專利名稱：高純度載脂蛋白a-i的制備方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質制備，尤其涉及載脂蛋白A-I的制備方法。 背彔技術
載脂蛋白A-1 (Apolip叩rotein A-1， apoA-I )是高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein, HDL)的主要載脂蛋白，為單一多肽鏈，由243個氨基酸 殘基組成，分子量28.3kD。 HDL主要功能是參與膽固醇逆向轉運(Reverse Cholesterol Transport, RCT)，將外周組織細胞中的膽固醇移出并轉運至肝臟 轉化清除，因而具有對抗動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)發生及發展的 重要作用，而apoA-I是HDL抗AS功能的主要承擔者。apoA-1還具有抗炎抗內 毒素的功能，因此是脂類代謝研究重點之一。由于apoA-I具有肝臟靶向作用 的特點，在靶向藥物研究中也有良好的應用前景。
目前，獲得apoA-1的常用制備方法有超速離心法、有機溶劑沉淀法和高 效液相法等，雖然能得到高純度apoA-1，但具有一些很明顯的缺點①制備量 小， 一般只能獲得毫克級的apoA-I蛋白，不適于工業生產；②蛋白得率低， 經超離心、有機溶劑沉淀、柱層析等多步處理，在制備過程中損失了大部分 apoA-I;③成本高，需要超速離心機等貴重儀器；④安全性差，乙醇、丙酮、 三氯乙酸等有機溶劑不僅具有生理毒性，而且易燃易爆，不利與安全生產。
另一方面，血漿組份四是人血漿經Cohn低溫乙醇法處理后的剩余部分， 常因不能利用而被丟棄，其主要蛋白成分是白蛋白和e脂蛋白。
因此，本領域迫切需要提供一種制備apoA-1的方法，該方法的蛋白得率 高、能較好地保持蛋白活性，同時成本低、而且適合于大規模的工業生產。另 外，該方法還能將被丟棄的組份四加以合理應用，使血漿資源得到更充分的利 用。
發明內容
本發明旨在提供一種從人血漿中獲得apoA-1的方法。在本發明的第一方面，提供了一種獲得載脂蛋白A-1的方法，它包括步驟
a. 將經Cohn低溫乙醇法獲得的組份四和1 一8M的尿素混合形成組份四預處理 溶液；
b. 步驟a得到的組份四預處理溶液流過陰離子交換層析柱后，用含1一8M尿 素，電導值l一4ms/cm的緩沖液I洗滌層析柱，得到含初步純化的載脂蛋白A-I 的洗脫液I;
c. 洗脫液I流過陰離子交換層析柱，用電導值l一15ms/cra的緩沖液II洗脫 雜質后用電導30 — 100ms/cm的緩沖液III洗脫下純化的載脂蛋白A-I。
在另一優選例中，步驟a中組份四和尿素的重量比為l:30 — 300。 在另一優選例中，步驟a中組份四和尿素的重量混合比為l:90 — 240。 在另一優選例中，步驟a中組份四和尿素的重量混合比為1:150 — 210。 在另一優選例中，步驟a、 b中所述的尿素濃度為3 — 8M。 在另一優選例中，步驟a、 b中所述的尿素濃度為5 — 7M。 在另一優選例中，緩沖液I的電導值為2 — 4ms/cm;緩沖液II的電導值為7
—15ms/cm;緩沖液III的電導值為70 — 95ms/cm。
在另一優選例中，緩沖液I的電導值為2.5 — 3.6ms/cm;緩沖液II的電導值
為9 —12ms/cm;緩沖液III的電導值為80—90ms/cm。
在另一優選例中，步驟b、 c中的洗脫緩沖液I、 II或III中含有NaCl、 KC1、
MgCl2或CaCl2。
在另一優選例中，步驟b、 c中的洗脫緩沖液I、 II或III中含有NaCl。 在另一優選例中，步驟c所述的緩沖液n或III中含有0 — 1M尿素。 在另一優選例中，所述的陰離子交換層析柱為弱酸性或弱堿性陰離子交換層 析柱。
在另一優選例中，所述的陰離子交換層析柱為QAE或DEAE陰離子交換層析柱。 在另一優選例中，所述的陰離子交換層析柱為DEAE陰離子交換層析柱。 在另一優選例中，步驟a和b之間還包括步驟a':將組份四預處理溶液離心 除不溶性雜質，并用濾膜過濾。
在另一優選例中，離心速度為6000—10， 000rpm，濾膜孔徑為0. 2 — 0. 6u m。 在另一優選例中，步驟b和c之間還包括步驟b':用電導值4.5 — 70ms/cm
的緩沖液iv洗脫除去大部分雜質。
在另一優選例中，步驟c后還包括步驟c':超濾換液，添加穩定劑，然后灌裝、冷凍干燥得成品。
在另一優選例中，緩沖液IV或V中含0—1M尿素。 在另一優選例中，緩沖液IV或V中含有NaCl、 KC1、 MgCl2或CaCl2。 在另一優選例中，緩沖液IV或V中含有NaCl。
在另一優選例中，上述的各緩沖液的pH7.2 — 8.5，更佳地pH7.5 — 8，最佳地 pH7.8。。
在另一優選例中，上述的各緩沖液為Tris緩沖液。
在本發明的第二方面，提供了一種用上述方法得到的載脂蛋白A-1。
據此，本發明提供了一種制備apoA-I的方法，所制得的蛋白得率高、蛋 白活性好。所述的方法成本低、適于大規模的工業化生產。該方法使血漿資源 得到充分的利用。
圖1是人血漿載脂蛋白apoA-I生產工藝流程圖。 圖2是實施例1中第一次DEAE陰離子交換柱層析的洗脫曲線圖； 其中，橫坐標表示從層析柱出口端流出的洗脫液體積，縱坐標表示在線測 得的層析柱出口端洗脫液的蛋白濃度；1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9為取樣點， 分別對應圖3中的1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9號電泳條帶。
圖3是實施例1第一次DEAE陰離子交換柱層析的SDS-PAGE電泳結果圖； 其中，1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9號蛋白條帶分別對應圖2中1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9號取樣點；箭頭卡所指處的蛋白條帶表示apoA-1。
圖4是實施例1第二次DEAE陰離子交換柱層析的SDS-PAGE電泳結果圖； 其中，1為上柱流穿液的蛋白條帶，2為低分子量標準蛋白，3， 4， 5為先 洗脫下來的雜蛋白，6， 7， 8， 9， 10為后洗脫下來的apoA-1，其中6， 7為5 倍稀釋樣品，8為10倍稀釋樣品，箭頭+所指處的蛋白條帶表示apoA-1。 圖5是實施例4 apoA-1中試純化的SDS-PAGE電泳結果圖； 其中，1為組份四預處理液上清液，4， 5， 6， 7， 8為DEAE層析純化得到 的目的蛋白；10為雜蛋白；箭頭卡所指處的蛋白條帶表示apoA-I。
圖6是實施例2第二次DEAE陰離子交換柱層析的SDS-PAGE電泳結果其中，l為低分子量標準蛋白，2， 3， 4為純化得到的目的蛋白。
圖7是實施例3第二次DEAE陰離子交換柱層析的SDS-PAGE電泳結果圖； 其中，l為低分子量標準蛋白，2， 3， 4為純化得到的目的蛋白。
具體實施例方式
發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現，將一定濃度的尿素與目前被 丟棄的人血漿組份四以一定的比例混合，apoA-I在尿素溶液中性質變化，使其 與陰離子交換層析柱的結合具有高度特異性，通過兩步陰離子交換層析，得到 了高純度的apoA-I。
本發明提供的制備apoA-1的方法，參見附圖1的流程圖，它包括以下步
驟
(1) 組份四沉淀預處理
所述的組份四是人血漿經cohn低溫乙醇法所得到的沉淀(CohnE J， Strong LE， Huges WL， et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins IV A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids.Amer Chem Soc， 1946， 68:459-475.)。將組份四 沉淀溶于緩沖液中，再加入一定濃度的尿素，充分混勻，使組份四中的apoA-1 等蛋白變性，所謂的變性是可逆的。
所加入的尿素濃度為1一8M，優選地3 — 7M，更佳地為5 — 6M。組份四沉淀 與所加入的尿素的重量比為l:30 — 300，優選地l:90 — 240，更佳地為1:150 一210。
可使用本領域熟知的堿性緩沖液，如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、HEPES緩 沖液，其中優選Tris緩沖液。緩沖液的pH為7.2—8.5，優選地pH7.5 — 8，更 優選地pH7. 8。
在另一優選例中，在低溫環境(0 — 4'C)將組份四沉淀溶于緩沖液。 在一個優選例中，組份四和尿素在緩沖液中充分混勻后，再離心除去不溶
性雜質，然后用濾膜過濾。離心速度為6000—10， 000rpm，更佳地為8000rpm;
濾膜孔徑為0. 2 — 0. 6u m，更佳地為0. 45陶。
(2) 第一次陰離子交換柱層析(apoA-I的粗純)
將步驟(1)的組份四復溶液以一定流速流過陰離子交換層析柱，apoA-I
與雜蛋白均結合到層析柱上。
先以含尿素且較低離子強度的緩沖液洗滌陰離子交換層析柱，此時apoA-I 與層析柱具有較弱的結合力，含有少量雜蛋白的apoA-I首先被洗脫下來，而 絕大部分雜蛋白則留在層析柱；再以離子強度較高的緩沖液洗滌陰離子交換層 析柱，將絕大部分雜質洗脫下來，雜質中不含apoA-1。 apoA-I得到初步純化。
在將含少量雜蛋白的apoA-1洗脫下來的洗脫液中含有1一8M尿素，較佳 地3 — 7M，更佳地為5 — 6M。在該洗脫液的電導值為l一4ms/cm，較佳地2 — 3. 8ms/cm，更佳地2. 5 — 3. 6ms/cra;該洗脫液中可含有的鹽包括但不限于NaCl、 KC1、 MgCl2、 CaCl2，其中優選NaCl。
在將大部分雜質洗脫下來的洗脫液中含有0—1M尿素，優選不含尿素。其 電導值為4. 5—100ms/cm;其中所含的鹽包括但不限于NaCl、 KC1、 MgCl2、 CaCl2，其中優選NaCl。
所述的洗脫液可使用本領域熟知的堿性緩沖液，如Tris緩沖液、磷酸緩 沖液、HEPES緩沖液，其中優選Tris緩沖液。緩沖液的pH為7. 2 — 8. 5，優選 地pH7. 5 — 8，更優選地pH7. 8。
步驟(1)的組份四復溶液流過陰離子交換層析柱的流速為0.5 — L5ml/min，優選0. 8—1. 2ml/rain。組份四沉淀的重量和層析柱體積的比例為 1:5 — 50，優選1:15 — 40，更優選1:20 — 30。
(3)第二次陰離子交換柱層析(apoA-I的精純)
初步純化的apoA-I溶液(含apoA-1，尿素及微量雜蛋白)用水稀釋到較 低的鹽濃度，并以一定流速流過陰離子交換層析柱，apoA-I與微量雜蛋白結合 到層析柱上。
以離子強度較低的緩沖液洗滌層析柱，此時apoA-1與層析柱具有較強的 結合力，尿素和雜蛋白被首先洗脫下來；再以離子強度較高的緩沖液洗滌層析 柱，將apoA-I洗脫下來，得到電泳純的apoA-1。
將尿素和雜蛋白洗脫下來的洗脫液電導值為l一20ms/cm，較佳地7 — 15ms/cm，更佳地9一 12ras/cm，其中可含有0—1M尿素，優選不含尿素。在該 洗脫液中可含有的鹽包括但不限于NaCl、 KC1、 MgCl2、 CaCl2，其中優選NaCl。
將apoA-I洗脫下來的洗脫液電導值為50— 100ms/cm，較佳地70 — 95ms/cm，更佳地80 — 90ms/cm，其中可含有0—1M尿素，優選不含尿素。其中 所含的鹽包括但不限于NaCl、 KC1、 MgCl2、 CaCl2，其中優選NaCl。
在另一優選例中，可以在apoA-I與微量雜蛋白結合到層析柱上后，用電 導從l一100ms/cm，以3ms/cm/min的速度變化的梯度洗脫液進行洗脫，截取電 導30 — 60ms/cra時洗脫下的純化的載脂蛋白A-1。
所述的洗脫液可使用本領域熟知的堿性緩沖液，如Tris緩沖液、磷酸緩 沖液、HEPES緩沖液，其中優選Tris緩沖液。緩沖液的pH為7. 2 — 8. 5，優選 地pH7. 5 —8，更優選地pH7. 8。
用I一IO倍體積的水稀釋初步純化的apoA-1溶液，優選的稀釋倍數為3 一7倍。稀釋后的初步純化的apoA-1溶液流過陰離子交換層析柱的流速為0. 5 —1.5ml/rain，優選0. 8—1. 2ral/min。
本發明還可包括apoA-I洗脫液后處理的步驟，即將洗脫下來的精純(電 泳純)apoA-1超濾濃縮換液，并添加穩定劑，再經冷凍干燥，制成apoA-I凍 干制劑。
可使用本領域熟知的方法進行超濾，采用Millipore公司聚醚砜(PES)超 濾膜(截留分子量5k) ， 4。C超濾，壓力不超過0.3Mpa。
所添加的穩定劑是本領域熟知的，選自但不限于羥丙基纖維素、羥丙基 甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、蔗糖、山梨醇等。
使用本領域常用的真空冷凍干燥方法凍干物料于-36'C下預凍3-4小時， 控制真空度7-9Pa冷凍干燥，冷阱溫度-55"左右，解析階段擱板溫度4(TC， 凍干時間約15小時。
本發明提供的純化apoA-I的方法中所使用的陰離子交換層析柱可使用本 領域熟知的，優選填料為QAE或DEAE的陰離子交換層析柱，更優選DEAE陰離 子交換層析柱。
apoA-1是血漿高密度脂蛋白(HDL)的主要載脂蛋白，與HDL的生理功能 密切相關，是HDL抗動脈粥樣硬化病(AS)功能的主要承擔者。國外研究表明， apoA-1缺乏導致動脈粥樣硬化和增加炎癥。本發明所制得的高純度apoA-1在 動脈粥樣硬化的治療以及抗內毒素抗炎癥藥物、肝臟耙向藥物等方面均有較好 的應用前景。
本發明的主要優點在于 1、 所提供的純化apoA-I的方法具有很高的特異性，apoA-I收率高；
2、 純化過程不需使用有機溶劑，操作安全方便；
3、 設備要求低、工藝步驟少，節約成本；
4、 中試試驗證明，通過簡單的增大層析柱尺寸即可很容易的實現工藝放 大，純化結果完全保持一致，非常適合工業化生產。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例l
制備apoA-I①
組份四0.2克，層析柱采用5ml DEAE陰離子交換預裝柱(購自GE Healthcare公司)，純化設備為AKTA EXPLORER 100 (購自GE Healthcare公 司)，電導測定采用AKTA EXPLORER 100自帶的電導檢測裝置。
(1) 組份四沉淀預處理
0. 2克組份四沉淀于4"C溶于100ml pH7. 8的Tris緩沖液，并加入尿素至 終濃度6mol/L，充分混勻。8000rpm離心除去不溶性雜質，然后用0. 45Wn濾 膜過濾。
(2) 第一次DEAE陰離子交換柱層析
DEAE柱以含6mol/L尿素Tris緩沖液(pH7.8)平衡，步驟(1)的過濾液 以lml/min流速流過DEAE陰離子交換層析柱，apoA-I與雜蛋白均結合到層析 柱上。
以含6mol/L尿素的Tris緩沖液(電導為3. 5 ms/cm， pH7. 8)洗滌DEAE 層析柱，apoA-1首先被洗脫下來，洗脫液體積約20ml;再以四種不含尿素的 pH7. 8Tris緩沖液(電導分別為4. 3ms/cm， 5. 4ms/cm， 6. 7ras/cm, 59. 2ras/cm)洗 滌DEAE層析柱，將絕大部分雜質洗脫下來。
洗脫曲線及SDS-PAGE電泳結果見附圖2和3。 (3)第二次DEAE陰離子交換柱層析
apoA-I洗脫液(含apoA-1，尿素及微量雜蛋白，電導3. 5， pH7.8)以純 水5倍稀釋，上DEAE陰離子交換層析柱(流速lml/min) ， apoA-1與微量雜 蛋白結合到層析柱上。
以不含尿素的Tris緩沖液(電導為11. 7ms/cm， pH7. 8)洗滌DEAE層析柱， 微量雜蛋白被首先洗脫下來；再以不含尿素的Tris緩沖液(電導為85. 2ras/cm， PH7.8)洗滌DEAE層析柱，將apoA-I洗脫下來。
經SDS-PAGE電泳檢測，獲得了電泳純的apoA-1，而雜蛋白溶液中不含 即oA-1 (圖4)。
實施例2 制備apoA-I②
稱取組份四0.2克，實驗設備同實施例l。
(1) 組份四沉淀預處理
0. 2克組份四沉淀于4'C溶于100ml pH7. 8的Tris緩沖液，并加入尿素至 終濃度lmol/L，充分混勻。8000rpm離心除去不溶性雜質，然后用0. 45Wn濾
膜過濾。
(2) 第一次DEAE陰離子交換柱層析
DEAE柱以含lmol/L尿素Tris緩沖液(pH7.8)平衡，步驟(1)的過濾液 以lral/min流速流過DEAE陰離子交換層析柱，apoA-I與雜蛋白均結合上柱。
以含lmol/L尿素的Tris緩沖液(電導為3. 5 ms/cm， pH7. 8)洗脫apoA-1， 洗脫液體積約20ml;再以pH7. 8電導59. 2 ms/cra的Tris緩沖液洗滌DEAE層
析柱，將絕大部分雜質洗脫下來。
(3) 第二次DEAE陰離子交換柱層析 方法同實施例l，純化結果見圖6。
實施例3 制備apoA-I③
稱取組份四0.2克，實驗設備同實施例l。 (1)組份四沉淀預處理
0. 2克組份四沉淀于4。C溶于100ml PH7. 8的Tris緩沖液，并加入尿素至 終濃度8mol/L，充分混勻。8000rpm離心除去不溶性雜質，然后用0. 45to濾 膜過濾。
(2) 第一次DEAE陰離子交換柱層析 DEAE柱以含8mol/L尿素Tris緩沖液(pH7.8)平衡，步驟(1)的過濾液
以lml/min流速流過DEAE陰離子交換層析柱，apoA-1與雜蛋白均結合上柱。
以含8mol/L尿素的Tris緩沖液(電導為3. 5 ms/cm， pH7. 8)洗脫apoA-1， 洗脫液體積約20ml;再以pH7. 8電導59. 2 ms/cm的Tris緩沖液洗滌DEAE層 析柱，將絕大部分雜質洗脫下來。
(3) 第二次DEAE陰離子交換柱層析 方法同實施例l，純化結果見圖7。
實施例4
放大(中試)制備apoA-I
組份四60克，DEAE陰離子交換層析柱體積1500ml (購自上海錦華層析設 備廠)，層析填料DEAE S印harose FF (購自GE Healthcare公司)，純化設 備為國產蠕動泵和紫外檢測儀(購自上海錦華層析設備廠)，電導測定采用AKTA EXPLORER IOO上的電導檢測裝置(購自GE Healthcare公司)。
(1) 組份四沉淀預處理
60克組份四沉淀于4'C溶于30L pH7. 8的Tris緩沖液，并加入尿素至終 濃度6mol/L，充分混勻。8000rpm離心除去不溶性雜質，然后用0. 45陶濾膜 過濾。
(2) 第一次DEAE陰離子交換柱層析
DEAE柱以含6mol/L尿素Tris緩沖液(pH7. 8)平衡，步驟(1)的過濾液 以lml/min流速流過DEAE陰離子交換層析柱，apoA-1與雜蛋白均結合到層析 柱上。
以含6mol/L尿素的Tris緩沖液(電導為3. 7 ms/cm， pH7. 8)洗滌DEAE 層析柱，apoA-I首先被洗脫下來，洗脫液體積約10L;再以不含尿素的pH7. 8Tris 緩沖液(電導為80. 3 ms/cm)洗滌DEAE層析柱，洗脫絕大部分雜質。
(3) 第二次DEAE陰離子交換柱層析
apoA-I洗脫液(含apoA-1，尿素及微量雜蛋白，電導3. 7 ms/cm， pH7. 8)
以純水5倍稀釋，上DEAE陰離子交換層析柱(流速lml/rain) ， apoA-I與微
量雜蛋白結合到層析柱上。
以不含尿素的Tris緩沖液(電導為12.2 ms/cm， pH7.8)洗滌DEAE層析 柱，微量雜蛋白被首先洗脫下來；再以不含尿素的Tris緩沖液(電導為50.4 ras/cm， pH7. 8)洗滌DEAE層析柱，將apoA-I洗脫下來。
經SDS-PAGE電泳結果見圖5。結果表明，放大后同樣可獲得電泳純的 apoA-1，而且雜蛋白溶液中不含apoA-I。
實施例5
apoA-1蛋白測定
用太陽生物技術公司的apoA-1免疫濁度試劑盒檢測實施例1所制得的 apoA-1①蛋白。
取10ul純化得到的蛋白樣品，加入lral apoA-I抗血清，于37。C孵育 15min，在波長505nm下檢測吸光度，檢測結果該蛋白樣品為apoA-1蛋白。
實施例6—8 apoA-I蛋白測定
同實施例5所述的方法，用太陽生物技術公司的apoA-1免疫濁度試劑盒 檢測實施例2、 3所制得的apoA-I②、③及實施例4所制得的apoA-1蛋白。 結果類似。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術 內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任 何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
權利要求
1. 一種獲得載脂蛋白A-I的方法，其特征在于，它包括步驟a.將經Cohn低溫乙醇法獲得的組份四和1-8M的尿素混合形成組份四預處理溶液；b.步驟a得到的組份四預處理溶液流過陰離子交換層析柱后，用含1-8M尿素，電導值1-4ms/cm的緩沖液I洗滌層析柱，得到含初步純化的載脂蛋白A-I的洗脫液I；c.洗脫液I流過陰離子交換層析柱，用電導值1-15ms/cm的緩沖液II洗脫雜質后用電導30-100ms/cm的緩沖液III洗脫下純化的載脂蛋白A-I。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a、 b中所述的尿素濃度為3 一8M。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a、 b中所述的尿素濃度為5 一7M。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，緩沖液I的電導值為2—4ms/cm; 緩沖液II的電導值為7 — 15ms/cm;緩沖液III的電導值為70 — 95ms/cm。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的陰離子交換層析柱為弱酸 性或弱堿性陰離子交換層析柱。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中組份四和尿素的重量比 為1:30 — 300。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b、 c中的洗脫緩沖液I、 II 或III中含有NaCl、 KC1、 MgCl2或CaCl2。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a和b之間還包括步驟a': 將組份四預處理溶液離心除不溶性雜質，并用濾膜過濾。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b和c之間還包括步驟b': 用電導值4. 5 — 70ms/cm的緩沖液IV洗脫除去大部分雜質。
10. 如權利要求l一9任一所述的方法，其特征在于，所述的各緩沖液pH7.2 一8.5。
全文摘要
本發明公開了一種獲得載脂蛋白A-I的方法，它包括步驟a.將經Cohn低溫乙醇法獲得的組份四和1-8M的尿素混合形成組份四預處理溶液；b.步驟a得到的組份四預處理溶液流過陰離子交換層析柱后，用含1-8M尿素的緩沖液洗滌層析柱，得到初步純化的載脂蛋白A-I；c.含步驟b得到的初步純化的載脂蛋白A-I的溶液流過陰離子交換層析柱，洗脫雜質后用含0-1M尿素的緩沖液洗滌層析柱，得到純化的載脂蛋白A-I。所述的方法蛋白得率高、成本低，適合工業化生產；同時，該方法還充分利用了血漿資源。
文檔編號C07K1/18GK101205250SQ20061014750
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月20日 優先權日2006年12月20日
發明者秋 何, 包驤飛, 李軍輝, 李春洲, 沈積慧, 許必雄, 凱 黃 申請人:上海萊士血液制品股份有限公司