專利名稱：人胰高糖素樣多肽－1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品的制作方法
技術領域：
人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品，屬于長效融合蛋白藥物技術領域。
背景技術：
人胰高糖素樣多肽1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由腸道內分泌L細胞合成和分泌的由30個氨基酸組成的多肽。體內外研究顯示GLP-1能增強葡萄糖依賴性的胰島素分泌，減少食物的攝取，減慢胃的排空，以及抑制胰高血糖素的分泌，導致血糖降低。此外，近年研究揭示GLP-1能刺激胰β細胞增殖，促進胰島再生，又能抑制胰β細胞的凋亡，并能促進胰β細胞合成胰島素。動物實驗和臨床試驗表明II型糖尿病病人給予GLP-1后血糖水平顯著降低，且無胰島素和磺脲類降糖藥的低血糖危險。GLP-1獨特的降血糖作用機制與眾不同，是現有抗糖尿病藥物無可比擬的。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血漿中的主要蛋白成分，在血漿中的濃度為40mg/ml，它除了具有維持血漿滲透壓功能外，還能結合內源性和/或外源性配體，包括激素、有毒代謝產物、藥物等。通過結合這些配體，HSA可以調節激素活性、內源性和/或外源性物質的毒性和藥物的利用度。細胞中剛翻譯出來的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein結構，包括18個氨基酸殘基的信號肽和6個氨基酸殘基前肽的原肽。信號肽和前肽在轉運和分泌的過程中被切除，成熟的HSA由585個氨基酸殘基組成，含有17對二硫鍵，分子量約為66.5KDa。通常情況下，HSA為非糖基化蛋白，然而有的突變體中也存在N-連接糖基化(見Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。HSA的分子量相對較大，在正常情況下，不易被腎小球濾過，其血漿半衰期在20天左右。
雖然GLP-1具有較好的抗糖尿病效應，但是由于其體內半衰期僅2分鐘(主要是DPP-IV的水解和腎臟排泄)，又屬體內注射的多肽類藥物，必須持續給藥方能奏效，給臨床應用帶來很大的限制，迄今難以在臨床上廣泛應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品。本發明的融合蛋白在保持了人胰高糖素樣多肽-1的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，在藥學領域有良好的應用前景。
本發明的技術方案人工合成(GLP-1)2cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術，連接(GLP-1)2cDNA和HSAcDNA，中間不加入任何連接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主細胞中進行表達。
(GLP-1)2cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆，融合蛋白(GLP-1)2-HSA的重組酵母構建和融合蛋白(GLP-1)2-HSA的表達的步驟詳見實施例。
用上述方法制備的人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人胰高糖素樣多肽-1至少85％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區；所述與人胰高糖素樣多肽-1同源的第一區位于融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白同源的第二區位于融合蛋白的N末端，所述與人胰高糖素樣多肽-1同源的第一區位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
優選的是所述融合蛋白包括與人胰高糖素樣多肽-1至少95％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少95％序列同源的第二區。
所述融合蛋白的第二區可以由人血清白蛋白部分結構域組成、經結構域重排后的人血清白蛋白組成，包括所有HSA天然存在的多態型外，還包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名為HSA(1-n)，n為369-419。
所述融合蛋白包括與人胰高糖素樣多肽-1氨基酸殘基序列相同的第一區和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
宿主細胞是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞等。優選的宿主細胞是酵母。優選的酵母是畢赤酵母。優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
由于(GLP-1)2基因較短，采用人工合成該段基因。HSA cDNA可以通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得。利用重疊PCR技術，連接(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩定性和免疫原性方面的問題，得到的(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存。
(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多個宿主系統中表達，如細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞，及生物體(如脊椎動物、昆蟲等)等。在這些表達系統中目的基因被整合到宿主的染色體中或插入到質粒中。本發明優選的是酵母表達系統，該系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白后修飾系統，有利于大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢氏酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢氏酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
畢氏酵母表達系統分泌型表達載體主要有pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞內型表達載體主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，優選的是畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有His缺陷型的選擇性標記基因HIS4、AOX1啟動子、MFα分泌信號肽和G418抗性基因(可作為篩選重組子的標記)等元件。AOX1啟動子是一個強啟動子，可以高效的啟動目的基因的表達。在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶AOX1和AOX2，細胞中絕大多數乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇為唯一碳源培養的細胞中，該酶可占細胞總蛋白的30％以上。AOX2與AOX1的同源性雖然高達97％，但酶活很低。當AOX1基因缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細胞利用甲醇能力降低，細胞在甲醇為唯一碳源的培養基上生長很慢。
帶有融合cDNA的表達載體可以通過轉化鋰鹽法、PEG法、原生質體法或電穿孔法轉化宿主細胞。成功轉化的細胞，即帶有本發明構建的DNA的細胞，可以通過本領域熟知的方法加以鑒定，如收集細胞，裂解后提取DNA，然后進行Southern雜交和PCR鑒定，也可在誘導表達后用HSA抗體和/或GLP-1抗體檢測培養液上清。
本發明的有益效果利用重疊PCR技術，連接(GLP-1)2cDNA和HSAcDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩定性(避免針對連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的問題。
優選的酵母表達系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白后修飾系統，有利于大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢赤酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢赤酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
可以通過培養帶有本發明構建的DNA的宿主細胞，來生產本發明的融合蛋白。宿主細胞培養優選在生物反應器上進行，培養分兩個階段，第一階段主要用于宿主細胞生長，第二階段主要用于產物合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細胞培養物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術及這些技術的組合。
圖1.質粒pPIC-(GLP-1)2-HSA構建圖2.融合蛋白基因的瓊脂糖電泳分析 Lane1PCR產物；Lane2DNAMarK圖3.融合蛋白的SDS-PAGE分析 Lane1空質粒轉化發酵上清；Lane2發酵上清1；Lane3發酵上清2；Lane4白蛋白；Lane5蛋白質MarK圖4.融合蛋白的GLP-1抗體檢測(Western blot) Lane1對照；Lane2蛋白質Mark；Lane3GLP-1抗體雜交具體實施方法實施例1(GLP-1)2cDNA的克隆人工合成(GLP-1)2cDNA(由上海生工生物工程技術服務有限公司完成)。以人工合成(GLP-1)2cDNA為模板，通過PCR擴增出(GLP-1)2cDNA，所用的引物如下PG15’TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3’PG25’-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PG1和PG2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl(dNTP、10×pfu Buffer、pfu DNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術服務有限公司，下同)，(GLP-1)2cDNA 1μg，加雙蒸水補齊50μl，在MJ Research公司的PTC-100TMPCR儀上(下同)，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸20秒，循環30次；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.2kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescript IIKS(+)(簡寫為pBlue2KSP)分別經BamHI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及BamHI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒BamHI和NotI雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pBlue2KSP-(GLP-1)2，陽性重組子命名為DH5α/pBlue2KSP-(GLP-1)2。
實施例2HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為
PH15’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBlue2KSP分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pBlue2KSP-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue2KSP-HSA。
實施例3(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆(GLP-1)2cDNA的PCR擴增，所用引物如下PG35’-GAGAGGTACCTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’PG45’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCCCTTCCTTTTACTAACCATG-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-(GLP-1)21ng，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下PH35’-CATGGTTAGTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’PH45’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的引物PG3和PH4各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-HSA 1ng，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；利用重疊PCR融合(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA將(GLP-1)2的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物分別稀釋40倍，再以1∶1比例混合后作為模板，于反應體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 1μl，10mol/LMg2+2.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊45μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性1分鐘，循環5次后，向反應體系中加入10μmol/L的PG3和PH4的引物各1.5μl，繼續做30次上述循環；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.9kb的目標片段，用T4連接酶連接純化好的目標片段和載體pUC18-T；連接產物轉化大腸桿菌XL-1 blue感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SnaBI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SnaBI和NotI酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pUC18T-(GLP-1)2-HSA，陽性重組子命名為XL-1/pUC18 T-(GLP-1)2-HSA。
實施例4(GLP-1)2-HSA重組酵母構建及融合蛋白的表達(GLP-1)2/HSA酵母表達系統構建取一支凍存的XL-1/pUC18T-(GLP-1)2-HSA，20ml氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。質粒pUC18T-(GLP-1)2-HSA和酵母表達載體pPIC9K，經SnaBI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取雙酶切后純化好的pUC18T-(GLP-1)2-HSA片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μlT4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養過夜。挑取若干個長出的菌落，接種于20ml氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。通過PCR，及SnaBI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆。陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃。重組質粒命名為pPIC-(GLP-1)2-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pPIC-(GLP-1)2-HSA。提取DH5α/pPIC-(GLP-1)2-HSA中的質粒，經SalI酶切后，電擊轉化畢赤酵母KM71。轉化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培養6天。每塊平板上用2ml水洗滌，收集洗滌液。取部分收集到的洗滌液，分別涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培養3～6天。挑取在最高濃度G418的YPD平板上的長出菌落，接種于20mlMD培養基中，30℃培養24小時，用常規方法提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子。陽性重組子命名為KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA。
(GLP-1)2-HSA融合蛋白的表達將KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA接種至裝有100mlBMGY(100mM磷酸鉀，pH6.0、1.34％無氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm值為2～6，離心收集菌體。將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY(100mM磷酸鉀，pH 6.0、1.34％無氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％(V/V)，誘導3天。離心收集上清，進行SDS-PAGE電泳，融合蛋白的GLP-1的免疫源性檢測(Western blot)。
權利要求
1.人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是人工合成(GLP-1)2cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSAcDNA；利用重疊PCR技術，連接(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；將(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主細胞中進行表達；(1)(GLP-1)2cDNA的克隆以人工合成(GLP-1)2cDNA為模板，通過PCR擴增出(GLP-1)2cDNA，所用的引物如下PG15’-TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3’PG25’-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PG1和PG2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人工合成的(GLP-1)2cDNA 1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸20秒，循環30次；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.2kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBlue2KSP分別經BamHI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及BamHI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒BamHI和NotI雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pBlue2KSP-(GLP-1)2，陽性重組子命名為DH5α/pBlue2KSP-(GLP-1)2；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBlue2KSP分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pBlue2KSP-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue2KSP-HSA；(3)(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆(GLP-1)2cDNA的PCR擴增，所用引物如下PG35’-GAGAGGTACCTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’PG45’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCCCTTCCTTTTACTAACCATG-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PG3和PG4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-(GLP-1)21ng，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；HSAcDNA的PCR擴增，所用引物如下PH35’-CATGGTTAGTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’PH45’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的引物PH3和PH4各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-HSA 1ng，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；利用重疊PCR融合(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA將(GLP-1)2的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物分別稀釋40倍，再以1∶1比例混合后作為模板，于反應體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 1μl，10mol/LMg2+2.5μl，5U/μl的Taq聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊45μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性1分鐘，循環5次后，向反應體系中加入10μmol/L的PG3和PH4的引物各1.5μl，繼續做30次上述循環；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.9kb的目標片段，用T4連接酶連接純化好的目標片段和載體pUC18-T；連接產物轉化大腸桿菌XL-1blue感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SnaBI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SnaBI和NotI酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pUC18T-(GLP-1)2-HSA，陽性重組子命名為XL-1/pUC18T-(GLP-1)2-HSA；(4)融合蛋白(GLP-1)2-HSA的重組酵母構建取一支凍存的XL-1/pUC18T-(GLP-1)2-HSA，接種到20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒，提取的質粒pUC18T-(GLP-1)2-HSA和酵母表達載體pPIC9K，分別經SnaBI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取長出菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SnaBI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pPIC-(GLP-1)2-HSA，陽性重組子命名為DHSα/pPIC-(GLP-1)2-HSA；提取DH5α/pPIC-(GLP-1)2-HSA中的質粒，經SalI酶切后，電擊轉化畢赤酵母KM71，提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA；(5)融合蛋白(GLP-1)2-HSA的表達將KM71/pPIC-(GLP-1)2-HSA接種至裝有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm為2～6，離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％(V/V)，誘導3天，離心收集上清，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑒定融合蛋白(GLP-1)2-HSA分子的GLP-1的免疫源性。
2.用權利要求1所述方法制備的人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是包括與人胰高糖素樣多肽-1至少85％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區；所述與人胰高糖素樣多肽-1同源的第一區位于融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白同源的第二區位于融合蛋白的N末端，所述與人胰高糖素樣多肽-1同源的第一區位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
3.根據權利要求2所述的人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人胰高糖素樣多肽-1至少95％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少95％序列同源的第二區。
4.根據權利要求2所述的人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第二區由人血清白蛋白部分結構域組成或經結構域重排后的人血清白蛋白組成。
5.根據權利要求2所述的人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人胰高糖素樣多肽-1氨基酸殘基序列相同的第一區和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
6.根據權利要求5所述的人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是宿主細胞是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征是優選的宿主細胞是酵母。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征是優選的酵母是畢赤酵母。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征是優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
全文摘要
人胰高糖素樣多肽－1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品，屬于長效融合蛋白藥物技術領域。本發明利用重疊PCR技術，將串聯的兩個GLP－1基因cDNA(簡稱(GLP－1)
文檔編號C07K19/00GK1916173SQ20061008615
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月5日 優先權日2006年9月5日
發明者金堅, 竇文芳, 張蓮芬, 雷楗勇, 盧大儒 申請人:江南大學