專利名稱：一種對葛根粗提物中染料木素選擇性的富集分離方法
技術領域：
本發明為復雜體系中微量組分的富集分離方法，具體地說是一種對染 料木素具有高選擇性、高親和性的分子印跡固相萃取技術。
技術背景異黃酮是存在于豆科植物中的一類天然化合物，許多研究表明異黃酮具有抗癌、抗氧化、清除自由基、降低膽固醇和雌激素活性等作用(J.Agric.Food Chem.， 41 (1993)1961; Chem. Pharm. Bull" 36(1988)2090; Lipids, 14 (1979) 535; J. Nutr" 84 (1964) 201; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., , 90 (1993) 2690)。做為植物雌，素，異黃酮不僅能緩解由于雌激素缺乏而導致的更年期癥狀，而且沒有毒副作用(Food Res. Int., 26 (1993 ) 131; Arch. Intern.Med.，16 (2001) 1161)，因此日益受到人們的重視。染料木素是具有較高雌激素活性的一種異黃酮類化合物，在植物中的含量較低。傳統的植物中活性成分分離純化方法是用有機溶劑萃取或大孔樹脂分離技術。這種方法不僅費時費力，而且選擇性較差，不利于中藥活性成份的分離表征。分子印跡技術是一種對特定化合物具有高親和性和選擇性的聚合物制 備技術。分子印跡聚合物因其制備簡單、性質穩定(耐高溫、耐酸堿、耐 有機溶劑)等優點使其在色譜分離aa^m她^.乂691 (1995)317.; / C7zTO/natogr，728 (1999) 1; Anal. Chim. Acta, 442 (2001) 105 )，傳感器(Anal. Chim. Acta 392 (1999)105.; Anal. Chem. 67 (1995) 2142.)，模擬酶催化(polymer 42 (2001) 2263) 以及固相萃取(Anal. Chem. 66 (1994) 1578.;爿朋/.Cfew.， 73 (2001) 2171; ^"a/. C&w., 72 (2000)4122.)等領域均有廣泛應用。近年來有學者將分子印跡技術用于中藥 有效成分的富集分離并獲得滿意的結果(J. Chromatogr. A ， 934 (2001) 1; ./. Ozrawfltogr.A 991 (2003) 151; J. Chromatogr. A ， 1098 (2005 ) 66)目前關于染半斗 木素的分子印跡固相萃取未見報導。發明內容本發明的目的是發展一種對染料木素高親和性、高選擇性的分子印跡 固相萃取方法。為實現上述目標，本發明采用的技術方案為首先川自制的200 mg 38 65pm的染料木素分子印跡聚合物微粒為填料，裝填出固相萃取柱，通過 對淋洗和洗脫條件的優化，發展了一種對葛根粗提物中染料木素具有高選 擇性、高親和性的富集分離方法。具體為a)以染料木素分子印跡聚合物微粒為填料制成固相萃取柱；
b)對步驟a制備的固相萃取柱進行活化、上樣，然后依次用體積比49-51%水的乙腈溶液、體積比4.9-5. 1%水的乙腈溶液對萃取柱進行淋洗， 最后用體積比0. 18-0. 22%TEA的甲醇溶液洗脫；洗脫液蒸干得產品。步驟b)中是依次采用甲醇、乙腈對萃取柱進行活化所述染料木素分子印跡聚合物微粒為:以染料木素為模板，4-乙烯基吡 啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈為引發劑、 四氫呋喃為制孔劑，按模板:功能單體:交聯劑:引發劑:致孔劑二lmmol : 4. 9-5. 1 mmol : 19—21 mmol : 39-41mg : 5.4-5.8ml的配比，于55漏65。C聚 合18-24小時制備出聚合物，經研磨過篩、萃取除去模板后，得到的38~65pm 的分子印跡聚合物微粒。所述萃取是采用甲醇/乙酸體積比9: 1、甲醇依次萃取除去模板，萃取 次數可為反復萃取5-20次。本發明具有如下優點本發明的優點為葛根乙醇粗提物經分子印跡固相萃取后，除去了多 數干擾成分，得到了清潔的色譜圖，染料木素的回收率達70%以上。同時大 豆黃素也有明顯的保留。本方法能夠對復雜體系中染料木素實現選擇性的 富集分離，在對葛根粗提物樣品前處理方面有著廣闊的應用前景。
圖l為本發明葛根乙醇總提物分子印跡固相萃取前后色譜圖；其中a: 葛根乙醇總提物色譜圖；b:經分子印跡固相萃取后的色譜圖；C:經非印 跡柱固相萃取后的色譜圖；其中橫坐標為時間，縱坐標為吸光度。
具體實施方式
實施例l將處理過的粒徑為38 65,的染料木素分子印跡聚合物微粒200mg裝于 內徑為lcm、長10cm的固相萃取小柱中，柱中底部和上部塞上玻璃篩板。萃 取實驗在自制的固相萃取裝置上進行。上樣前萃取柱依次用5ml甲醇、5ml 乙腈活化；然后lml 0.378 mg/ml葛根總提物的乙腈溶液上樣，再依次用 2ml5(F。水的乙腈溶液、lml 5%水的乙腈溶液淋洗，最后用2ml0. 2。/。TEA的甲 醇溶液洗脫，洗脫液用氮氣吹干后l ml 60%水的乙腈溶液流動相定容，然 后對染料木素進行色譜分析。葛根乙醇總提物分子印跡固相萃取前后色譜圖比較 葛根乙醇總提取物用乙醇配制成O. 378mg/ml的供試液，然后按前述方法進行分子印跡固相萃取。結果表明分子印跡固相萃取后，除去了多數干 擾成分，得到了清潔的色譜圖，如圖1所示，染料木素的阿收率達70%以上。 同時大豆黃素也有明顯的保留。
權利要求
1. 一種對葛根粗提物中染料木素選擇性的富集分離方法，其特征在于步驟如下，a)以染料木素分子印跡聚合物微粒為填料制成固相萃取柱；b)對步驟a制備的固相萃取柱進行活化、上樣，然后依次用體積比49-51％水的乙腈溶液、體積比4.9-5.1％水的乙腈溶液對萃取柱進行淋洗，最后用體積比0.18-0.22％TEA的甲醇溶液洗脫；洗脫液蒸干得產品。
2. 按照權利要求1所述富集分離方法，其特征在于步驟b)中是依次 采用甲醇、乙腈對萃取柱進行活化。
3. 按照權利要求1所述富集分離方法，其特征在于所述染料木素分 子印跡聚合物微粒為:以染料木素為模板，4-乙烯基吡啶為功能單體，乙二 醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈為引發劑、四氫呋喃為制孔劑， 按模板:功能單體:交聯劑:引發劑:致孔劑^mmo1 : 4.9-5.1 mmol : 19-21 mmol : 39-41mg : 5.4-5.8ml的配比，于55-65。C聚合18-24小時制備出聚 合物，經研磨過篩、萃取除去模板后，得到的38 65pm的分子印跡聚合物微 粒。
4. 按照權利要求3所述富集分離方法，其特征在于所述萃取是采用 甲醇/乙酸體積比9: 1、甲醇依次萃取除去模板。
5. 按照權利要求4所述富集分離方法，其特征在于所述萃取次數為反復萃取5-20次。
6. 按照權利要求1所述富集分離方法，其特征在于步驟a)中固相萃取填料的量是200mg，柱內徑為lcm、長10cm;對步驟a制備的固相萃取柱進行活化、上樣，上樣量為1 ml 0.3~0.5 mg/ ml葛根總提物的乙腈溶液，然后依次用2ml 50%水的乙腈溶液、lml 5%水 的乙腈溶液對萃取柱進行淋洗，最后用2ml0. 2%TEA的甲醇溶液洗脫。
全文摘要
本發明為復雜體系中微量組分的富集分離方法，具體地說是一種對葛根粗提物中染料木素選擇性的富集分離方法，步驟如下，a)以染料木素分子印跡聚合物微粒為填料制成固相萃取柱；b)對步驟a制備的固相萃取柱進行活化、上樣，然后依次用體積比49-51％水的乙腈溶液、體積比4.9-5.1％水的乙腈溶液對萃取柱進行淋洗，最后用體積比0.18-0.22％TEA的甲醇溶液洗脫；洗脫液蒸干得產品。本發明的優點為葛根乙醇粗提物經分子印跡固相萃取后，除去了多數干擾成分，得到了清潔的色譜圖，染料木素的回收率達70％以上。同時大豆黃素也有明顯的保留。該方法在對葛根粗提物樣品前處理方面有著廣闊的應用前景。
文檔編號C07D311/00GK101210004SQ20061013509
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月27日 優先權日2006年12月27日
發明者巖 張, 青 徐, 梁鑫淼, 王金成, 章飛芳, 薛興亞 申請人:中國科學院大連化學物理研究所