專利名稱：：作物籽粒灌漿基因gif1及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于基因技術和植物學領域。更特別的，本發明涉及新的作物籽粒灌漿基因G/F/及其應用。
背景技術：
：當前，對于農作物產量改良的研究主要集中在以下幾個方面1.增加作物的源，即加強作物的光合作用；2.增加作物庫的大小；3.提高作物光合產物由源向庫運輸的能力。其中，增大庫的容量和提高光合產物向庫運輸的能力是有效的育種途徑。盡管人們采取了許多方式來提高農作物的產量和對農作物進行改良，然而，目前還缺乏有效的手段。例如，我國的主要糧食作物水稻，當前的許多水稻高產栽培品種尤其超級雜交稻和大穗大粒品種存在籽粒灌漿不飽滿的情況，這在很大程度上影響了水稻產量的進一步提高。因此，本領域迫切需要找到有效的手段，解決農作物籽粒灌漿不飽滿的問題，從而進一步改良農作物，實現農作物產量和品質的提高。
發明內容本發明的目的在于提供一種新的作物籽粒灌漿基因及其應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的作物籽粒灌漿蛋白，所述蛋白選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDN0:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進作物籽粒灌漿功能的由(a)衍生的多肽。在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組(i)編碼所述的作物籽粒灌漿蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽。在本發明的另一優選例中，該多核苷酸具有選自下組的序列(l)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；C2)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或(3)與(1)或(2)所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發明的第五方面，提供所述的作物籽粒灌漿蛋白或其編碼基因的用途，用于調節作物籽粒灌漿(更優選的，為促進作物籽粒灌漿)；調節作物籽粒的糖代謝或積累；或提高作物籽粒的抗病性或耐儲藏性。在本發明的第六方面，提供一種改良作物的方法，該方法包括增加所述作物中作物籽粒灌漿基因的表達。在本發明的第七方面，提供一種制備轉基因植物的方法，它包括步驟將所述的多核苷酸導入植物細胞或組織中，培養所述的植物細胞或組織，再生成植物。在本發明的另一優選例中，所述的方法包括步驟(a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的籽粒灌漿蛋白的編碼基因；(b)將作物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使該籽粒灌漿蛋白DNA編碼序列轉入作物細胞、組織或器官，并且整合到作物細胞的染色體上；(c)將轉入了所述籽粒灌漿蛋白DNA編碼序列的作物細胞、組織或器官再生成作物植株。在本發明的第八方面，提供一種所述的作物籽粒灌漿蛋白或其編碼基因的激動劑或拮抗劑。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了Gi7^基因對于米質的影響，其中，圖1A表示野生型植株的糙米顆粒，圖1B表示突變型植株的糙米顆粒，圖1C表示表示野生型植株的精米顆粒，圖1D表示突變型植株的精米顆粒。圖2顯示了^T^基因對于種子活力的影響，其中，WT(左)表示ZH11野生型植株，p'/7(右)表示ZHll突變型植株。圖3顯示了W尸基因對植株穗部的影響，其中，WT表示ZH11野生型植株的穗，F1表示ZH11野生型與ZH11突變型雜交的第l代的穗，^'/7表示WT表示ZH11突變型植株的穗。圖4顯示了含有突變型^Y7基因的植株的種子上分離獲得的代表性的倉儲病害，圖4A和圖4C(對圖4A的放大)為分離得到的根霉菌(朋"o/^s卬.)；圖4B和圖4D(對圖4B的放大)為分離得到的鏈格孢菌"he/77sw's邵.)。圖5顯示了^F7基因的組織特異性。其中，A，根；B，節間；C，伸長的節間；D，2天；E，4天；F，6天；G，IO天；H，15天；I，25天；J，穎殼；K，10天種子橫切面；L，突變體和野生型GIF1基因的表達情況；M，GIF1基因在幼苗，葉，根，節間，穗的表達情況(其中，LS代表水稻幼苗、L代表水稻葉子、R代表水稻根、I代表水稻節間、P代表水稻穗子)；N，GIF1基因在開花后不同時間的表達情況；DAF(DayAfterFlowering)指開花后天數。圖6顯示了G/f7基因對籽粒的糖代謝與積累的影響，其中總淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉。具體實施例方式本發明人經過深入的研究，首次發現了一個控制作物籽粒灌漿的基因，該基因的不表達或降低表達可嚴重影響作物籽粒的灌漿，降低種子粒重。通過精細定位，本發明人克隆了該基因，并將之命名為作物籽粒灌漿基因《/,7，fo"^/2T/7co/職Jete/^"^^"。試驗證實，基因正常表達的野生型植株的籽粒正常生長，而^F7基因發生突變、不表達GIF1蛋白后，植株的米質差，種子活力低、對倉儲病害的抗性差。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，所述的"作物"包括但不限于禾本科植物。更優選的，所述的禾本科植物包括但不限于小麥、大麥、玉米、高粱等。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的GIF1蛋白"或"分離的GIF1多肽"是指GIF1蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化GIF1蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括GIF1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的GIF1蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語"GIF1蛋白"指具有GIF1蛋白活性的SEQIDNO:2序列的多肽。該術語還包括具有與GIF1蛋白相同功能的、SEQIDN0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地l-30個，更佳地1-20個，最佳地卜10個，還更佳如1-8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為IO個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括GIF1蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與GIF1蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗GIF1蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含GIF1蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了GIF1蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有GIF1蛋白序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。發明還提供GIF1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然GIF1蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、y-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，"GIF1蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發明還提供了編碼本發明GIF1蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發明中是指編碼具有SEQIDN0:2的蛋白質，但與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDN0:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，6CTC;或(2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDN0:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少IOO個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼GIF1蛋白的多聚核苷酸。應理解，雖然本發明的GIF1基因優選獲自水稻，但是獲自其它植物的與水稻GIF1基因高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本發明考慮的范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如BLAST。本發明的GIF1蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或GIF1蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science，1984;224:1431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的GIF1蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼GIF1蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，GIF1蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含GIF1蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨節青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得籽粒灌漿能力或籽粒品質發生改變的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。重組的GIF1蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進或對抗GIF1蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組GIF1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激GIF1蛋白功能的多肽分子。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用GIF1蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測GIF1蛋白的轉錄產物。本發明還涉及一種改良作物的方法，該方法包括增加所述植物中GIF1基因或其同源基因的表達。增加GIF1基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過用強啟動子驅動從而增強GIF1基因或其同源基因的表達。或者通過增強子(女口水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子等)來增強該GIFl基因的表達。適用于本發明方法的強啟動子包括但不限于35s啟動子、水稻、玉米的Ubi啟動子等。作為本發明的一種優選方式，所述的改良作物的方法包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有GIF1蛋白DNA編碼序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使該GIF1蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述GIF1蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織；和(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織再生成植株。其中，可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施此方法。此外，本發明還涉及利用作物籽粒灌漿性狀作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。此外，還可利用該基因的籽粒灌漿特性作為雜交制種過程中真雜種的才旨不豐示i己。在本發明的一個實例中，提供了一種G/^7基因，其基因組序列為6840bp(SEQIDNO:3)，其中開放閱讀框(ORF)位于2380-2594，3723-4605，4994-5152，5903-6168，6276-6364，6651-6840位，全長cDNA(SEQIDNO:l)為1797bp，編碼一個含有598個氨基酸的蛋白質(SEQIDNO:2)。所述的G/尸/基因可為作物的品種改良提供新的途徑，因而具有巨大的應用前景。本發明的主要優點在于(1)首次分離得到一種新的作物籽粒灌漿基因^7=7，該基因具有控制種子灌漿的功能，同時也有調控品質的功能。(2)作物籽粒灌漿基因WF7可以作為控制作物籽粒灌漿，提高產量和品質的一個基因，應用于作物品種的改良。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照以下文獻中公布的方法CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Devkslereds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。或按照制造廠商所建議的條件。材料和方法1.pCAMBIA1301-GZP7的克隆和轉化G/W用Munl、BamHl酶切后，連接到用BamHI和EcoRI酶切的pBluescriptsk+中(購自Stratagene公司)，得到的克隆再用HindIII和BaraHI酶切，并克隆到用相同酶切的pCAMBIA1301(參見htt.p://www,bios,net/daisy/cambia/585.html#dsy585—gus—intron)中，得至UpCAMBIA1301-d尸7。將pCAMBIA1301-GIFl轉入農桿菌1.把l微克的pCAMBIA1301-GIFl的質粒加入到農桿菌EHA105(參見HoodE.E.，Gelvin，S.B.，Melchers，L.S.禾卩Hoekema,A.，TransgenicRes.，1993,2,208-218)的感受態中，冰上放置30分鐘；2.液氮冷凍1分鐘；3.放到37"C的溫水中直到液體融化；4.加入1毫升YEP在28度培養2-4小時；5.取200微升涂在含有抗生素的YEP平板上；6.28r放置兩天直到陽性克隆出現，選出陽性克隆。2.水稻成熟胚愈傷組織的誘導及轉化ZH11和突變體(^'/7)的種子去殼，70%乙醇浸泡lrain，20%(v/v)NaC10浸泡20min，并不停搖晃，用無菌水沖洗5-6次，使無異味且米粒呈現乳白色。無菌濾紙吸干后，在NBD/N6培養基上誘導愈傷，26。C暗培養一周后，剝愈傷組織，剔去胚乳，胚芽，胚根等。愈傷組織繼代于NBD/N6培養基(sigma公司)上暗培養，每2-3周繼代一次作為受體。3.農桿菌介導水稻愈傷組織的轉化1.愈傷組織接種在NBD/N6培養基上25-26"暗培養4天；2.配制YEBCM培養基待用；3.將含有重組質粒pCAMBIA1301-d尸7的農桿菌EHA105劃YEB培養基(含Kan50ul/ml，Rif20ug/ml)上，28。C200rpm36hr;4.養至0D660為1.0-1.5;5.將愈傷組織轉移到一無菌三角瓶；6.將適量前述培養的農桿菌EHA105菌液倒入三角瓶(保證浸沒所有愈傷材料)；7.室溫放置20min，適量晃動；8.倒去菌液，用無菌濾紙吸去多余菌液，然后轉移至NBD培養基(+AS100)上；9.20-25°C，共培養2-3天；10.將共培養后的愈傷組織轉移到無菌三角瓶，用含有500mg/L羧卞青霉素(Carbenicillin)的無菌水洗去農桿菌，2-3次；11.然后轉移到篩選培養基(含有NBD+Timent(特美丁)200mg/l+潮霉素(Hyg)50mg/l)上進行轉化細胞的篩選，3周為一周期，篩選2-3輪；12.2-3周后，可將經過預分化的愈傷組織移到分化培養基(含有NB+BAP2mg/l+NAA0.5mg/1)上培養，16hr光照，8hr暗，26°C;13.2-3周后，可將抗性再生植株轉移至生根培養基(含有1/2MS+NAA0.5mg/1)上壯苗生根；14.3周后，再生抗性植株洗凈瓊脂，移栽于溫室收種子并作為分子鑒定材料。實施例l群體的構建、基因的克隆及功能研究本發明人從水稻中花ll(ZHll)誘變突變體庫中，發現了一個水稻突變體，該突變體的種子的灌漿受到較為嚴重的影響，營養生長和野生型相比沒有變化，但籽粒灌漿受到嚴重影響，種子千粒重減少15-30%,并且米質變差，本發明人將之命名為(^ra^j'/7coz^Jez^/iJh';^7)，說明^T尸7基因是一個重要的通過灌漿控制產量和米質的基因。本發明人通過gi/7突變體和珍汕97雜交得到基因定位群體。利用BSA(BulkedSegregantAnalysis)分析法，以均勻分布在水稻12條染色體上的130對SSR引物對LIF1位點進行掃描，將位點初步定位在4號染色體長臂SRD5附近，最終將LIF1基因定位在caps-4和caps-8之間的32Kb中，經預測這段區域共包含三個基因，本發明人通過對突變體和野生型的DNA的測序，發現在突變體中有一個堿基的缺失(d尸7基因組DNA序列第4588位)。通過對f/F7的精細定位，通過測序和功能驗證，得到野生型67—尸7的基因組(DNA)序列見SEQIDN0:3(包括驅動子)；編碼區的序列(cDNA序歹lj)見SEQIDNO:1;GIF1蛋白的序列見SEQIDNO:2。當發生前述的突變(G/Z^基因組DNA序列第4588位缺失)后，突變型不表達GiW蛋白。實施例2677^7基因對種子灌漿和產量的影響本發明人對比了從f'"突變型和G/F7野生型的中花11(ZH11)植株獲得的米粒的各項表型，結果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>因此，^'/7突變體影響種子灌衆，降低產量，而轉基因互補可以消除該影響，并控制水稻的灌漿，從而可實現提高產量。實施例36TF7基因對于米質的影響具有野生型G/F7基因的糙米和精米的顆粒大且飽滿，而6TF/基因不表達的突變型的顆粒小且不飽滿。本發明人構建了含有G/F7基因的pC認BIA1301-677^7重組質粒，并轉化突變體(^'/7)的愈傷組織，得到突變型的轉基因植株，發現轉基因植物能恢復到野生型的狀態。結果見圖1。由結果可見，具有野生型G/尸7基因的糙米和精米的顆粒大且飽滿，而G/F7基因不表達的突變型的顆粒小且不飽滿。因此，突變型突變體降低米質，而轉基因互補可以消除該影響，提咼品質o此外，發明人還進行了過量表達GIF1的植株與野生型植株的比較，發現過量表達GIF1可使籽粒比野生型更飽滿。實施例4G/F7基因對于種子活力的影響具有野生型G77^基因的植株根系發達、葉子生長迅速，而具有突變型^/基因的植株根系明顯不發達、葉子生長明顯緩慢。本發明人構建了含有Gi7^7基因的pCAMBIA1301-G/尸7重組質粒，并轉化突變體(&/7)的愈傷組織，得到突變型的轉基因植株，轉基因植物的根系，葉子能恢復到野生型的狀態。結果見圖2，具有野生型G/Z^7基因的植株根系發達、葉子生長迅速，而具有突變型gi/基因的植株根系明顯不發達、葉子生長明顯緩慢。由結果可見，gi/7突變體降低種子活力，而轉基因互補可以消除該影響。實施例5677^7基因對于種子穗部和倉儲病害的抗性本發明人構建了含有G/尸7基因的pCAMBIA1301-67F7重組質粒，并轉化突變體(^Y7)的愈傷組織，得到突變型的轉基因植株，轉基因植物對倉儲病害恢復到野生型的狀態。結果見圖3和圖4。由圖3可知，從含有野生型G/尸基因的植株獲得的麥穗顆粒飽滿；而從含有突變型^'/基因的植株獲得的麥穗顆粒明顯干癟，且其穗子對病害更敏感。圖4為從含有突變型w'/基因的植株的種子上分離獲得的代表性的倉儲病害，圖4A為分離得到的根霉菌UMz叩^印,)；圖4B為分離得到的鏈格孢菌"Bw77sn'asa);此外，還分離到其它一些倉儲病害。由結果可見，gi/7突變體降低對穗部和倉儲病害的抗性，縮短糧食儲藏期；而轉基因互補可以消除該影響，并提高抗性。實施例6WF7基因的組織特異性本發明人構建G/F7基因的啟動子連3-葡糖醛酸酶基因(GUS)的克隆，并轉化水稻ZHll，觀察GIFl啟動子啟動GUS報告基因和GIFl基因的組織特異性表達。具體的構建方法如下-用正向引物tataagcttgatcggccatactcc(SEQIDNO:4)禾卩反向弓|物taggatccctttgctctcacacttg(SEQIDNO:5)，以G/尸7的基因組DNA為模板，PCR得到^尸7基因的啟動子，并克隆載體pBI101(購自Clonetech公司，帶有GUS)，再用EcoR1、Hindni酶切，回收片斷，將該片斷連入用相同酶切的pCAMBIA1300便得到了pCAMBIA1300+啟動子+GUS的相應克隆(組織顯色方法見Jeferenson,RA(1987)PlantMolBiolR印)。結果見圖5A-K，可知^F7基因在植株的根部、節間、種子的背腹部的微管束有特異性表達。此外，采用RT-PCR的方法，從所述的野生型或突變型植株中抽提mRNA，通過RT-PCR分別擴增GiF厶將獲得的擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。結果見圖5L-N，其中，圖5L是突變體gj了7和野生型的mRNA的RT-PCR檢測結果；圖5M是水稻不同組織mRNA的RT-PCR檢測結果；圖5N是不同時期(MF)水稻穗部組織mRNA的RT-PCR檢測結果。實施例7GIFl對籽粒的糖代謝與積累的影響本發明人構建了含有W尸7基因的pCAMBIA1301-67F7重組質粒，并轉化突變體(W'/7)的愈傷組織，得到突變型的轉基因植株，觀察轉基因植株的糖代謝與積累，并與野生型的ZH11進行比較。結果見圖6，可見GIF1能夠調節籽粒的糖代謝與積累，從而調節米質。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院〈120〉作物籽粒灌漿基因GIF1及其應用<130>065311<160〉5<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉1797<212〉DNA〈213>稻屬(0ryzasativaL.)<400〉1atgggagttcttggtagtagggtcgcttgggcatggctggtccagctgctgctgctccag60cagctcgccggagcgtcgcacgtcgtctacgacgacctcgagctgcaggcggctgctacc120acagcggacggcgtgccgccgtccatcgtcgactctgagctccggactgggtatcacttc180CagCC3CCC3agaactggatcaatgatccgEL3CgCgCCgatgtactacaaggggtggtac240catctgttctax;cagtaca^ccccaagggcgccgtgtgggggaacatcgtgtgggcgcac300tcagtgtcacgtgacctcatcaactgggtggcgctc幼gccggccatcgagcccagcatc360agtacggctgctggtcggggtcggcgacg已tgatggccgacgggacgccg420gtgatcatgtacaccggcgtc^ccgccccgacgtcaactaccaggtgcagaacgtggcg480ctgccgaggaacgggtcggacccgctgctgcgcgagtgggtgaagcccggccacaacccg540gtgatcgtgcccgagggcggcatcaacgcgacgcagttccgcgacccgaccaccgcgtgg600cgcggggccgacggccactggcggctgctcgtcggcagcctcgcggggcagtcccgcggc660gtggcgt已cgtg"Uccggagcagggacttccggcggtggacgcgcgcggcgcagccgctg720cactcggcgcccacggggatgtgggagtgcccggacttctacccggtcacCgCgg￡LCggC780cgccgcg鄉gcgtcgacacctcgtccgccgtcgtcgacgccgccgcctcggcgcgcgtc840aagtacgtgctcaagaacagcctcgacctgcgccggtacgactactacaccgtcgg肌cg900tacgaccggaaggccg柳ggtacgtgccggacgaccccgccggcgacgagcaccacatc960cgctacgactacggcaacttctacgcctccaagacgttctacgacccggcgaagcgccgc1020cgcatcctctggggatgggccaacgagtccgacaccgccgccgacgacgtggccaagggc1080tgggccggaatccaggcgattccgaggaaagtgtggctggacccaagtgggaagcaactg1140Ugcagtggcc組cgaggaggtcgagaggctgagagggaagtggccggtcattctcaag1200gac鄉gtggtcaagccaggggaacacgtcg鄉tgaccgggctacaaactgcacaggct1260gacgtggaggtgagcttcgaggtgggg鄉ctggaggcggcggagcggctggacccggcg1320atggcgtacgacgcgcagcggctgtgcagcgcgcggggcgccgacgcgaggggcggcgtg1380gggccgttcggcctgtgggtgctcgcgtccgcggggctgg鄉卿卿ccgccgtgttc1440ttcagggtgttcaggccggcggcgcgcggcggcggcgccggcaagcccgtcgtgctcatg1500tgcaccgaccccaccaagtcatcgcgcaacccgaacatgtaccagccgacgtttgc鄉g1560ttcgttgacacggacatcaccaacggg卿3tatctctgagg柳ctgstcgacaggtcg1620gttgttg卿gcttcggggctgg鄉犯aggcgtgcatcctgtc眺ggtgtacccgtcg1680ctggccatcggcaagaacgcgcgcctttacgttttcaataacgggaaggcgg卿tc鄉1740gtgtcgcagctcaccgcgtggg卿tgaagaagccggtcatgatg組ggagcctaa1797<210>2<211>598<212〉PRT<213〉稻屬(0ryzasativaL.)<400〉2MetGlyValLeuGlySerArgValAlaTrpAlaTrp1510LeuLeuLeuGinGinLeuAlaGlyAlaSerHisVal2025LeuGluLeuGinAlaAlaAlaThrThrAlaA印Gly3540lieValAspSerGluLeuArgThrGlyTyrHisPhe505560AsnTrplieAsnAspProAsnAlaProMetTyrTyr657075HisLeuPheTyrGinTyrAsnProLysGlyAlaVal8590ValTrpAlaHisSerValSerArgAspLeulieAsn100105LysProAlalieGluProSerlieArgAlaAspLys115120SerGlySerAlaThrMetMetAlaAspGlyThrPro130135140ThrGlyValAsnArgProAspValAsnTyrGinVal145150155LeuProArgAsnGlySerAspProLeuLeuArgGlu165170GlyHisAsnProVallieValProGluGlyGlylie180185PheArgAspProThrThrAlaTrpArgGlyAlaAsp195200LeuLeuValGlySerLeuAlaGlyGinSerArgGly210215220TyrArgSerArgAspPheArgArgTrpThrArgAla225230235HisSerAlaProThrGlyMetTrpGluCysProAsp245250ThrAlaAspGlyArgArgGluGlyValAspThrSer260265AspAlaAlaAlaSerAlaArgValLysTyrValLeu275280AspLeuArgArgTyrAspTyrTyrThrValGlyThr290295300AlaGluArgTyrValProAspAspProAlaGlyAsp305310315ArgTyrAspTyrGlyAsnPheTyrAlaSerLysThr325330AlaLysArgArgArglieLeuTrpGlyTrpAlaAsn340345AlaAlaAspAspValAlaLysGlyTrpAlaGlylieLeuValGinLeu15ValTyrAspAsp30ValProProSer45GinProProLysLysGlyTrpTyr80TrpGlyAsnlie95TrpValAlaLeu110TyrGlyCysTrp125VallieMet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