專利名稱：一種同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽的方法。
背景技術：
上世紀末以來，對抗菌肽的研究、開發利用已引起了國際生物醫學界的極大興趣。
由于當今微生物對傳統抗生素廣泛耐藥這一事實，而內源性抗生素肽經過了幾百萬年的進化歷程仍保留了強大的抗菌效力，因此，發展新的高科技抗微生物戰略勢在必行。而在發展抗感染新戰略上，天然抗生素肽格外引人注目。抗菌肽具有廣譜、高效的抗微生物活性，來自機體自身，起源古老，經幾百萬年進化仍保留強大的抗微生物活性，故可能是解決微生物耐藥問題的最佳選擇。并可能由此帶來一場抗微生物戰略的新革命。
肝素鈉是肝素的鈉鹽，本質上是分子量不同的粘多糖相混合在一起的硫酸氨基多糖的鈉鹽，廣泛存在于哺乳動物歐立(Ehrlich)氏肥大細胞中，具有高效抗凝血、防止血檢形成和降血功效，并可用于治療某些免疫復合體(ImmunoComplex)疾病，有廣泛使用和開發價值。肝素是一種水溶性物質，其分子量約為3000-50000道爾頓。肝素系天然酸性黏多糖，為線性陰離子聚電解質，是由結構不一、帶有很強負電荷鏈所組成的一族化合物，肝素在體內和體外均具有延長血凝時間的作用，其抗凝作用非常迅速、強大。肝素對熱穩定，對一般微生物及酶不敏感，為白色或類白色無定形粉末。靜脈注射肝素時還可使脂蛋白質酶釋放和穩定，因而降低血漿甘油三脂。藥用肝素一般可自豬或牛的腸黏膜中提取。
在《中國免疫學》1993年第9卷第2期上吳琦等發表了一篇名為“人中性粒細胞防御素的分離純化”的文章，其中提出了一種對人中性粒細胞抗菌肽進行分離純化的方法，將獲得人中性粒細胞胞漿顆粒，以5％乙酸浸提，然后進行Sephadex G-100和Bio-gel P10過濾，獲得純化的抗菌肽。由于腸道組織結構復雜，雜蛋白種類繁多，因而采用吳琦等的分離純化方法需要進行多次才能達到較為滿意的純化效果。
發明內容
本發明的目的是提供一種同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽的方法本發明所提供的同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽的方法，包括如下步驟
1)取豬腸粘膜加入蛋白酶制劑，加熱到85-95℃，調節pH值到9.0-9.5，保溫20-40分鐘；冷卻后，加入吸附樹脂進行吸附，保留分離液，并回收樹脂；2)步驟1)回收的樹脂以質量百分濃度為19-40％的NaCl水溶液洗脫，洗脫液以乙醇沉淀，得到肝素鈉；3)步驟1)得到的分離液按體積比1∶1-2加入體積濃度為5-10％的乙酸進行攪拌浸提；浸提后的混合液離心，取上清液，并保存沉淀；4)調步驟3)所得上清液pH值到5～6.0，離心，保留上清液，凍干得到豬腸粘膜抗菌肽。
如果需要將豬腸粘膜抗菌肽用于醫藥用途，要進一步純化將步驟5)所得豬腸粘膜抗菌肽溶于雙蒸水后，利用Sephadex G-100層析除大分子，利用Sephadex G-25層析脫鹽；層析得到的洗脫液先以截留分子量為10kD的超濾膜超濾，然后過截留分子量為3kD的超濾膜超濾，收集得到分子量為3-8kD的純化豬腸粘膜抗菌肽。
Sephadex G-100層析除大分子的洗脫液為0.2mol/L乙酸鈉溶液；Sephadex G-25層析脫鹽的洗脫液為雙蒸水。
為了能夠更徹底地收獲原料中的有效物質，還可以將步驟3)中的沉淀中的有效物質再進行提取，其方法是，按體積比為1∶1-2的比例向所述步驟3)所得離心沉淀中加入體積濃度為5-10％的乙酸，攪拌浸提；浸提后混合液離心，取上清液，并且與步驟3)所得的上清液合并，再進行以后的工序。
在上述提取過程中，步驟1)所述蛋白酶可以為胰蛋白酶，其用量為20g酶/公斤豬腸粘膜；吸附樹脂可以為吸附樹脂D254，其吸附用量為豬腸粘膜重量的5-10％。所述提取過程中的離心均可以采用在4℃，10000rpm條件下進行。
對分離純化所得豬腸粘膜抗菌肽的生物學活性進行研究的結果表明，所得豬腸粘膜抗菌肽對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等常見的致病菌有明顯的抑制作用；豬腸粘膜抗菌肽還對雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞新城疫病毒(NDV)和雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)均有顯著的滅活作用。更有意義的是，豬腸粘膜抗菌肽還可提高機體非特異性免疫功能、雞特異性免疫血清抗體水平和腸道黏膜免疫功能，并且能提高雛雞日增重、降低料重比，促進雞胚和雛雞的生長發育。
本發明從豬肉屠宰加工的廢棄物腸黏膜中同時提取肝素鈉和抗菌肽兩種物質，極大的提高屠宰加工廢棄物的利用價值；所提取得到的肝素鈉和抗菌肽，在功能上具有廣譜抗菌、抗病毒，不產生耐藥性，并具有免疫調節作用。本發明方法分離純化方法簡便，分離、提取率高，所用原料可使用生豬屠宰廠、腸衣加工廠等企業的廢棄物，來源豐富、成本低，實現廢棄物高值化利用，可最大限度地減少或消除生豬屠宰廠、腸衣加工廠等企業的廢棄物對環境的污染，具有良好的經濟效益和社會效益。
具體實施例方式
實施例1、同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽第一階段肝素鈉的提取步驟一，取腸衣加工的副產品豬腸粘膜，加入胰蛋白酶制劑攪拌，其用量為20克酶/公斤豬腸粘膜，加熱到90℃，用氫氧化鈉調節pH值9.0-9.5，恒溫20-40分鐘。
步驟二，冷卻后，加入清洗干凈的吸附樹脂D254進行吸附，樹脂用量為腸粘膜重量的5％。
步驟三，吸附后的液體與樹脂分離，液體用于提取抗菌肽，回收樹脂，用19-30％(重量)NaCl水溶液洗脫；步驟四，洗脫液用純乙醇沉淀，收集沉淀出的肝素鈉粗品，干燥保存。經鑒定，該產品中肝素鈉的含量可以達到65％以上。
第二階段抗菌肽的提取步驟五，取上述步驟三分離出液體，按1∶1(v/v)加入5％乙酸，攪拌浸提24h；步驟六，將混合物于4℃，10000rpm離心30min，取上清。
步驟七，將離心后的沉淀按步驟五再次浸提，再按照步驟六進行離心，保留上清液后，繼續下一步；步驟八，合并兩次上清液，調其pH值至5～6.0，離心，去掉沉淀，保留上清液，得到豬腸粘膜抗菌肽粗產品(可凍干保存)。
如果需要將豬腸粘膜抗菌肽用于醫藥用途，進一步純化將凍干物溶于雙蒸水，利用Sephadex G-100層析除大分子(用0.2mol/L乙酸鈉洗脫)和利用Sephadex G-25層析脫鹽(用雙蒸水洗脫)，層析得到的洗脫液先以截留分子量為10kD的超濾膜超濾，然后過截留分子量為3kD的超濾膜超濾，收集得到分子量為3-8kD的抗菌肽純品。
將所得產品紫外檢測，測量OD260納米處的吸收值，如果在260nm處有吸收值，證明有蛋白，可進行抑菌實驗。
實施例2、豬腸粘膜抗菌肽的功能實驗1、抑菌試驗采用微量瓊脂糖彌散試驗法檢測豬腸粘膜抗菌肽對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌自然分離株、凡隆嗜水氣單胞菌等細菌的作用，結果表明豬腸粘膜抗菌肽對這些細菌均有不同程度的抑制和殺滅作用，殺菌率由59.5％～98.5％不等，揭示了豬腸粘膜抗菌肽具有很強的抗菌作用和較廣的抗菌譜。
2、抗病毒實驗抗病毒實驗結果表明，豬腸粘膜抗菌肽可使雞胚尿囊液中IBV的血凝效價由7.3log2(病毒組)降至1.0log2(豬腸粘膜抗菌肽處理病毒組)，抑制IBV所引起的雞胚病變；還可以使NDV感染雞群發病率由100％(NDV攻毒組)降至40％(ABPs處理NDV攻毒組)，相應的死亡率由60％降至13.3％。使IBDV感染雞群發病率由100％(IBDV攻毒組)降至33.3％(ABPs處理IBDV攻毒組)，相應的死亡率由80％降至20％。揭示豬腸粘膜抗菌肽對IBV、NDV和IBDV有一定的抑制和殺滅作用。
3、肌肉注射實驗采用肌肉注射的方法，給雞按照每周1次，每次10μg劑量注射豬腸道抗菌肽；對照組注射相同劑量的生理鹽水。結果表明實驗組雛雞平均日增重(15.54±0.20g)顯著高于對照組(11.10±0.19g)(p＜0.05)；實驗組料重比(2.27±0.04)顯著低于對照組(2.60±0.05)(p＜0.05)。由此可見豬腸粘膜抗菌肽可以提高雛雞的生長速度和飼料轉化率，改善雞的生長指標，促進雛雞生長發育。同時，在研究中還發現，豬腸粘膜抗菌肽可以促進雞胚的生長發育，顯著提高各段腸管的腸絨毛長度和V/C值。
權利要求
1.一種同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽的方法，包括如下步驟1)取豬腸粘膜加入蛋白酶制劑，加熱到85-95℃，調節pH值到9.0-9.5，保溫20-40分鐘；冷卻后，加入吸附樹脂進行吸附，保留分離液，并回收樹脂；2)步驟1)回收的樹脂以質量百分濃度為19-40％的NaGl水溶液洗脫，洗脫液以乙醇沉淀，得到肝素鈉；3)步驟1)得到的分離液按體積比1∶1-2加入體積濃度為5-10％的乙酸進行攪拌浸提；浸提后的混合液離心，取上清液，并保存沉淀；4)調步驟3)所得上清液pH值到5～6.0，離心，保留上清液，凍干得到豬腸粘膜抗菌肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將步驟5)所得豬腸粘膜抗菌肽溶于雙蒸水后，利用Sephadex G-100層析除大分子，利用Sephadex G-25層析脫鹽；層析得到的洗脫液先以截留分子量為10kD的超濾膜超濾，然后過截留分子量為3kD的超濾膜超濾，收集得到分子量為3-8kD的純化豬腸粘膜抗菌肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于Sephadex G-100層析除大分子的洗脫液為0.2mol/L乙酸鈉溶液；Sephadex G-25層析脫鹽的洗脫液為雙蒸水。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于按體積比為1∶1-2的比例向所述步驟3)所得離心沉淀中加入體積濃度為5-10％的乙酸，攪拌浸提；浸提后混合液離心，取上清液，并且與步驟3)所得的上清液合并。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于步驟1)所述蛋白酶為胰蛋白酶，其用量為20g酶/公斤豬腸粘膜；所述吸附樹脂為吸附樹脂D254，其吸附用量為豬腸粘膜重量的5-10％。
6.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述提取過程中的離心均是在4℃，10000rpm條件下進行的。
全文摘要
本發明公開了一種同步提取肝素鈉和豬腸粘膜抗菌肽的方法。本發明方法，包括1)取豬腸粘膜加入蛋白酶制劑，加熱到85－95℃，調節pH值到9.0－9.5，保溫20－40分鐘；冷卻后，加入吸附樹脂進行吸附，保留分離液，并回收樹脂；2)步驟1)回收的樹脂以質量百分濃度為19－40％的NaCl水溶液洗脫，洗脫液以乙醇沉淀，得到肝素鈉；3)步驟1)得到的分離液按體積比1∶1－2加入體積濃度為5－10％的乙酸進行攪拌浸提；浸提后的混合液離心，取上清液，并保存沉淀；4)調步驟3)所得上清液pH值到5～6.0，離心，保留上清液，凍干得到豬腸粘膜抗菌肽。本發明從豬肉屠宰加工的廢棄物腸黏膜中同時提取肝素鈉和抗菌肽兩種物質，極大的提高屠宰加工廢棄物的利用價值，具有良好的經濟效益和社會效益。
文檔編號C07K14/435GK1844166SQ20061007886
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月11日 優先權日2006年5月11日
發明者佘銳萍, 包匯慧, 馬衛明, 胡艷欣, 劉天龍, 劉偉, 李冰玲, 楊玉榮, 張艷梅, 王德成, 彭芳珍, 靳紅 申請人:中國農業大學