專利名稱：一種人類agt蛋白小分子抑制劑的制作方法
技術領域：
一種人類AGT蛋白小分子抑制劑，屬于藥物篩選新產品的技術領域，具體涉及一種O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤。這種抑制劑能不可逆地使人類AGT蛋白失去活性，用它對腫瘤細胞預處理，再進行烷基化化療，能提高化療療效。
背景技術：
烷基化試劑作為一種陽性抗癌藥已經廣泛應用于化療中殺死腫瘤細胞。這些試劑通常作用于鳥嘌呤6位氧，使之烷基化成為O6-烷基鳥嘌呤。通常使用的烷基化試劑有氯乙基化試劑和甲基化試劑。這些烷基化試劑，特別是氯乙基化試劑對殺死腫瘤細胞效果十分顯著。因為當氯乙基化試劑進入體內作用于惡性腫瘤時，首先與鳥嘌呤6位氧作用使之烷基化，然后通過分子內環化，再與DNA鏈上的胞嘧啶交叉偶聯，形成共價鍵連接的穩定大分子，造成DNA堿基不能正常配對，阻止DNA復制，從而導致惡性腫瘤細胞死亡。
這類烷基化試劑在治療惡性腫瘤如淋巴瘤，腦瘤，黑色瘤和Hodgkin病等都有好的療效。但是人類O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(h AGT)對烷基化藥物作用后的O6-烷基鳥嘌呤的修復影響了這些化療療效。因此有效抑制腫瘤細胞中人類AGT蛋白的活性對提高當前抗癌烷基化化療療效非常重要。
由于人類AGT蛋白修復功能的不可逆性，它可以通過接受而失去活性，該烷基基團從損壞的堿基而來。一些小分子已經被設計用來在烷基化化療治療腫瘤細胞之前，使人類AGT(血管緊張素原)蛋白失去活性。這種小分子已經顯示了能不可逆地使人類AGT蛋白失去活性，部分地抑制由這種蛋白引起的抗藥性。正用于II期臨床試驗的O6-芐基鳥嘌呤，對腫瘤細胞預處理，再進行烷基化化療，可以提高幾倍的療效。
目前這種小分子的應用前景看好，但它卻有致命弱點。這種小分子對人類AGT蛋白的低親和性、低生物可獲得性、較差的水溶性以及在體液中不能較長時間存在等特性都將大大降低它的應用潛力。
發明內容
本發明的目的在于公開一種人類AGT蛋白小分子抑制劑，它對人類AGT蛋白的親和性、生物可獲得性、水溶性都比O6-芐基鳥嘌呤高，在體液中存在時間較長，可以提高化療療效。
為達上述目的，本發明通過對分子水平上人類AGT蛋白對DNA損害部位的特異識別和作用的探討，合理的設計一些小分子抑制劑來更有效的抑制人類AGT蛋白。具體是在O6-芐基鳥嘌呤的芐基的對位引入甲氨基得到一種O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤。這種O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤，既不影響人類AGT蛋白對此類分子的特異性識別，還可以增加其對人類AGT蛋白的親和性和水溶性。經檢驗發現本發明的O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤比O6-芐基鳥嘌呤的生物活性高1～5倍。
其特征是本發明的抑制劑是O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤，化學結構式如下 本發明的O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤的合成方法如下以2-氨基-6-氯嘌呤為起始原料，先和三甲氨或1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷成鹽，生成三甲氨-嘌呤(TMA-purine)或1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)，再與對氨甲基芐醇在氫化鈉的作用生成O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤。
其中，三甲氨-嘌呤(TMA-purine)2a的合成在100℃，2-氨基-6-氯嘌呤(1.69g，10mmol)溶解在無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，溶解后冷卻到室溫，滴加50％(體積比)三甲氨的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。滴加完畢后，反應液于室溫攪拌24小時，析出沉淀，過濾用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌。于70～80℃真空干燥固體沉淀，得三甲氨基-嘌呤2.19g，產率95％。熔點207～208℃1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)2b的合成方法同三甲氨-嘌呤(TMA-purine)2a的合成，1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷(DABCO)(6.17g，55mmol)在無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)在室溫反應24小時，得到1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)2.54g，產率90％。熔點＞300℃。
O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤的合成對氨甲基芐醇(32mmol)溶于干燥的10ml二甲亞砜(DMSO)，將氫化鈉(30mmol)加入其中，于室溫下攪拌1小時后，加入15mmol三甲氨-嘌呤(TMA-purine)2a或1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)2b。繼續于室溫攪拌3小時。待反應完全，加入3ml冰醋酸中和。再加入400ml乙酸乙酯劇烈攪拌30分鐘，生成沉淀，過濾。用乙酸乙酯和水先后洗滌固體，干燥固體得O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤3.41g，產率84.3％。
1H NMR(500Hz，CD3OD)64.58(s，2H)，5.46(s，2H)，6.26(s，NH2重水交換消失)，7.26(d，J＝7.8Hz，2H)，7.38(d，J＝7.8Hz，2H)，7.85(s，1H)，12.30(br，s，NH，重水交換消失)。
具體實施例方式
實施例1藥理藥效試驗1.細胞培養選取多種化療敏感細胞株及耐藥細胞株，(如卵巢癌細胞株SKOV-3ip及卵巢癌順鉑耐藥細胞株SKOV-3/DDP)在含10％小牛血清的RPM11640培養液中，于37℃、含5％CO2的培養箱中貼壁生長，待培養至對數生長期后，0.25％胰酶消化、制成單細胞懸液。以每孔2×105個細胞加入96孔培養板中，置于37℃、含5％CO2的培養箱中培養，同時加入不同濃度的待測藥物，檢測在不同的細胞株上待試藥物的IC50，觀察陽性對照藥物(順鉑)在單用、同時合并用藥或序貫用藥中IC50的變化。通過金氏公式判斷是否在單獨用藥、合并用藥48小時及序貫用藥(待測藥物先作用24小時后加入陽性對照的化療藥物24小時)中存在療效增強的作用，得到藥物的增效劑量范圍。
2.細胞周期和凋亡率測定將每孔2×105個細胞接種于12孔培養板中，培養過夜后，棄培養基。實驗組I分別加入不同濃度的待測藥物，陽性對照藥物及待測藥物陽性對照藥物聯合用藥和陽性對照藥物，繼續培養48小時；實驗組II先加入終濃度為待測藥物作用24小時后，棄去培養基，再加入陽性對照藥物培養24小時。每孔設4個平行孔，消化收集細胞制成含1×106/ml的單細胞懸液1ml，PBS沖洗3次，300目尼龍網過濾，PI染色30分鐘后置流式細胞儀分析，觀察待測藥物對細胞凋亡率及細胞周期的影響。
試驗結果O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤90％AGT抑制效價在乳腺癌MCF-7細胞中，O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤為0.5μM，O6-芐基鳥嘌呤為1μM。培養細胞抑制試驗對乳腺癌細胞，O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤使替莫唑胺的IC50從100μM降低到8μM。
實施例2動物模型對粘附性差的腫瘤細胞株而言無菌條件下取生長良好的S-180腹水型小鼠腹水，用生理鹽水稀釋，制成瘤細胞懸液，1×106個/ml。于小鼠腹腔接種0.2ml/只，隨機分為1，2，3，4，5，b，7，8共八組。接種瘤細胞24h后腹腔給藥。1組(對照組)單用生理鹽水，2組(待測藥物組)單用待測藥物，3組(陽性抗癌藥物組)單用陽性抗癌藥，4組(待測藥物+陽性抗癌藥組)同時給予待測藥物與陽性抗癌藥，5組(待測藥物十8h陽性抗癌藥)注射待測藥物后8h給予陽性抗癌藥，以下以此類推，6組(待測藥物+12h陽性抗癌藥)兩藥間隔12h，7組(待測藥物+24h陽性抗癌藥組)兩藥間隔24h，8組(待測藥物+72h陽性抗癌藥組)兩藥間隔72h。以上實驗重復3次。
對粘附性好的腫瘤細胞株而言，直接接種腫瘤細胞到小鼠皮下或相應部位，檢測瘤塊大小、重量、動物存活情況等。
觀察每組小鼠的體重變化、瘤塊大小、重量及生存天數，計算生命延長率。生命延長率(increase in life span ILS)＝(治療組生存天數一對照組生存天數)/治療組生存天數×100％。實驗第60日終止實驗，觀察存活的小鼠數量，小鼠生存超過60天視為治愈。計算治愈率。治愈率(curable rate)＝生存超過60天的小鼠數/小鼠總數×100％。
試驗結果裸鼠接種惡性膠質瘤治療試驗替莫唑胺(35mg/kg，腹腔注射)+伊立替康(4mg/kg，腹腔注射，1-5，8-12天給藥)+新化合物20mg/kg，給抗癌藥1小時前腹腔注射)以治療開始時的瘤體大小增加5倍所需要的時間為判定指標。與對照組比較，合并用藥使腫瘤生長延遲150天，而單獨給與抗癌藥使瘤體成長延遲7-9天。
權利要求
1.一種人類AGT蛋白小分子抑制劑，其特征在于該抑制劑是O6-對氨甲基芐基鳥嘌呤，化學結構式如下
全文摘要
一種人類AGT蛋白小分子抑制劑，屬于藥物篩選新產品的技術領域，具體涉及一種O
文檔編號C07D473/00GK1861078SQ20061002759
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月12日 優先權日2006年6月12日
發明者楊琍蘋, 韓峰燕, 何川, 施章杰, 艾瑞卡 申請人:華東師范大學