抗流感病毒轉移因子的制備工藝的制作方法

專利名稱：抗流感病毒轉移因子的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物及其制劑領域，涉及一種人參多糖的新劑型以及相關制備工藝。
背景技術：
流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流行性感冒與一般病毒性感冒，是不同病原引起的兩種疾病。一般的致病病毒入侵呼吸道粘膜后，抗病毒抗體會對其進行中和，可在一定程度上起到避免感染的作用。而引起流行性感冒的病原是流感病毒。流感病毒的最大特點就是容易發(fā)生變異，導致人體內已經出現的抗流感病毒特異性抗體失去中和病毒的作用，因而使人容易感染，甚至造成大規(guī)模流行。病人受流感感染后有的會并發(fā)原有的嚴重疾病，如肺心病、呼吸衰竭、心血管疾病等，重者可導致死亡。進入20世紀80年代以后，流感疫情以散發(fā)與小暴發(fā)為主，沒有明顯的流行發(fā)生。但近年來，高致病性禽流感發(fā)生人禽間傳染的變異，正在危及人類健康，而且有蔓延和擴大的趨勢，引起世界衛(wèi)生組織和各國政府的高度重視。
盡管目前已經有一些抗流感病毒的藥品或制劑，但是由于現有藥品制劑的針對性不強，療效有限，而且，治療性制劑多是在發(fā)病后才應用的，不能起預防作用。對于流感的易感人群，每年在流感流行季節(jié)來臨前接種流感疫苗是預防流感的有效方法。其次應增強體質，提高自身免疫力。通過藥物提高機體抵抗力或調節(jié)免疫力也是一種預防感冒的有效方法，轉移因子可起到此作用。
轉移因子(TF，Transfer Factor)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復合物，它能將供體的某種特定的細胞免疫功能特異地轉移給受體正常的淋巴細胞，參與機體的免疫反應，提高受體機體的細胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細菌性感染；同時促進B淋巴細胞的抗體分泌作用，能夠誘導細胞釋放干擾素和白介素，從而增強受體的免疫功能。
目前已報道的轉移因子的提取方法都是關于非特異性轉移因子的制備方法。例如，中國發(fā)明專利“從豬脾中提取轉移因子的方法”(專利號ZL92113517.3號，申請日為1992年12月3日，授權公告日為1996年5月1日)披露的是利用透析法提取豬脾中的非特異性轉移因子的方法。這種方法的制備時間較長，細胞破碎不完全，得率較低，生產成本較高，而且產物的活性容易降低。中國發(fā)明專利申請“制備轉移因子的工藝方法——全濾法”(專利申請?zhí)?00310118439.6，申請日為2003年12月16日，
公開日為2004年11月7日)則公開了采用壓濾、超濾、納濾幾種方法連續(xù)過濾的制備工藝。另一份中國發(fā)明專利申請“制備轉移因子的工藝方法——加熱法”(專利申請?zhí)?00410039444.2，申請日為2004年2月13日，
公開日為2005年8月17日)是由同一申請人在前一份申請的基礎上加上加熱處理的步驟，仍然是連續(xù)采用多種過濾法的制備工藝。上述專利申請的內容是對破碎后的組織經冷凍離心后直接進行過濾提取，同樣存在細胞破碎不完全的缺陷，而且其工藝煩瑣，時間較長，對產物的活性損失也較大，因此得率很難提高(上述專利申請也并未對實際提取產物提供數據分析)。
豬脾臟和胸腺是免疫活性細胞聚集的場所，而且材料來源非常廣泛，因此，從這類細胞中提取特異性轉移因子，有重要的理論意義和現實意義，但目前尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種從動物臟器中制備抗流感病毒轉移因子的工藝方法，所生產的是一類新型的轉移因子制劑，是采用現代高科技生物分離技術精制而成的天然高效純生物活性物質。
本發(fā)明所述的一種抗流感病毒轉移因子的制備工藝，包括以下步驟(1)原材料的制備選健康無病史的6月齡豬，用流感病毒疫苗皮下注射免疫，計量為1單位/100kg，15天后，再以同樣方法及劑量免疫一次；二次免疫后15-20天宰殺，取脾臟和胸腺于冰上，轉移置-20℃保存，備用；(2)預處理稱量豬脾后，用冷三蒸水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪組織，再用冷三蒸水洗滌干凈；
(3)破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；(4)凍融將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融10次或以上；(5)提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5℃以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；(6)超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維管加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；(7)除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0.22μm的濾膜加壓過濾除菌；(8)分裝，4℃密封保存，即得所述的抗流感病毒轉移因子提取液。
本發(fā)明所述的抗流感病毒轉移因子的制備工藝，具有以下優(yōu)點(1)原材料來源容易，無污染，價廉。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料，以前多是丟棄的廢物。
(2)本工藝采用先免疫后提取的方法，免疫家豬后在免疫高峰期宰殺，取脾臟、胸腺等，最終得到特異性抗流感病毒轉移因子。
(3)在破碎組織后，加入低溫凍融處理的步驟，特別是在30℃下溶解，不使小分子物質活性喪失，并能夠使抗流感病毒轉移因子得以充分地提取。
(4)本工藝采用了比較先進的中空纖維管超過濾法，從而縮短了制備時間，保證物質分離過程中活性不被破壞。
(5)本提取工藝的每個步驟，從選種、免疫到每步處理，均經過大量實驗總結而得，是優(yōu)選的實施方案，提取步驟盡可能簡便易行，并確保提取物不容易失活。
(6)提取物經生化測定和若干成分分析，是一種低分子量多肽-核苷酸復合物，是一種不含蛋白質、可溶的小分子物質，分子量在6000道爾頓以下。經體內外生物活性試驗以及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、免疫活性強、起效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應等特點，其療效確切，安全可靠，既可治療又可增強抗病能力。該提取物可做成口服液等劑型，便于應用。
具體實施例方式
實施例一抗流感病毒轉移因子的制備本發(fā)明所述的一種抗流感病毒轉移因子的制備工藝，包括以下步驟(1)原材料的制備選健康無病史的6月齡豬10頭，用流感病毒疫苗皮下注射免疫，計量為1單位/100kg，15天后，再免疫一次，方法劑量同上。二次免疫后15-20天宰殺，取脾臟和胸腺于冰上，轉移置-20℃保存，備用。
(2)預處理稱量豬脾后，用冷三蒸水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪組織，再用冷三蒸水洗滌干凈。
(3)破碎將以上洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機(1000r/min)搗碎3次，每次3min，制得勻漿液。
(4)凍融將勻漿液(用器皿裝)至于超低溫冰箱(-80℃)里快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融10次。
(5)提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機離心30min(4000r/min，5℃)，取上層液體(血紅色)，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液。
(6)超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維管加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子。
(7)除菌分別用無菌濾器(濾膜孔徑為0.22μm)加壓過濾。
(8)包裝按口服液的要求，加15％的糖漿，加標準防腐劑(苯甲酸鈉0.25％)后分裝，10ml/瓶。
(9)保存4℃密封貯存。
實施例二對本發(fā)明所述工藝制備的抗流感病毒轉移因子的檢測對實施例一所述工藝制備的抗流感病毒轉移因子(下稱“本品”)進行以下檢測1)紫外線分光光度測定本品在250.0～252.0nm處有一高吸收峰，且ABS260/ABS280＞2.0。
2)標準液為淡黃色，pH值在6.0～6.5之間。
3)20％磺基水楊酸檢測本品無渾濁及沉淀現象，說明蛋白反應均為陰性，其不含大分子蛋白質。
4)多肽含量測定本品經雙縮脲法測定多肽含量為1.130mg/ml。
5)核酸含量測定本品經地衣酚法測定核酸含量為532.899μg/ml。
6)細菌學檢測本品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
7)E-玫瑰花結形成率比較人外周血淋巴細胞表面有鼠紅細胞受體，并能與之結合形成E-玫瑰花結。而轉移因子對淋巴細胞和大鼠紅細胞的結合有一定的促進作用。本品的E-玫瑰花結形成率平均為37.4％，比對照組的增加16.7％(F2，6＝36.96，P＜0.01)。
8)取健康小白鼠5只，口服本品濃縮液，相當于正常口服液劑量的40倍，觀察小白鼠的生存能力變化，結果無任何毒性反應，也無死亡現象出現，說明本品是安全的，無任何毒性和副作用。
9)用PPD做家兔皮試實驗，發(fā)現本品具有轉移免疫活性的功能。
10)用流感病毒抗原做皮試檢測，有微弱的陽性反應，說明本品具有良好的轉移活性和特異性。
實施例三利用本發(fā)明所述工藝制備的抗流感病毒轉移因子的應用將實施例一制備得到的抗流感病毒轉移因子溶液，按口服液的要求，加15％的糖漿，加標準防腐劑，如苯甲酸鈉0.25％，然后分裝，10ml/瓶。
除上述糖漿劑型外，本發(fā)明所述的抗流感病毒轉移因子還可制成其他口服液。
此外，通過常規(guī)凍干工藝進一步可得到抗流感病毒轉移因子的粉末，結合常規(guī)輔料，可制成膠囊、片劑等劑型。
權利要求
1.一種抗流感病毒轉移因子的制備工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)原材料的制備選健康無病史的6月齡豬，用流感病毒疫苗皮下注射免疫，計量為1單位/100kg，15天后，再以同樣方法及劑量免疫一次；二次免疫后15-20天宰殺，取脾臟和胸腺于冰上，轉移置-20℃保存，備用；(2)預處理稱量豬脾后，用冷三蒸水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪組織，再用冷三蒸水洗滌干凈；(3)破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；(4)凍融將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融10次；(5)提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5℃以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；(6)超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維管加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子。(7)除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0.22μm的濾膜加壓過濾除菌；(8)分裝，4℃密封保存，即得所述的抗流感病毒轉移因子提取液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗流感病毒轉移因子的制備工藝。該制備工藝包括以下步驟原材料的制備、預處理、破碎、凍融、提取、超濾、除菌、分裝等。本工藝采用先免疫后提取的方法，得到特異性抗流感病毒轉移因子。本工藝采用了低溫凍融處理、中空纖維管超過濾法，從而縮短了制備時間，保證物質分離過程中活性不被破壞，可做成口服液等劑型，便于應用。
文檔編號C07K1/14GK101057864SQ200610035059
公開日2007年10月24日 申請日期2006年4月17日 優(yōu)先權日2006年4月17日
發(fā)明者李充璧, 李湘樂, 王燕萍, 黃麗華, 溫虎成, 邵玲, 郭雁君, 李蕓瑛 申請人:肇慶學院