專利名稱：：作為豬生殖和呼吸道征候群疫苗的prrs病毒的融合蛋白的制作方法
技術領域：
：本發明是關于具備誘發豬只產生PRRSV中和力價反應的融合蛋白次單位疫苗。
背景技術：
：豬生殖與呼吸道征候群(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是一種由豬生殖與呼吸道征候群病毒(PRRSV)感染，其為一種會導致母豬繁殖障礙，并對各年齡層豬只呼吸道感染為主的豬只傳染病。PRRSV被視為極頑強的病毒，其基于在寄主體內不易誘發具有中和力價的抗體。且PRRSV為RNA病毒，可在寄主細胞內經由簡化的基因復制系統進行繁殖，也因此基因突變機率非常高。此外，PRRSV感染可分為兩階段(A)感染上呼吸道及下呼吸道上皮細胞系統；及(B)感染呼吸道外圍組織的單核球及巨嗜細胞。因此，寄主需同時具備中和力價的體液或黏膜免疫反應機制及細胞免疫機制，利于清除被感染的細胞以進行防御。然而，自然界中PRRSV可以真正的在動物體內產生中和力價即不容易，因此一般的抗體對防御PRRSV效果不大，甚至會刺激病毒的突變。因此，在抗體-依賴性的增強作用機制中，非中和力價抗體的使用可能導致更嚴重的感染。中國臺灣第I-2289933號(美國專利公開號US20040247617)中，提供一種對標靶細胞具專一性的融合蛋白，該融合蛋白利用一綠膿桿菌外毒素部位及一功能區架構PRRSVORF7核蛋白片段，并于羧基端添加KDEL訊碼。該融合蛋白可以大量在大腸桿菌中生產，免疫豬只后，可有效降低及清除豬只攻毒后的病毒血癥的發生。該專利的全文引用記載并入本申請中。在PRRSV的ORF5與ORF6雜二聚合反應(heterodimerization)中，ORF5的Cys-34抗原決定部位區域，及ORF6的Cys-8抗原決定部位區域，對病毒感染及其外套膜裝配(envelopeassembly)具關鍵性作用(SnijderEricJ.,JessicaC.etal.，JournalofVirology,January2003,Vol.77，No.1:97-104)。此外，PRRSVORF5的保留序列(consensuss叫uence)—YKNTHLDLIYNA，為介于胺基酸38至44之間的抗原決定部位，其位于PRRSVORF5的N-端體外區，業經鑒別為一中和抗原決定部位(OstrowskiM.,J.A.Galeota，etal.,JournalofVirology,May2002,Vol.76，No.9:4241-4250)。公知技術亦曾將ORF5或ORF6整個蛋白架構在PE及KDEL中間，免疫到豬只后發現，攻毒的豬只在肺部反而發生更嚴重的發炎現象，顯見ORF5或ORF6比本身更具有免疫毒性。因此，欲有效防治豬只感染PRRS，仍有必要發展具有高中和力價且低免疫毒性的疫苗。
發明內容本發明目的之一是提供一種融合蛋白，及其組合方式。本發明的另一目的是關于利用該等融合蛋白制備具中和力價融合蛋白組成的次單位PRRS疫苗。本發明的再一目的是提供醫藥組合物，其包括本發明的融合蛋白及在藥學上可接受的載劑。為實現上述目的，本發明提供的PE-PQGAB-K3融合蛋白，其包括一含有豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序列，與PRRSVORF5部分序列的N端蛋白區；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基終端部份。所述的融合蛋白，其中該PRRSV為美洲株。所述的融合蛋白，其中該PRRSV為歐洲株。所述的融合蛋白，其中該PRRSV的該0RF6部分序列為SEQIDN0.13。所述的融合蛋白，其中該PRRSVORF5部分序列為SEQIDNO.12。所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.l。所述的融合蛋白，其中該PRRSV的該部分ORF6為SEQIDNO.15。所述的融合蛋白，其中該PRRSV的該部分ORF5為SEQIDNO.14。所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.10。本發明可作為疫苗的醫藥組合物，其包含一豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基終端部份；以及一藥學上可接受的載體。所述的醫藥組合物，其中該PRRSV為美洲株。所述的醫藥組合物，其中該PRRSV為歐洲株。所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.13。所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF5為SEQIDNCU2。所述的醫藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.1。所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.15。所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF5為SEQIDN0.14。所述的醫藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.10。所述的醫藥組合物，其中該載體包含一福氏佐劑、乳化劑二縮甘露醇單油酸鹽(mannidemono-oleateemulsifier，ISA720,ISA206)佐齊U。所述的醫藥組合物，其中該載體包含一ISA206佐劑。再進一步地說，本發明PE-PQGAB-K3融合蛋白包括一含有豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序歹U，與PRRSVORF5部分序列的N端蛋白區；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基終端部份。本發明還包括一種可作為疫苗的醫藥組合物，其包含一豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基終端部份；以及一藥學上可接受的載體。本發明中所指的PRRSV病毒株種類不限，可以是美洲型病毒株、歐洲型病毒株、或澳洲型病毒株，于本發明較佳實施例中，PRRSV病毒株為美洲型病毒株、或歐洲型病毒株。本發明中，融合蛋白的N端蛋白區可包含的片段不限制，較佳為任一具備抗原特性的PRRSV片段，如PRRSVORF5、ORF6、或ORF7。以美洲型病毒株為例，較佳PRRSV的ORF6部分序列可為SEQIDN0.13。而PRRSVORF5部分序列則可為SEQIDN0.12。以歐洲型病毒株而言，較佳PRRSV的部分ORF6可為SEQIDN0.15,而PRRSV的部分ORF5較佳則可為SEQIDNCU4。本發明中，融合蛋白含部分PRRSVORF6及部分PRRSVORF5的核酸序列是經改質，其序列不限制，較佳為可于大腸桿菌系統中高度表現，且表現出的蛋白質結構與野生型相同的核酸序列。以美洲型病毒株為例，更佳的改質后核酸序列為SEQIDNO.l。而以歐洲型病毒株為例，更佳的改質后核酸序列為SEQIDNO.IO。本發明的醫藥組合物可包括根據已知技術使用適合的佐劑；分散劑或保濕劑(如Tween80)以及懸浮劑調配無菌注射劑，例如，無菌注射水溶液或含油性懸浮液。無菌注射制劑亦可用于無毒性注射的稀釋劑或溶劑中的無菌注射液或懸浮液，例如，于l，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的載體與溶劑中，有甘露醇、水、Ringer溶液、與等張氯化鈉溶液。此外，常用上使用滅菌、固定油類作為溶劑或懸浮介質(例如合成的單酸或二酸甘油酯類)。脂肪酸(例如油酸與其甘油酯衍生物)，以及天然醫藥上可接受的油類(例如橄欖油或蓖麻油，尤其是其多氧乙基化的型態)，可使用于可注射制劑。此等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其它一般使用的界面活性劑例如Tweens或Spans或其它類似的乳化劑或生體可用率增強劑(一般用于制造醫藥上可接受的固體、液體、或其它劑量形式)亦可用于調配的目的。口服投藥用的組合物可為任何口服上可接受的劑量形式，包含但不限于膠囊、錠、乳劑、及水性懸浮液、分散劑、與溶液。在口服用途的錠劑例中，一般使用的載體包含乳醣及玉米淀粉。一般亦常添加潤滑劑，例如，硬脂酸鎂。對于以膠囊形式口服投藥而言，可使用的稀釋劑包含乳糖及玉米淀粉。當口服投藥水性分散劑或乳劑時，可使活性成份與乳化劑或懸浮劑組合懸浮或分散于油相中。若需要，可添加特定的甜味劑、風味劑、或著色劑。鼻腔噴劑或吸入劑組合物可依據醫藥配方的技術中公知技術制備，及可制成生理食鹽水，使用苯甲醇或其它適合的防腐劑、增加生體可用率的吸收促進劑、氟碳化合物、及或其它技術中已知的溶解劑或分散劑。含吲哚化合物的組合物亦可以直腸投藥的栓劑形式投藥。醫藥組合物中的載體必須為"可接受"，意為與配方中的活性成份相容(及較佳地是能使配方安定)及對接受治療的病患無害。其它載體的實例包含膠態二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二垸基硫酸鈉、及D&C黃色10號。而含本發明融合蛋白的醫藥組合物中，較佳地還包括一免疫佐劑；所適用的免疫佐劑不限，可以是任何一種常用于疫苗的佐劑，包括鋁膠以及油質佐劑如福氏佐劑(Freund'sFCAorFIA)或乳化劑二縮甘露醇單油酸鹽(mannidemono-oleateemulsifier,ISA720或ISA206,SEPPIC,France),較佳為ISA206佐劑。本發明的詳細說明陳述于下列說明中。在本發明說明及申請專利范圍中將顯而易見本發明的其它特征、目的及優勢。圖l表示根據實例1的PE-PQGAB-K3融合蛋白的簡圖。圖2表示根據實例1的PE(AIII)-PQGAB質體構筑流程圖。圖3表示根據實例1所合成的核酸片段電泳圖，共4段DNA片段(a段70bp、b段129bp、c段186bp、d段204bp)。圖4表示PE(AIII)-PQGAB質體圖譜。圖5為利用8M尿素法萃取及溶出包涵體(inclusionbodies)內的PE-PQGAB-K3抗原蛋白質片段定量的結果圖。具體實施方式本發明特征在于，發現將ORF5及ORF6大多數的抗原去除，僅留下ORF5及ORF6的N端數十幾個胺基酸，以此架構一個雜合勝肽鏈PQGAB，接著使的嵌入PE及KDEL3序列中間，該融合蛋白PE-PQGAB-KDEL3經小鼠及豬只的免疫試驗，確認具有血清中和力價能力。為解釋本發明目的，提供下列實例，惟，其并非用以限制本發明的范圍。實施例l:美洲株PRRSV的PQGAB融合勝肽美洲株PRRSV的ORF5及ORF6結構蛋白序列是得自美國國立生物技術數據中心(NCBI)的數據庫。而根據上述病毒感染機轉已知，PRRSV病毒具有中和力價的區域分別為ORF6及ORF5的N端。即為ORF6結構蛋白第2至26號胺基酸勝肽區(SEQIDNO.13)，及ORF5結構蛋白第30至63號胺基酸勝肽區(SEQIDN0.12)。將融合此二段勝肽區的胺基酸序列列出，如下GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA艮卩，PRRSV-ORF6-226-ORF5-31~63融合勝肽，其由(ORF6)-G2SSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITY26(SEQIDNO.13)及(ORF5)-A31SNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA63(SEQIDN0.12)兩勝肽片段所組成，其中，GSSLDDFC片段稱的P、YDSTAPQKVLLAFSITY片段稱的Q、ASNDSSSHLQLIYNLTLC片段稱的A，且ELNGTDWLANKFDWA片段稱的B。PQ片段屬于一部份的ORF6片段，而AB片段屬于一部份的ORF5片段。本例利用PQGAB勝肽融合區，構筑一個具有誘發中和力價免疫保護力的關鍵蛋白質(即抗原決定部位)，以達成誘發活體免疫效果。PE-PQGAB-K3融合蛋白簡圖及PE(AIII)-PQGAB質體構筑的流程圖分別如圖1及2所示。實施例2以下說明PQGAB核酸序列的編制。由于一胺基酸可對應多組不同的核酸序列，因此可先由學術數據(如http:〃www.kazusa.or.jp/codon)，找到比較適合在大腸桿菌(￡."")寄主系統中表現的核酸對應序列，且避開大腸桿菌不容易辨識、表現的核酸對應序列。同理，如果這序列要在酵母菌系統中表現，則亦要選擇適于酵母菌系統GSacc/wraA^c^或P/c/zz'aspp.)表達的序列。根據PQGAB融合蛋白區的胺基酸序列，找出適合于大腸桿菌寄主系統中表現的對應核酸序列，并且在核酸序列的5'及3'-末端分別接上限制酵素序列，以利于往后的基因片段剪接步驟。為了增加酵素的切割效率以及利于PCR引子的設計，該基因兩端可加上一些重復堿基的核酸，如CCC、AAA、GGG或TTT。本例中改質后的PQGAB融合蛋白區核酸序列可見SEQIDNO.l。SEQIDNO.l中總共207個核酸，當利用酵素進行與質體的剪接時，上述連續三碼的核酸會有部分被切除，而至少會有186至180個核酸進入質體內。標的核酸序列確定后，在開始進行合成前，需利用計算機軟件(如DNAstrider)分析標的核酸序列上帶有限制酵素切點的圖譜，并根據圖譜結果，于標的核酸序列兩端安裝限制酵素的序列，以供往后進行剪接用。而由于產生出來的標的物須進行限制酵素的剪接，因此最好在標的核酸序列內避免出現與剪接時相同的限制酵素切位。為此，須再利用常用的軟件，分析DNA序列中是否有這些切位(restrictionmap)。如果標的核酸序列內有與剪接時相同的限制酵素切位序列，就必須再改換核酸序列，找尋相同胺基酸對應的不同核酸序列，使標的核酸序列片段內的限制酵素切位消失。接著利用前述中國臺灣第1-2289933號(美國專利號US20040247617)專利所公開的方法，根據野生型胺基酸進行對應的核酸序列的改質，使得上述野生型胺基酸可由大腸桿菌系統大量表現出來。改質的重點主要在將野生病毒株的核酸片段，以在不影響其原本表現出的胺基酸，而又能有效的在大腸桿菌宿主系統中表現的狀況下，進行核酸序列的改質。此改質后的核酸序列，可分別利用多對引子，以聚合酶連鎖反應進行合成，所有引子對的對應編號請見表l。表l:美洲株PRRSV標的抗原PQGAB引子對的對應編號標的抗原正向引子序列編號(S叫.IDNo.)反向引子序列編號(Seq.IDNo.)PQGABFl2Rl6PQGABF23R27PQGABF34R38PQGABF45正向引子及反向引子的序列分別如下所示正向引子Fl(SEQIDNo.2)為SEQIDNo.l的第81至124號胺基酸序列，即，5'-GCTTTCTCCATCACCTACGCTTCCAACGACTCCTCCTCCCACCT-3';正向引子F2(SEQIDNo.3)為SEQIDNo.l的第48至96號胺基酸序列，即，5'-CGACTCCACCGCTCCCCAGAAAGTTCTGCTGGCTTTCTCCATCACCTA-3';正向引子F3(SEQIDNo.4)為SEQIDNo.l的第22至65號胺基酸序列，即，5'-GGTTCCTCCCTGGACGACTTCTGCTACGACTCCACCGCTCCCCA-3';正向引子F4(SEQIDNo.5)為SEQIDNo.l的第l至41號胺基酸序列，即，5'-CCCAAACCCCATATGGAATTCGGTTCCTCCCTGGACGACT-3';反向引子Rl(SEQIDNo.6)為SEQIDNo.l的第148至106號胺基酸序列，即，GGAGTC-3';反向引子R2(SEQIDNo.7)為SEQIDNo.l的第176至133號胺基酸序列，即，5'-GCCAGCCAGTCGGTACCGTTCAGTTCGCACAGGGTCAGGTTGTA-3';反向引子R3(SEQIDNo.8)為SEQIDNo.l的第204至164號胺基酸序列，即，5'-TTTTTTCTCGAGAGCCCAGTCGAATTTGTTAGCCAGCCAGTCGG-3';其中R1、R2及R3為表1基因序碼的逆向互補基因序列。首先利用無DNA模板的聚合方式，利用正向引子F1以及反向引子R1進行核酸片段的聚合，其中各引子的3'端部分各有10-18個堿基是設計為彼此互補的結合，以經由聚合酵素的讀寫及補足成為一條雙股的DNA模板聚合產物。完成第一次PCR后，取0.01~4pl的聚合產物作為第二次PCR的模板DNA，同時加入第二組引子對正向引子F2及反向引子R2各0.014pl，連同所需的dNTPs、反應試劑以及Pfli聚合酶等，開始進行第二次PCR;接著依照相同方式，分次加入不同引子對F3及R3進行PCR后，再進行引子對F4及R3的PCR步驟，即可合成出PQGAB改質后的207bp核酸序列。所分別合成出的核酸片段經電泳試驗后，可確認其產物的片段大小與預期相符。PQGAB-l段(207bp)，如圖3;PQGAB-產生a、b、c及d共4段DNA片段(a段70bp、b段129bp、c段186bp、d段204bp)。實施例3、歐洲型病毒株PRRSV的PQGAB實施例12為PRRSV美洲型的融合蛋白設計，但是PRRSV在全球的感染盛行率除了PRRSV美洲型病毒株外，歐洲型病毒株、澳洲型病毒株的盛行亦相當普遍，由于這些病毒株在結構蛋白胺基酸的相似度并不高，只在60~80%，因此對于其它型的ORF5與ORF6的融合蛋白設計，亦可分別根據如實施例12的類似方式，進行序列的設計與合成。歐洲型病毒株PRRSV的PQGAB融合蛋白區的胺基酸序列如SEQIDNO.ll所示。其中包含0RF6-M1I28(SEQIDNCU5)片段，以及ORF5-F31A64(SEQIDNO,14)的片段序列。以SEQIDNO.ll為依據所設計的合成用引子，分別為四組，如下表2所示。表2:歐洲株PRRSV標的抗原PQGAB引子對的對應編號<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>經如實施例2所述的方式，由如表2的引子序列，可體外合成出一改質后的歐洲株PQGAB核酸序列。為了增加酵素的切割效率以及利于PCR引子的設計，于歐洲株PQGAB核酸序列的兩端，同樣可加上一些具重復堿基的核酸，如CCC、AAA、GGG或TTT。本例中改質后的歐洲株PQGAB核酸序列為SEQIDNO.IO。實施例4:含標的序列的質體構筑以實施例2制備出的改質核酸片段為例，將上述合成出的207bpDNA片段，分別以限制酵素￡"/7、^!o7切割后，接入已帶有一結合與移位功能的勝肽序列，以及一羧基終端勝肽的大腸桿菌質體中，所得質體為pPE-PQGAB-K3質體。構筑于含T7啟動子及具抗生素(ampicilin)抗性片段的pET15質體系統，可表現含有PRRSVPQGAB以及去毒性的綠膿桿菌外毒素A(/^M&mo"asexoto;n力AwithoutdomainIII)的融合蛋白，質體圖譜系如圖4所示。最后分別將上述質體轉染于可以表現該融合蛋白質的菌株或細胞中。實施例5、標的蛋白質的表現與分析經確定含有以上質體的菌種，90。/。以上細菌均含有質體及PQGAB基因，個別以甘油保存法于2ml分裝瓶中保存于-7(TC溫度下。在無菌室中，將以上保存菌苗取2ml接種于滅菌的500ml三角瓶，其內含有200mlLB(+500嗎/mlAmp)，于37'C回轉式培養箱以150rpm轉速下培養1012小時，完成種菌培養。該菌苗的OD600應達到1.0士0.4。在無菌室中，將50ml菌種液各別接種于滅菌的3000ml三角瓶共八瓶，該三角瓶內含有1250mlLB(+500嗎/mlAmp+50ml10%Glucose),于37°。回轉式培養箱以150rpm轉速下培養23小時，檢測OD600在0.3士0.1時，注入最終濃度為50ppm的IPTG蛋白質誘導劑后，于37'C回轉式培養箱以150rpm轉速下培養2小時，即完成蛋白生產步驟。接著，利用8M尿素法萃取及溶出包涵體(inclusionbodies)內的PE-PQGAB-K3抗原蛋白質片段，各以十公升細菌液(一小批量，Iot庫取，可得到300400mg抗原量。利用西方墨點法(Westem-blottingmethod)、coomasieblue染色法、SDS-PAGE電泳分析法，并以密度計(densitometer)量測電泳條帶的密度，以進行各抗原溶液的蛋白質定量(結果如圖5)。將上述抗原蛋白質取0.2士0.02mg，作為針劑高劑量的主成份。取0.02士0.002mg作為針劑低劑量的主成份，進行豬只免疫及攻毒的功效性試驗。實施例6、豬只免疫及攻毒的功效性試驗在SPF農場中，將豬只隨機分成三組，每組五只豬，且每組豬只分別飼養在裝設有空調及換氣設備的隔離室內。PE-PQGAB-E3接種疫苗組的豬只在14及28日齡時，藉由肌肉內分別注射含有lmlPE-PQGAB-E3(含有200嗎蛋白質/劑量)，在lmlISA206(SEPPK^法國)佐劑中乳化的2ml疫苗，免疫兩次。GP5&M免疫組則以PE-ORF5-K3及PE-ORF6-K3(各含有200嗎蛋白質/劑量)所免疫。對照組則于無免疫接種下養育。在最后的疫苗接種之后二周，對豬只在肌肉內投予100mg氯胺酮(ketamine)溶液以達鎮靜作用，接著在鼻內滴下lml的2。/。利多卡因(Lidocaine)抑制咳嗽-反射作用之后，以鼻內攻毒豬只。使用新鮮的lml的MD-1品系的PRRSV培養物，以大約1x107TCID5()/ml的劑量攻毒每組中的五只豬。接種后第14天時，對所有犧牲的豬只進行完整解剖。收集肝臟樣品(自頭蓋葉的兩部份及各來自肝尾狀葉的中間及附屬部份)，并利用10%中性緩沖福爾馬林予以固定，以進行后續組織病理學檢驗。該檢驗方式是采用盲模式(blindfashion)并根據間質性肺炎嚴重程度加以評比(OpriessnigT,P.G.Halbur,etal.,JournalofVirology,76(2002):11837-11844及Halbur，P.G.,P.S.Paul,etal.，1996.J.VetDiagn.Investig.8:11-20)，以0至6作區分，數字愈大表示病變程度愈嚴重。實驗結果第二次免疫的后兩周，豬只血液白血球試樣以RT-PCR檢測PRRSV，結果顯示在PRRSV攻毒之前，所有豬只均未引起病毒血癥。在攻毒之后3、7及14天后，再次利用RT-PCR檢測豬只的血液白血球試樣，結果如表3所示。表3:PRRSV攻毒后，豬只PRRSV病毒血癥比例<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>"^表示死亡的豬只之前均由RT-PCR檢測出PRRSV病毒血癥對所有豬只(包括已經犧牲的豬只及兩周研究結束時還存活的豬只)進行解剖，巨觀檢查顯示，攻毒后豬只肺臟顯示，對照組及ORF5&ORF6疫苗組觀察到較廣泛的病變以及嚴重之間質性肺膜炎，而本發明PE-PQGAB-K3疫苗組則未發現此等廣泛的病變及之間質性肺膜炎。表4:以PRRSV攻毒后14天對于PRRSV-所誘發的巨觀肺臟病變的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>平均指數5.75±0.503.80±0.845.80±0,45*:間質性肺炎病變指數。如表4所示，本發明PE-PQGAB-K3疫苗組所表現的巨觀肺臟病變嚴重程度顯著地較對照組及ORF5&ORF6疫苗組為小。表5、PE-PQGAB-K3疫苗組所表現的巨觀肺臟病變指數，以生物統計具極顯著差異水平，較對照組及ORF5&ORF6疫苗組低(p0.01)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>NOVA變源ss自由度MSFP曙值臨界值組間13.3333326.66666718.181820.0002333.885294組內4,4120.366667總禾口17.7333314比較對照組及ORF5&ORF6疫苗組低(p0.01)根據以上實驗結果清楚顯示，本發明PE-PQGAB-K3不但確實可有效保護豬只免于PRRSV感染，且根據本發明的疫苗，其相對于其它疫苗(例如PE-ORF5-K3，PE-ORF6-K3)所表現之間質性肺炎更為輕微。表6、血清力價總表GroupcoatingantigenIFAtitersNTtitersPE(AIII)IgG-ELISAPQGABtiters(S肌)APE-ABCF-K3PE-PQGF-K312808-168-16BNegativeCTL11<8<8CPE-PQG1AB畫K3173032-6416-64攻毒后豬只抗體力價變化如圖6所示。序列表<110>生寶生物科技股份有限公司<120>作為豬生殖與呼吸道征候群疫苗的PRRS病毒的融合蛋白<130>S0160/0613<160>23<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>207<212>DNA<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>1cccaaaccccatatggaattcggttcctccctggacgacttctgctacgactccaccgct60cccc3gaaagttctgctggctttctccatcacctacgcttcc犯cgactcctcctcccac120ctgcaactgatctacaacctgaccctgtgcgaactgaacggtaccgactggctggctaac180aaattcgactgggctctcgagaaaaaa207<210〉2<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>正向引子PQGAB-US.<400>2Gctttctccatcacctacgcttccaacgactcctcctcccacct44<210>3<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的正向引子.<400>3cgactccaccgctccccagaaagttctgctggctttctccatcaccta48<210>4<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的正向引子.<400>4ggttcctccctggacgacttctgctacgactccaccgctcccca44<210>5<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的正向引子<權>5ggttcctccctggacgacttctgctacgactccaccgctcccca44<210>6<211>43<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的反向引子.<400>6acagggtcaggttgtagatcagttgcaggtgggaggaggagtc43<210>7<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的反向引子.<400>7gccagccagtcggtaccgttcagttcgcacagggtcaggttgta44<210>8<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的反向引子.<400>8ttttttctcgagagcccagtcgaatttgttagccagccagtcgg44<210>9<211〉207<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>9CysCysCysAlaAlaAlaCysCysCysCysAlaThrAlaThrGlyGly151015202530GlyGlyAlaCysGlyAlaCysThrThrCysThrGlyCysThrAlaCys354045GlyAlaCysThrCysCysAlaCysCysGlyCysThrCysCysCysCys505560AlaGlyAlaAlaAlaGlyThrThrCysThrGlyCysThrGlyGlyCys65707580ThrThrThrCysThrCysCysAlaThrCysAlaCysCysThrAlaCys859095GlyCysThrThrCysCysAlaAlaCysGlyAlaCysThrCysCysThr100105110CysCysThrCysCysCysAlaCysCysThrGlyCysAlaAlaCysThr115120125GlyAlaThrCysThrAlaCysAlaAlaCysCysThrGlyAlaCysCys130135140145150155160GlyThrAlaCysCysGlyAlaCysThrGlyGlyCysThrGlyGlyCys165170175ThrAlaAlaCysAlaAlaAlaThrThrCysGlyAlaCysThrGlyGly180185190GlyCysThrCysThrCysGlyAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAla195200205<210>10<211>219<212>PRT400>10CysCysCysGlyAlaAlaThrThrCysCysAlaThrAlaThrGlyGly151015ThrCysGlyAlaCysAlaThrGlyGlyGlyThrThrCysThrCysThr202530CysGlyAlaCysGlyAlaCysThrThrThrThrGlyThrAlaAlaCys354045GlyAlaCysThrCysThrAlaCysCysGlyCysThrGlyCysThrCys505560AlaGlyAlaAlaAlaCysThrGlyGlyThrThrCysThrGlyGlyCys65707580ThrThrThrThrThrCysThrAlaThrCysAlaCysCysThrAlaCys85909525AlaCysCysCysCysAlaAlaThrCysThrThrThrGlyThrThrGly100105110CysThrGlyGlyThrGlyGlyThrThrCysThrThrCysThrThrCys115120125ThrAlaCysCysThrAlaCysCysAlaGlyThrAlaCysAlaThrCys130135140ThrAlaCysAlaAlaCysCysThrCysAlaCysCysAlaThrCysThr145150155160GlyThrGlyAlaAlaCysThrCysAlaAlaCysGlyGlyThrAlaCys165170175CysGlyAlaCysThrGlyGlyCysThrGlyThrCysThrAlaAlaCys180185190CysAlaCysThrThrThrGlyAlaCysThrGlyGlyGlyCysThrCys195200205ThrCysGlyAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAla210215<210>11<211>219<212>DNA<213〉豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>11cccgaattccatatggtcgacatgggttctctcgacgacttttgtaacgactctaccgct60gctcagaaactggttctggctttttctatcacctacaccccaatctttgttgctggtggt120tcttcttctacctaccagtacatctacaacctcaccatctgtgaactcaacggtaccgac180tggctgtctaaccactttgactgggctctcgagaaaaaa219<210>12<211>33<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>12AlaSerAsnAspSerSerSerHisLeuGinLeulieTyrAsnLeuThr151015LeuCysGluLeuAsnGlyThrAspTipLeuAlaAsnLysPheAspTip202530Ala<210>13<211>25<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>13GlySerSerLeuAspAspPheCysTyrAspSerThrAlaProGinLys151015ValLeuLeuAlaPheSerlieThrTyr2025<210>14<211>28<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>14MetGlySerLeuAspAspPheCysAsnAspSerThrAlaAlaGinLys151015LeuValLeuAlaPheSerlieThrTyrThrProlie2025<210>15<211>34<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>15PheValAlaGlyGlySerSerSerThrTyrGinTyrlieTyrAsnLeu151015ThrlieCysGluLeuAsnGlyThrAspTipLeuSerAsnHisPheAsp202530TipAla<210>16<211>42<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子.<400>16ctggctttttctatcacctacaccccaatctttgttgctggt42<210>17<211>41<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子<400>17gactctaccgctgctcagaaactggttctggc微ctat41<210>18<211>39<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子.<楊>18ggttctctcgacgac加gtaacgactctaccgctgct39<210>19<211>38<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子.<楊>19cccgaattccatatggtcgacatgggttctctcgacga38<210>20<211>42<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>20gatgtactggtaggtagaagaagaaccaccagcaacaaagat42<210>21<211>42<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>21gttgagttcacagatggtgaggttgtagatgtactggtaggt42<210>22<211>39<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>22gtggttagacagccagtcggtaccgttgagttcacagat3932<210>23<211>38<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>23ttttttctcgagagcccagtcaaagtggttagacagcc38權利要求1、一種PE-PQGAB-K3融合蛋白，其包括一含有豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序列，與PRRSVORF5部分序列的N端蛋白區；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基終端部份。2、如權利要求l所述的融合蛋白，其中該PRRSV為美洲株。3、如權利要求l所述的融合蛋白，其中該PRRSV為歐洲株。4、如權利要求2所述的融合蛋白，其中該PRRSV的該ORF6部分序列為SEQIDN0.13。5、如權利要求2所述的融合蛋白，其中該PRRSVORF5部分序列為SEQIDNO,12。6、如權利要求2所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.l。7、如權利要求3所述的融合蛋白，其中該PRRSV的該部分ORP6為SEQIDNO,15。8、如權利要求3所述的融合蛋白，其中該PRRSV的該部分ORF5為SEQIDNO.14。9、如權利要求3所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.10。10、一種可作為疫苗的醫藥組合物，其包含一豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORP6及部分ORF5的N端融合蛋白區；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基終端部份；以及一藥學上可接受的載體。11、如權利要求10所述的醫藥組合物，其中該PRRSV為美洲株。12、如權利要求10所述的醫藥組合物，其中該PRRSV為歐洲株。13、如權利要求ll所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.13。14、如權利要求ll所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF5為SEQIDN0.12。15、如權利要求ll所述的醫藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.l。16、如權利要求12所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.15。17、如權利要求12所述的醫藥組合物，其中該PRRSV的該部分ORF5為SEQIDN0.14。18、如權利要求12所述的醫藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區的核酸序列為SEQIDNO.IO。19、如權利要求10所述的醫藥組合物，其中該載體包含一福氏佐劑、乳化劑二縮甘露醇單油酸鹽(mannidemono-oleateemulsifier，ISA720，ISA206)佐劑。20、如權利要求15所述的醫藥組合物，其中該載體包含一ISA206佐劑。全文摘要本發明提供一種具中和力價融合蛋白組成的次單位PRRS疫苗，PE-PQGAB-K3，其由綠膿桿菌外毒素部位I(結合部位-轉位部位(II))架移PRRSVORF5及ORF6N-端與細胞接受器結合的PQGAB結構勝肽，并于此融合蛋白羧基端添加一個KDEL-RDEL-KDEL(KEDL3)的訊碼。本發明PE-PQGAB-K3免疫在小鼠或豬只后所得的血清可抑制PRRSV在MAC-10A細胞的生長及繁殖，其中和力價可達16至32。文檔編號C07K14/435GK101104641SQ20061009881公開日2008年1月16日申請日期2006年7月11日優先權日2006年7月11日發明者廖朝,章修綱申請人:生寶生物科技股份有限公司