專利名稱：以白花丹素為配體的金屬配合物、其合成方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及金屬配位化合物，特別是以白花丹素為配體的金屬配合物；本發明還涉及這種金屬配合物的合成方法及其用途。
背景技術：
白花丹素(Plumbagin)是從藍雪科藍雪屬植物白花丹(Plumbagozeylanica)中分離的天然生物活性分子，又名藍雪醌，化學名為5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌，具有抗菌、消炎和抗腫瘤作用。抗腫瘤體外實驗體表明，白花丹素具有較強的細胞毒活性，如能顯著抑制白血病細胞(Raji)，肺癌細胞(Calu-1)，子宮癌細胞(HeLa)和上皮細胞(Wish)等多種腫瘤細胞的生長，IC50值分別為8.1μM，25.0μM，21.5μM和21.2μM。(參見文獻Nguyen A T，Malonne H Duez P.Cytotoxic constituents fromPlumbago zeylanica.Fitoterapia，2004，75500-504)；體內實驗也表明白花丹素可抑制P388淋巴白血病細胞瘤的生長。(參見文獻KrishnaswamyM，Purushothaman K K.Plumbagina study of its anticancer，antibacterial and antifungal properties.Indian J.Exp.Biol.，1980，18(8)876-877)。但迄今，白花丹素的藥學用途只是局限在對皮膚的抗菌、消炎作用，以白花丹素為配體的金屬配合物的合成及其藥理活性研究尚未有公開的報道。
發明內容
本發明將公開以廣西特有植物白花丹的抗腫瘤有效成份——白花丹素為配體的金屬配合物；本發明還將公開上述金屬配合物的合成方法及其用途。
對天然活性成分進行結構修飾和優化，合成高效、低毒的抗腫瘤有效成分是當今研究和開發新藥的熱點，特別是生物無機化學、配位化學與天然藥物化學之間學科的交叉應用，許多具有抗腫瘤活性的金屬配合物如順鉑配合物、二烴基錫衍生物已被合成并且一些已用于臨床，在這種情況下，把具有抗腫瘤活性的白花丹素與一些已用于臨床或試驗的具有抗腫瘤作用的金屬配合物的金屬離子作用，以增加其作用靶點，提高白花丹素的藥效和降低其毒性，這是極有意義的工作。
作為配體的白花丹素化學式為C11H8O3，分子量為188，結構式如下
白花丹素在結構上具有較高的超離域度，完整的大∏鍵共軛體系，較強的配位氧原子與合適的空間構型，可作為金屬離子良好的螯合配體。
本發明所述的金屬配合物的結構如式(I) 合成時，白花丹素的羰基氧和羥基氧(脫去一個質子)以雙齒鰲合形式與金屬離子M配位，形成六元環鰲合體。
其中，M代表某種能接受孤對電子的金屬離子；所述金屬離子可為主族金屬離子，或過渡金屬離子，或稀土金屬離子；具體選擇時，可優先選取一些其金屬配合物已被用于治療腫瘤的臨床應用或臨床試驗的金屬離子，如Ga(III)、Ru(III)、Pt(II)、Au(I)、Sn(IV)等，以增加其作用靶點；或選擇一些對人體的正常生長、發育是必需的，而且對人體的其它生命活動有著極為重要的作用的微量元素如Fe(II)、Zn(II)、Cu(II)等是酶和蛋白質的關鍵成分，Ni(II)有可促進胰腺作用；還有對人體有特殊生理功能的Mn(II)、Co(II)、Mo(VI)、Mg(II)、Ca(II)等；當然也可選擇一些有藥理實驗表明具有生物活性、且以其合成的金屬配合物有研究報道具有較強的抗腫瘤活性和抑菌活性的金屬離子，如稀土元素Y(III)、La(III)、Nd(III)等；及可優先選擇Sm(III)、Eu(III)、Er(III)、Ag(I)、Pd(II)、W(VI)等金屬離子。
本發明金屬配合物的合成方法有溶液法、水熱法、溶劑熱法等，一般可采用溶液法合成，合成步驟如下1)將摩爾比為1∶1～3的金屬鹽與配體溶于溶劑中；溶劑的選擇應由溶解度來決定，以能溶解金屬鹽和配體為準，一般選擇溶解性較好的溶劑，如水，或其它強極性有機溶劑，或弱極性有機溶劑，如乙醇、甲醇、氯仿、乙腈、丙酮、四氫呋喃、二甲亞砜、二甲基甲酰胺等，還可根據反應需要選擇相應的混合溶劑及其配比量，如常用水-乙醇溶液；金屬鹽與溶劑、配體與溶劑之間的配比用量與溶解度有關，確定溶劑用量時，首先考慮要能將金屬鹽和配體完全溶解，當然也可根據反應需要可以適當過量些，如有些長時間的加熱回流反應，則需要加大溶劑的用量，配體與溶劑的用量比、金屬鹽與溶劑的用量比一般均為1mol∶30～100ml為宜；若將金屬鹽與配體分別用溶劑溶解后再混合，溶解金屬鹽的溶劑與溶解配體的溶劑的配比量(體積比)一般可為1∶1～3；2)所得的混合溶液進行反應；由于攪拌可使反應物分子或離子之間能有更好的碰撞、接觸，使反應進行得更充分、更完全，因此最好將所得的混合溶液在攪拌條件下進行反應；反應溫度和反應時間可根據實際反應需要確定，一般來說，反應溫度的提高可以加快反應的進行，縮短反應時間，但具體合成時，有些反應一般在常溫條件下反應已經能快速完成，則沒有必要提高溫度，如白花丹素Cu(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Fe(II)、Mn(II)、Y(III)、La(III)、Nd(III)、Sm(III)、Eu(III)、Er(III)、Ag(I)、Ru(III)金屬配合物的合成；反之，有些反應不能在常溫下進行，沒有達到一定的溫度則不能反應或反應很慢，則需要提高溫度，一般從20℃加熱至80℃，如白花丹素Mo(VI)、W(VI)、Pt(II)、Pd(II)、Sn(IV)金屬配合物的合成；其次，溫度的提高還需考慮所用溶劑的沸點溫度，一般反應溫度不超過所用溶劑的沸點溫度，還有對高溫時容易分解的反應物，反應溫度還不能超過其分解溫度；而反應時間一般可由反應速度確定，對反應速度慢的反應，則可適當加長反應時間；所述反應溫度一般為20℃～80℃，反應時間一般為2～48小時；反應時，金屬離子按一定的配位方式與配體配位作用，從而達到制備配合物的目的；在合成過程中，最好適當的調節溶液的pH值，其pH值大小可根據反應的需要來選擇的，一般來說，反應堿性強有利于白花丹素羥基上的質子脫去，有利于反應的進行，溶液的pH值范圍最好為5～8；此外，對于一些見光易氧化、分解的金屬鹽，還需要避光、惰性氣體保護等；3)將反應后溶液過濾，取溶液的沉淀進行提純、干燥，得到相應的金屬配合物；所述將溶液的沉淀提純的方法可為，將沉淀用不同類型的溶劑進行洗滌例如選用水或極性較強的有機溶劑如乙醇、丙酮，極性較弱的有機溶劑如氯仿等洗滌沉淀，以除去未反應的配體、金屬鹽和其它副產物，一般可洗滌三次；所得金屬配合物的結構可由一些物理性質的分析和譜學分析來確定，如元素分析、差熱-熱重分析、紅外光譜、核磁共振分析等。
由于可以給出孤對電子的白花丹素非常適合與能接受孤對電子的金屬離子作用形成金屬配合物，所以本發明以其為配體與多種金屬鹽合成了一系列金屬配合物，并通過考察所得配合物對多種腫瘤瘤株的抑制作用，結果表明其中多種配合物表現出了比白花丹素更為顯著的抗腫瘤活性，具有很高的藥用價值，可用于各種抗腫瘤藥物的制備。
具體實施例方式實施例1合成白花丹素Cu(II)金屬配合物按摩爾比1∶2的比例，將1mol的醋酸銅和2mol的白花丹素分別稱取后，分別溶于30ml水和30ml乙醇中，在25℃攪拌的條件下，將醋酸銅水溶液逐滴加到白花丹素乙醇溶液中，即有棕紅色沉淀生成，繼續攪拌2小時使其完全反應，過濾溶液，所得的沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再置于P2O5的干燥器中真空干燥至恒重，此產物即(C11H7O3)2Cu·2H2O。
白花丹素Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Fe(II)、Mn(II)等金屬配合物的合成方法與此方法相同。
實施例2合成白花丹素Mo(VI)金屬配合物按摩爾比1∶2的比例，將1mol的鉬酸溶于25ml水中，將2mol的白花丹素溶于50ml乙醇溶液，將所得的鉬酸水溶液加入白花丹素乙醇溶液中，所得的混合溶液加熱回流20分鐘，然后在其中滴入氫氧化四乙基銨，調節混合溶液的pH值至6～7，再回流6小時，濾出黃綠色沉淀，所得沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再置于P2O5的干燥器中真空干燥至恒重，此產物即MoO2(C11H7O3)2。
白花丹素W(VI)金屬配合物的合成方法與此方法相同。
實施例3合成白花丹素Y(III)金屬配合物按YCl3·6H2O∶白花丹素＝1∶3的摩爾比，稱取1mol的YCl3·6H2O和3mol的白花丹素，分別溶于30ml水和30ml乙醇中，將得到YCl3·6H2O水溶液和白花丹素乙醇溶液混合，將所得的混合溶液攪拌20分鐘，再滴加1∶1(體積比)氨水溶液入其中，調節混合溶液的pH值至5～6，再于30℃繼續攪拌2小時使其完全反應，析出棕紅色沉淀，過濾溶液，所得的沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再置于P2O5的干燥器中真空干燥至恒重，此產物即(C11H7O3)3Y·2H2O。
白花丹素La(III)、Nd(III)、Sm(III)、Eu(III)、Er(III)等金屬配合物的合成方法與此方法相同。
實施例4合成白花丹素Pt(II)金屬配合物按摩爾比1∶2的比例，將1mol的K2[PtCl4]溶于30ml水中，在攪拌狀態下緩慢將其加入至溶有2mol白花丹素的60ml甲醇溶液中，所得的混合溶液攪拌20分鐘，再滴加5wt％的KOH水溶液，調節混合溶液的pH值至6～7，在50℃、避光、惰性氣體(N2或Ar)條件下，讓混合溶液反應48小時，生成墨綠色沉淀，過濾溶液，所得的沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再在無水CaCl2真空干燥器中干燥至恒重，此產物即Pt(C11H7O3)2。
白花丹素Pd(II)金屬配合物的合成方法與此方法相同。
實施例5合成白花丹素Sn(IV)金屬配合物按摩爾比1∶2的比例，將1mol SnCl4·5H2O溶于30ml乙醇溶液中，并將所得溶液在攪拌狀態下緩慢加至溶有2mol白花丹素的30ml乙醇溶液中，50℃下攪拌1小時，出現沉淀，再繼續攪拌1小時，生成淺紫色沉淀，過濾溶液，所得的沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再在無水CaCl2真空干燥器中干燥至恒重，此產物即Sn(C11H7O3)2Cl2。
實施例6合成白花丹素Ag(I)金屬配合物按摩爾比1∶1的比例，將1mol的AgNO3溶于30ml水中，并將所得溶液在避光、攪拌狀態下緩慢加至溶有1mol白花丹素的30ml乙醇溶液中，滴加1∶1(體積比)氨水溶液，調節混合溶液的pH值為6～7，再于30℃反應24小時，生成紫色沉淀，過濾溶液，所得的沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再在無水CaCl2真空干燥器中干燥至恒重，此產物即Ag2(C11H7O3)2。
實施例7合成白花丹素Ru(III)金屬配合物將1molRuCl3·3H2O和4mol醋酸鈉溶于30ml水中，在攪拌狀態下，將所得的溶液緩慢加熱至30℃，再將該溶液逐滴加至溶有3mol白花丹素的30ml乙醇溶液中，所得混合溶液于30℃繼續攪拌12小時，溶液由紅色變為橙色，且有深黃色的固體生成，過濾溶液，所得的沉淀先用水、無水乙醇分別洗滌三次，再在無水CaCl2真空干燥器中干燥至恒重，此產物即Ru(C11H7O3)3。
實驗例1白花丹素金屬配合物的抗腫瘤活性實驗1)細胞株與細胞培養本實驗選用乳腺癌MDA-MB-231和喉癌細胞KB及其耐藥株KBv200細胞。KBv200細胞較KB細胞對VCR(硫酸長春新堿)耐藥約100倍，在VCR濃度為200nmol/l時生長良好。所有細胞株均培養在含10wt％小牛血、100∪/ml青霉素、100∪/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液內，置37℃含體積濃度5％CO2孵箱中培養。KBv200細胞培養時加入VCR維持其多藥耐藥性，實驗前停藥1周。
2)初篩根據抗腫瘤藥物療效的評價標準之一，即體外抑瘤試驗合成化合物或植物提取物純品的半數抑制濃度IC50＜10μg/ml或植物粗提物的IC50＜20μg/ml，并有細胞毒性的劑量依賴關系，且最高抑制效率應達80％以上，則判定樣品在體外對細胞有殺傷作用。本研究所用化合物，純度較高(≥95％)，故反用這一抗腫瘤藥物療效評價標準，將所有化合物配制成10μg/ml，助溶劑DMSO終濃度≤1％(體積百分比濃度)，測試該濃度下化合物對癌細胞的抑制，凡抑制率大于50％(0.5)并符合光鏡下細胞受抑的形態變化(如細胞皺縮，破碎，漂浮等)的，則判定為初篩有效，進入下一步求IC50。結果二者在抗腫瘤活性判定上完全一致，各化合物10μg/ml抑制率初篩結果見表1。
3)細胞生長抑制實驗(MTT法)注MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。MTT是一種噻唑鹽，化學名3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。英文名為MTT，即([4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)。
將初篩抗腫瘤效果較好的受試化合物以DMSO助溶后，使用完全培養基依次對半稀釋成五個梯度，20倍于終濃度的工作液，各梯度之間除藥物濃度不同外，助溶劑DMSO等含量均一致。再用直徑為0.22um的微孔濾膜過濾除菌置于4℃保存。將對數生長期的MDA-MB-231、KB與KBv200細胞，以每孔0.19ml分別接種于96孔板，細胞濃度依次約為0.5×104/孔、0.4×104/孔、0.5×104/孔，培養12h待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的受試化合物，每孔10μL，使其終濃度分別為12μg/ml、6μg/ml、3μg/ml、1.5μg/ml、0.75μg/ml，每個梯度設4個復孔，其中DMSO終濃度≤0.5％，同時設相應的陰性對照組(培養液中只有細胞和等量DMSO，無藥物)和空白對照組(培養液中只有等量的藥物，無細胞)，每個組也設4個復孔，藥物作用48h。培養結束前4h加入10μL MTT(5mg/ml PBS)，繼續培養4h后，傾去培養液，加入DMSO 0.15ml，平板震蕩器振蕩5min，使結晶物充分溶解，空白對照組調零，用酶標儀以550nm/655nm雙波長測定去除本底光吸收值后的吸光度(A)值，以Bliss法分別計算各化合物對三種癌細胞的IC50值，所有實驗重復3次。實驗結果見表2、表3。
表1 白花丹素金屬配合物對腫瘤細胞的體外活性(10μg/ml抑制率)
表2 白花丹素金屬配合物對腫瘤細胞的體外活性(IC50值)
表3 白花丹素金屬配合物對腫瘤細胞的體外活性(IC50值)
注其中KB為口腔上皮癌細胞株，KBV200口腔上皮癌耐長春新堿株，MDA-MB-231為乳腺癌細胞株，SGC-7901為人類胃癌細胞株，hela細胞為人宮頸癌細胞株，cne-1、cne-2鼻咽癌細胞株，skov3為卵巢癌耐紫杉醇藥株。
體外抑瘤實驗表明，所得的配合物對所試的腫瘤細胞的體外活性則普遍較好，表中列舉的所試配合物活性較好、對各種腫瘤細胞的生長具有顯著抑制效果，適用于制備高效的抗腫瘤藥物。
權利要求
1.以白花丹素為配體的金屬配合物，如式(I) 其中，M代表某種能接受孤對電子的金屬離子。
2.根據權利要求1所述的以白花丹素為配體的金屬配合物，其特征在于所述金屬離子為主族金屬離子，或過渡金屬離子，或稀土金屬離子。
3.根據權利要求2所述的以白花丹素為配體的金屬配合物，其特征在于所述主族金屬離子為Ca(II)、Mg(II)、Sn(IV)。
4.根據權利要求2所述的以白花丹素為配體的金屬配合物，其特征在于所述過渡金屬離子為Cu(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Fe(II)、Mn(II)、Ag(I)、Mo(VI)、Pd(II)、Ru(III)、W(VI)、Pt(II)。
5.根據權利要求2所述的以白花丹素為配體的金屬配合物，其特征在于所述稀土金屬離子為Y(III)、La(III)、Nd(III)、Sm(III)、Eu(III)、Er(III)。
6.權利要求1～5中任何一項所述的以白花丹素為配體的金屬配合物的合成方法，其步驟如下1)將摩爾量比為1∶1～3的金屬鹽和白花丹素配體溶解于溶劑中；2)所得的混合溶液進行反應；3)將反應后溶液過濾，取溶液的沉淀進行提純、干燥，得到相應的金屬配合物。
7.根據權利要求6所述的以白花丹素為配體的金屬配合物的合成方法，其特征在于所述溶劑為水，或強極性有機溶劑，或弱極性有機溶劑。
8.根據權利要求7所述的以白花丹素為配體的金屬配合物的合成方法，其特征在于所述溶劑為水，或乙醇，或甲醇，或二甲亞砜，或二甲基甲酰胺，或乙腈，或丙酮，或四氫呋喃，或氯仿。
9.根據權利要求6～8中任何一項所述的以白花丹素為配體的金屬配合物的合成方法，其特征在于步驟2)中，反應時間為2～48小時；反應溫度為20～80℃。
10.權利要求2～5中任何一項所述的以白花丹素為配體的金屬配合物在制備抗腫瘤藥物中的運用。
全文摘要
本發明將公開以白花丹素為配體的金屬配合物、其合成方法及其用途，本金屬配合物如右式，其中，M代表某種能接受孤對電子的金屬離子，可為主族金屬離子，或過渡金屬離子，或稀土金屬離子；如Ca(II)、Mg(II)、Sn(IV)、Cu(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Fe(II)、Mn(II)、Ag(I)、Mo(VI)、Pd(II)、Ru(III)、W(VI)、Pt(II)、Y(III)、La(III)、Nd(III)、Sm(III)、Eu(III)、Er(III)。本發明以白花丹素為配體與多種金屬鹽合成了一系列金屬配合物，并通過考察所得配合物對多種腫瘤瘤株的抑制作用，結果表明其中多種配合物表現出了比白花丹素更為顯著的抗腫瘤活性，具有很高的藥用價值，可用于各種抗腫瘤藥物的制備。
文檔編號C07F15/00GK101037447SQ20061002052
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月17日 優先權日2006年3月17日
發明者梁宏, 陳振鋒, 譚明雄, 王恒山, 劉華鋼, 楊斌 申請人:廣西師范大學