一種重組人胰島素的制備方法

專利名稱：一種重組人胰島素的制備方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質多肽類藥物領域，尤其涉及一種重組人胰島素的制備方法。
背景技術：
糖尿病是僅次于心血管和腫瘤的第三大致死疾病，現今世界上已有2億糖 尿病患者，而且每年新增約600萬新病例，每年死于糖尿病及相關并發癥者達 到320萬(2006年6月美國糖尿病年會報告)。胰島素是治療糖尿病的特效藥， 尤其是在治療I型糖尿病和II型糖尿病晚期患者時，還沒有其它藥物可以代替。 胰島素在臨床上已經成功地應用了80多年。隨著生物技術的發展，重組人胰島 素已經逐漸取代了動物內臟提取的動物胰島素。隨著對糖尿病患者人群的擴大 和胰島素用藥方式的多樣化(口服給藥、肺部給藥和口腔噴霧給藥等)，胰島素 的用量迅速增加，因此，提高胰島素的產量，降低胰島素的生產成本，滿足廣 大糖尿病患者用藥的需求，不僅具有重要的經濟意義，而且具有重要的社會意 義。
目前應用大腸桿菌表達重組人胰島素生產方式主要要包括三種方式 一種是 美國Eli Lilly and Company(禮來公司)1982年采用的重組大腸桿菌分別表達胰 島素的A鏈和B鏈，表達產物經氰化溴(bromine cyanide, CNBr，中文別名 溴化氰)切下多余片段后，得到的A鏈和B鏈經純化后再進行復性，最后得到 有活性的重組人胰島素。由于A鏈和B鏈共存在6個半胱氨酸，復性率只有 10%左右，所以采用這條工藝路線生產胰島素的成本高，每克成本在100美元 以上。第二種也是美國Eli Lilly and Company建立的，目前仍然采用此工藝生 產年產量達十幾噸的重組人胰島素。將含有A鏈、B鏈和C肽的胰島素原在大腸桿菌中表達，在這種人胰島素原表達工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能 形成良好的空間構象，三對二硫鍵的正確配對率也相應提高，折疊率高達80% 以上。雖然這條工藝路線并不比A、 B鏈分別表達法更為簡捷，在去除肽鏈過
程中使用了 CNBr，而且還要使用胰蛋白酶和羧肽酶B兩種高純度的酶制劑， 但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產品的成 本僅50美元。第三種方式是采用丹麥NovoNordisk公司(諾和諾德公司)所采 用的A、 B鏈同時表達的方法，在A鏈前端和A、 B鏈中間均有甲硫氨酸，表 達后純化的產物經CNBr處理，得到A鏈和B鏈，再經過復性和純化得到有活 性的重組人胰島素，這種方式與第一種方式同樣存在復性率低和生產成本高的 問題。
現有重組人胰島素的生產方法中存在在生產過程中使用劇毒CNBr之技術 缺陷。通過吸入、食入、經皮吸收，對人體健康造成極大危害，例如吸入后引 起頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、虛弱、驚厥、昏迷、咳嗽、呼吸困難，重者發生 肺水腫，可致死；對眼和皮膚有強烈刺激性。其危險特性在于與水或水蒸氣 接觸會放出劇毒、易燃和腐蝕性的溴化氫和氰化氫氣體。有不純物質存在時能 很快引起分解，并引起爆炸。因而操作條件苛刻，對環境保護措施要求高。另 外簡化重組人胰島素的生產工藝、提高收率和降低生產成本不但可以滿足臨床 對胰島素用藥量的需求，也可以滿足越來越多中低收入患者和發展中國家糖尿 病患者的對重組人胰島素價格的要求。

發明內容
發明人經過廣泛而深入的研究，對大腸桿菌表達重組人胰島素的制造方法 進行了改進，經過廣泛試驗改進了胰島素原包涵體的溶解、包涵體純化和胰島素原的酶切轉化條件。最終實現了避免使用CNBr，簡化重組人胰島素的生產工藝并提高了重組人胰島素的收率。
因而，本發明所要解決的技術問題是提供一種大腸桿菌表達重組人胰島素的
制備方法以克服現有技術中存在的使用有毒有害物質CNBr、生產工藝復雜之技 術缺陷。
本發明的一種重組人胰島素的制備方法，包括如下步驟
(a) 表達重組人胰島素原的大腸桿菌菌體破碎，收集包涵體；
(b) 洗滌包涵體，然后溶解包涵體使人胰島素原磺化；
(c) 用陽離子交換法純化步驟(b)的人胰島素原；
(d) 純化的人胰島素原復性，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切轉化；
(e) 用陰離子交換法純化步驟(d)的酶切產物；和
(f) 用本領域常用的方法結晶人胰島素，
其特征在于，步驟(b)所述的人胰島素原磺化是通過將人胰島素原中的胱氨酸 殘基的巰基(一SH)取代為一ssor實現的。
優選地， 一種重組人胰島素的制備方法，其特征在于，溶解包涵體的條件是:
終濃度為50mM的EDTA、終濃度50mM的Tris-HCl、終濃度為6M的尿素、終 濃度為0.2M的亞硫酸鈉、終濃度為0.1M的連四硫酸鈉、pH9.0-10.5。
更優選地， 一種重組人胰島素的制備方法，其特征在于，經陽離子交換法純 化的人胰島素原S —磺酸鹽復性的條件是蛋白濃度0.5 1.0mg/mL。進一步優
選的重組人胰島素的制備方法，其特征在于人胰島素原復性的條件是緩沖液
為含1M尿素的50mM的Gly緩沖液(pH11.5)，通氮氣，巰基乙醇的濃度與胰島 素原的摩爾比為1: 3 6。
所說的重組人胰島素原的結構與天然人胰島素原相同或不同，包括完整的人
胰島素的A鏈和B鏈，其C鏈和人胰島素原相同或不同，例如可以是改短的C 鏈。重組人胰島素原還可以包含一段前導的序列。尤其是用本領域技術人員常 用的分子生物學技術設計高等電點(pi)的胰島素原。
步驟(c)和步驟(e)所述的陽離子交換法和陰離子交換法所采用介質可以 是本領域常用的介質，可以通過多種商業途徑購得。優選地步驟(c)的陽離子 交換介質采用強陽離子交換介質，如SPSepharoseFF(GE Healthcare),步驟(e) 的陰離子交換介質釆用TEME介質。更優選地步驟(c)的層析條件是將步驟 (b)溶解的包涵體溶液用6M尿素稀釋，4。C條件下離心，上清上SP Sepharose FF柱進行層析，用lMNaCl洗柱，再用含3M乙酸鈉、1MNaCl的洗脫液平 衡，收集洗脫峰。步驟(e)的陰離子交換法采用本領域技術人員熟知的方法進 行，或者按照廠家推薦的方法活化陰離子交換介質、進行層析操作。
胰島素結晶的方法在本領域是已知的，例如可以參見CN1390854A公開的方法。
本發明的重組人胰島素的制備方法具有如下有益的技術效果本發明針對 一種高等電點的胰島素原，提供一種簡便高效的純化方法，大腸桿菌表達的胰 島素原包涵體經溶解后，通過陽離子交換柱一步純化后，純度可達到95%以上， 純化后的胰島素原復性率可達60%以上，復性后再經胰蛋白酶和羧肽酶B酶切， 通過陰離子交換柱純化后的純度可達99.0%以上，收率為500mg/100g菌體。再 通過結晶得到的產品與重組人胰島素標準品的化學結構和生物活性相同。本發 明在整個工藝過程中不使用CNBr等有毒試劑和有機溶劑，工藝簡單，快速高效， 所有操作過程均可以在室溫或4t:環境下進行，從而大大降低了純化過程的生產 成本，適合大規模生產重組人胰島素。


圖1是本發明的流程圖。
圖2是表達重組人胰島素原的大腸桿菌菌體破碎全菌、上清和經洗滌的包涵 體的SDS——PAGE檢測結果，泳道1是全菌，泳道3是包涵體。
圖3是陽離子柱層析純化磺化胰島素原目的峰SDS—PAGE檢測結果。
圖4是胰島素原經胰蛋白酶和羧肽酶B酶切轉化后的電泳結果，泳道2系胰 島素原、泳道3是胰蛋白酶酶切后、4是羧肽酶B酶切后、泳道5是胰島素標準 品，顯示本發明的胰島素和胰島素標準品具有相同的分子量。
圖5是酶切產物的陰離子交換層析圖譜。
圖6是胰島素產物的HPLC檢測結果，A為人胰島素標準品，B為本發明的 人胰島素。
以下結合具體的實施方法詳細描述本發明的構思，所有的實施例描述無論多 么詳細和具體，都不意味著對本發明的范圍的限制，本發明保護的范圍由權利 要求的法律結構唯一決定。所有的試驗操作，除非特別說明均按照本領域技術 人員常用的方法進行。
實施例1重組人胰島素的制備
步驟l:菌體破碎和包涵體收集
每100g濕菌體加1升TE緩沖液[5mM EDTA; 50mM Tris-HCl(pH9.0)]混 勻，均質機中700 750bar條件下破碎，至菌體完全破碎后用離心機進行離心，
收集沉淀。得到的沉淀主要是包涵體，按以下方法洗滌三次，除去大部分雜質
每100g沉淀用1LSTET緩沖液[5mMEDTA; 50mM Tris-HCl(pH 9.0); Triton-X 100， 3% (V/V)]混勻，室溫下攪拌30min;再次進行離心，收集沉淀；洗滌后 的包涵體通過SDS-PAGE檢測，見附圖1所示，可以看到其組分已經較少，純度較高，可以進行包涵體溶解。
步驟2:包涵體溶解
將洗滌后的包涵體按1: 4 (w/v)加入冷水混勻，再依次加入0.5M EDTA 至終濃度為50mM、 Tris-HCl至終濃度50mM、尿素至終濃度為6M、亞硫酸鈉 至終濃度為0,2M、連四硫酸鈉至終濃度為0.1 M，調節PH至9.0-10.5，在室溫
下將混懸液攪拌混勻后，移至4'C攪拌至混懸液全部溶解，在此過程中，胰島素 前體中的一SH被取代為一SSO—3而得到磺化的胰島素原。
步驟3:陽離子柱層析
將溶解后的包涵體溶液用6M尿素稀釋10倍，4'C條件下離心，棄去不溶物， 將可溶性溶液收集后上SPSepharoseFF柱進行層析，首先用1MNaCl洗柱，再 用含3M乙酸鈉、1M NaCl的洗脫液平衡SP柱后，樣液上柱，收集洗脫峰， 量體積，測蛋白濃度，計算蛋白總量，見附圖2所示。由于在包涵體洗滌和溶 解過程中，將不溶性的雜質除去，所以在收集到的洗脫峰中，胰島素原S—磺酸 鹽的含量較高，純度可達95%以上。
步驟4:復性與酶切
經SP柱純化的胰島素原S —磺酸鹽，用含1M尿素的50mM的Gly緩沖 液(pH11.5)稀釋，使蛋白濃度達到0.5mg/ml，立即脫氣，充入氮氣，加入現配制 的巰基乙醇溶液，使其濃度與胰島素原的摩爾比為1: 3，在4。C攪拌12小時； 通過此步驟折疊，至少有60%胰島素原S —磺酸鹽可以折疊成正確構像。
折疊后的胰島素原，不需經過純化可直接進行胰蛋白酶和羧肽酶B的酶切， 酶切條件如下按蛋白總量的1/1000加入羧肽酶B，攪拌5 10分鐘后，按蛋 白總量的1/1000加入胰蛋白酶，室溫下溫和攪拌5 10小時，充分進行酶切， 切除胰島素原中的多余氨基酸，形成正確的胰島素分子，酶切后的電泳圖見附圖3。
步驟5:陰離子層析
折疊和酶切后的溶液使用TEME層析柱進行純化，用含50mMTris-HCl(pH 9.0)、 lMNaCl洗柱，再用50mMTris-HCl(pH9.0)平衡后，樣液上柱，收集洗 脫峰，必要時改變PH條件再純化一次，整個過程都在4"C條件下完成，色譜圖 見附圖4。經過此純化步驟之后，得到的溶液中胰島素純度達到99.0%以上。
步驟6:鋅沉淀與結晶
將收集到經的陰離子層析純化的溶液加入醋酸鋅溶液，至醋酸鋅終濃度 (WAO為1%，在室溫下進行沉淀，沉淀用醋酸鋅和擰檬酸溶液(參加專利 CN 1390854A)進行溶解，溶解后條件PH至6.0 6.1,攪拌2小時。4'C放置12 小時，離心，依次用冷水、丙酮、乙醚各洗滌一次，干燥，稱重，見附圖5。 實施例2重組人胰島素的制備
經SP柱純化的胰島素原S—磺酸鹽，用含1M尿素的50mM的Gly緩沖 液(pH11.5)稀釋，使蛋白濃度達到0.75mg/ml，立即脫氣，充入氮氣，加入現配 制的巰基乙醇溶液，使其濃度與胰島素原的摩爾比為h 3，在4。C攪拌12小時; 通過此步驟折疊，至少有60。％胰島素原S—磺酸鹽可以折疊成正確構像。其它 操作同實施例1。胰島素純度達到99.0%以上，SDS—PAGE檢測和胰島素標準 品具有同樣的分子量。和人胰島素標準品具有同樣的RP—HPLC保留特性。 實施例3重做人胰島素的制備
經SP柱純化的胰島素原S—磺酸鹽，用含1M尿素的50mM的Gly緩沖 液(pH11.5)稀釋，使蛋白濃度達到1.0mg/ml，立即脫氣，充入氮氣，加入現配制 的巰基乙醇溶液，使其濃度與胰島素原的摩爾比為1: 6，在4。C攪拌12小時。 其它同實施l。胰島素純度達到99.0%以上，SDS—PAGE檢測和胰島素標準品具有同樣的分子量，和人胰島素標準品具有同樣的RP—HPLC保留特性。
實施例4重組人胰島素RP—HPLC檢測
實施例1的純化人胰島素和胰島素標準品，分別按美國藥典USP28th的方法進行RP—HPLC檢測，圖6。
權利要求
1.一種重組人胰島素的制備方法，包括如下步驟(a)表達重組人胰島素原的大腸桿菌菌體破碎，收集包涵體；(b)洗滌包涵體，然后溶解包涵體使人胰島素原磺化；(c)用陽離子交換法純化步驟(b)的人胰島素原；(d)純化的人胰島素原復性，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切轉化；(e)用陰離子交換法純化步驟(d)的酶切產物；和(f)用本領域常用的方法結晶人胰島素，其特征在于，步驟(b)所述的人胰島素原磺化是通過將人胰島素原中的胱氨酸殘基的巰基(-SH)取代為-SSO3-實現的。
2. 根據權利要求1的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，溶解包涵體的條件是終濃度為50mM的EDTA、終濃度50mM的Tris-HCl、終濃度為6M的尿素、終濃度為0.2M的亞硫酸鈉、終濃度為0.1M的連四硫酸鈉、pH9.0-10.5。
3. 根據權利要求2所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，經陽離子交換法純化的人胰島素原S —磺酸鹽復性的條件是蛋白濃度0.5 1.0mg/mL。
4. 根據權利要求3所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，人胰島素原復性的條件是緩沖液為含1M尿素的50mM的Gly緩沖液(pH11.5)，通氮氣， 巰基乙醇的濃度與胰島素原的摩爾比為1: 3 6。
5. 根據權利要求4所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，步驟(c)的陽離子交換介質采用強陽離子交換介質SP Sepharose FF，步驟(e)的陰離子交 換介質采用TEME介質。
6. 根據權利要求5所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，步驟(c)的層析條件是將步驟(b)溶解的包含體溶液用6M尿素稀釋，4℃條件下離心，上清上SPSepharoseFF柱進行層析，用1MNaCl洗柱，再用含3M乙酸鈉、lMNaCl的洗脫液平衡，收集洗脫峰。
7.根據權利要求1 6任一所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，所述的人胰島素原有高等電點。
全文摘要
本發明一種重組人胰島素的制備方法涉及蛋白質多肽類藥物領域。本發明所要解決的技術問題是提供一種大腸桿菌表達重組人胰島素的制備方法以克服現有技術中存在的使用有毒有害物質CNBr、生產工藝復雜之技術缺陷。本發明的重組人胰島素的制備方法包括菌體破碎、包涵體溶解、胰島素原磺化、純化胰島素原、胰島素原復性和酶切轉化等步驟，特征在于在包涵體溶解的過程中將胰島素原的-SH轉化為-SSO₃^-，經過陽離子純化該磺化的胰島素原、還原復性、酶切轉化再經過陰離子交換層析純化獲得人胰島素。本發明的重組人胰島素的制備方法不使用CNBr，工藝簡單、人胰島素的收率和純度高。
文檔編號C07K14/62GK101173006SQ20061011774
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者文良柱, 曹韞旭, 王偉剛 申請人:江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司