編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途的制作方法

專利名稱：編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼細胞壁甘露糖蛋白(mannoprotein)的基因及其用途，特別是涉及制造降低了混濁生成能力的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。更具體地說，本發明涉及通過提高編碼釀造酵母的細胞壁甘露糖蛋白的Cwp2p的ScCWP2基因或特別是啤酒酵母中的特征性的nonScCwp2基因的表達量，可使產品中的混濁降低的酵母及使用該酵母的酒類制造方法等。
背景技術：
酒類中，有以糖類、淀粉質等為原料，由酵母等的作用，通過乙醇發酵制造的葡萄酒、啤酒、清酒等的釀造酒。
例如，啤酒是以麥芽為主原料通過糖化得到麥芽汁，用此麥芽汁和酵母進行主發酵，之后嫩啤酒進行后發酵(貯酒)過程，再經過過濾、灌裝入瓶工序來制造。如此制造的啤酒等的釀造酒(特別是色澤淺的酒)，從制造出后到消費期間不產生混濁的所謂“混濁穩定性”在釀造酒的品質上是極為重要的項目。
例如啤酒混濁的原因大致區分為生物學混濁和非生物學混濁2類。生物學的混濁是由微生物的混入引起的。非生物學混濁是由于啤酒成分自身的變性所引起的混濁，例如，由蛋白質成分和多酚結合引起的總稱為混濁蛋白的蛋白質成分的生成(K.Asano et al.，ASBC Journal 40147-154，1982；J.A.Delcour et al.，MBAA Technical Quarterly，2562-66，1988)。一般地，通常生成的混濁是非生物學混濁。非生物學混濁的原因物質、形成機理等雖未被詳細解明，但近年來認為，來自酵母的細胞壁成分(甘露糖蛋白等)與來自麥芽、啤酒花的蛋白質成分、多酚等通過結合，會逐漸形成大的粒子。
近年來發現，從酵母上的甘露糖蛋白的分離程度與啤酒混濁的強度間有良好的相關性 (F.Omura et al.，30thEBC Congress SUMMARIESPRESENTATIONS，19，2005)。Cwp2p是構成細胞壁的主要甘露糖蛋白之一，具有細胞壁穩定化、低pH值時的抵抗性的作用(M，Skrzypek et al.，Curr Genet，38，191-201，2000)。

發明內容
如上所述，雖然非生物學混濁的原因物質、形成機理等還未被詳細解明，但在釀造酒的品質管理上強烈需要降低此種非生物學混濁。
本發明者等為解決上述課題不斷銳意研究的結果，從啤酒酵母中成功地鑒定·分離出了編碼細胞壁甘露糖蛋白的的基因。且制備了將所得基因導入酵母并使其表達的轉化酵母，確認了混濁生成量的減少，從而完成了本發明。
即本發明涉及啤酒酵母中的特征性存在的編碼細胞壁甘露糖蛋白基因、該基因編碼的蛋白質、調節了該基因表達的轉化酵母、通過使用調節了該基因表達的酵母以控制產品中混濁的方法等。具體地說，本發明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導入了該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒類的制造方法等。
(1)從以下(a)～(f)組成的組中選擇的多核苷酸(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1中的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)組成的組中選擇(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在十分嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)一種蛋白質，其由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸編碼。
(7)一種載體，其含有上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的載體，其含有具有以下(x)～(z)組成要素的表達框架(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中所述的多核苷酸，其與該啟動子以正向結合；以及(z)與RNA分子的轉錄終止及多腺苷酸化有關的、在酵母中起作用的信號。
(8)一種載體，其含有從以下(j)～(1)組成的組中選擇的多核苷酸。
(j)含有編碼由序列號4的氨基酸序列或序列號4的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；
(k)含有編碼具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(1)含有與序列號3的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號3的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在十分嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(9)一種酵母，其中導入了上述(7)或(8)中所述的載體。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通過導入上述(7)或(8)中所述的載體，降低了混濁的生成能力。
(11)上述(10)中所述的酵母，其通過使上述(6)中所述的蛋白質的表達量增加，降低了混濁的生成能力。
(12)一種酒類的制造方法，其使用上述(9)～(11)中任一項所述的酵母。
(13)上述(12)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
(14)上述(12)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
(15)一種酒類，其用上述(12)～(14)中任一項所述的方法制造。
(16)一種評價方法，其是使用根據編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的堿基序列而設計的引物或探針，評價被檢酵母的混濁生成能力的方法。
(16a)根據上述(16)中所述的方法，選別降低了混濁生成能力的酵母的方法。
(16b)使用通過上述(16a)中所述方法選別的酵母制造酒類(例如啤酒)的方法。
(17)一種評價方法，其為通過培養被檢酵母，測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的表達量，評價被檢酵母的混濁生成能力的方法。
(18)一種酵母的選擇方法，其為培養被檢酵母，對上述(6)中所述的蛋白質定量或測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的表達量，選擇與目標混濁生成能力相應的前述蛋白質量或前述基因表達量的被檢酵母。
(18a)酵母的選擇方法，其為培養被檢酵母，測定混濁生成能力，選擇目標混濁生成能力的被檢酵母。
(19)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其為培養標準酵母及被檢酵母，測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達的被檢酵母。
(20)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其為培養標準酵母及被檢酵母，對各酵母中上述(6)中所述的蛋白質定量，選擇該蛋白質量比標準酵母多的被檢酵母。即上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其為培養多種酵母，對各酵母中上述(6)中所述的蛋白質定量，選擇其中該蛋白質量多的被檢酵母。
(21)一種酒類的制造方法，其特征在于，使用上述(9)～(11)中所述的酵母及通過上述(18)～(20)中所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進行用于酒類制造的發酵，調節混濁的生成量。
根據使用本發明的轉化酵母的酒類制造法，因通過細胞壁甘露糖蛋白可使酵母的細胞壁結構穩定化，所以可制造將啤酒釀造及產品中的混濁量抑制到很低水平的酒類。


圖1是表示實施例2的啤酒試驗釀造中酵母增殖量的經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。
圖2是表示實施例2的啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是表示實施例2的啤酒試驗釀造中酵母的nonScCWP2基因表達變動圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示檢測出的信號輝度。
圖4是表示此實施例的啤酒試驗釀造中酵母增殖量的經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。
圖5是表示此實施例的啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖6是表示實施例6的啤酒試驗釀造中酵母的ScCWP2基因表達變動圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示檢測出的信號輝度。
圖7是表示此實施例的啤酒試驗釀造中酵母增殖量的經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。
圖8是表示此實施例的啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
具體實施例方式
本發明者等認為，通過使酵母的細胞壁甘露糖蛋白增大，可使酵母的細胞壁穩定化。基于此設想反復進行了研究，以用日本特開2004-283169號公報中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎，分離·鑒定了編碼啤酒酵母特有的細胞壁甘露糖蛋白的nonScCWP2基因。將該基因的堿基序列、及由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列，分別用序列號1或序列號2表示。另外，以用日本特開2004-283169號公報中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎，分離·鑒定了編碼啤酒酵母的細胞壁甘露糖蛋白的ScCWP2基因。該基因的堿基序列、及由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列，分別用序列號3或序列號4表示。另外，ScCWP2也可從S.cerevisiae基因組數據庫(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)獲得。
1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供(a)含有由序列號1或序列號3的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有編碼由序列號2或序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作為本發明對象的多核苷酸，不只限于編碼來自上述啤酒酵母的細胞壁甘露糖蛋白的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質具同等功能的蛋白質的其他多核苷酸。作為功能相同的蛋白質，例如，可例舉為(c)由序列號2或序列號4的氨基酸序列中1個或多個的氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質(構成細胞壁的甘露糖蛋白)。
此種蛋白質，在序列號2或序列號4的氨基酸序列中，例如，可為由1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1～數個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質。上述氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或付加的數量，一般愈小愈好。此種蛋白質可例舉為具有(d)與序列號2或序列號4的氨基酸序列有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的氨基酸序列，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質。上述同源性的數值一般愈大愈好。
另外，是否是作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質，例如可通過將樣品用SDS-電泳按分子量分離，對其樣品，利用刀豆蛋白A的植物凝集素識別甘露糖蛋白的甘露糖部分并與其結合的性質，使用affinoblotting(Faye Land Chrispeels MJ，Anal Biochem，1985)的手法進行檢測。
另外，本發明也包含(e)含有與序列號1或序列號3堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號2或序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
此處的“在嚴格條件下雜交的多核苷酸”，是指以序列號1或序列號3的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸、或編碼序列號2或序列號4的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本說明書中所述的“嚴格條件”可為低嚴格條件、中嚴格條件、十分嚴格條件中的任一種。“低嚴格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件。“中嚴格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件。“十分嚴格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域技術人員通過適宜選擇這些因素，均可實現同樣的嚴格條件。
還有，雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據試劑盒中附帶的說明方案，與標記了的探針進行一夜培養后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗滌緩沖液1次洗滌之后，可檢測雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外，可雜交的多核苷酸，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認值(default)計算時，可為與編碼序列號2或序列號4的氨基酸序列的多核苷酸有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。
還有，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可使用根據Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc NatlAcad Sci USA 905873，1993)決定。開發了基于BLAST算法、被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數例如為score＝100、wordlength＝12。使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數例如為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認值(default)參數。
2.本發明的蛋白質本發明也提供由上述多核苷酸(a)～(1)中任一種編碼的蛋白質。本發明的優選蛋白質，是由序列號2或序列號4中的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質(本說明書中有時僅稱為“細胞壁甘露糖蛋白”)。
此種蛋白質可例舉為由序列號2或序列號4的氨基酸序列中上述數量的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且具有作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質。另外，此種蛋白質，可例舉為含有與序列號2或序列號4的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質。此種蛋白質，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點誘變法獲得。
本發明的蛋白質氨基酸序列中1個以上的氨基酸殘基被缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、且1個或多個氨基酸序列的位置上，有1個或多個氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2種以上也可同時發生。
以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosubericacid)；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發明的蛋白質可通過Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等的化學合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、Protein TechnologiesInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、島津制作所公司制等的肽合成機進行化學合成。
3.本發明的載體及導入了該載體的轉化酵母其次，本發明提供含有上述多核苷酸的載體。本發明的載體含有上述(a)～(1)中任一項所述的多核苷酸(DNA)。本發明的載體通常由含有(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)與該啟動子以正向或反向結合的、上述(a)～(1)中任一項所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有與RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷酸化有關的、在酵母中起作用的信號作為構成因子的表達框架構成。
導入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)、YCp型載體中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035，1979)均已為人所知，且易獲得。
用于調節酵母中基因表達的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用，同時又不受醪液中成分的影響，可任意組合。例如可利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如可通過M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中詳細記載的已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養缺陷型標記，所以，轉化時使用的選擇性標記可利用耐氨基糖苷類抗生素(Geneticin)基因(G418r)、耐銅基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐淺藍菌素基因(fas2m，PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學，64，660，1992；Hussain etal.，gene，101，149，1991)等。
如上所述構建的載體被導入宿主酵母。宿主酵母，為可用于釀造的任意的酵母，例如可為啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，雖可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，但在本發明中，可使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NCYC90等；還可使用例如協會葡萄酒用1號、同3號、同4號等的葡萄酒酵母；例如協會酵母、清酒用7號、同9號等的清酒酵母，但不限于此。本發明中，啤酒酵母例如可優選使用巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)。
酵母的轉化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methodsin yeast genetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實施，但不限于此。
更具體地說，將宿主酵母置于標準酵母營養培養基(例如YEPD培養基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養，使OD600nm的值為1～6。將此培養酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優選鋰離子進行預處理。將此細胞在約30℃條件、靜置約60分鐘后，與導入的DNA(約1～20μg)同時在約30℃條件、靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優選加入約4,000道爾頓(Dalton)的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃、靜置約30分鐘后，將此細胞在約42℃條件、加熱處理約5分鐘。優選將此細胞懸浮液用標準酵母營養培養基洗滌后，放入所定量的新鮮標準酵母營養培養基中，約30℃、靜置約60分鐘。之后，接種到含有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基中，獲得轉化體。
其他有關一般性的克隆技術，可參照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發明的酒類制造方法及根據其制法獲得的酒類將上述本發明的載體導入適合釀造的需制造酒類的酵母中，并可通過使用其酵母，制造所需要的、且減少了混濁生成量的酒類。另外，通過下述本發明的酵母評價方法選擇的酵母也可同樣使用。作為制造對象的酒類并不限于此，例如可為啤酒、發泡酒等的啤酒味飲料，葡萄酒、清酒等。
制造上述酒類時，除使用本發明中所得到的釀造酵母代替親株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往完全相同，不會為制造減少了混濁生成量的酒類而增加成本。即根據本發明，可在使用已有設施、不增加成本的情況下，制造出混濁穩定性等優異的酒類。
5.本發明的酵母的評價方法本發明涉及使用根據編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因堿基序列而設計的引物或探針，評價被檢酵母的混濁生成能力的方法。此種評價方法的一般手法為公知，例如，如WO 01/040514號公報、日本特開平8-205900號公報等的記載。以下，就此評價方法進行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因組為對象，使用根據編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因的堿基序列(優選ORF序列)設計的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的設計可使用公知的手法進行。
基因或特異性序列的檢測，可使用公知的手法進行。例如，將含有包含特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸作為一種引物使用，另一種引物使用含有包含此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸，通過PCR法擴增酵母的核酸，并測定擴增物的有無、擴增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數通常為10bp以上，優選為15～25bp。另外，夾在兩引物間的堿基數，通常300～2000bp較為適當。
PCR法的反應條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環數10次以上等的條件。所得到的反應生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，測定擴增產物的分子量。根據此方法，通過擴增產物的分子量是否含有特異部分的DNA分子的大小，來預測·評價其酵母的混濁生成能力。另外，通過分析擴增物的堿基序列，可進一步更正確地預測·評價上述性能。
本發明中，可通過培養被檢酵母，測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的表達量，評價被檢酵母的混濁生成能力。還有，基因表達量的測定，可通過培養被檢酵母，對編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因的產物mRNA或蛋白質進行定量來進行。mRNA或蛋白質的定量，可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量的RT-PCR等，蛋白質的定量例如可通過Western印跡法進行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。通過測定培養被檢酵母時所得到的發酵液中的混濁量，也可預測該被檢酵母中的上述基因的表達量。
而且，通過培養被檢酵母，測定具有序列號1或3堿基序列的本發明的基因表達量，選擇與目標混濁生成能力相應的基因表達量的酵母，可選擇適合釀造所需酒類的酵母。另外，培養標準酵母及被檢酵母，測定各酵母中前述基因的表達量，比較標準酵母和被檢酵母的前述基因表達量，以選擇所需的酵母。具體地說，例如，可通過培養標準酵母及被檢酵母，測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達的被檢酵母，來選擇適合所需酒類釀造的酵母。
或者可通過培養被檢酵母，選擇混濁生成能力低的酵母，以選擇適合所需酒類釀造的被檢酵母。
此時，被檢酵母或標準酵母，例如可使用上述導入了本發明載體的酵母、上述本發明的多核苷酸(DNA)表達增加了的酵母、上述本發明的蛋白質表達增加了的酵母、實施了突變處理的酵母、自發突變的酵母等。混濁的定量，例如可使用(P.W.Gales等J.Am.Soc.Brew.Chem.58，101-107(2000))中所述的方法進行。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學方法等的任何方法進行(例如，參照大島泰治編著、生物化學實驗法39酵母分子遺傳學實驗法、p67-75、學會出版中心等)。
還有，可作為標準酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為釀造時可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發明中，可使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且還可使用例如酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等的威士忌酵母；例如協會葡萄酒用1號、同3號、同4號等的葡萄酒酵母；例如協會酵母 清酒用7號、同9號等的清酒酵母，但不限于此。本發明中，啤酒酵母例如可優選使用巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。標準酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意組合選擇。
實施例以下，通過實施例詳細敘述本發明，但本發明不限于以下實施例。
實施例1編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因(nonScCWP2)的克隆使用日本特開2004-283169號公報中記載的比較數據庫檢索的結果，發現了啤酒酵母中特有的新型編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因nonScCWP2(序列號1)。以所得到的堿基序列的信息為基礎，設計用于擴增nonScCWP2全長基因的引物nonScCWP2_for(序列號5)/nonScCWP2_rv(序列號6)，以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株(可簡寫為“W34/70株”)的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonScCWP2全長基因的DNA片段(約0.3kb)。
將如上所述得到的nonScCWP2基因片段通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制)。將nonScCWP2基因的堿基序列用雙脫氧測序法(Sanger方法)(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進行分析，以確認堿基序列。
實施例2啤酒試驗釀造中nonScCWP2基因表達分析使用啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株進行啤酒試驗釀造，將從發酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
麥汁浸出物濃度12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度8.6ppm發酵溫度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL對發酵液經時抽樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經時變化。與此同時對酵母菌體抽樣，對制備后的mRNA進行生物素標記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制)進行。nonScCWP2基因表達模式如圖3所示。由此結果，可確認通常的啤酒發酵中nonScCWP2基因進行了表達。
實施例3nonScCWP2基因高表達株的制備將實施例1中所述的nonScCWP2/pCR2.1-TOPO用限制性內切酶SacI及NotI酶切，制備包含蛋白質編碼區域全長的DNA片段。使此片段與用限制性內切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構建了nonScCWP2高表達載體nonScCWP2/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子高表達。酵母中的選擇性標記包含耐氨基糖苷類抗生素(Geneticin)基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的nonScCWP2高表達載體，用日本特開平07-303475中所述的方法轉化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素300mg/L的YPD平板培養基(1％酵母浸出物、2％多蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉化體。
實施例4啤酒試驗釀造中混濁生成量的解析使用親株及用實施例3得到的nonScCWP2高表達株，通過以下條件進行了發酵試驗。
麥汁浸出物濃度11.85％麥汁容量 2L麥汁溶解氧濃度約8ppm發酵溫度 15℃一定酵母投入量10g濕酵母菌體/2L麥汁對發酵醪液經時抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量的經時變化。對醪液中混濁的定量，通過將醪液用5,000rpm、進行10分鐘離心，使懸浮酵母沉淀，回收離心上清液，將此樣品用于硅藻土過濾及混濁測定。上述樣品使用在孔徑為50μm的金屬網上的硅藻土過濾。過濾后，為營造易產生混濁的環境，在冰水中(0℃)保持24小時。將樣品的混濁用濁度計(Sigrist公司制、Sigrist光電計KTL30)測定，將此值作為T-haze(總混濁量)。將28℃下的冷凝固體物增溶溶解后測定的值作為P-Haze(永久混濁量)、將T-Haze和P-Haze的差值作為冷凝固體物引起的Haze值、C-Haze(冷凝固體物混濁量)。單位可使用Helm表示(1Helm＝0.1FTU(Formazin TurbidityUnit))(文獻；P.W.Gales等J.Am.Soc.Brew.Chem.58，101-107(2000))。所得結果如表1所示。
表1

根據表1所示，T-Haze生成量對于親株的64Helm，nonScCWP2高表達株為41Helm。另外，P-Haze量對于親株的46Helm，nonScCWP2高表達株為31Helm，C-Haze量對于親株的18Helm，nonScCWP2高表達株為10Helm。上述結果表明，由于nonScCWP2高表達，Haze量約減少34％-45％。且此時，親株與破壞株之間，增殖速度及浸出物消耗速度基本無差異。
該實施例得出的結果如圖4及圖5表示。圖4是表示此實施例的啤酒試驗釀造中酵母增殖量的經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。圖5是表示此實施例的啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
實施例5編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因(ScCWP2)的克隆設計用于擴增ScCWP2全長基因的引物ScCWP2_for(序列號7)/ScCWP2_rv(序列號8)，以S.cerevisiae X2180-1A的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有ScCWP2全長基因的DNA片段(約0.3kb)。
將如上所述得到的ScCWP2基因片段分別通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制)。將ScCWP2基因的堿基序列用雙脫氧測序法(Sanger方法)(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進行分析，以確認堿基序列。
實施例6啤酒試驗釀造中ScCWP2基因表達分析使用啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株進行啤酒試驗釀造，將從發酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
麥汁浸出物濃度12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度8.6ppm發酵溫度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL對發酵液經時抽樣，觀察酵母增殖量(圖4)、表觀浸出物濃度(圖5)的經時變化。與此同時，對酵母菌體抽樣，對制備后的mRNA進行生物素標記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用GeneChip OperatingSystem(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制)進行。ScCWP2基因表達模式如圖6所示。由此結果，可確認通常的啤酒發酵中ScCWP2基因進行了表達。
實施例7ScCWP2基因高表達株的制備從實施例5所述的質粒TOPO/ScCWP2中，制備含有用限制性內切酶XhoI及BamHI處理的ScCWP2基因的約0.7kb的DNA片段。使此片段與用限制性內切酶XhoI及BamHI處理的pUP3GLP2連接，構建了ScCWP2高表達載體pUP-ScCWP2。酵母表達載體pUP3GLP2是作為同源重組位點含有乳清苷-5-磷酸脫羧酶基因URA3的YIp型(染色體整合型)載體，導入的基因通過3-磷酸甘油醛脫氫酶基因TDH3的啟動子/終止子高表達。酵母中的選擇性標記，在半乳糖激酶基因GAL1的啟動子/終止子控制下整合抗藥性基因YAP1，并在含有半乳糖的培養基上誘導表達。另外，大腸桿菌中的選擇性標記，包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的nonScCWP2高表達載體，用日本特開平07-303475中所述的方法，轉化Weihenstephan Nr.164株。用含有淺藍菌素1.0mg/L的YPGal平板培養基(1％酵母浸出物、2％多蛋白胨、2％半乳糖、2％瓊脂)選擇淺藍菌素抗性株。
實施例8啤酒試驗釀造中混濁生成量的解析使用親株及用實施例7得到的ScCWP2高表達株，通過以下條件進行了發酵試驗。
麥汁浸出物濃度11.85％麥汁容量 2L麥汁溶解氧濃度約8ppm發酵溫度 15℃一定酵母投入量10g濕酵母菌體/2L麥汁對發酵醪液經時抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量的經時變化。對醪液中混濁的定量，通過將醪液用5,000rpm、進行10分鐘離心，使懸浮酵母沉淀，回收離心上清液，將此樣品用于硅藻土過濾及混濁測定。上述樣品使用置于孔徑為50μm的金屬網上的硅藻土過濾。過濾后，為營造易產生混濁的環境，在冰水中(0℃)保持24小時。將樣品的混濁用濁度計(Iigrist公司制、Sigrist光電計KTL30)測定，將此值作為T-haze(總混濁量)。將28℃下的冷凝固體物增溶溶解后測定的值作為P-Haze(永久混濁量)、將T-Haze和P-Haze的差值作為冷凝固體物引起的Haze值、C-Haze(冷凝固體物混濁量)。單位可使用Helm表示(1Helm＝0.1FTU(FormazinTurbidity Unit))(文獻；P.W.Gales等J.Am.Soc.Brew.Chem.58，101-107(2000))。所得結果如表2所示。
表2

根據表2所示，T-Haze生成量對于親株的33Helm，ScCWP2高表達株為24Helm。另外，P-Haze量對于親株的23Helm，ScCWP2高表達株為18Helm，C-Haze量對于親株的10Helm，ScCWP2高表達株為7Helm。上述結果表明，由于ScCWP2高表達，Haze量約減少22％～23％。此時，親株與破壞株之間，增殖速度及浸出物消耗速度基本無差異。
該實施例中得出的結果如圖7及圖8所示。圖7是表示此實施例的啤酒試驗釀造中酵母增殖量的經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。圖8是表示此實施例的啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
因根據本發明的酒類制造法可將啤酒釀造及產品中的混濁量抑制到很低的程度，所以，可制造出減少了混濁量的酒類。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>編碼細胞壁甘露糖蛋白的基因及其用途(Gene encoding cell wallmannoprotein and use thereof)<130>PCT05-0092<150>JP2005-276423<151>2005-09-22<150>JP2005-375016<151>2005-12-27<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>300<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>1atgcaattct ctactgtcgt ttccgtcgct ttcgtcgcct tggccaactt tgttgccgct 60gaatctgctg ccgccatctc tcaaattact gatggtcaaa tccaagctac cactgctacc 120accactgctc catccaccac tgccgctcca tccaccactg ctgctccatc ttcttcccac 180gttgaaaccg tttctgcttc cagcactgaa accatttctc aacaaactga aaatggtgct 240gctaaggccg ctgtcggtat gggtgccggt gctctagctg ccgctgctat gttgttgtaa 300
<210>2<211>99<212>PRT<213>酵母(Yeast)<400>2Met Gln Phe Ser Thr Val Val Ser Val Ala Phe Val Ala Leu Ala Asn1 5 10 15Phe Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly20 25 30Gln Ile Gln Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Thr Thr Ala35 40 45Ala Pro Ser Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Ser His Val Glu Thr Val50 55 60Ser Ala Ser Ser Thr Glu Thr Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn Gly Ala65 70 75 80Ala Lys Ala Ala Val Gly Met Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala85 90 95Met Leu Leu<210>3
<211>279<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>3atgcaattct ctactgtcgc ttccgttgct ttcgtcgctt tggctaactt tgttgccgct 60gaatccgctg ccgccatttc tcaaatcact gacggtcaaa tccaagctac taccactgct 120accaccgaag ctaccaccac tgctgcccca tcttccaccg ttgaaactgt ttctccatcc 180agcaccgaaa ctatctctca acaaactgaa aatggtgctg ctaaggccgc tgtcggtatg 240ggtgccggtg ctctagctgc tgctgctatg ttgttataa 279<210>4<211>92<212>PRT<213>酵母(Yeast)<400>4Met Gln Phe Ser Thr Val Ala Ser Val Ala Phe Val Ala Leu Ala Asn1 5 10 15Phe Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly20 25 30Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Glu Ala Thr Thr Thr Ala35 40 45Ala Pro Ser Ser Thr Val Glu Thr Val Ser Pro Ser Ser Thr Glu Thr50 55 60
Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn Gly Ala Ala Lys Ala Ala Val Gly Met65 70 75 80Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu85 90<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>5gagctcatag cggccatgca attctctact gtcgtttccg 40<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>6ggatcctatg cggccgcagg taaaaaggaa tcaaacactt ac 42<210>7<211>36
<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>7gagctcatgc aattctctac tgtcgcttcc gttgct 36<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>8ggatcccatt cgaagagaaa tcacaggaac atcgtt 3權利要求
1.從以下(a)～(f)組成的組中選擇的多核苷酸(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
2.按照權利要求1中所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)組成的組中選擇(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在十分嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
3.按照權利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.按照權利要求1中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
5.按照權利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
6.一種蛋白質，其由權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸編碼。
7.一種載體，其含有權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
8.一種載體，其含有從以下(j)～(1)組成的群中選擇的多核苷酸。(j)含有編碼由序列號4的氨基酸序列或序列號4的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列所組成的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有編碼具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列的，且作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(1)含有與序列號3的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號3的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在十分嚴格條件下雜交，且編碼作為細胞壁甘露糖蛋白起作用的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
9.一種酵母，其中導入了權利要求7或8中所述的載體。
10.按照權利要求9中所述的酵母，其通過導入權利要求7或8中所述的載體，降低混濁的生成能力。
11.按照權利要求10中所述的酵母，其通過使權利要求6中所述的蛋白質的表達量增加，降低混濁的生成能力。
12.一種酒類的制造方法，其使用權利要求9～11中任一項所述的酵母。
13.按照權利要求12中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
14.按照權利要求12中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
15.一種酒類，其用權利要求12～14中任一項所述的方法制造。
16.一種評價方法，其使用根據編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的堿基序列而設計的引物或探針，評價被檢酵母的混濁生成能力。
17.一種評價方法，其通過培養被檢酵母，測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的表達量，評價被檢酵母的混濁生成能力。
18.一種酵母的選擇方法，其為培養被檢酵母，對權利要求6中所述的蛋白質定量或測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因的表達量，選擇與目標混濁生成能力相應的前述蛋白質的生成量或前述基因表達量的被檢酵母。
19.按照權利要求18中所述的酵母的選擇方法，其為培養標準酵母及被檢酵母，測定編碼具有序列號1或序列號3堿基序列的細胞壁甘露糖蛋白的基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達的被檢酵母。
20.按照權利要求18中所述的酵母的選擇方法，其為培養標準酵母及被檢酵母，對各酵母中權利要求6中所述的蛋白質定量，選擇該蛋白質量比標準酵母多的被檢酵母。
21.一種酒類的制造方法，其特征在于，使用權利要求9～11中所述的酵母及通過權利要求18～20中所述方法選擇的酵母中的任一個酵母，進行用于酒類制造的發酵，調節混濁的生成量。
全文摘要
本發明提供一種制造降低了混濁生成能力的酒類釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。更具體地說，本發明涉及通過編碼釀造酵母的細胞壁甘露糖蛋白Cwp2p的ScCWP2基因或特別是提高啤酒酵母中的特征性的nonScCwp2基因的表達量，從而使產品中的混濁減少了的酵母、使用該酵母的酒類制造方法等。
文檔編號C07K14/39GK1936006SQ200610138878
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月21日 優先權日2005年9月22日
發明者中尾嘉宏, 兒玉由紀子, 下永朋子, 大村文彥 申請人:三得利株式會社