專利名稱：抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體及其制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域中的一種免疫球蛋白及其制備方法，尤其是涉及抗孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)毒雞卵黃抗體及其制備。
背景技術：
毒蛇咬傷突發性強、病情重、進展快及死亡率高，盡快、盡早應用特異性抗蛇毒血清是治療蛇傷最有效的方法。在我國南方的劇毒蛇中，屬眼鏡蛇亞科的眼鏡蛇主要有2種，即中華眼鏡蛇(Naja atra)及孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)。中華眼鏡蛇又稱舟山眼鏡蛇，以其項背具有明顯的白色眼鏡狀斑紋為特征，該蛇咬傷的首選特效藥為精制中華眼鏡蛇抗毒血清。孟加拉眼鏡蛇又稱泰國眼鏡蛇，項背的＂眼鏡＂狀斑僅有單個圓圈，原分布于廣西西南部、云南南部及西部、孟加拉、印度東北部、尼泊爾、泰國、緬甸、越南與柬埔寨等地，近年來該蛇大量流入廣東、福建等地。孟加拉眼鏡蛇毒性較中華眼鏡蛇更大，因國內尚無孟加拉眼鏡蛇抗毒血清，故被該蛇咬傷者致殘、致死率較高。目前，臨床多采用兩種抗毒血清聯合注射(精制中華眼鏡蛇抗毒血清+銀環蛇血清)的方式以治療孟加拉眼鏡蛇咬傷。
國產的精制抗蛇毒血清系用脫毒的蛇毒免疫馬匹，血漿經胃酶消化、硫酸銨鹽析后，再進一步精制提純，制成以去除Fc片段的IgG為主要成分的單價抗血清制劑。由于該制劑的制備至今還采用上世紀70年代的生產工藝，且價格昂貴、過敏反應率高(多見有皮疹、喉頭水腫、血壓下降，四肢關節疼痛、血清病、過敏性休克等III型變態反應)，故極大地限制了其的臨床應用。
近年來的研究表明，用原始、脫毒或γ射線照射的蛇毒作抗原，免疫母雞后12-15天，即可從雞卵黃中分離出相應的免疫球蛋白，簡稱為卵黃抗體(Immunoglobulin yolk，簡稱IgY)。IgY在結構上類似哺乳動物IgG，其分子量為180～210KD，包括1條67-70KD的重鏈和2條22-30的輕鏈。與現有的馬血清IgG相比，IgY具有產率高、成本低、穩定性好、特異性強、過敏性小及顯著減少由于抗體采集而造成對動物的傷害等優點，因此，IgY已成為新一代蛇傷特效藥物研制的一個重要方向。由于多價雞卵黃蛇毒抗體制備成本低、產量大、安全性高，除可替代馬血清供注射外，還可開發為口服制劑，后者在蛇傷預防方面有廣闊的應用前景，社會及經濟效益更為可觀。
目前，國內外學者已制備出了抗巴西抗響尾蛇毒、抗具竅腹蛇毒、抗蝰蛇毒、抗蝮蛇毒抗眼鏡王蛇毒及抗中華眼鏡蛇等數種IgY，其在親和力及特異性方面均明顯高于馬源抗血清，但至今尚無抗孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)毒雞卵黃抗體制備及其應用方面的報道。
發明內容
為了克服現有的品種及制備方面的不足，本發明的目的是提供一種抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY。
本發明所提供的孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體IgY，其特征是在非還原型SDS-PAGE上呈現單一條帶，分子量約為200KD；在還原SDS-PAGE上顯示為65KD及35KD 2條帶，所述的還原SDS-PAGE的分離膠濃度為10％；采用Western Blot檢測，PVDF膜上可見至少13條染色條帶，分子量為100～0.7KD。
本發明的另一個目的是提供一種抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備方法。
它通過以下技術措施來實現的，一種抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備方法包括以下步驟(1)雞卵黃抗體提取取經注射孟加拉眼鏡蛇毒抗原免疫后的母雞產下的雞蛋，用水稀釋法從蛋黃液中提取卵黃抗體IgY粗品，去離子水與蛋黃液的比率5～12∶1，調pH至4～8，4℃放置6～12h，4℃離心15min/19000g，上清經超濾濃縮，溶液濃度15～25mg/ml；(2)用硫酸銨鹽析法純化IgY，加入飽和硫酸銨至40～60％飽和度，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，超濾脫鹽、濃縮。
本發明可進一步純化用陰離子交換層析進一步純化IgY，采用DEAE Sepharos FF柱，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH 7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮，凍干，4℃保存。所得抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的純度可達95％以上，其分子量約為200KD。
本發明步驟1中抗原制備利用蛇毒取毒器采集孟加拉眼鏡蛇毒，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，低溫真空干燥為凍干粉。使用戊二醛對蛇毒進行減毒處理，毒性測定，層析除鹽，與福氏佐劑乳化而制成抗原；本發明步驟1中雞卵黃抗體制備抗原經雞皮下及肌肉多位點注射，初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續收集達6～8個月；本發明所述的步驟1中，去離子水與蛋黃液的比率優選為9∶1，pH優選為5.1，4℃放置時間優選8h，濃縮所得的溶液濃度優選為20mg/ml。
本發明所述的步驟2中，所述的加入飽和硫酸銨的飽和度為50％。
本發明的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的制備方法適用范圍較廣泛，可用于制備各種抗蛇毒IgY，所得到的抗體可用于制備預防和/或治療因毒蛇咬傷所引起的相關重癥的藥品、保健食品等，也可用于制備檢測相關蛇毒的檢驗試劑。
本發明的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY由孟加拉眼鏡蛇毒免疫產卵母雞而得，不但對孟加拉眼鏡蛇毒有專一的特異性，對眼鏡蛇科的其他屬、種的毒蛇，如中華眼鏡蛇等咬傷也有良好的治療效果。
本發明的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY采用雞卵為載體，避免了因抗體采集而造成對動物的傷害，符合歐、美對動物權益的保護法規，還因為其化學性質穩定、產量高、成本低等優勢，故更適于產業化生產。
圖1是制備抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY方法及其檢測的工藝流程圖。
具體實施例方式
抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的制備實施例1(1)孟加拉眼鏡蛇毒抗原制備成年孟加拉眼鏡蛇，體重1.5～2.0kg，使用專利號為200420046279.9所公開的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，真空、低溫干燥為凍干粉。取蛇毒凍干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得溫度下放置2h后，利用Sephadex G-25層析除去鹽分，測定蛇毒LD50。
(2)佐劑乳化及雞免疫取22周齡的萊杭母雞(體重1.0±0.1kg)，將孟加拉眼鏡蛇毒與福氏佐劑按1∶1(V/V)充分乳化后，經雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點注射。初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續收集達6～8個月，編號后于4℃保存，留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。
動物飼養條件單元式籠養，一雞一舍，舍內配有棲木及干草束，喂以標準蛋雞飼料及清潔水。
(3)提取水稀釋法取免疫后雞蛋，去蛋白，分離出蛋黃液，用10倍去離子水攪拌下稀釋，用0.1mol/L HCl調pH至5.1，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經超濾，濃縮為IgY水提物，溶液濃度為20mg/ml。
(4)純化
①硫酸銨鹽析IgY水提物加入飽和硫酸銨至50％飽和度，充分混勻，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，用孔徑為100KD的濾膜超濾脫鹽、濃縮為IgY鹽析物；②陰離子交換層析IgY鹽析物再經DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)層析，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮為IgY層析物，凍干，4℃保存備用。
實施例2(1)孟加拉眼鏡蛇毒抗原制備成年孟加拉眼鏡蛇，體重1.5～2.0kg，使用專利號為200420046279.9所公開的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，真空、低溫干燥為凍干粉。取蛇毒凍干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得溫度下放置2h后，利用Sephadex G-25層析除去鹽分，測定蛇毒LD50。
(2)佐劑乳化及雞免疫取22周齡的萊杭母雞(體重1.0±0.1kg)，將孟加拉眼鏡蛇毒與福氏佐劑按1∶1(V/V)充分乳化后，經雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點注射。初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續收集達6～8個月，編號后于4℃保存，留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。
動物飼養條件單元式籠養，一雞一舍，舍內配有棲木及干草束，喂以標準蛋雞飼料及清潔水。
(3)提取水稀釋法取免疫后雞蛋，去蛋白，分離出蛋黃液，用6倍去離子水攪拌下稀釋，用0.1mol/LHCl調pH至4，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經超濾，濃縮為IgY水提物，溶液濃度為15mg/ml。
(4)純化③銨鹽析IgY水提物加入飽和硫酸銨至40％飽和度，充分混勻，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，用孔徑為100KD的濾膜超濾脫鹽、濃縮為IgY鹽析物；④子交換層析IgY鹽析物再經DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)層析，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮為IgY層析物，凍干，4℃保存備用。
實施例3(1)孟加拉眼鏡蛇毒抗原制備成年孟加拉眼鏡蛇，體重1.5～2.0kg，使用專利號為200420046279.9所公開的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，真空、低溫干燥為凍干粉。取蛇毒凍干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得溫度下放置2h后，利用Sephadex G-25層析除去鹽分，測定蛇毒LD50。
(2)佐劑乳化及雞免疫取22周齡的萊杭母雞(體重1.0±0.1kg)，將孟加拉眼鏡蛇毒與福氏佐劑按1∶1(V/V)充分乳化后，經雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點注射。初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續收集達6～8個月，編號后于4℃保存，留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。
動物飼養條件單元式籠養，一雞一舍，舍內配有棲木及干草束，喂以標準蛋雞飼料及清潔水。
(3)提取水稀釋法取免疫后雞蛋，去蛋白，分離出蛋黃液，用13倍去離子水攪拌下稀釋，用0.1mol/L HCl調pH至8，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經超濾，濃縮為IgY水提物，溶液濃度為25mg/ml。
(4)純化⑤銨鹽析IgY水提物加入飽和硫酸銨至60％飽和度，充分混勻，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，用孔徑為100KD的濾膜超濾脫鹽、濃縮為IgY鹽析物；⑥子交換層析IgY鹽析物再經DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)層析，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮為IgY層析物，凍干，4℃保存備用。
試驗例1抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的效價及純度檢測抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY效價及純度檢測的具體步驟如下(1)效價測定①雙向免疫擴散法用0.9％氯化鈉溶液配制成1.5％瓊脂糖凝膠，煮沸熔化后倒入平板中，室溫放置15min，打孔，7孔為一組，中央1孔，周邊6孔，孔徑均為4mm，中心孔加孟加拉眼鏡蛇毒150μg/15μl，周圍孔加1∶2～64倍比稀釋的IgY溶液15μl，1∶2孔的抗體起始濃度均為30mg/ml，置37℃水浴鍋孵育24～48h，考馬斯亮蘭R-50染色。結果顯示IgY水提物的效價為1∶2，IgY鹽析物的效價為1∶8，IgY層析物的效價達到1∶16。
②間接Elisa法以20μg/ml pH9.6孟加拉眼鏡蛇毒碳酸緩沖液100μl/孔包被96孔酶標板，4℃放置過夜；以pH7.4 0.05％PBS Tween 20緩沖液洗滌酶標板3次，再以含3％BSA的0.01％PBS-Tween 20封閉液100μl/孔封閉酶標板，37℃溫育2h；取出后洗滌、甩干，每孔加IgY稀釋液100μl，以非免疫卵黃的提取液作陰性對照，37℃溫育1.5h；洗滌后加入兔抗雞IgY-HRP，顯色，酶標儀測定A值，計算批內及批間差異。結果顯示IgY水提物效價為6.33×104；IgY鹽析物效價為65.17×104，IgY層析物效價為104.58×104。批內差異為1.57％，批間差異為7.32％。
(2)純度及分子量測定參照《分子克隆實驗指南》，按SDS-PAGE法進行。還原、非還原SDS-PAGE濃縮膠濃度均為5％，分離膠濃度均為10％，上樣量約為100μg。結果顯示IgY水提物含6個主要雜質帶，分子量分別為25KD和50～66KD之間，經50％硫酸銨沉淀去除了56～66KD之間的4條雜質帶，經DEAE柱層析進一步去除了25KD附近的2條雜質帶，IgY層析物在非還原型SDS-PAGE上僅顯示一條濃染帶，達到電泳純度。加入DTT后，IgY二硫鍵被打開，顯示IgY的重鏈約為65KD，輕鏈約為35KD，據此計算出IgY分子量約為200KD。
(3)交叉免疫性測定制備瓊脂糖凝膠板，打孔，5孔為一組(中央1孔，周邊4孔)，中央孔加蛇毒15μl，周邊孔加倍比稀釋(1∶2～16)的IgY層析物溶液15μl，1∶2孔的IgY起始濃度均為30mg/ml，，于37℃培養箱放置40小時作免疫擴散。觀察中央孔與周邊孔之間的沉淀線。結果顯示經層析純化的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY對舟山眼鏡蛇(Naja atra，Na)及眼鏡王蛇(Ophiophagus Hannah，Oh)有高度交叉免疫(+++)，對銀環蛇(Bungarusmulticinctus，Bm)、金環蛇(Bungarus fasciatus，Bf)及國產圓斑蝰(Vipera russelii inChina，VrC)有中度交叉免疫(++)。該結果表明，抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY除可用于眼鏡蛇科毒蛇咬傷的治療外，還可作為抗圓斑蝰抗體的替代品用于臨床急救。
試驗例2抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY對蛇毒的中和及保護性實驗抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY中和及保護性實驗的具體步驟如下(1)Western Blot檢測孟加拉眼鏡蛇毒經SDS-PAGE電泳，轉入PVDF膜，封閉液中緩慢搖蕩1小時，抗體層析物孵育，4℃靜置12h，用PBST漂洗，兔抗雞IgY-HRP孵育1h，漂洗，DAB顯色。結果顯示PVDF膜上可見13條黃褐色條帶，分子量從100～0.7KD，說明IgY層析物對孟加拉眼鏡蛇毒的主要抗原均有特異性地結合。
(2)動物保護實驗選用NIH系健康小鼠20只，隨機分成2組，每組10只。試驗組將孟加拉眼鏡蛇毒1.5mg/kg與IgY層析物10mg/kg在無菌試管內混合，置25℃恒溫水浴箱中孵育60min，腹腔注射。對照組將孟加拉眼鏡蛇毒1.5mg/kg直接進行腹腔給藥，記錄給藥后24h內小鼠的存活率。結果顯示試驗組10只小鼠全部存活，而對照組均2h內死亡。該試驗表明，IgY層析物可特異性中和孟加拉眼鏡蛇毒，阻止孟加拉眼鏡蛇毒對機體的攻擊。
權利要求
1.一種制備孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體其特征是在非還原型SDS-PAGE上呈現單一條帶，分子量約為200KD；在還原SDS-PAGE上顯示為65KD及35KD 2條帶，所述的還原SDS-PAGE的分離膠濃度為10％；采用Western Blot檢測，PVDF膜上可見至少13條染色條帶，分子量為100～0.7KD。
2.一種制備抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的方法，其特征是包括以下步驟(1)雞卵黃抗體提取取經注射孟加拉眼鏡蛇毒抗原免疫后的母雞產下的雞蛋，用水稀釋法從蛋黃液中提取lgY粗品，去離子水與蛋黃液的比率5～12∶1，調pH至4～8，4℃放置6～12h，4℃離心15min/19000g，上清經超濾濃縮，溶液濃度15～25mg/ml；(2)用硫酸銨鹽析法純化IgY，加入飽和硫酸銨至40～60％飽和度，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，超濾脫鹽、濃縮。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是對步驟(2)所得的產物進一步純化用陰離子交換層析進一步純化IgY，采用DEAE Sepharos FF柱，分別以0.075、0.15及0.3mol/LpH 7.0的PB梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮，凍干，4℃保存。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是步驟(1)中孟加拉眼鏡蛇毒抗原抗原制備利用蛇毒取毒器采集孟加拉眼鏡蛇毒，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，低溫真空干燥為凍干粉；使用戊二醛對蛇毒進行減毒，層析除鹽，與福氏佐劑乳化而制成抗原。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是所述的步驟(1)中，去離子水與蛋黃液的比率為9∶1，pH為5.1，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經超濾濃縮，溶液濃度為20mg/ml。
6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是所述的步驟(2)中，所述的加入飽和硫酸銨的飽和度為50％。
全文摘要
本發明的目的是提供一種抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體(IgY)及其制備方法。本發明通過水稀釋法從蛋黃液中提取IgY粗品，再用硫酸銨鹽析法純化IgY，取沉淀溶入PBS，超濾脫鹽、濃縮；用陰離子交換層析進一步純化lgY，超濾脫鹽、濃縮，凍干，保存備用。所述的IgY在非還原型SDS－PAGE上呈現單一條帶，分子量約為200KD；在還原SDS－PAGE上顯示為65KD及35KD 2條帶，所述的還原SDS－PAGE的分離膠濃度為10％；采用Western Blot檢測，PVDF膜上可見至少13條染色條帶，分子量為100～0.7KD。該抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備方法適用范圍較廣泛，可用于制備各種抗蛇毒雞卵黃抗體，所得到的抗體可用于制備預防 和/或治療因毒蛇咬傷所引起的相關重癥的藥品、保健食品等，也可用于制備檢測相關蛇毒的檢驗試劑。
文檔編號C07K1/00GK1858064SQ20061003576
公開日2006年11月8日 申請日期2006年6月2日 優先權日2006年6月2日
發明者孔天翰, 劉四紅, 董偉華, 黃熱平, 黃劭, 覃媛 申請人:廣州蛇毒研究所, 孔天翰