專利名稱：甲基異硫脲陽離子作為連接基的脫氧核糖核酸雙嵌入劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類以甲基異硫脲陽離子作為連接基的萘酰亞胺類脫氧核糖核酸雙嵌入劑，其制備方法以及其作為腫瘤抑制劑的生物學應用。
背景技術：
近年來，新型抗癌藥物的研發一直是醫藥化學的熱點。由于腫瘤細胞與正常細胞的脫氧核糖核酸(以下簡稱DNA)存在顯著的差異性，將DNA作為抗腫瘤藥物的靶點是一種理想的選擇。DNA嵌入劑能夠嵌入到DNA堿基對中間，導致DNA拓撲結構的變化，進而影響拓撲異構酶對DNA的識別與作用。根據文獻(Cur.Pharm.Design，2001，7，1745)報道，不同類別的DNA嵌入劑，如蒽環類、吖啶類、萘酰亞胺類、放線菌素類等，都被用作抗腫瘤研究；以它們作為先導，合成了大量衍生物，已經從中篩選出了一些具有顯著的腫瘤治療作用的藥物分子，嵌入劑也因此成為抗腫瘤藥物的一個重要類別。此外，文獻(Cacer Res.，1995，55，1176)報道，如果采用適當的基團將兩個具有DNA嵌入作用的結構單元連接起來形成的分子可作為DNA雙嵌入劑；與相應的單嵌入劑相比，DNA雙嵌入劑往往表現更高的抗腫瘤活性；而連接基團，盡管本身并不能嵌入到DNA中，但可能通過靜電作用、氫鍵作用等與DNA的溝槽區域產生親合力，從而顯著地影響雙嵌入劑的DNA嵌入方式和嵌入效率；因此通過連接基的設計和修飾，可能實現對雙嵌入劑化合物的抗腫瘤活性和選擇性的控制和調節。目前，盡管已經報道了許多DNA雙嵌入劑，但多數是在嵌入母體結構上作修飾，而連接基的選擇則比較單一，通常是采用柔性的含氮原子的烷氨基鏈。本發明所涉及的甲基異硫脲陽離子作為DNA雙嵌入劑的連接基的分子設計思想，目前為止，未見任何報道。
發明內容
本發明的目的在于采用甲基異硫脲陽離子作為連接基，利用其具有與DNA磷酸鍵較強親合力的特點，獲得具有良好抗腫瘤活性的萘酰亞胺類DNA雙嵌入劑。
本發明涉及的一類以甲基異硫脲陽離子作為連接基的萘酰亞胺類DNA雙嵌入劑分子具有如下的結構通式 其中L是C2-C6直鏈烷烴，X-是I-，或1/2 SO42-。
本發明中，考慮到甲基異硫脲陽離子具有獨特的正電荷和氫鍵供體性質，而DNA的磷酸骨架結構具有負電荷和氫鍵受體性質，二者之間具有強親合力，使甲基異硫脲陽離子結構單元與DNA發生穩固的溝槽結合；本發明采用的萘酰亞胺作為嵌入結構單元，其本身是具備良好的DNA嵌入作用；本發明中，甲基異硫脲陽離子作為連接基對稱性地連接兩個萘酰亞胺形成的DNA雙嵌入劑利用以上兩種作用的協同效應；通過改變L鏈的長短，可改變甲基異硫脲陽離子與萘酰亞胺的空間間隔，對二者的協同作用進行調控；本發明涉及的DNA雙嵌入劑經過生物學實驗，證實具有顯著的DNA損傷能力，和誘導腫瘤細胞凋亡的活性。
本發明所涉及的甲基異硫脲陽離子作為連接基的萘酰亞胺類DNA雙嵌入劑可采用以下反應過程制備 原料萘酐(A)和1～3倍摩爾量的烷基二胺(H2N-L-NH2)在溶劑水、乙醇、甲醇、乙睛、三氯甲烷、乙二醇單甲醚、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中，60～120℃溫度條件下，攪拌反應0.5～5小時后，冷卻，析出固體，過濾得到中間產物B。化合物B懸浮在上述一種溶劑中，與0.5倍摩爾量的二硫化碳，60～120℃溫度條件下攪拌反應0.5～5小時，冷卻，析出固體，過濾得到中間產物C。化合物C懸浮在上述一種溶劑中，與等摩爾量的硫酸二甲酯或10～20倍摩爾量的碘甲烷，40～120℃溫度條件下攪拌反應2～5小時，冷卻析出固體，過濾得到產物D(使用硫酸二甲酯得到硫酸鹽，使用碘甲烷反應得到的產物則得到碘化鹽，)，即本發明所涉及的DNA雙嵌入劑化合物。
本發明所涉及的烷基異硫脲陽離子作為連接基的萘酰亞胺類DNA雙嵌入劑的生物活性通過DNA切割實驗和腫瘤細胞誘導實驗測試，證實其具有良好的DNA切割能力和抗腫瘤活性。
圖1是DNA凝膠電泳譜帶圖；圖2是流式細胞儀測定的細胞凋亡指數圖，其中橫坐標是DNA含量，縱坐標是細胞數量。
具體實施例方式
實施例110克萘酐和6.1克乙二胺，加入到60毫升乙睛中，攪拌、加熱，保持60℃保持3小時，然后冷卻至常溫，析出固體，過濾、干燥得到10.3克中間產物B1，產率85％；5克化合物B1懸浮在100毫升乙二醇單甲醚中，加入0.8克的二硫化碳，攪拌、加熱到120℃，保溫2.5小時，冷卻，析出固體，過濾得到5.1克中間產物C1，收率94％。1克化合物C1在懸浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.24克硫酸二甲酯，攪拌，加熱60℃，保持2小時，冷卻析出固體，過濾得到0.8克產物，DNA雙嵌入劑D1，收率71％。
D1熔點190-191℃；1H NMRδδ9.40(br s 2H)，，8.46-8.44(d，J＝8.4Hz，8H)，7.87-7.83(t，J＝7.6Hz，4H)，4.31(br s，4H)，3.78-3.72(m，6H)，2.45(s，3H)；ESI-MSm/e 537(C30H25N4O4S+).
實施例210克萘酐和7.5克乙二胺，加入到60毫升乙睛中，攪拌、加熱，保持60℃保持3小時，然后冷卻至常溫，析出固體，過濾、干燥得到9.8克中間產物B2，產率76％；5克化合物B1懸浮在100毫升乙二醇單甲醚中，加入0.74克的二硫化碳，攪拌、加熱到120℃，保溫2.5小時，冷卻，析出固體，過濾得到5.2克中間產物C2，收率96％。1克化合物C2懸浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.23克硫酸二甲酯，攪拌，加熱60℃，保持2小時，冷卻析出固體，過濾得到0.82克產物，DNA雙嵌入劑D2，收率77％。
D2熔點147-148℃；1H NMRδ9.08(br s 1H)，8.68(br s，1H)，8.42-8.36(m，8H)，7.84-7.79(t，J＝7.6Hz，4H)，4.02-4.00(m，4H)，3.51(s，4H)，2.74(br s，3H)，2.10(br s，2H)，1.93(br s，2H)；ESI-MSm/e 565(C32H29N4O4S+).
實施例310克萘酐和11.8克己二胺，加入到60毫升乙睛中，攪拌、加熱，保持60℃保持3小時，然后冷卻至常溫，析出固體，過濾、干燥得到10.0克中間產物B1，產率66％；5克化合物B3懸浮在100毫升乙二醇單甲醚中，加入0.64克的二硫化碳，攪拌、加熱到120℃，保溫2.5小時，冷卻，析出固體，過濾得到5.2克中間產物C3，收率98％。1克化合物C3懸浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.19克硫酸二甲酯，攪拌，加熱60℃，保持2小時，冷卻析出固體，過濾得到0.84克產物，DNA雙嵌入劑D3，收率76％。
D3熔點115-116℃；1H NMRδ9.11(br s 1H)，8.71(br s，1H)，8.42-8.36(m，8H)，7.84-7.79(t，J＝7.6Hz，4H)，4.03-4.00(t，J＝7.2Hz，4H)，3.36(s，3H)，2.64(br s，2H)，2.10(br s，2H)，1.63-1.60(m，8H)，1.37(br s，8H)；ESI-MSm/e 649(C38H41N4O4S+).
實施例41克化合物C3懸浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.19克硫酸二甲酯，攪拌，加熱40℃，保持4小時，冷卻析出固體，過濾得到0.78克產物，DNA雙嵌入劑D3I，收率73％。
D4熔點190-191℃；1H NMRδδ9.40(br s 2H)，，8.46-8.44(d，J＝8.4Hz，8H)，7.87-7.83(t，J＝7.6Hz，4H)，4.31(br s，4H)，3.78-3.72(m，6H)，2.45(s，3H)；ESI-MSm/e 537(C30H25N4O4S+).
實施例5分別取無菌水18μL，加入質粒DNA(200ng/μL)1μL和雙嵌入劑D1(100μM)1μL(終濃度5μM)；無菌水17μL，加入質粒DNA(200ng/μL)1μL和雙嵌入劑D1(100μM)2μL(終濃度10μM)；無菌水15μL，加入質粒DNA(200ng/μL)1μL和雙嵌入劑D1(100μM)4μL(終濃度20μM)使反應總體積為20μL。混勻置于37℃水浴中24小時后進行1％瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，電泳顯色結果表明，雙嵌入劑D1在低濃度(5～20μM)下就能夠導致環形和線形質粒DNA的降解，具有明顯的切割DNA的能力。
實施例6細胞培養嚴格進行無菌操作，人結腸癌細胞(HT-29)采用含10％小牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM/F-12培養基，置于37℃含5％CO2的細胞培養箱中培養。細胞傳代，取處于對數生長期的HT-29細胞加入PBS洗液洗滌兩次，加入1.25g/L胰蛋白酶消化，棄去胰蛋白酶細胞分瓶，加入新鮮培養基。
取處于對數生長期的HT-29細胞傳代培養24小時，加入雙嵌入劑D1濃度為20μmol/L，對照組加入等量的培養基，培養24小時。收集細胞用PBS洗液洗滌三次，1體積細胞懸液加9體積70％乙醇于-20℃固定細胞24小時，離心，PBS液洗滌除盡乙醇，離心后懸于PI染液中室溫染色30分鐘，流式細胞儀測定，以凋亡指數(APO)表示細胞凋亡情況(APO＝凋亡細胞數/所測細胞數×100％)。
如圖2所示，流式細胞儀測定結果表明，低濃度(20μmol/L)的雙嵌入劑D1，能顯著地誘導人結腸癌細胞(HT-29)的凋亡。
權利要求
1一類甲基異硫脲陽離子作為連接基的脫氧核糖核酸雙嵌入劑，其特征是甲基異硫脲陽離子作為連接基，連接兩個萘酰亞胺結構單元，形成DNA雙嵌入劑，結構通式 其中L是C2-C6直鏈烷烴，X-是I-，或1/2SO42-。
2根據權利要求1所述的甲基異硫脲陽離子作為連接基的脫氧核糖核酸雙嵌入劑的制備方法，其特征是以原料萘酐，與1～3倍摩爾量的烷基二胺H2N-L-NH2在溶劑水、乙醇、甲醇、乙睛、三氯甲烷、乙二醇單甲醚、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中，60～120℃，攪拌反應0.5～5小時，冷卻，析出固體，過濾得到一個中間產物；此中間產物懸浮在上述一種溶劑中，與0.5倍摩爾量二硫化碳，在60～120℃下攪拌反應0.5～5小時，冷卻，析出固體，過濾得到另一個中間產物；此化合物懸浮在上述一種溶劑中，與等摩爾量硫酸二甲酯或10～20倍摩爾量的碘甲烷，在40～120℃下攪拌反應2～5小時，冷卻析出固體，過濾得到產物DNA雙嵌入劑。
3根據權利要求1所述的甲基異硫脲陽離子作為連接基的脫氧核糖核酸雙嵌入劑的用途，其特征是在37℃無菌水中經過24小時后，引起環形和線形質粒DNA的降解，具有明顯的切割DNA的能力。
4根據權利要求1所述的一種甲基異硫脲陽離子作為連接基的脫氧核糖核酸雙嵌入劑的用途，其特征是在37℃無菌條件下經過24小時后，導致人結腸癌細胞HT-29的凋亡，具有明顯的抗腫瘤活性。
全文摘要
本發明涉及一類以甲基異硫脲陽離子作為連接基的萘酰亞胺類脫氧核糖核酸(DNA)雙嵌入劑，其制備方法以及其作為腫瘤抑制劑的生物學應用。此類DNA雙嵌入劑以甲基異硫脲陽離子作為連接基，連接兩個萘酰亞胺結構單元。其制備方法是以原料萘酐，與烷基二胺H
文檔編號C07D221/06GK1850082SQ20061004594
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月3日 優先權日2006年3月3日
發明者肖義, 金禮吉 申請人:大連理工大學