專利名稱：二苯基醚類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)，該菌株已于2005年12月16日保藏在武漢中國菌種保藏中心(保藏編號是CCTCC M 205148)制備二苯基醚類化合物的方法；本發明還涉及該類化合物在制備細胞周期抑制劑、細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
二苯基醚類化合物是水楊酸的衍生物。水楊酸是目前為止發現的第一個非蛋白類的endothelin(ET)結合抑制劑。該類化合物是一類常見的真菌代謝產物。通常認為這類化合物是蒽醌類化合物借助sulochrin和grisandienes(如geodin)得來的。已有一些文獻報道，該類化合物顯示了許多獨特的生物活性，如能夠抑制血管生成因子(VEGF)誘導的血管生成以及endothelin(ET)結合抑制作用。
該類化合物的結構特征是均具有水楊酸化合物的二苯基醚類母核，如T.Ogawa，；K.Ando，Y.Aotani，K.Shinoda，T.Tanaka，E.Tsukuda，M.Yoshida & Y.MatsudaRES-1214-1 and -2，novel non-peptidic endothelin type A receptorantagonists produced by Pestalotiopsis sp.J.Antibiotics，1995，481401～1406；H.J.Lee，J.H.Lee，B.Y.Hwang，H.S.Kim and J.J.Lee，Fungal Metabolites，AsterricAcid Derivatives Inhibit Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-induced TubeFormation of HUVECs.J.Antibiotics，2002，55(6)552～556等曾分別報道了相關該類化合物，但尚未見該類化合物具有細胞周期抑制抗腫瘤活性的報道。本發明人研究發現曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)液體發酵產物經超聲破碎后的粗提物有很好的腫瘤細胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進行了研究，結果發現了新的二苯基醚類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見對該化合物的化學結構及細胞周期抑制、細胞增殖抑制及細胞凋亡誘導活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關的藥物。
發明內容
本發明旨在提供一種結構獨特的具有細胞增殖抑制以及直接殺傷癌細胞等抗腫瘤活性的新化合物。
本發明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
本發明首次從曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)發酵物中發現了結構新穎的二苯基醚類化合物，如式I
式I其結構特征是R1和R2為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R3為烴基、氫或氨基。
本發明的式I化合物優選其中化合物1中R1為氫，R2為羥基，R3為甲基。
上述發明中最優選的化合物是由海洋來源的曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)的液體發酵物經硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇95∶5的洗脫物，再經SephadexLH20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫產物再經制備HPLC分離純化，以甲醇-水60∶40洗脫得式I化合物1。
本發明采用四氮唑鹽(MTT)還原法和流式細胞術結合顯微鏡下檢測細胞形態特征的方法，測試評價了本發明式I化合物對人白血病K562細胞的細胞增殖抑制、細胞周期抑制和細胞凋亡誘導以及對腫瘤細胞的直接殺傷等作用。實驗證實，式I化合物對腫瘤細胞可通過抑制細胞周期周轉、誘發癌細胞凋亡或直接的殺傷等方式，顯示抑制腫瘤細胞增殖的生物學活性，從而發揮其抗腫瘤作用。
因此本發明的式I化合物可用作細胞周期抑制劑、細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑。
式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
式I化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用于生命科學研究，作為探針應用時，式I化合物可溶于甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。
本發明的式I化合物可通過微生物發酵培養，然后從發酵物中分離純化而得到；也可由上述優選化合物經本領域技術人員熟知的化學修飾方法合成獲得。
需要特別說明的是，經發酵微生物制取本發明式I化合物的方法可采用其它任何能生產該類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可作為生產菌用于制備式I化合物。
本發明的實施例中列舉了利用曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)制備優選的本發明式I化合物的實例。
該真菌B-F-2株由從海底沉積物中分離，并經分類學研究鑒定為曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)。該菌株已于2005年12月16日保藏在中國菌種保藏中心(保藏編號CCTCC M205148)要特別說明的是，經發酵微生物制取本發明式I化合物的方法可采用其它任何能生產二苯基醚類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可用作生產菌用于制備式I化合物。
具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物1的化學結構是(結構式中的阿拉伯數字是化學結構中碳原子的標位) 式I實施例1化合物1的發酵生產及分離精制1發酵生產生產菌的發酵培養按培養微生物的常規方法，取曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)適量，接種到PDA斜面培養基上，在28攝氏度培養箱中培養4天。
取斜面培養4天的曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)適量，接種到裝有120mL培養液[培養基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH 7.0]的500mL錐型瓶中，在28℃、120轉/分鐘條件下搖床培養48小時，獲得曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)的種子培養液。將該種子培養液按10％接種量分別接種于裝有300毫升生產培養液[培養基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH 7.0]的1000mL三角燒瓶中，進行為期25天24℃的靜置生產發酵，獲得菌絲體和發酵液。
2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發酵液的浸膏，共22.0克。
3化合物的分離精制浸膏(22.0克)用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶劑溶解后，加70克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為12個流份。Fr-5(2克，氯仿-甲醇95∶5洗脫物)，再經Sephadex LH20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫產物再經HPLC，以甲醇-水6∶4洗脫得化合物1(7mg)。
化合物1無色針晶，mp 159～161℃，分子式C19H20O8，HRESI-MS m/z375.1094[M-H]+，計算值375.1080.UV λmaxnm in CHCl3(logε)255(2.30)，308(2.35).IR vmaxcm-1(KBr)3322，3014，1732，1725，1606，1467，1275，1202，1082，1056，996，.1H及13C NMR數據見表1。
表1化合物1的1H(600MHz)和13C NMR(150MHz)數據
aSpectra recorded in CDCl3.
實施例2抗腫瘤活性的測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物1。準確稱取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測試。
細胞系及細胞的繼代培養活性測試采用K562細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養基，在37℃通入5％二氧化碳的培養箱中繼代培養。
細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。活細胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量與活細胞數成正比，所以可根據吸收度求出活細胞的數目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。
活性測試時，取對數生長期的K562細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升5×104個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，在37℃下培養24小時后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續培養72小時。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養4小時，移出150μL培養液后加入150μLDMSO溶解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
流式細胞術取對數生長期的K562細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，37℃下培養17小時。取藥物作用下培養后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態學特征，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸鈉和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用庫爾特公司產計算機軟件WinCycle進行分析計算。
2實驗結果化合物1的細胞增殖抑制活性化合物1對K562細胞具有增殖抑制活性，其IC50值為76.5μM。
化合物1的流式細胞術檢測分析結果K562細胞經化合物1處理17小時后測得的流式細胞術結果見表2和
，如“圖1是化合物1的流式細胞直方圖”，化合物1當在每毫升10微克以上濃度時可將K562細胞的細胞周期顯著阻滯在S期，在每毫升100微克時顯示了細胞凋亡誘導活性。
表2K562細胞經化合物1處理17小時后在細胞周期各時相中的相對分布*
3結論化合物1對包括人在內的哺乳動物來源的癌細胞具有抗腫瘤作用。因此，本發明的式I化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細胞周期抑制細胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現象本質的生命科學實驗研究中。
權利要求
1.式I化合物 式I其中式I R1和R2為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R3為烴基、氫或氨基。
2.權利要求1所述的式I化合物，其中R1為氫，R2為羥基，R3為甲基。
3.權利要求2所述式I化合物的制備方法，其特征是發酵培養曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)，獲取含有上述式I化合物的發酵物，然后從發酵物中分離純化出式I化合物。
4.權利要求3所述的制備方法，其中將所述發酵物經硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇95∶5的洗脫物，再經Sephadex LH20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫產物再經制備HPLC分離純化，以甲醇-水60∶40洗脫得式I化合物。
5.權利要求4所述的制備方法，其中所述二苯基醚類化合物的生產菌是曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)。
6.權利要求1所述的式I化合物在制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。
7.權利要求1所述的式I化合物在制備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的用途。
8.權利要求1所述的式I化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及二苯基醚類化合物及其制備方法和用途。本發明用從海洋樣品中分離得到的曲霉B－F－2(Aspergillus sp.B－F－2)生產出結構新穎的上述類型的化合物。經實驗證實，該類化合物可作為細胞周期抑制劑、細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C07C217/00GK1896043SQ20061006504
公開日2007年1月17日 申請日期2006年3月17日 優先權日2006年3月17日
發明者朱天驕, 劉睿, 顧謙群, 朱偉明, 劉紅兵, 方玉春, 張亞鵬 申請人:中國海洋大學, 中國大洋礦產資源研究開發協會