篩選卡那霉素敏感性重組子。從所篩選的重組子分離基因組DNA,并通過PCR篩選缺失的存在。實施例10-^坦糖膠粘液形成突變體的特征幾個試驗的結果顯示dpsM和dpsN缺失均導致莢膜形成菌至粘液形成菌的轉變，如圖3和4所示。1.在高碳發酵培養基中生長約16小時的兩種缺失突變體(#3和#5)和兩種dpsM缺失突變體(#1and#5)的顯微鏡評價表明來自這些突變體的細月包沒有形成鞘氨醇單胞菌莢膜菌林S-657特有的大的細胞凝集物(圖3A和圖4A)。2.野生型ATCC5359細胞在含有1%葡萄糖的已知成份培養基(DM2)中生長24小時，并稀釋10倍，形成可見的凝塊，而dpsM和dpsN粘液突變體形成與非粘液樣菌抹DPSI(圖3C，dpsN)相似的均勻懸浮液。3.在含有r/。葡萄糖的DM2培養基中生長24小時的培養物的離心顯示，dpsM和dpsN粘液突變體的細胞可纟皮沉淀，而野生型ATCC5315928(S-657)的那些細胞仍附著多糖并因此沒有沉淀(圖3B和圖4B)。在搖瓶發酵中，與野生型對照相比，dpsN缺失突變體的六種獨立分離抹顯示全部可沉淀物質平均增加5.4%。在20LApplikon發酵罐中4吏用含有有機氮和無機氮、鹽和不同碳濃度(3-5%)的培養基評價所選擇的dpsN和dpsM突變體分離株。使用異丙醇沉淀多糖，并干燥和稱重。dpsN突變體始終表現較野生型莢膜對照菌抹全部可沉淀物質輕度增加。dpsM突變體提供了更為變異的和大體較低的繁殖力，如表6所示。表6.dps突變體多糖產量的增加5%碳源n=35.9%n=23.9%咖M弁1n=l-30.2%ii=49.3%3%碳源傘扁34.2%-10.1%咖M弁5-2.7%實施例11-l:坦糖膠粘液形成多糖的特征測定了通過使用異丙醇沉淀來從這些發酵物中回收的丟坦糖膠的流變學性質，如表7所示。dpsM和dpsN粘液突變導致丟坦糖膠的粘度改進。表7.粘液突變體的丟坦糖膠的流變學性質%0*06s-l%%菌棘'SWV3增加粘皮增加LSRV增加w脅typen=526.727,7602010薩535.332%37,鄉37%387393%n-237.3德41，柳49%4075103%咖Af#1n=3樣552%37,73336%390594%iw然39.146%3944042%372085%平均42%平均41%平均94%29還觀察到粘液突變體的纖維質量(如長度)得到改進。由于多糖分子在溶液中游離，而非附著于細胞表面，促進了這些分子的沉淀。低切變率粘度測量低切變率粘度是在3rpm下0.25%丟坦#唐膠溶液的粘度。通過在10升去離子水中溶解0gNaCl和1.47gCaCl2-2H20制備標準或合成的自來水。直接于400ml高型燒杯中稱量4.5g聚乙二醇(PEG)200。稱量0.75g等份的丟坦糖膠產物，并在PEG200中分散，形成均勻的液漿。將299ml合成的自來水添加至燒杯中，并在800±20rpm下攪拌混合物約4小時。從攪拌臺去除燒杯，并放置于25匸水浴中，使得放置30分鐘。使用BrookfieldLVViscometer使用2號轉子在3rpm下測量粘度。海水粘度測量使用下述步驟測量海水粘度。通過每980g去離子水溶解41.95g海鹽(ASTMD-l141-52,來自LakeProductsCo.,Inc.MarylandHeights,Missouri)制備海水溶液，根據需要使用HC1或NaOH調整pH至8.2。將307g海水溶液轉移至混合杯中，將0.86g丟坦糖膠產物經15-30秒緩慢添加至混合杯中，并使得在9B5型FannMulti-Mixer(FannInstruments,Inc,HoustonTX)中于1,500rpm下混合45分鐘。添加3滴BaraDefoam(NLBaroid/NLIndustries,Inc.,Houston,TX)并再繼續攪拌30秒。從混合器去除混合杯并將其浸于冷水中以降低液體的溫度，然后將其置于25。C恒溫水浴中。將溶液轉移至400ml高型燒杯。在低速(3rpm)下混合的同時，測量Fann粘度(Fann粘度計，35A型)。從刻度盤讀耳又切應力值，并記錄為在3rpm下的SWV值。還在BrookfiddLVDV-II或DV-II粘度計上使用LV-2C轉子測量粘度。在0.3rpm下觀'J量0.06sec隱1讀數。實施例12——材津+和方法培養基。每升YM含有3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麥芽提取物，以及10g葡萄糖。每升DM2培養基含有2.68gK2HP04，1.31gKH2P04，2.0gNH4SO4,0.1gMgS04-7H20，15mgCaCl22H20,8.34mgFeS04.7H20，0.05mgMnCl2.4H20,0.03mgCoCl2'6H20,0.8mgCuS04.5H20，0.02mgNa2Mo04.2H20,l.OmgZnS04'7H20，0.2mgH3B03以及10g葡萄糖。每升吉蘭糖膠燒瓶發酵培養基含有0.23gNaCl,0.165gCaa2.2H20,2.8gK2HP04,1.2gKH2P04，1.9gNaN03，l.OgN畫Z-胺型EKC(SheffieldProducts),36.46gStar畫Dri玉米糖漿，2.5mgFeS04.7H20，24嗎CoCl2.6H20以及0.1gMgSO4'7H20。粘液的離心試驗。在含有1%葡萄糖的DM2培養基中于30。C培養菌林約24小時，在350rpm下搖動，然后在Eppendorf離心機中以最大速度(10,000rpm)離心5分鐘。熱沉降試驗。在吉蘭糖膠燒瓶發酵培養基中培養菌株。在高壓滅菌器中加熱發酵液10分鐘以液化吉蘭糖膠。然后將熱發酵液轉移至大試管中并使得在95。C過夜沉降(以維持發酵液為液體)。對于莢膜菌抹，細胞附著多糖并保持懸浮。對于粘液形成菌，細胞未附著多糖并且在過夜培養過程中沉淀。PCR擴增。使用了來自Stratagene(LaJolla,CA)的高保真度PCR酶"PfuUltra熱啟動DNA聚合酶"。31參考文獻所引用的每一參考文獻的內容明確地并入本文。1.CotemanRC.2001.Cloningandanalysisof融i，卿nassp.ATCC53159polysaccharidegeaes.SanDiegoStateUniversityMSthesis2..DirtaG,SStanfield,DCoAtaandDRHdinskL1980.BroadhostrangeDNAdoningsystemforGram-negativebacteria:constructionofagenebanJcofme/f/off.ProcNatlAcadSciUSA77:7347-7351.3.HardingNE,YNPatelandRJCoieman.2004.Organizationofgenesrequiredforgeil邸polysaccharidebiosynthesisinS盧wgo柳nayeforfe。ATCC31461.JIndMicrobiolBiotechnol31:70-82.4.Le叫O.,E,Sdwartz,J.Demedde，M.EitingerandB.FriedriclL1994.Th"fca,扭臘eu^ro/A縱肌6hoxXgeneparticipatesinbydrogenasereguiatioitJ.Bacteriol.176:4385-4393.5.MatthewsTD,2004,Idmtificationofgenesinvolvedinphenotypicphaseshiftingof分/w'，mowass/j.ATCC53159SanDiegoStateUuivershyMSthesis6.PollockTJandRWArmentrot.l卿.Planktonic/s然siledimorphismofpolysaccharide^encapsulatedSphingomonads.JIndMicrobiolBiotechnol23:436-441.7.Pollock,TJ,WATvanWoitaim,LThornyMMikokjczak,MYamazaki,JWKijneandRWArmentroiit.l艦.AssignmentofbiochemicalfimctionstoglycosyltransferasegeneswhictiareessentialforWosynthsisofex叩olysaccharidrainSpAi'ng柳oiasstrainS88andJW206/"附/eguffK'womn肌JBacteriol180:586-593.8.Sa-CorreiaI，AMFialho，PVideira,LMMweira^ARMarquesandHAftano.2002,Gellangumbiosynth從isin^A!'wgo挑onos1pw"a'mofo7feATCC31461:Genes，enzymesandexopolysaccharideproductionengineering,JladMicrobiolBiotedinol.29:170-176.9.Y咖azakiM，LThome,.MMikolajczakRWArm幼troutandTJPollock.1996,Linkageofgenesessentialforsynthesisofapolysaccharidecapsulein^&gwomsstrainS88.JBacteriol178:2676>2,>10.Y咖azaldM,MMitolajczak^TJPollockandRWA鵬ntrout.2003.Productionofexopolysacctoaridesunattachedtothesurfeoeofbacterialcells.U.S.PatentNo.6,605,461.:11.Cleary,Joseph.M.,e/.。/Geneticallypurifiedgellan.gum.U.S.PatentApplicationNo.20060003051.權利要求1.一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和N基因的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和/或N基因的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N；分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。2.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和N基因的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA的兩個非連續片段，其中所述片段側鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和/或N基因；將所述兩個非連續片段連接在一起；將所述連接的非連續片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N;分離所述第二種細菌的子代，其中所述連接片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。3.權利要求l所述的方法，其中通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。4.權利要求1所述的方法，其中通過合成來分離所述基因組DNA的片段。5.權利要求l所述的方法，其中通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。6.權利要求2所述的方法，其中通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。7.權利要求2所述的方法，其中通過合成來分離所述基因組DNA的片段。8.權利要求2所述的方法，其中通過由所述基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。9.一種組合物，其含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予流體對于由菌抹ATCC53159產生的等量丟坦糖膠增加的粘度。10.權利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌林ATCC53159至少30%。11.權利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌林ATCC53159至少40%。12.權利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少50%。13.權利要求9所迷的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少60%。14.權利要求9所迷的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少70%。15.權利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少80%。16.權利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少90%。17.—種分離和純化的鞘氨醇菌屬細菌，其含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和N基因的一種基因或兩種基因的缺失。18.權利要求17所述的細菌，其是伊樂藻菌種。19.權利要求17所述的細菌，其不是伊樂藻菌種。20.權利要求17所述的細菌，其是與作為ATCC53159存放的細菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。21.權利要求17所述的細菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是丟坦糖膠。22.權利要求17所述的細菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是吉蘭糖膠。23.權利要求17所述的細菌，其中所述鞘氨醇膠多糖不是吉蘭糖膠。24.權利要求17所述的細菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是韋蘭糖膠。25.權利要求17所述的細菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是鼠李糖膠。26.權利要求7所述的細菌，其中所述細菌不含有外源性DNA。27.權利要求17所述的細菌，其中所述細菌含有一些或全部gdM缺失。28.權利要求17所述的細菌，其中所述細菌含有一些或全部gelN缺失。29.權利要求17所述的細菌，其中所述細菌含有一些或全部dpsM缺失。30.權利要求17所述的細菌，其中所述細菌含有一些或全部dpsN缺失。31.權利要求17所述的細菌，其中所述細菌含有一些或全部gelM和gelN缺失。32.4又利要求17所述的細菌，其中所述細菌含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。33.—種制備鞘氨醇膠多糖的方法，其包括在適于制備鞘氨醇膠多糖的條件下于培養基中培養權利要求17所述的細菌，由此在所述培養基中制備鞘氨醇膠多糖。34.權利要求33所述的方法，其還包括下述步驟從所述培養基中的細菌分離鞘氨醇膠多糖。35.權利要求34所述的方法，其中所述分離步驟通過離心進行。36.權利要求34所述的方法，其中所述分離步驟通過沉降進行。37.權利要求34所述的方法，其中所述分離步驟包括使用堿處理培養基。38.權利要求34所述的方法，其中所述物理分離步驟包括使用酶處理培養基。39.權利要求34所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是丟坦糖膠40.權利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是吉蘭糖膠。41.權利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖不是吉蘭糖膠。42.權利要求33所述的方法，其中所述細菌是伊樂藻菌種。43.權利要求33所述的方法，其中所述細菌不是伊樂藻菌種。44.權利要求33所述的方法，其中所述細菌是與作為ATCC53159存放的細菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。45.權利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是韋蘭糖膠。46.權利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是鼠李糖膠。47.權利要求33所述的方法，其中所述細菌含有一些或全部gelM缺失。48.權利要求33所述的方法，其中所述細菌含有一些或全部gelN錄:失。49.權利要求33所述的方法，其中所述細菌含有一些或全部dpsM缺失。50.權利要求33所述的方法，其中所述細菌含有一些或全部dpsN缺失。51.權利要求33所述的方法，其中所述細菌含有一些或全部gdM和gelN缺失。52.權利要求33所述的方法，其中所述細菌含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。53.—種培養物發酵液，其含有權利要求17所述的細菌。54.—種培養物發酵液，其含有權利要求18所述的細菌。55.—種培養物發酵液，其含有權利要求19所述的細菌。56.—種培養物發酵液，其含有權利要求20所述的細菌。57.—種培養物發酵液，其含有權利要求21所述的細菌。58.—種培養物發酵液，其含有權利要求22所述的細菌。59.—種培養物發酵液，其含有權利要求23所述的細菌。60.—種培養物發酵液，其含有權利要求24所述的細菌。61.—種培養物發酵液，其含有權利要求25所述的細菌。62.—種權利要求53所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。63.—種權利要求54所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。64—種權利要求55所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。65.—種權利要求56所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。66.—種權利要求57所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。67.—種權利要求58所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。68.—種權利要求59所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。69.—種權利要求60所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。70.—種權利要求61所述的培養物發酵液，其中所述培養物發酵液已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。71.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的I基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的I基因的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I;分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。72.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I中的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段側鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I;將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I;分離所述第二種細菌的子代，其中所述片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。73.權利要求71所述的方法，其中通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。74.權利要求71所述的方法，其中通過合成來分離所述基因組DNA的片段。75.權利要求71所述的方法，其中通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。76.權利要求72所述的方法，其中通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。77.權利要求72所述的方法，其中通過合成來分離所述基因組DNA的片段。78.權利要求72所述的方法，其中通過由基因組DNA純化來分離所述基因組DNA的片段。79.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R;分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并取代所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。80.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段側鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R;將所述片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R;分離所述第二種細菌的子代，其中所述片段已經整合入基因組并取代所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。81.權利要求79所述的方法，其中通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。82.權利要求79所述的方法，其中通過合成來分離所述基因組DNA的片段。83.權利要求79所述的方法，其中通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。84.權利要求80所述的方法，其中通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。85.權利要求80所述的方法，其中通過合成來分離所述基因組DNA的片段。86.權利要求80所述的方法，其中通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。全文摘要鞘氨醇單胞菌菌株具有牢固附著于細胞表面的細胞外多糖(即吉蘭糖膠、丟坦糖膠)。所述附著可通過破壞營養素攝入細胞或由于細胞表面多糖生物合成的限制位點而限制多糖產生。多糖生物合成的兩種基因——產生吉蘭糖膠的菌株中的gelM和gelN以及產生丟坦糖膠的菌株中的dpsM和dpsN，已經通過缺失突變而被滅活，并顯示產生非牢固附著于細胞表面的多糖，即粘液形式。多糖生物合成的另一種基因——產生吉蘭糖膠的菌株中的gelI，通過插入突變而被滅活，并也顯示產生粘液表型。產生丟坦糖膠的菌株中的同源性基因dpsI也與多糖至細胞表面的附著有關。粘液特征通過細胞被離心的能力和在顯微鏡下或在稀釋的懸浮液中沒有可見的細胞凝集而證明。丟坦糖膠粘液突變體的繁殖力稍增加，且回收的丟坦糖膠產物具有顯著改進的流變學性質。吉蘭糖膠粘液突變體的發酵液粘度較低，這便于在發酵過程中混合，然而，回收的吉蘭糖膠產物的凝膠強度較由莢膜菌株產生的吉蘭糖膠的凝膠強度低。gelR基因的缺失，所述gelR基因編碼與表面蛋白和外膜蛋白具有同源性以及與帶有多糖的蛋白質具有弱同源性的蛋白質。文檔編號C07G99/00GK101501213SQ200680009973公開日2009年8月5日申請日期2006年2月3日優先權日2005年2月4日發明者南茜·E·哈丁,帕特洛·雅美尼,拉塞爾·J·科爾曼申請人:Cp凱爾科美國公司