去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法及試劑盒的制作方法

專利名稱：去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及基因疫苗、基因治療所用質粒的純化工藝及蛋白質的純化工藝，更具體說，涉及去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法。
背景技術：
采用“裸工程質粒”的核酸疫苗是近十年出現的、目前正在研發的最新一代或第三代疫苗，研究顯示其對第一、第二代疫苗基本無效的傳染病如齲病、艾滋病、結核病、瘧疾等的預防和乙型肝炎的治療具有獨特的優勢和應用前景。核酸疫苗誘導機體細胞免疫應答能力的獨特優點彌補了第一、第二代疫苗的不足，而且這些顯著優點正是防治上述疾病所必須的，對此國際上已獲得共識。另外，腫瘤的免疫治療也主要依賴細胞免疫力，其核酸疫苗的研制也是當今熱點之一。除了作為核酸疫苗外，質粒也可用于基因治療和(表達)抗體治療。因而質粒純化技術的研究目前已從實驗室階段向實用產業化階段發展。
質粒是大腸桿菌細胞內能獨立于染色體進行復制和表達的環形DNA。工程質粒是將大腸桿菌質粒經基因工程改造，在其中插入了編碼病原體的保護性抗原蛋白的基因，和優選的免疫增強性細胞因子。將純化的工程質粒注射入人體肌肉等部位，能在相關抗原加工處理細胞(Antigen Present Cell，APC)或肌肉細胞中表達所編碼的抗原，誘導機體產生體液和細胞免疫應答反應來抵御病原體。
目前研制的針對不同人類病原體的精心制備的工程質粒，基本上都采用美國FDA推薦的可用于人體的卡那霉素抗性大腸桿菌質粒pVAX1改造而成，其中除病原體基因和細胞因子不同外，整個結構大同小異。從培養的工程大腸桿菌中抽提質粒首先要破裂細菌使質粒釋放出來，但是在釋放質粒的同時還釋放出大量大腸桿菌自身的RNA、基因組DNA、細菌蛋白質、脂類、細胞壁成分和內毒素等雜質，而質粒只占其中的千分之一左右，因此需要采用適當的技術提取質粒去除雜質。大規模破裂細菌的方法有機械和化學方法，而目前多采用化學方法即堿裂解法，其質粒破壞少回收率高(見盧圣棟主編“現代分子生物學實驗技術”，第二版，中國協和醫科大學出版社，1999年12月，北京；和J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實驗指南”，第三版，2002年8月，科學出版社出版，北京，中有關章節)。
本發明者在2004年12月21日提交的發明專利申請“改進的堿裂解法提取基本純質粒的方法及多層層析裝置”(申請號20041093322.1)已就初純質粒制備過程中的牛胰腺RNA酶替代物、離子交換層析和濃縮生產工藝進行了實用性改進，獲得了優良結果，但初純質粒中所含高度污染的內毒素必須去除才能適合人體應用。
另外，利用基因工程技術生產各種細胞因子、生長因子、白細胞介素、干擾素、激素、抗體等蛋白質已有二、三十年，其中不少采用大腸桿菌作為宿主菌，或利用噬菌體加宿主菌生產，因而也存在內毒素污染問題。但由于內毒素與蛋白質性質相差較大，蛋白污染的內毒素不多，含量為數千至數萬EU/mg，而這些蛋白生產工藝中采用的沉淀、多步凝膠層析、親和層析、超濾等多個步驟已足夠逐漸去除內毒素，故一般不需再次去除內毒素。然而實驗室小量制備蛋白時，有時需要去除其中的內毒素，以利于細胞培養、動物實驗等用途。
內毒素是熱源物質，注入動物體內可引起動物發熱等毒性作用，并大大降低質粒轉化及細胞表達抗原的效率。內毒素(endotoxin)是革蘭陰性菌(GNB)細胞壁外膜上的特有結構，其本質是脂多糖(LPS)。在化學結構上主要由兩大部分組成，即多糖(polysaccharide)和類脂A(lipid A)，多糖又可分為0-特異性多糖鏈(0-spcificpolysaccharide chain)和核心寡聚糖(core oligosaccharide)兩部分，結構見附

圖1，圖1中A為光滑型LPS結構，由三部分組成，0-特異性側鏈(m)、核心(外核+內核)(II)和類脂A(I)；B為粗糙型LPS結構，由兩部分組成，核心(外核+內核)(II)和類脂A(I)。不同的革蘭氏陰性細菌，其LPS的化學組成又有一定的差別，但都含有類脂A部分。類脂A是LPS的活性中心，也是其毒性的基礎，主要由氨基葡萄糖、磷酸10、18碳的長脂肪酸組成，在生理條件下，具有疏水性和電負性。鱟試劑和內毒素的反應主要是與脂質A結合。內毒素在高溫、強酸、強堿下都頗穩定。對于可用于人體的質粒，要求極高，即每毫克質粒中內毒素含量小于100EU，甚至小于10EU。
由于不同核酸疫苗的質粒結構大同小異，又同樣采用大腸桿菌作為工程菌進行培育增殖，其生產和提純方法也基本相同，這與蛋白質疫苗的制備和純化條件各異不同相比，具有很大的優點，即建立的提取純化方法將具有通用性。
傳統的去除內毒素的方法有加熱、蒸餾、過濾、反相滲透、活性碳粉、各種柱層析方法，這些方法能去除或滅活部分內毒素，但都很難將內毒素一次性徹底去除，甚至經過多個步驟后，最終仍達不到臨床試驗級的要求。
目前通常采用的去除生物制品中內毒素的方法有TritonX-114霧點法和層析法。其中，霧點法可用于去除蛋白及質粒中污染的內毒素(Clement Bordier，JBiological Chemistry，2561604-07，1981；Aida Y&Pabst MJ，J Immunol Methods，132191-195，1990；Cotten M，Baker A，Sallik M等Gene Therapy，1239-46，1994)，然而這些文獻披露的方法在操作過程中需要轉換溫度，操作難于控制，且它們均未報導可去除內毒素至何種水平。本發明者經實驗后發覺此法只能將內毒素降至10萬EU/mg(質粒)左右。一些公司開發的質粒純化試劑盒采用了有機溶劑離心分相法代替上述霧點溫度轉換分相離心法，即利用Triton X-114的兩性性能，采用能溶解TritonX-114(及其與內毒素形成的復合物)但與水混合時不能互溶的有機溶劑，經離心分相去除Triton X-114與內毒素形成的復合物的方法。其內毒素去除率略高，能使質粒中內毒素殘余量降低至1000EU/mg左右，但所得質粒的濃度下降一倍以上，需要濃縮，而且所得超螺旋質粒的含量明顯減少，變成二聚體、三聚體，這是人用生物制品所不允許的。本發明者應用Qiagen提供的質粒超純試劑盒進行實驗，發現內毒素也只能去除到1000EU/mg左右。因此這類試劑盒采用的方法仍難達到臨床用核酸疫苗內毒素含量小于100EU/mg的標準。
層析法可分為非特異性層析法和親和層析法。非特異性層析法雖然能去除質粒中的內毒素達到臨床級要求，但步驟較多，需要購買專用的填料和設備，生產成本高，同時因步驟過多導致質粒回收得率降低，這類方法不是專門去除內毒素的方法。
親和層析法是采用對內毒素有選擇性結合能力的多粘菌素B(Polymyxin B，PMXB)親和凝膠填料使內毒素結合在凝膠上，此法可去除蛋白制品中的內毒素，且PMXB凝膠用后可用1％脫氧膽酸鈉再生而重復使用。然而，此PMXB凝膠填料用于去除質粒中內毒素的效果不是令人非常滿意而應用不多。
多粘菌素B硫酸鹽，是一種從桿狀多粘細菌的發酵產物中分離出來的陽離子環狀多肽抗生素，其分子式為C55H96N16O13，其結構式見附圖2，可見也具有兩性(親水性和親脂性)基團。多粘菌素B是B1和B2突變體的混合物(其中占主導地位的是B1)，低于50mg/ml的多粘菌素B硫酸鹽水溶液澄清、色微黃。多粘菌素B硫酸鹽在有機溶液里是微溶的，在2-8℃可保存活性至少2個月，在室溫下可保存活性至少三星期，但在強酸溶液中迅速失活。多粘菌素B作用于革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖的脂質A部分，多粘菌素B的氨基端能與脂質A-kdo區的羧基端之間發生離子相互作用力、雙方巰基之間可產生疏水作用力，因而能選擇性結合內毒素(脂多糖)，二者是一對一結合。根據ISP國際計量單位(1969年)，每毫克多粘菌素B硫酸鹽含8403個單位。
將多粘菌素B通過化學偶聯固定在凝膠上后可用于去除蛋白制品溶液中的內毒素。Sigman和BioRad公司有相應的多粘菌素B親和凝膠產品出售。Cotten M等人也試用了BioRad的多粘菌素B凝膠來去除質粒污染的內毒素，他們用TritonX-114霧點分相離心法或PMXB凝膠法去除內毒素后的質粒DNA成功轉染了細胞而沒有毒性，但他們沒有具體測定去除內毒素到什么程度(Cotten M，Baker A，SallikM，et alGene Therapy，1239-46，1994)。據我們的常規質粒細胞轉染實驗，只要去除內毒素到1萬EU左右/mg(質粒)對細胞就沒有毒性了。由于質粒污染的內毒素量很高，Sigman和BioRad公司并不推薦他們的多粘菌素B親和凝膠用于去除質粒中污染的內毒素。本發明者購買了Sigma的多粘菌素凝膠進行柱層析，發覺最多可將質粒中內毒素含量降至1000EU/mg左右，而不能降到100EU/mg以下。而且這種凝膠層析法或混合法不可避免地會稀釋質粒液，即使去除內毒素達到要求，但至少要增加一濃縮步驟，這也會影響得率。目前北京卓冠科技公司生產了去內毒素用瓊脂糖凝膠FF(共價偶聯了多粘菌素的瓊脂糖凝膠)，但是由于其吸附內毒素量低于1萬/ml，而粗提質粒中內毒素的含量很高，故去除質粒內毒素效果不佳，達不到100EU/mg以下的要求。
在關于采用PMXB去除內毒素的文獻中均提到PMXB凝膠層析法，未見采用PMXB進行有機溶劑離心分相來去除內毒素的報導或試劑盒。而且，至今尚未有PMXB與內毒素結合形成的復合物更易溶于有機溶劑的報導。
為了解決上述技術問題，達到臨床級質粒純化去除內毒素到100EU/mg以下標準，急需獲得一種有效去除內毒素且質粒回收得率高的方法。本發明者根據已建立的Triton X-114有機溶劑離心分相法原理，利用本發明者對于PMXB與內毒素結合形成的復合物更易溶于有機溶劑的發現創立了PMXB有機溶劑分相法，或先用分相離心去除質粒液中的大部分內毒素，再結合PMXB親和層析法去除殘余內毒素；并利用本發明者對于PMXB和Triton X-114聯用能更有效去除內毒素的發現，采用更簡單的Triton X-114聯合PMXB的有機溶劑分相法徹底去除內毒素。同時，對于可與水分相的有機溶劑的選擇，本發明者也進行了研究，分別嘗試了氯仿和無毒無害的肉豆蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇單甲醚及苯甲酸芐酯等等，從中篩選到乙酸乙酯和苯甲酸芐酯，進一步完善了本發明，使本發明方法可有效地應用于核酸疫苗和基因治療用質粒產品的生產制備和蛋白質中內毒素的去除，從而完成了本發明。
因此，本發明第一個目的是提供兩種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法。
本發明第二個目的是提供一種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的試劑盒。
發明概述本發明第一方面提供一種用PMXB去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法，包括將質粒或蛋白質與PMXB，按質粒與PMXB的重量比為1000∶100-800或蛋白質與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，于室溫下混合均勻形成混合液；加入有機溶劑混勻后分層，收集含有質粒或蛋白質的水相。
本發明第二方面提供一種PMXB和TritonX-114聯用去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法，包括將質粒與PMXB和TritonX-114液，按質粒與PMXB的重量比為1000∶50-600、質粒與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶20-400μl，或將蛋白質與PMXB和Triton X-114液，按蛋白質與PMXB的重量比為1000∶1.5-20、蛋白質與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，4-20℃下混合均勻形成混合液；加入有機溶劑混勻后分層，收集含有質粒或蛋白質的水相。
本發明提供的去除內毒素的方法還包括用PMXB凝膠去除剩余內毒素的PMXB凝膠法步驟，包括PMXB凝膠混合法和/或凝膠層析法。
本發明提供的有機溶劑選自氯仿、苯甲酸芐酯和乙酸乙酯。
本發明提供的混合液還含有最終濃度為0.1-1.0M的NaCl。
本發明第三方面提供的一種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的試劑盒，包括PMXB、TritonX-114及使用說明書。其中PMXB及TritonX-114為分置于多個獨立包裝的無內毒素小管中的溶液，可為單獨用于去內毒素的試劑盒，或為質粒或蛋白質純化全套試劑盒中的組成部分。
發明詳述本發明第一方面提供一種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法，包括以下步驟；將質粒或蛋白質液與PMXB溶液，按質粒與PMXB的重量比為1000∶100-800，優選1000∶350-450；或蛋白質與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，優選1000∶5-15，混合均勻形成混合液，然后在混合液中加入有機溶劑，離心或靜置分層后獲得含有質粒或蛋白質的水相，和含有內毒素的有機相。
本發明第二方面提供一種PMXB和TritonX-114聯用去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法，包括將質粒液與PMXB液和TritonX-114液，按質粒與PMXB的重量比為1000∶50-600，優選1000∶350-450，質粒與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶20-400μl，優選1000μg∶70-90μl混合均勻形成混合液；或將蛋白質液與PMXB液和Triton X-114液，按蛋白質與PMXB的重量比為1000∶1.5-20，優選1000∶4-10，蛋白質與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，優選1000μg∶4-10μl，混合均勻形成混合液；然后在混合液中加入有機溶劑，離心或靜置分層后獲得含有質粒或蛋白質的水相，和含有內毒素的有機相。
術語“混合液”指質粒或蛋白質與具有去除內毒素作用的試劑混合后形成的溶液，除含有質粒或蛋白質外，還含有PMXB或PMXB和TrintonX-114。
當混合液中含有TrintonX-114時，與TritonX-114的混合在4-20℃，優選4-10℃下進行，Triton X-114可以和PMXB同時或先后與質粒混合。優選先將PMXB與質粒混合，混合時間優選20分鐘，再加入Triton X-114液，混合時間優選15分鐘。
本發明還包括采用上述第一方面或第二方面的方法去除大部分內毒素后，再聯合使用PMXB凝膠法進一步去除內毒素的方法，包括使用PMXB凝膠混合法和/或層析法去除剩余內毒素的步驟。其中，PMXB凝膠與質粒的體積比可以為1-3∶1。所述PMXB凝膠可用1％膽酸鈉溶液再生、平衡后重復使用。
術語“初純質粒或蛋白質”是指從基因工程大腸桿菌提取的基本上已純化或部分純化但沒有去除內毒素的質粒或蛋白質。可采用含0.1-1.0M NaCl的純水、生理鹽水、濃度為0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris/HCl等進行配制，其中NaCl濃度優選0.3M。可將質粒或蛋白質配制成各種濃度，優選1mg/ml以上濃度。
本發明中選用的PMXB，優選其硫酸鹽溶液。可用與質粒液相同或不同的含0.1-1.0M NaCl的純水、生理鹽水、濃度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris/HCl等緩沖液進行配制，可將PMXB配制成各種濃度，優選5mg/ml濃度，緩沖液優選含50-80％甘油，便于保存在零下20-25℃。
術語“有機溶劑”是任何與水混合但不能互溶，離心或靜置后可分離形成有機相和水相兩相的有機溶劑。本發明中有機溶劑是本領域技術人員熟知的，優選氯仿、苯甲酸芐酯或乙酸乙酯，更優選無毒性且不被懷疑有致癌作用的苯甲酸芐酯或乙酸乙酯。有機溶劑洗滌次數為1-5次，優選3-4次，每次用量優選約等于混合液體積。
本發明提供的去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法可用于小量或規模化去除初純質粒液或初純蛋白質液中的內毒素，或成為質粒提取純化整個工藝中的一個組成部分。
本發明第三方面提供一種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的試劑盒，包括PMXB、TritonX-114及使用說明書，其中PMXB及TritonX-114為分置于一個或多個獨立包裝的無內毒素小管中的溶液。該試劑盒可以是獨立的去內毒素試劑盒，用于實驗室小量去除初純質粒或蛋白質中的內毒素，或用于規模化去除初純質粒中的內毒素，也可成為質粒或蛋白質大規模純化全套試劑盒中的組成部分。
本發明提供的試劑盒中PMXB優選其硫酸鹽，可用含0.1-1.0M NaCl的純水、生理鹽水、濃度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris/HCl等緩沖液進行配制，可配制成各種濃度，優選5mg/ml濃度，其中NaCl濃度優選0.3M。其中Triton X-114液優選不稀釋的原液。其中有機溶劑為與水混合時不能互溶，離心或靜置后可分離形成有機相和水相二相的任何有機溶劑，優選氯仿、苯甲酸芐酯或乙酸乙酯，更優選氯仿或苯甲酸芐酯原液。
本發明的優點是操作簡便快速、成本低，可將質粒液或蛋白液中的內毒素降低至10EU/mg以下，符合臨床用藥要求，而且不影響去除內毒素后質粒或蛋白液的濃度。
附圖的簡單說明圖1是內毒素(脂多糖LPS)的分子結構圖。
圖2是多粘菌素B的分子結構圖。
圖3是有機溶劑離心分相法去內毒素后質粒的瓊脂糖凝膠電泳結果。
具體實施例方式
下面結合附圖與具體實施例，更具體地說明本發明的內容，并對本發明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施中所作的任何變動都將屬于本發明權利要求書的范圍內。
實驗材料和儀器初純質粒HG43、PSW、PSA43和Ag85A重組蛋白質液得自上海海規生物科技有限公司。
有機溶劑肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、二乙二醇單甲醚(dietylene glycol monomethyl ether)、苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)、氯仿(chloroform)，分析純，均購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。硫酸多粘菌素B(PMXB)和Triton-X-114購自Sigma(P1004和93428)，PMXB親和凝膠購自Sigma(P-1411)和北京卓冠生物技術公司。脫氧膽酸鈉購自Aldrich。
以下實施例中肉豆蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇單甲醚、苯甲酸芐酯、氯仿和Triton X-114均以不稀釋的原液使用。硫酸多粘菌素B(PMXB)先用0.1M PBS緩沖液溶解，再加入甘油配制成濃度為5mg/ml、含80％甘油的溶液，保存于-20℃至-25℃冰箱中。
潔凈的(即無內毒素的)1.5ml或2.0ml離心管(microtubes Clear)，200μl和1000μl吸嘴購自AXYGEN公司；一次性滅菌注射器和超純水或注射用生理鹽水購自上海醫藥公司。分液漏斗、旋轉瓶等玻璃器皿先用0.5M NaOH溶液浸泡24-48小時，大量蒸餾水洗滌后于250℃烘烤2小時除去內毒素。
HS-3垂直混合儀和旋渦振蕩器購自寧波新芝公司，LXS-11B低速大容量離心機及TGL-16B小型臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠，RE-52B型旋轉蒸發儀購自上海博通公司。鱟試劑及潔凈的玻璃小試管購自湛江安度斯生物有限公司，靈敏度為0.25EU/ml，按說明書操作采用膠凝法半定量測定質粒液的內毒素含量。
實施例1應用鱟試劑膠凝半定量法測定質粒液中的內毒素含量1.鱟試劑靈敏度復核采用湛江安度斯公司生產的鱟試劑盒(靈敏度為0.25EU/ml)和內毒素標準品(10EU/ml)，按廠家說明書進行操作，復核結果見表1。
表1鱟試劑靈敏度復核

上述實驗結果說明所用鱟試劑的靈敏度與標示值相符合，按標示值使用。
2.質粒樣品的系列稀釋和鱟試劑檢測所用器材均應潔凈，如醫用注射用水、塑料吸頭、玻璃小管等另準備好試管架和37℃水浴箱。
1)取20μl質粒液加入到裝有780μl注射用水的第1號玻璃小管中(1∶40稀釋)，旋渦振蕩20分鐘，以使聚集成團的內毒素均勻分散；2)從第1號小管中取20μl液體加入到裝有980μl注射用水的第2號玻璃小管中(1∶2000稀釋)，旋渦振蕩1分鐘；3)從第2號小管中取20μl液體加入到裝有980μl注射用水的第3號玻璃小管中(1∶10萬稀釋)，旋渦振蕩1分鐘；4)從第3號小管中取20μl液體加入到裝有980μl注射用水的第4號玻璃小管中(1∶500萬稀釋)，旋渦振蕩1分鐘；或從第1號小管中取20μl液體至裝有180μl注射用水的第3號玻璃小管中稀釋10倍(1∶400稀釋)，旋渦振蕩1分鐘。如此可制備1∶4,000，1∶40,000等不同稀釋度的質粒液；5)各小管保留100μl質粒液，棄去其余液體，旋渦振蕩1分鐘。另設置陽性對照管和陰性對照(100μl潔凈水)管。各管加入100μl鱟試劑，混合5-10秒，37℃水浴靜置1小時。小心取出各官，將其倒置并觀察膠凝結果。
第一次倒置時管底有膠凝物不流下為陽性，若流下為陰性。陰性和陽性對照管均成立才記錄其它各管結果。本實驗中所用鱟試劑的靈敏度為0.25EU/ml，故最高稀釋度為陽性的稀釋液，將其稀釋度除以4即為該質粒液殘留的內毒素濃度(EU/ml)，再除以質粒原液的濃度即為每mg質粒中殘留的內毒素含量(EU/mg(質粒))。此試驗為半定量法，所得結果用每mg質粒所含內毒素大于、小于多少個EU表示，為近似值。
實施例2 Triton霧點離心分相法去除質粒液中的內毒素此實施例是重復文獻所述步驟操作(Cotten，Baker A，Sallik M等GeneTherapy，1239-46，1994)，目的是驗證該法去除內毒素的效果。
取1ml濃度為1.2mg/ml的初純HG43質粒液(用0.1M PBS緩沖液液配制)加至潔凈的離心小管中，在4-10℃下按1ml質粒液∶20μl TritonX-114液的比例加入TritonX-114(不稀釋)。4-10℃混合15分鐘，然后移至35-37℃靜置5分鐘后混合液出現云霧樣混濁，在同一溫度的臺式離心機中13,000rpm離心5分鐘，小管底部有油狀液沉積(為TritonX-114與內毒素形成的復合物)。小心吸取含質粒的上層水相(不可觸及油狀液)，移至另一潔凈小管中，加入20μl TritonX-114，于4-10℃混合30分鐘，然后移至35-37℃靜置5分鐘后混合液出現云霧樣混濁，在同一溫度的臺式離心機中13,000rpm離心5分鐘。小心吸取上層水相移至另一潔凈小管中。如此重復3次，隨后用鱟試劑測定質粒液中殘留內毒素量，測定結果見表2。
表2 Triton霧點離心分相法去除內毒素

質粒液濃度去內毒素前為1.2mg/ml，去內毒素后為1.15mg/ml。質粒液殘留內毒素含量約為10-20萬EU/mg。按1ml質粒液∶40或60μl TritonX-114液的二種比例重復此實驗，殘留內毒素含量仍在10-20萬EU/mg，表明用量加大效果仍如此。此實施例表明應用Triton X-114霧點法可去除質粒污染內毒素至10萬EU/mg左右。
實施例3有機溶劑離心分相法去除質粒液中內毒素的基本步驟1.試劑的選用1)初純質粒液可用純水、生理鹽水、濃度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris-HCl等緩沖液配制。
2)PMXB可用與質粒液相同或不相同的溶液配成5mg/ml或1-50mg/ml濃度，一般加入50-80％的甘油，以便在負20-25℃長期保存活性且使用方便。由于高濃度時用量少不易精確，低濃度時會帶入水份導致稀釋質粒液，故常用5mg/ml濃度。
3)TritonX-114的原液較粘稠，可用與質粒液相同或不相同的溶液作1∶1、1∶2或1∶3稀釋。但其稀釋液用量應相應增加，雖稀釋液不粘稠，使用較方便，然而會稀釋質粒液，故仍常用其原液。由于TritonX-114在4-20℃時水溶性好，利于結合內毒素，因此使用時需在4-20℃環境下。
4)各有機溶劑采用不稀釋的原液。
2.步驟1)取濃度為1mg/ml以上的初純質粒液加至2ml潔凈的離心小管中；加入PMXB和/或TritonX-114液；
2)在4-20℃或室溫下，于垂直混合器中緩慢混合20-35分鐘，或混合20分鐘后再置4-20℃混合15分鐘；隨后加入大約等體積的有機溶劑混合2分鐘，于臺式離心機中10,000--13,000rpm離心3-4分鐘。離心后兩相之間形成的一層薄膜，此膜為PMXB和/或TritonX-114與內毒素形成的復合物；3)小心吸取含質粒的水相(不可觸及薄膜)并移至另一潔凈小管中，再加入等體積有機溶液，按步驟2)所述混合后離心(此步簡稱為用有機溶劑洗去內毒素)；4)如此重復洗滌3-4次，隨后取質粒液樣品測定體積，按常規用紫外分光光度計測OD260值計算質粒液濃度，由凝膠電泳觀察純度和用鱟試劑測定殘留內毒素量。
實施例4 TritonX-114有機溶液離心分相法去除質粒液中的內毒素此法已為許多商品化質粒純化試劑盒所采用。這里主要是驗證其去除內毒素能到何種水平，并作為本發明的對照。
各取1ml濃度1.2mg/ml的PSW初純質粒液(內毒素含量大于500萬EU/mg)，加至3個潔凈的離心小管中，按1mg質粒∶80μl、120μl或200μl TritonX-114的比例分別加入TritonX-114；有機溶劑采用氯仿，洗滌3次；按實施例3所述步驟操作。結果見表3。
表3 TritonX-114有機溶液離心分相法去除內毒素

本實施例中Triton X-114僅使用1次，實施例2中使用3次。結果表明，TritonX-114的用量為80μl時，去除內毒素效果較差；為120μl時，內毒素含量降至2.5-5萬EU/ml；為200μl時，內毒素含量降至1-2.5萬EU/ml；為350μl時，效果與200μl時的相似。本發明者重復此實驗幾十次，證實該法可將內毒素降至10,000EU/mg左右，此類質粒已可用于要求不太高的動物實驗、細胞轉染等。
實施例5 PMXB有機溶液離心分相法去除質粒液中的內毒素各取1ml濃度為1.32mg/ml的PSA43質粒液(內毒素含量大于500萬EU/mg)，加至3個潔凈的2ml小管中，按質粒量∶PMXB(5mg/ml)體積比為1000∶80或60或40的比例；有機溶劑采用氯仿，洗滌3次；如實施例3所述步驟操作。結果見表4。
表4 PMXB有機溶液離心分相法去除內毒素

結果顯示，PMXB用量高，去內毒素后質粒濃度降低較多、回收率損失較大，但去除內毒素的效果較好。當此比例為1000∶80時，內毒素降低至500-1,000 Eu/mg。當PMXB用量降低時，去除內毒素的效果降低。本發明者在上百次試驗中觀察到，即使加大PMXB用量至質粒對PMXB的比例1000∶120時，內毒素仍只能降低至500-1,000Eu/mg。
實施例6 加鹽對降低PMXB去除內毒素時質粒損失的影響取0.95mg/ml PSA43質粒液(內毒素含量大于500萬EU/ml)，在該質粒液中加入NaCl至如下表5所示濃度，采用每mg質粒∶80μl PMXB的比例；用氯仿洗滌3次去除內毒素；按實施例3所述步驟操作。結果見表5。
表5 加鹽對降低PMXB去除內毒素時質粒損失的影響

結果顯示，PMXB可能會結合一些質粒將其去除，NaCl的加入對去除內毒素效果沒有影響，且一定濃度的NaCl可以有效避免質粒的損失，但并不是鹽濃度越高效果越好。根據上述結果，當NaCl濃度為0.5M時，質粒回收率提高至92％左右；當NaCl濃度為1.0M時，回收率不再提高。經多次試驗后，本發明者摸索到，采用2％(約0.3M)的NaCl較適當，回收率可保持在90％以上，故以下實施例中的質粒液均用含2％NaCl、pH 8.0的PBS緩沖液配制。此法去除內毒素效果達到99％以上，內毒素可降至500-1000EU/mg，但離人用疫苗100EU/mg以下的標準尚有距離。
實施例7 PMXB和TritonX-114聯用離心分相法去除質粒液中的內毒素上述實施例結果表明，單獨使用PMXB或TritonX-114進行有機溶劑離心分相，內毒素含量無法降至100EU/mg以下。因此本發明者將二者聯用，檢測其效果。
各取1ml濃度為1.28mg/ml的初純HG43質粒液(含0.3M NaCl)，加至6個潔凈的2ml離心管中；先加不同量(如下表6所示)的PMXB(5mg/ml)垂直混合20分鐘后，再加不同量(如下表6所示)的TritonX-114混合15分鐘，于4-10℃靜置15分鐘，然后用氯仿洗滌3次；按實施例3所述步驟操作。結果見表6。
表6 PMXB和TritonX-114聯用離心分相法去除內毒素

結果顯示，PMXB和TritonX-114聯用，在適當的用量和比例下，內毒素可降至100EU/mg以下，甚至10EU/mg以下。本發明者重復此試驗幾十次，只要PMXB和Triton X-114的用量足夠、比例適當，都可以達到此結果，可見此方法重復性非常好。經幾十次試驗確定，質粒量與加入的PMXB(5mg/ml)或TritonX-114(原液)體積比例是質粒1000μg∶PMXB或TritonX-114各70-100μl為佳(質粒與PMXB的質量比＝1000μg質粒∶350-450μgPMXB)，內毒素可降至100EU/mg以下，甚至10EU/mg以下。如果某些初純質粒污染的內毒素極高(如7000萬EU/mg以上)時，若此用量還不能去除干凈，可再用此劑量的1/5-1/4量重復上述去內毒素操作一次，仍可使內毒素降低至10EU/mg以下。
實施例8 PMXB和TritonX-114聯用的順序對分相離心法去除內毒素的影響各取1ml濃度為1.5mg/ml的初純HG43質粒液(含0.3M NaCl)，加至3個潔凈的2ml離心管中，第1管先加105μl PMXB、第2管先加105μl Triton X-114，垂直混合20分鐘后，第1管再加入105μl Triton X-114、第二管再加入105μl PMXB，再次混合20分鐘，共1小時。第3管同時各加105μl PMXB和Triton X-114，混合40分鐘。然后用氯仿洗滌3次。按實施例3所述步驟操作。結果見表7。
表7 PMXB和TritonX-114聯用的順序對分相離心法去除內毒素的影響

結果表明，PMXB和TritonX-114同時加入時效果略差，而二者分別先后加入效果相似，因此以下實施例均按實施例7所述步驟操作。
實施例7、8的結果分析不想受現有理論的束縛，本發明者推測PMXB和Triton X-114聯用取得如此優良的效果可能是如下原因。
1.內毒素(LPS)本身不是一種非常均一的分子，而且在細胞裂解時有些LPS分子可能碎裂成較小片段。而PMXB和Triton X-114各自與LPS選擇性結合的基團有所不同。細胞裂解產生的大部分LPS可與PMXB和Triton X-114二者同時結合，但可能一小部分LPS片段(根據實施例5-6約占內毒素的萬分之一)不能結合PMXB，而另一小部分LPS片段(根據實施例4約占內毒素的千分之一)不能結合Triton X-114。故單用PMXB或Triton X-114都有不能完全去除干凈質粒中的內毒素，只有二者聯用才能達到此目的。
2.內毒素分子中雖也有疏水基團，但通常內毒素分子聚集成團，其疏水基團包在內部，表面為親水基團，故內毒素分子溶于水而不溶于有機溶劑。PMXB或/和Triton X-114與LPS緊密結合后可能使成團的LPS內部疏水部分暴露，產生的二重或三重復合物疏水性大大增強而易溶于有機溶劑中，因而可用不與水混溶的有機溶劑將此種復合物分相除去。
3.PMXB或Triton X-114先后加入質粒液中時，先加的先與內毒素結合，后加的可能與形成的復合物再結合，最后形成三重復合物。而二者同時加入質粒液中時，可能有一部分PMXB和Triton X-114先互相發生結合而不能再與內毒素結合。因此同時加入PMXB和Triton X-114去除內毒素效果較差。
實施例9 無毒無害有機溶劑的選擇上述實施例中洗滌用有機溶劑均采用氯仿，且取得了很好效果，但氯仿被懷疑有致癌作用，因此生物制品制備工藝中應盡量避免使用。為此本發明者選擇了幾種文獻顯示不會與水混溶且安全無毒性無害的有機溶劑肉豆蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇單甲醚、苯甲酸芐酯，并從中進行篩選。篩選的原理是利用TritonX-114的水溶液中OD260與OD280測定值都很高，若有機溶劑能洗滌去除TritonX-114則水相OD260與OD280測定值將降低，若不能去除則測定值保持高水平。
先配制含有10％TritonX-114的PBS緩沖液，每只離心小管中各裝1ml，分別加入等體積的上述4種有機溶劑，以氯仿作對照。混合4分鐘，13,000rpm離心3-4分鐘，分別取水相和有機相測D260與OD280值。結果見表8。
表8無毒無害有機溶劑的選擇結果

結果表明，苯甲酸芐酯和乙酸乙酯類似氯仿，可洗滌去除Triton X-114，但效果較氯仿略差。而肉豆蔻酸異丙酯和二乙二醇單甲醚達不到氯仿的效果。因此選擇苯甲酸芐酯和乙酸乙酯進行以下實施例。
實施例10 苯甲酸芐酯和乙酸乙酯分相法去除質粒中的內毒素1.單獨使用PMXB或TritonX-114分別單獨使用PMXB或TritonX-114去除質粒液中的內毒素，有機溶劑采用苯甲酸芐酯或乙酸乙酯洗滌4次，以氯仿洗滌三次作對照，按實施例3所述步驟操作。結果見表9。
表9單獨使用PMXB或TritonX-11結合苯甲酸芐酯和乙酸乙酯分相法去除內毒素

結果表明，單獨使用PMXB或TritonX-114結合苯甲酸芐酯或乙酸乙酯洗滌都能去除質粒中的90％以上的內毒素，使其殘留量降至1-2.5萬，但無法降至100EU/mg以下，而PMXB加氯仿可降低至1000EU/mg左右。苯甲酸芐酯或乙酸乙酯的溶劑強度比氯仿略差，需洗滌4次(氯仿洗滌三次)。根據實施例7所得結果，PMXB和Triton X-114聯用效果好，因此本發明者再次將二者聯用試驗。
2.PMXB和TritonX-114聯用各取1ml濃度為1.5mg/ml的初純HG43質粒液，加至2個潔凈2ml離心管和一支醫用一次性注射器(5ml，下端出口用封端堵住，用于下步乙酸乙酯洗滌)中，各管先加105μl PMXB，垂直混合20分鐘后再加入105μl TritonX-114，4-10℃再混合15分鐘，以三種有機溶劑洗滌，按實施例3操作，用乙酸乙酯洗滌時注射器不離心而是垂直靜置分相分層，每次洗滌將含質粒的下層水相從下部出口放到另一干凈注射器中。結果見表10。
表10 PMXB和TritonX-114聯用結合苯甲酸芐酯和乙酸乙酯分相法去除質粒污染的內毒素

結果表明，當PMXB和Triton X-114聯用時，苯甲酸芐酯或乙酸乙酯與氯仿一樣可有效去除質粒污染的內毒素，只是洗滌增加一次而已。
實驗過程中苯甲酸芐酯和氯仿比水重，離心分相后有機相位于下部，第1、2次洗滌時兩相界面形成復合物薄膜，第3、4次洗滌時此薄膜逐漸消失，表明已逐漸去除。第1次洗滌，苯甲酸芐酯形成的水相較混濁，而氯仿形成的水相澄清。洗滌第2次時苯甲酸芐酯形成的水相已澄清。乙酸乙酯比水輕，不用離心而是靜置幾分鐘自行分相，形成的水相位于下部，兩相界面無薄膜，下部水相含質粒。去除內毒素的質粒液濃度不降低反而略升高但體積也相應略減少，可能因這二種有機溶劑能吸附少量水而致。
有機溶劑離心分相法去內毒素后質粒的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3。其中，泳道1是去內毒素前的質粒；泳道2是去內毒素后的質粒，其中有機溶劑為氯仿；泳道3是去內毒素后的質粒，其中有機溶劑為苯甲酸芐酯；泳道4是去內毒素后的質粒，其中有機溶劑為乙酸乙酯；采用氯仿、苯甲酸芐酯和乙酸乙酯所獲得的去除內毒素的質粒與去內毒素前相比，電泳圖相似，超螺旋質粒條帶無顯著變化，也無二聚體或多聚體條帶形成。
上述結果表明，聯用PMXB和TritonX-114及無毒的苯甲酸芐酯或乙酸乙酯可去除質粒污染的內毒素至10EU/mg以下，達到了臨床人用標準。此實施例是小量去除內毒素，可配備相應的潔凈離心小管(乙酸乙酯比水輕應配備無菌注射器那樣有下部出口加封帽的小管，不用離心)，用于實驗室小規模純化質粒的內毒素去除，相對而言，采用比水重的苯甲酸芐酯作為有機溶劑更適合此用途。
實施例11 規模化苯甲酸芐酯或乙酸乙酯分相法去除質粒污染的內毒素1.苯甲酸芐酯分相取200ml濃度為1.64mg/ml的初純HG43質粒液(共含質粒328mg)平均分裝至8個潔凈50ml離心管中，每管25ml。各管先加入2900μl PMXB(5mg/ml)(88μlPMXB/mg質粒)，室溫(8-10℃)、10rpm轉速垂直緩慢混合20分鐘，再各加入2900μlTritonX-114，混合15分鐘。隨后用LXS-11B低速大容量離心機室溫3,000rpm離心5分鐘。分別吸取上部含質粒的水相，轉移到新的潔凈離心管中，加入25ml苯甲酸芐酯混合5分鐘。室溫3,000rpm離心5分鐘，吸取上部水相轉移到新的潔凈離心管中。按此步驟，用苯甲酸芐酯洗滌4次。
合并各管上部水相得175ml質粒液，經測定其濃度為1.70mg/ml(總量297.5mg，回收率91％)、內毒素含量＜10EU/mg。其中回收率達不到100％的原因主要是在每次吸取水相質粒液時，為避免觸及二相之間的內毒素復合物而舍棄部分質粒液。
2.乙酸乙酯分相乙酸乙酯比水輕，故采用經250℃烘烤2小時去除內毒素的玻璃圓形分液漏斗8個(500ml)和旋轉蒸發儀的圓形旋轉瓶(1000ml)。將300ml濃度為1.47mg/ml的初純HG43質粒液(共含質粒441mg)加入旋轉瓶中，再加入3528μl PMXB(5mg/ml)(80μl PMXB/mg質粒)，在旋轉蒸發儀25-28℃水浴中以10rpm轉速旋轉混合20分鐘，再加入3258μl TritonX-114，并在旋轉蒸發儀水浴中加入冰塊，使水溫降至8-10℃，同速旋轉混合15分鐘。加入300ml乙酸乙酯混合5分鐘。將混合液倒入二個分液漏斗中，靜置5分鐘即分層。將二個分液漏斗中含質粒的下層水相從下部出口放到另二個干凈的分液漏斗中，再各加入乙酸乙酯150ml混合5分鐘，靜置5分鐘，隨后將下層水相放入另一干凈漏斗中。如此用乙酸乙酯重復洗滌4次后，合并水相，測其體積、濃度和內毒素。
結果顯示，體積為250ml，濃度為1.65mg/ml(總量412mg，回收率93.5％)，內毒素含量＜10EU/mg。乙酸乙酯價格是苯甲酸芐酯的1/4，此例表明乙酸乙酯特別適合規模化去除內毒素。
以上實施例結果表明，本發明者已成功建立去除質粒污染內毒素達到臨床應用標準的有效方法，即聯用PMXB和TritonX-114二種內毒素結合試劑，并采用安全無毒性無害的有機溶劑苯甲酸芐酯或乙酸乙酯進行分相法。此法簡便快速，耗時1小時左右，所用材料價格低，適合規模化生產。
實施例12 分相法與PMXB凝膠法聯用去除質粒污染的內毒素去內毒素FF凝膠(北京卓冠生物公司，1.5cm×68cm)的再生用100ml 1％脫氧膽酸鈉液再生此凝膠，再用潔凈的pH7.5、0.1M PBS緩沖液100ml充分洗滌使之平衡。
1.凝膠質粒液混合法去除內毒素取20ml再生的去內毒素FF凝膠置于潔凈玻璃三角瓶中，沉降后吸棄上層液體。加入20ml濃度為1.35mg/ml的HG43質粒液，室溫搖動48小時(卓冠公司推薦方法)。沉降后吸取上層質粒液，下部凝膠移入潔凈大離心管，3,000rpm離心10分鐘，吸取壓積后擠出的液體與以上質粒液合并，共25ml。
結果顯示，質粒濃度為0.75mg/ml，內毒素含量為5000-10000EU/mg。表明利用此法去除內毒素效果不佳。
2.凝膠層析法去除質粒內毒素準備玻璃層析柱和蠕動泵管道系統，用300ml 0.5M NaOH液循環洗滌過夜，再用2000ml超純水洗滌整個系統去除NaOH。填裝20ml再生后的FF膠，加入20ml1.35mg/ml的HG43質粒液，室溫循環吸附8小時(卓冠公司推薦方法)，收集流出的質粒液，其中當柱頂液體幾乎流干時再加入10ml PBS使柱內質粒液盡量流出。共收集得28.5ml質粒液。
結果顯示，質粒濃度為0.62mg/ml，內毒素含量為5000-1000EU/mg。本發明者另用Sigma的PMXB凝膠產品重復此實施方式，內毒素最低降至1000-2000EU/mg。表明此法不能有效去除質粒污染的內毒素。
3.分相法與PMXB凝膠混合法聯用去除內毒素取HG43質粒液先用PMXB和/或Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內毒素后(是本發明者早期摸索PMXB和Triton X-114聯用時由于用量不足而使內毒素去除不夠的質粒液)，再將此質粒液與FF膠按1∶1、1∶2或1∶3的體積比混合搖動4小時，取質粒液樣品測濃度和內毒素含量。結果見表11。
表11分相法與PMXB凝膠混合法聯用去除內毒素

其中，*先用Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內毒素；**先用PMXB加氯仿離心分相法去除大部分內毒素；***先用PMXB和Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內毒素。
4.分相法與PMXB凝膠層析法聯用去除內毒素取HG43質粒液，先用PMXB和/或Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內毒素后，得到60ml濃度為1.39mg/ml的質粒液(內毒素含量為1-2萬EU/mg)。同時取120ml再生后去內毒素FF凝膠裝柱，經pH7.5含2％NaCl的0.05M PB緩沖液平衡后，加入上述質粒液，蠕動泵流速1ml/分。待質粒液基本全進入柱內后，關閉層析柱下出口30分鐘，讓內毒素與柱上的PMXB充分結合。然后從下出口原流速分管收集流出的質粒液，測定各管質粒濃度和內毒素含量。結果見表12。
表12分相法與PMXB凝膠層析法聯用去除內毒素

結果表明，去內毒素后質粒液濃度0.622mg/ml(共74.72mg)，內毒素含量10-100EU/mg；回收率89.6％。PMXB凝膠的內毒素吸附量不高(卓冠公司說明其內毒素負載量為5,000-7,000EU/ml)，單用此凝膠難以去除質粒液中高污染的內毒素，需要先用離心分相法去除內毒素降至1萬EU/mg左右，再用PMXB凝膠，可有效去除質粒污染的內毒素；雖然先單用PMXB分相可將內毒素含量降至1000EU/mg左右，但再采用PMXB凝膠卻達不到所需效果(見表11的**)；而采用分相法，即聯用PMXB和Triton X-114分相法之后再用親和凝膠(見表11的***)，內毒素可降至100EU/mg以下。這與實施例7-8的結果分析相一致，即有很少的一小部分內毒素碎片不能與PMXB結合因而二步都采用PMXB時不能將其去除。
單用PMXB凝膠混合或層析法，或與上述分相法聯合應用PMXB凝膠混合或層析法去除內毒素的另一缺點是由于在使用過程中凝膠約含一半水份導致質粒液濃度被稀釋，當需要較高濃度質粒產品時需要增加濃縮步驟，因此會減少回收率。但規模化制備臨床用質粒時，考慮將PMXB凝膠層析步驟放在后面也可能有其好處，因先用的分相法所得質粒液中可能殘留有PMXB和/或Triton X-114，因此通常需要再使用分子篩凝膠(一般采用Sepharose CL-4BB或6B)將其除去。而PMXB凝膠大都用Sepharose CL-4B制成，其對內毒素而言是親和吸附，對不能吸附的質粒而言則起著分子篩作用可去除分子量比質粒小得多的有機分子、蛋白等殘留雜質。當然PMXB凝膠的成本比普通分子篩凝膠高，這需要綜合考慮。
實施例13 離心分相法去除蛋白質污染的內毒素大規模制備蛋白產品時一般無專門設置去除內毒素的步驟，但實驗室小量制備時一般需要去除其中的內毒素，以利于細胞培養、動物實驗等用途。考慮本發明的PMXB或PMXB聯用Triton X-114離心分相法簡便快速，適合于這種實驗室小量制備蛋白質，為此進行了此實施例。
取實驗室制備的大腸桿菌表達的初純結核桿菌保護性抗原Ag85A蛋白液(2.06mg/ml，內毒素含量5,000-10,000EU/ml)各1ml，置于潔凈離心小管中。根據蛋白質量分別加入不同量的PMXB(5mg/ml)或PMXB(5mg/ml)和Triton X-114，其中有機溶劑采用苯甲酸芐酯，按實施例3所述步驟操作，獲得去除內毒素的Ag85A蛋白液。用BioRad蛋白定量試劑盒按說明書步驟測定所得蛋白濃度，用鱟試劑測其內毒素殘留量。結果見表13。
表13離心分相法去除蛋白質污染的內毒素

結果表明，本發明單用PMXB或PMXB與TritonX-114聯用，經離心分相能有效去除蛋白質中污染的內毒素。我們重復此實施例多次得出以下用量單用PMXB時，蛋白質與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，優選1000∶5-15。PMXB與Triton X-114聯用時，蛋白質與PMXB的重量比為1000∶1.5-20，優選1000∶4-10μl，蛋白質與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，優選1000μg∶4-10μl。如背景資料所述蛋白質中內毒素含量不高，一般為1萬EU/mg左右，因此單用PMXB已足夠將蛋白質中的內毒素去除到所需水平。按實施例7-8結果分析所述，無法與PMXB結合的內毒素片段一般只占萬分之一左右，即使不能去除也僅僅殘留1EU/mg左右。故該PMXB離心分相法適合于實驗室小量蛋白質去除污染的內毒素。
權利要求
1.一種用PMXB去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法，包括以下步驟將質粒或蛋白質與PMXB，按質粒與PMXB的重量比為1000∶100-800或蛋白質與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，于室溫下混合均勻形成混合液；加入有機溶劑混勻后分層，收集含質粒或蛋白質的水相。
2.一種PMXB和Triton X-114聯用去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法，包括以下步驟將質粒與PMXB和TritonX-114液，按質粒與PMXB的重量比為1000∶50-600、質粒與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶20-400μl，于4-20℃下混合均勻形成混合液；或將蛋白質與PMXB和TritonX-114液，按蛋白質與PMXB的重量比為1000∶1.5-20、蛋白質與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，于4-20℃下混合均勻形成混合液；加入有機溶劑混勻后分層，收集含質粒或蛋白質的水相。
3.如權利要求1或2所述的方法，還包括用PMXB凝膠去除剩余內毒素的PMXB凝膠法步驟。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述PMXB凝膠法包括凝膠混合法和/或凝膠層析法。
5.如權利要求1或2所述的方法，其中所述有機溶劑選自氯仿、苯甲酸芐酯和乙酸乙酯。
6.如權利要求1或2所述的方法，其中所述PMXB選用5mg/ml濃度，所述TrintonX-114液采用不稀釋的原液。
7.如權利要求1或2所述的方法，其中所述混合液還包括終濃度為0.1-1.0M的NaCl。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述NaCl終濃度為0.3M。
9.一種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括PMXB及使用說明書。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其中還包括TritonX-114。
11.如權利要求9或10所述的試劑盒，其中所述PMXB及TritonX-114為分置于多個獨立包裝的無內毒素小管中的溶液；所述試劑盒為獨立的去內毒素試劑盒，或為質粒或蛋白質純化全套試劑盒中的組成部分。
全文摘要
本發明者建立了一種去除初純質粒或蛋白質中內毒素的方法包括單獨應用PMXB，或聯用PMXB和TritonX－114，加有機溶劑混合后進行分相；或先應用PMXB和TritonX－114加有機溶劑進行分相，再與PMXB凝膠混合法和/或PMXB凝膠層析法相結合的方法去除質粒或蛋白質中的內毒素。本發明操作簡便快速、成本低，可將質粒液或蛋白液中的內毒素量降低至10EU/mg以下，符合臨床用藥標準，而且不影響去除內毒素后質粒或蛋白液的濃度。
文檔編號C07K1/00GK101091797SQ200610028088
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優先權日2006年6月23日
發明者劉慶良 申請人:上海海規生物科技有限公司, 劉慶良