專利名稱：：調節植物生長素敏感性及葉片面積的基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于基因工程領域，涉及到一種植物激素生長素結合蛋白AtABP2基因及其在調節植物對生長素敏感性及葉片面積中的應用。
背景技術：
：生長素(Auxin)是最早發現的一種植物激素，其廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子及胚芽鞘等器官中。生長素也是應用最早和最廣的廣譜植物生長調節劑，在農業生產上被廣泛應用。在生產上利用合成的生長素可以有以下幾大方面的作用(l)促進扦插的枝條生根、(2)促進果實發育、(3)防止落花落果。另外，高濃度的生長素類似物也可作為除草劑，除去田間的雙子葉類雜草。生長素結合蛋白1(AuxinBindingProtein,ABP1)在諸多物種中均有發現。對植物來說，己知生長素結合蛋白1影響植物早期胚胎的發育，細胞伸長等過程(Chen等，GENES&DEVELOPMENT15:902-911)。然而，在目前的植物種植培育中，為了使植物良好地生長，仍然需要施與大量的生長素，大大提高了種植成本，因此本領域迫切需要找到一些降低植物對生長素需求的途徑，從而降低農業種植成本。
發明內容本發明的目的在于提供一種新的生長素結合蛋白2(ABP2)及其用途。本發明的目的還在于提供利用所述的生長素結合蛋白2或其編碼基因改良植物的方法。在本發明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。在本發明的另一優選例中，(a)所述多肽的功能是調節植物對生長素敏感性功能和/或調節植物葉片面積。在本發明的另一優選例中，該多肽是具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，所述的多核苷酸選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，所述的多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。在本發明的另一優選例中，所述的多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的序列。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有所述的載體；或基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發明的第五方面，提供一種所述的多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞，獲得培養物；(b)從培養物中分離出所述的多肽。在本發明的第六方面，提供所述的多肽的用途，用于調節植物對生長素的敏感性或植物葉片面積；或制備對生長素敏感性高的植物，或制備葉片面積增加或葉片面積減小的植物。在本發明的另一優選例中，所述的多肽可用于提高植物對生長素的敏感性，或增加植物葉片的面積。在本發明的另一優選例中，所述的植物選自(但不限于)下組禾本科、薔薇科、十字花科。在本發明的另一優選例中，所述的植物包括(但不限于)擬南芥、水稻、煙草、瓜果、蔬菜、油菜等。在本發明的第七方面，提供一種制備對生長素敏感性高或葉片面積大的植物的方法，所述的方法包括(1)將所述的多核苷酸轉入植物細胞、組織或器官(如花苞)，獲得轉化入所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(l)獲得的轉入了所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。在本發明的另一優選例中，所述的方法包括步驟(Sl)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的多核苷酸；(s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(sl)中的農桿菌接觸，從而使所述的多核苷酸轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(S3)選擇出轉入了所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1為野生型植株與基因過表達株系和下調株系對生長素敏感度比較圖。圖1A為未添加生長素的野生型和變異株系對生長素的敏感度比較；圖1B為添加相應生長素的野生型和變異株系對生長素的敏感度比較。其中，WT為野生型擬南芥，aZ^2為ABP2基因表達下調的株系。sZ^^-d為ABP2基因表達上調的株系。a^^與野生型相比，對生長素喪失了部分敏感性，即比野生型對生長素的敏感性差，與基因下調的對生長素的反應正好相反的是，基因上調的株系W;^W/在和野生型相比較時對生長素超敏感。圖2為野生型植株與基因過表達株系葉片面積比較圖，WT為野生型擬南芥，W;^-J為ABP2基因表達上調的株系。基因上調的株系a6p2-t/與WT相比，Wp2-d葉片面積明顯比野生型大，說明ABP2基因參與葉片增大的正調控過程。縱列第l列指蓮座葉第l片，第2列表示蓮座葉第2片，之后依次類推。圖3為野生型植株與基因過表達株系葉片面積比較的統計結果。其中，"☆"表示與野生型相比有顯著性，P〈0.05，表示與野生型相比有顯著性，p〈0.01。具體實施例方式本發明人經過長期的研究，找到一種新的蛋白一一生長素結合蛋白2(AuxinBindingProtein2，ABP2)，并且將之與植物的生長素敏感性相關聯，發現ABP2蛋白的過表達能夠提高植物對生長素的敏感性，而ABP2的低表達或缺失表達使得植物對生長素不敏感。并且，本發明人還發現，ABP2基因還參與了調節植物葉片面積的大小，ABP2在葉中的高表達使得植物的葉片面積增大，而低表達或缺失表達使得植物的葉片面積減小。基于此完成了本發明。如本文所用，所述的"植物"包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的"植物"包括但不限于十字花科蕓薹屬的擬南芥、禾本科的水稻、玉米、薔薇科的櫻桃，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。如本文所用，所述的"對生長素敏感性高的植物"是指在施加外源生長素后，所述植物的一些已經證明的對生長素的響應指標(如在一定生長素濃度下發生根的伸長，側根增加以及葉片增大等)高于同種植物(如正常野生型的植物、或ABP2表達低或不表達的植物)，此處"高"的指標基于數據分析中顯著性差異的值(比如PO.Ol)。如本文所用，所述的"葉片面積大的植物"或"葉片面積增加的植物"是指一種植物，其在適當的生長條件下生長至一定階段時(如抽薹時)比在相同條件下同種植物(如正常野生型的植物、或ABP2表達低或不表達的植物)的葉片面積顯著大(如大10%以上；如大10-40%，更優選的大30-40%)。所述的"葉片面積小的植物"或"葉片面積減小的植物"是指在適當的生長條件下生長至一定階段時(如抽薹時)比在相同條件下同種植物的葉片面積顯著小的植物。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的ABP2蛋白"或"分離的ABP2多肽"是指ABP2蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化ABP2蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括ABP2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的ABP2蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。任何一種ABP2蛋白的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這里，ABP2蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的ABP2蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長ABP2蛋白的活性。在更優選的條件下，所述活性片段能夠保持全長ABP2蛋白的60X、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。在本發明中，術語"ABP2蛋白"指具有ABP2蛋白活性的SEQIDN0:2序列的多肽。該術語還包括具有與ABP2蛋白相同功能的、SEQIDN0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為IO個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括ABP2蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與ABP2蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗ABP2蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含ABP2蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了ABP2蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有ABP2蛋白序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。發明還提供ABP2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然ABP2蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他己知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，"ABP2蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDN0:2的氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。表1<table><row><column>氨基酸殘基</column><column>代表性的取代</column><column>優選的取代</column></row><row><column></column><column>Ala(A)</column><column>Val;Leu;lie</column><column>Val</column></row><row><column></column><column>Arg(R)</column><column>Lys:Gin;Asn</column><column>Lys</column></row><row><column></column><column>Asn(N)</column><column>Gin;His;Lys;Arg</column><column>Gin</column></row><row><column></column><column>Asp(D)</column><column>Glu</column><column>Glu</column></row><row><column></column><column>Cys(C)</column><column>Ser</column><column>Ser</column></row><row><column></column><column>Gin(Q)</column><column>Asn</column><column>Asn</column></row><row><column></column><column>Glu(E)</column><column>A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對生長素敏感性或調節的葉片面積的組合物。本發明還涉及ABP2的激動劑或拮抗劑及其用途。由于ABP2的激動劑或拮抗劑可調節ABP2的表達和/或調節ABP2的活性等，因此，所述的ABP2的激動劑或拮抗劑也可通過對ABP2的影響來調節植物對生長素的敏感性或調節植物葉片面積，從而達到降低植物培植的成本的目的。任何可調節ABP2蛋白的活性、調節ABP2蛋白的穩定性、促進或抑制ABP2蛋白的表達、延長或減少ABP2蛋白有效作用時間、或促進或降低ABP2的轉錄和翻譯的物質均可用于本發明，作為可用于調節植物對生長素敏感性或調節植物葉片面積的有效物質。本發明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調節所述植物中ABP2基因或其同源基因的表達。一方面，本發明提供了一種使植物對生長素敏感性高或葉片面積大的方法，所述的方法包括使所述植物過量表達ABP2蛋白。另一方面，本發明還提供了一種使植物的葉片面積減小的方法，所述的方法包括降低所述植物中ABP2蛋白的表達(包括使ABP2蛋白不表達或低表達)。在得知了所述的ABP2蛋白的用途后，可以采用本領域人員熟知的多種方法來調節所述的ABP2蛋白的表達。比如可通過一定的途徑將攜帶ABP2基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表達活性的ABP2蛋白。此外，也可以采用本領域人員熟知的多種方法來降低ABP2蛋白的表達或使之缺失表達，比如將攜帶反義ABP2基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到耙點上，使得細胞或植物組織不表達或降低表達ABP2蛋白。作為本發明的一種實施方式，將編碼ABP2蛋白的基因通過常規的方法克隆到適當的載體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導入到可表達所述ABP2蛋白的植物細胞中，使所述的植物細胞表達ABP2蛋白。可通過將所述植物細胞再生成植物，獲得過量表達ABP2蛋白的植物。優選的，所述的制備對生長素敏感性高或葉片面積大的植物的方法包括(1)將外源的ABP2蛋白的編碼基因轉入植物細胞、組織或器官(如花苞)，獲得轉化入ABP2蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了外源ABP2蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物植株。作為一種優選的實例，所述的方法包括步驟:(sl)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有ABP2蛋白的編碼基因；(s2)將植物細胞、組織、器官與步驟(sl)中的農桿菌接觸，從而使ABP2蛋白的編碼基因轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(s3)選擇出轉入ABP2蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。其它增加ABP2基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過用強啟動子驅動從而增強ABP2基因或其同源基因的表達。或者通過增強子(如水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子等)來增強該ABP2基因的表達。適用于本發明方法的強啟動子包括但不限于35s啟動子、水稻、玉米的Ubi啟動子等。此外，本發明還涉及利用植物對生長素的敏感性或植物葉片面積性狀作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。此外，還可利用該基因的葉片面積或生長素敏感性特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。此外，本發明還提供篩選調節植物對生長素敏感性或調節植物葉片面積的潛在物質的方法。在得知了所述的ABP2蛋白的用途后，可以采用本領域熟知的多種方法來篩選調節植物對生長素敏感性或調節植物葉片面積的潛在物質。在本發明的一種優選方式中，提供一種篩選調節植物對生長素敏感性或調節植物葉片面積的潛在物質的方法，所述的方法包括將候選物質與表達ABP2蛋白的體系接觸，檢測候選物質對ABP2蛋白的影響；若所述候選物質可提高或降低ABP2蛋白的表達，或促進或抑制ABP2蛋白的活性，則表明其是可用于調節植物對生長素的敏感性或調節植物葉片面積。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠對于調節植物對生長素敏感性或調節植物葉片面積有用的物質。因此，本發明還包括通過所述的篩選方法獲得的物質，所述的物質可用于調節植物對生長素的敏感性或調節植物葉片面積。更具應用價值地，所述的物質是促進植物對生長素敏感性，或增加植物的葉片面積。在本發明的一個實例中，提供了一種獲自擬南芥的ABP2基因，該基因全長663bp，編碼220AA的一條多肽，所述的基因如SEQIDNO:l所示。其編碼的蛋白如SEQIDNO:2所示。本發明人通過克隆該ABP2基因，用該ABP2全長基因的DNA片段構建原核蛋白表達載體，然后利用["C]IAA證明了ABP2的生長素結合能力。為了論證該ABP2的用途，本發明人從SalkT-DNA插入文庫中篩選得到了ABP2過表達的擬南芥株系和ABP2下調表達的擬南芥株系，將野生型ABP2與過表達和下調表達的株系之間進行比較研究。研究表明，相比野生型擬南芥，T-DNA插入突變的過表達ABP2基因的擬南芥對于生長素引起的生長效應更加敏感，說明ABP2基因在生長素控制的根的伸長，葉片面積增大(因ABP2控制細胞分裂等過程中起著正調節因子的作用，因而ABP2基因過表達株系對于外源施加的生長素非常敏感，基于這一特性，ABP2基因可以用于調節植物對于生長素的敏感性，應用于生產，可以大大降低田間生長素的施用量，降低農業成本。而ABP2對于葉片面積的調節也可以使轉基因植物根據實際生產需要改變葉片大小，從而改良植物產量和品質。利用ABP2基因調節植物對于生長素(如吲哚乙酸，2，4二氯苯氧乙酸)的敏感性，可以使轉基因植株對于外源施加的生長素非常敏感。該轉基因植株應用于生產，可以大大降低田間生長素的施用量，從而降低農業成本。利用ABP2基因調節葉片面積的功能，可以使轉基因植物根據實際生產需要改變葉片大小，從而改良植物產量和品質。這一發現不僅具有理論意義，同時也顯示了ABP2基因在現代農業中的應用前景。本發明的主要優點在于首次將分離了一種新的蛋白一一生長素結合蛋白2(ABP2)，并將之與植物的生長素敏感性相關聯，發現ABP2能夠用于調節植物對生長素的敏感性。并且，該蛋白還能調節植物的葉片面積。所述蛋白對于植物培植領域具有廣泛的應用價值，其能夠使植物對生長素更敏感，從而可大大降低田間生長素施用量，可非常有效地降低農業成本；或者可根據實際生產需要改變葉片大小，從而改良植物產量和品質。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sarabrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照以下文獻中公布的方法CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Devkslereds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。或按照制造廠商所建議的條件。實施例1ABP2基因的獲得發明人根據一個據預測可能編碼ABP基因的未知cDNA片段(即GenBank登錄號AC068602的片段，其中未記載該片段的任何功能)，設計如下引物正向引物5'-ATGGCGTTAGAACTATGGC-3(SEQIDNO:3);反向引物5'-CTACTCCTCCTTCTTCAAC-3(SEQIDNO:4)。通過常規的噬菌體PCR篩庫法篩選擬南芥下胚軸cDNA的文庫(購自擬南芥生物研究中心，ABRC)，發現了一個編碼ABP的新的基因，所述的基因全長663bp，編碼220AA的一個多肽，所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，其編碼的蛋白如SEQIDN0:2所示。接著，本發明人將上述基因在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網站做BLAST分析，找到了該基因在擬南芥染色體上的位置(l號染色體)。本發明人將該基因命名為ABP2(AuxinBindingProtein2)。到目前為止，對于ABP2基因的功能研究及其應用尚未見任何文獻報道。實施例2ABP2基因的克隆參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾(美)編著，黃培堂等譯，科學出版社，北京，2002)，以擬南芥葉片為原料，采用RNA提取試劑盒(TrizolIV，上海順華生物工程公司)，按照產品說明書操作提取擬南芥RNA。采用RNA反轉錄試劑盒(FSKIOI，TaKaRa(大連)公司)，按照產品說明書操作將獲得的RNA反轉錄為cDNA。反轉錄反應條件為30℃，10min;42℃，30min;99℃，5min;4℃，5min。以反轉錄得到的cDNA為模板，采用以下引物對進行PCR擴增ABP2-1:5'-ATGGCGTTAGAACTATGGC-3'(SEQIDNO:3);ABP2-2:5'-CTACTCCTCCTTCTTCAAC-3'(SEQIDNO:4)。以pfu聚合酶擴增所述的cDNA，PCR反應條件為94℃，3min，1次循環；94℃，49sec，58℃，40sec，72℃，50sec，28次循環；72℃，10min，1次循環。擴增產物經測序，其序列如SEQIDNO:1所示，不包含3，端polyA共663bp長，表明克隆產物為ABP2基因。實施例3ABP2蛋白表達載體的構建以及蛋白的表達2.1設計以下引物對ABP2-3(其中，下劃線表示7VcoI酶切位點)5'-CATGCCATGTTTCCATGCAAATCAGCCG-3'(SEQIDNO:5);ABP2-4(其中，下劃線表示J力oI酶切位點)5'-CCGCTCGAGAGTTGTATCATCAGTCCTAAA-3'(SEQIDNO:6)。以實施例1中得到的陽性克隆為模板，用pfu聚合酶擴增(全長蛋白導致原核表達宿主致死)的cDNA，PCR反應條件為30°C，10rain;42°C，90min;95°C，5min;4°C，60min。根據實施例1所獲得的SEQIDNO:2序列，刪除掉N端的20個氨基酸(全長蛋白導致原核表達宿主致死)，因而得到編碼序列長度為600bp的DNA片段，將該片段克隆到pET32C載體(Novagen,Inc.Madison,Wisconsin,美國)中，并經測序予以確認，從而構建出ABP2基因的原核蛋白表達載體。2.2以常規的CaCl2處理法(參見《分子生物學實驗技術》，郝福英等編著，北京大學出版社，北京，1998)制備大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen,Inc.Madison，Wisconsin,美國)感受態，通過電擊轉化法將實施例2.1所構建的原核表達載體轉化大腸桿菌。挑取陽性克隆，放入含卡那霉素(Km)的LB培養液(胰蛋白胨lOg/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調pH至7.5)中，在37攝氏度培養箱中利用IPTG(終濃度1mM)誘導ABP2蛋白的表達，分離提純蛋白，進而用于進行生長素結合分析。實施例4ABP2過表達株系和下調株系的鑒定本發明搜索了ABP2的T-DNA插入突變體(獲自SalkT-DNA插入突變體庫，獲自SALK研究所，或參見網站w冊.signal,salk.edu)，發現登錄號Salk—022981的植株為ABP2過表達株系(稱為abp2-d，登錄號Salk—657-F8的植株為ABP2的下調株系(稱為abp2)。首先，通過抗性篩選和分離比分析結果表明，T-DNA插入突變體的插入位點在突變體基因中只有一個；其次，根據SALK網站提供的相應突變體的插入位點的信息，在插入位點兩端設計引物ABP2-Pl和ABP2-P2，分別與SALK網站提供的檢測引物LBal通過PCR檢測可確定T-DNA的插入位點在ABP2基因內部。由上述兩點證明，突變體的突變部位僅限于ABP2基因。具體地，上述對ABP2基因表達下調的株系aZ^么以及ABP2基因表達上調的株系進行驗證，實驗方法及步驟如下1、基因組DNA的提取以常規CTAB(十六垸基三甲基溴化銨)法提取擬南芥基因組DNA。2、反轉錄反轉錄反應條件為3CTC，10min;42°C，30min;99°C，5min;4°C，5min。以反轉錄得到的cDNA為模板，采用以下引物對進行PCR擴增。3、PCR擴增和檢測T-DNA上的引物(LBal):5'-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3，(SEQIDNO:7);ABP2-P1(SEQIDNO:8):5'-AATTATCTCAGCTTTCTCCAAC-3';ABP2-P2(SEQIDNO:9):5'-TGAATACCATACGTTGACAATG-3'。用RT-PCR法，鑒定結果a/A為ABP2基因表達下調的株系；Wp2-d為ABP2基因表達上調的株系。且突變體的突變部位僅限于ABP2基因。擬南芥在人工氣候室，每天于22"C下光照培養16小時黑暗培養8小時。實施例5對不同濃度的幾種生長素的敏感性實驗取WT、abp2(ABP2基因表達下調)、abp2-d(ABP2基因表達上調)三個株系的種子，經20X漂水+iy。Tween20震蕩漂洗16-18分鐘后，用無菌水漂洗三遍。消毒處理后的種子置于MS培養基表面上，4攝氏度春化48小時，在人工氣候室豎直培養3天后，選取生長狀態良好的幼苗移植至含有0.01nM剛哚乙酸(IAA)、2，4二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)，或1mMIAA、2，4-D，NAA，以及不含任何添加生長素的MS培養基上再豎直培養三天，觀察表型。高濃度的生長素對植物的主根伸長有抑制作用，而低濃度的生長素對植物的主根伸長有促進作用，故植物的根長是測定植株本身對生長素敏感性的重要指標。本發明人選取了兩個濃度(lum與0.Olnm)的生長素分別處理野生型植株以及ABP2的突變體植株，觀察植株對生長素的敏感性是否會由于ABP2的表達量多少而發生改變。實驗結果中，植株表型如圖l所示，結果見表l。其中，相對根長為IAA處理情況下主根的長度(設為100%)相對于未處理植株主根長度的百分比。表lABP2影響植株對生長素的敏感性<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage21</column></row><table>因上表可見，與野生型相比，abp2在高濃度IAA條件下根的變短較野生型為少，而abp-d的根短趨勢則更加劇烈，說明ABP2降低表達使植株對IAA喪失了部分敏感性，即比野生型對IAA的敏感性差。而過量表達ABP2的植株則具有較高的IAA敏感性。同理，ABP2的減少使植株對2，4-D的敏感性也降低，其表達的增加也可以造成對2,4-D敏感性的增加。實施例6ABP2基因調節葉片面積的變化選取WT、abp2-d(ABP2基因表達上調)兩個株系的種子，經2(m漂水+l《Tween20震蕩漂洗16-18分鐘后，用無菌水漂洗三遍。消毒處理后的種子置于MS培養基表面上，4攝氏度春化48小時，在人工氣候室豎直培養5天后移栽至土中，取20天時的苗進行表型觀察和葉片電鏡掃描。表型如圖2所示，實驗統計結果如圖3所示。由圖可知，abp2d(ABP2基因表達上調)株系的蓮座葉從第2片開始均比野生型的面積顯著增大，說明ABP2基因在葉片增大過程中起到正調控因子的作用。實施例7ABP2上調表達植株和下調植株的構建根據實施例1所獲得的SEQIDNO:2序列，正方向亞克隆至p35S1301載體(參見LiuW,XuZH，LuoD，XueHW.(2003).RolesofOsCKIl，aricecaseinkinaseI，inrootdevelopmentandplanthormonesensitivity.PlantJ.36，189-202)的多克隆位點內，構建出ABP2的正義表達載體；將該序列反方向亞克隆至pl300載體的多克隆位點內，構建出ABP2的反義表達載體，再分別利用常規的農桿菌轉化法轉入擬南芥植株中，構建ABP2的上調表達基因植株和下調表達基因植株。在ABP2上調表達植株中，蓮座葉表型與abp2表型一致，均有增大的趨勢。實施例8ABP2基因的變異基因及其功能重復實施例3，不同點在于額外地對實施例3獲得的質粒進行定點誘變，獲得SEQIDNO:1中第26位由c變為t(從而使得第9位氨基酸由Ala變為Val)的基因，構成ABP2基因的變異基因Mut.1。對制備的ABP2基因的變異基因Mut.1，根據實施例7的方法構建超表達ABP2蛋白的轉基因植株和低表達的轉基因植株，用實施例5的方法測定所述植株對不同濃度的幾種生長素的敏感性，并與野生型相比較，結果表明用所述的變異基因制備的轉基因植株對生長素的敏感性顯著高于野生型，且葉片面積顯著大于野生型。本發明人在擬南芥ABP2基因功能研究過程中發現，基因下調及上調植株表型明顯，性征可以遺傳。并且，ABP2基因的調節作用還可用于其它經濟植物例如水稻、煙草、瓜果、蔬菜、油菜等的品質改良及生產。討論擬南芥作為一種典型的模式植物，具有生長周期短、個體形態小和基因組小的特點，在植物分子生物學研究中已經成為非常重要的工具。擬南芥是一種珍貴的實驗模型，對于理解光合作用和其他植物的特有的功能、以及在分子和細胞水平上理解高等生物共有的基本過程具有重要意義。雖然以上僅以擬南芥為實驗材料、以BL21質粒為蛋白表達載體、以T-DNA插入突變體作為基因過表達和下調的轉基因株系對本發明的技術方案進行了闡述，但是根據本發明的公開，采用其他表達載體和轉基因方法同樣可以方便地構建出ABP2過量表達和下調(達到基因上調或下調的目的)轉基因株系，這對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。因此，采用其他表達載體和轉基因方法構建出其他種類植物的ABP2的過量表達和下調轉基因株系，同樣應屬于本發明的范圍。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院<120〉調節植物生長素敏感性及葉片面積的基因及其應用<130〉066105<160〉9<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉663<212>DNA<213〉擬南芥<400>1atggctactctcc犯ataccttctgctcttttaagatctttccttcttatgttttgtctc60tttgtaatcccatctctctcatctgattctgatcctttacaagacttctgcgttggcgat120ctcaaagcttctgcttccatcaatggctttccatgcaaatcagccgtttctgcttctgac180ttcttctactccggtttaggtggccccttagacacgtcaaaccctaacggagtaaxxgtt240gctcccgccaacgtcttaaccttcccgggtctaaacactttaggaatctcgatgaataac300gttgagctagctccaggaggtgtaaatccgcctcacttgcacccgcgtgcaaccgaagta360ggaactgtgatcgaaggctcggtgtttgtcggattcttgagtaccaacaacactttgttc420tcaaaagttttgaatgcaggagaggcgtttgttatccctagaggattggttcatttccaa480tggaacgttggccaagtgaaagcgcgaatgataaccgcttttaacagccagctcccagga540gcagttgttttgcctagtactctgttcggctcgaaacctgagattccaaacgcagtcctg600accagagcgtttaggactgatgatacaactgtgcagaatctcaagtccaagtttgctgtt660663<210>2<211〉220<212>PRT<213>擬南芥<400〉2MetAlaThrLeuGinlieProSerAlaLeuLeu1510MetPheCysLeuPheVallieProSerLeuSer2025LeuGinAspPheCysValGlyAspLeuLysAla3540GlyPheProCysLysSerAlaValSerAlaSer5055GlyLeuGlyGlyProLeuAspThrSerAsnPro657075AlaProAlaAsnValLeuThrPheProGlyLeu8590ArgSerPheLeuLeu15SerAspSerAspPro30SerAlaSerlieAsn45AspPhePheTyrSer60AsnGlyValThrVal80AsnThrLeuGlylie95<formula>seeoriginaldocumentpage25</formula><210〉3<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉3atggcgttagaactatggc19<210〉4<211>19<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>raise—feature〈223〉引物<400〉4ctactcctccttcttcaac19〈210〉5<211>28<212〉DNA<213>人工序列<220>〈221〉raise—feature<223〉引物<400〉5catgccatgtttccatgcaaatcagccg28<210><211〉<212><213〉<220><221〉<223〉630腿人工序列isc—featurei物<400〉6ccgctcgagagttgtatcatcagtcctaaa30<210><211〉<212〉〈213〉〈220〉<221><223〉722腿人工序列misc—feature引物〈400〉7tggttcacgtagtgggccateg22<210〉<211><212><213><220><221〉〈223>822DNA人工序列misc—feature引物<400〉8aattatctcagctttctccaac22<210〉9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>9tgaataccatacgttgacaatg2權利要求1.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。2.—種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，所述的多核苷酸選自下組(a)編碼如權利要求l所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。4.一種載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的多核苷酸。5.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞-含有權利要求4所述的載體；或基因組中整合有權利要求2所述的多核苷酸。6.—種權利要求l所述的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，獲得培養物；(b)從培養物中分離出權利要求l所述的多肽。7.權利要求l所述的多肽的用途，其特征在于，用于調節植物對生長素的敏感性或植物葉片面積；或制備對生長素敏感性高的植物，或制備葉片面積增加或葉片面積減小的植物。8.一種制備對生長素敏感性高或葉片面積大的植物的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將權利要求2所述的多核苷酸轉入植物細胞、組織或器官，獲得轉化入權利要求2所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了權利要求2所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。9.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(Sl)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求2所述的多核苷酸；(s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(sl)中的農桿菌接觸，從而使權利要求2所述的多核苷酸轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(s3)選擇出轉入了權利要求2所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。全文摘要本發明公開了一種新的具有調節植物對生長素敏感性或調節植物葉片面積功能的生長素結合蛋白。本發明還公開了所述蛋白的編碼基因，含有所述基因的載體和細胞。本發明還公開了利用所述的基因制備生長素敏感性高的植物的方法，以及利用所述的基因制備具有合適的葉片面積的植物的方法。本發明的蛋白對于植物培植領域具有廣泛的應用價值，其能夠使植物對生長素更敏感，從而可大大降低田間生長素施用量，可非常有效地降低農業成本；或者可根據實際生產需要改變葉片大小，從而改良植物產量和品質。文檔編號C07K14/415GK101173001SQ20061011772公開日2008年5月7日申請日期2006年10月30日優先權日2006年10月30日發明者珂殷,薛紅衛申請人:中國科學院上海生命科學研究院