無致突變作用的抗菌多肽的制作方法

專利名稱：無致突變作用的抗菌多肽的制作方法
技術領域：
本發明屬于多肽技術領域，特別涉及可用于制備抗菌組合物的無致突變作用的抗菌多肽、其制備方法及含有抗菌多肽的復合物。
背景技術：
所有的生物，從病毒到人類，其蛋白質都是由20種氨基酸組成。多肽是一類由氨基酸構成但又不同于蛋白質的中間物質。多肽中的氨基酸彼此以稱肽鍵連接。一種肽含有的氨基酸少于10個的肽稱為寡肽，超過10個氨基酸以就稱為多肽。氨基酸在50多個以上的多肽稱為蛋白質。
由于越來越嚴重的對現有抗菌素耐藥性問題，開發和研究新的抗菌素成了醫學界的一個重要課題。除此之外，人們在研究生物的對外防御機制時發現一類多肽具有抗菌作用。因此引起了醫藥界對多肽抗菌素研究和開發的極大興趣。40年代發現第一個抗菌肽，從此，多肽的抗菌作用也引起了研究者的高度重視。比如，Steiner et al(1981)發現從cecropia口腔分離出的抗菌多肽可造成細菌的裂解。Zasloff(1987)發現了Magainins。More(Mor et al.，1991)發現dermaseptins也可以使哺乳類動物細胞裂解。這兩種多肽均可從蛙的皮膚組織中提取。多肽Venom melittin(1967)和neurotoxin pardaxin(1988)均可造成細胞和細菌的代裂解。最初大多抗菌多肽在動物組織中發現。在這些組織中起到防御作用，并可抑制微生物的復制(Boman，1995)。
多肽抗菌素不同于傳統的抗菌素，抗菌肽作用專一，能從核酸和基因的角度去發揮作用。
1980年，瑞典科學家G.Boman等人發現了多肽的抗菌作用。后來，人們從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發現并分離出有抗菌活性的多肽。將其稱為“antibactetial peptides，ABP”，即抗菌肽。但在后來又發現某些抗菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有殺傷作用，便又稱其為“peptide antibiotics”即多肽抗生素(Shai，et al.，U.S.Patent，7001983，2006；Paradies.U.S.Patent Documents，4874850，1989；Jacob et al.，U.S.Patent，5635479，1997；Maloy，U.S.Patent，1998；Lee et al，5889148，1999；WO，97-02286，1997)。天然抗菌肽通常是由30多個氨基酸殘基組成，水溶性好，分子量大約為4000道爾頓左右。大部分抗菌肽具有熱穩定性，在100℃下加熱10～15分鐘仍能保持其活性。多數抗菌肽的等電點可大于7，表現出較強的陽離子特征(Peptide AntibioticsDiscovery，Modes of Action and Applications edited by Christopher J.Dutton et al1998-2005 Culinary and Hospitality Industry Publications Services)。同時，抗菌肽對較大的離子強度和較高或較低的pH值均具有較強的抗性。此外，部分抗菌肽尚具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。一般認為抗菌肽殺菌作用主要是通過破壞細菌的細胞壁的完整性。并能造成細胞槳內物質溢出胞外而死亡。抗菌肽先由靜電吸引而附于細菌膜表面，疏水性的C端插入膜內疏水區并改變膜的構象，多個抗菌肽在膜上形成離子通道而導致離子的溢出而死亡。抗菌肽可使膜蛋白凝聚、失活，引起膜滲透性改變而導致細菌死亡。不同類別的抗菌肽作用機理可不一樣。抗菌肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點。某些抗菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用。抗菌肽對革蘭氏陰性及陽性細菌均有高效廣譜的殺傷作用。國內外已報道抗菌肽對至少有100種以上的細菌有殺傷作用。具有螺旋結構的線性多肽cecropins是第一個被發現的動物抗菌肽，1980年，由Boman等從美國天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37～39個氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區域具有強堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結構，而在C端區域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區，多數多肽的C端被酰胺化，酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。此后，人們相繼從家蠶、柞蠶、果蠅、麻蠅中分離到了cecropins類抗菌肽。1989年，Lee等人從豬小腸中分離到了cecropin P1，說明了cecropins可能在動物中廣泛存在。cecropins對革蘭陽性菌、陰性菌組具有很強的殺傷力，而對真菌和真核細胞沒有毒性。目前cecropins已被人工合成并已商品化。Magainins也是較早發現的一類抗菌肽。1987，Zasloff最先從兩棲動物蛙(African clawed frogXenopus laevis)的皮膚中發現magainins具有抗真菌和抗菌作用。含有23個氨基酸，并在水溶性的條件下具有抗菌作用。他因此成立了一家公司開發該產品。它不僅對革蘭氏陽性菌和革蘭陰性菌有殺傷作用，對真菌及原蟲亦有殺傷作用Zasloff，1987；Hancock，1998)。另外一組抗菌多肽叫Defensins，它是一類動物細胞內源性殺菌多肽，是從吞噬細胞中分離出來的，具有很寬的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌的殺傷作用大于對革蘭陰性菌的殺傷作用，它也作用于真菌和部分真核細胞。但是對革蘭陰性菌的活性比cecropins要低10倍左右(Dorschner RA，et al.，2006)。Apidaecins是從蜜蜂中分離得到的含某種氨基酸的線性多肽。Maloy和Kari UP(1995)發現含脯氨酸的另一類多肽抗生素。一般含有16～18個氨基酸殘基，其中脯氨酸含量高達33％，精氨酸含量可達17％。apidaecins對某些革蘭陰性菌具有很強的活性，而對革蘭陽性菌不起作用。Apidaecins對某些革蘭陰性的植物病原菌和腸桿菌科的致病菌的高殺傷力，但會產生神經原毒性作用。然而它只在植物抗細菌病基因工程和食品工業中有著很好的應用前景。還有一種叫作Drosocin抗菌肽(Otvos L Jr，2002)。它是來源于果蠅的一種富含脯氨酸的抗菌肽，在結構上與apidaecins具有一定的相似性，但是在其11位的蘇氨酸羥基上連接著一個O-二糖鏈(-N-乙酰半乳糖胺-半乳糖)。它可能會影響蛋白質的合成和代謝(Otvos，2002)。Coleoptericin和hemiptericin分別來源于鞘翅目和半翅目昆蟲，一級結構中富含甘氨酸，分子量一般較大(Imamura M，et al，1999；CociancichS et al.，1994)。但是，由于缺乏對其抗菌作用的研究，目前尚無開發商。Oppenheim等人從人的腮腺和下頜腺分泌物中分離得到了一組富含組氨酸的抗菌肽，長度在7～38個氨基酸殘基不等，被稱為histatins。對于引起口腔感染的多種微生物具有活性(Raj PA and Dentino AR.，2005)。Indolicidin是來源于牛中性粒細胞的多肽抗生素，因其13個氨基酸中含有5個色氨酸而得名。其C端是酰胺化的，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有很強的殺菌活性(Shaw JE.，et al.，2006)，但會產生耐藥性(Samuelsen O.，et al.，2005)。含有一個二硫鍵的多肽，這是一類數量很少的抗菌肽，第1個被發現的這類多肽是bactenecin，來源于牛中性粒細胞。其12個氨基酸中含有4個精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵。bactenecin對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有活性(Raj PA and Dentino AR.，2005)。這類多肽中還包括一些來源于蛙類皮膚的多肽抗生素，一般在C端有一個由7個氨基酸形成的“loop”和一個長的N端“尾巴”，如brevinin-1，brevinin-2。含有兩個或兩個以上二硫鍵的多肽，這類多肽的典型代表是defensins，最初發現的defensins來源于哺乳動物的組織中，一般含有29～34個氨基酸殘基，其中6個保守的半胱氨酸形成3個分子內二硫鍵；此外，其第6位和第15位的精氨酸，第24位的甘氨酸也是保守的。α-defensins可形成3層的β片層結構，通過3個二硫鍵和Arg-6與Glu-24之間的鹽橋而被穩定。目前，defensins已被合成并已商品化。Defensins對多種細菌和某些真菌具有殺傷作用，并且對真核細胞有一定的毒性。defensins對革蘭陽性菌的活性比革蘭陰性菌強。defenssins的活性比cecropins弱，并且通常在低離子強度下起作用。β-defensins比α-defensins大一些，一般含有38～42個氨基酸殘基。都含有3個二硫鍵和4～8個精氨酸。昆蟲defensins在C末端與α-defensins相似，但是只有兩個β片層結構，中間有一段α螺旋起穩定作用，主要對革蘭陽性菌起作用，而對真菌沒有作用。植物defensins一般有45～54個氨基酸殘基，可形成4個二硫鍵，3個β片層結構和一個α螺旋結構。植物defensins一般只對真菌起作用而對細菌沒有作用。不同植物defensins對真菌的抗菌譜不同。Thionins也是一類來源于植物的多肽抗生素，含有45～47個氨基酸殘基，有6個或8個半胱氨酸形成的3個或4個二硫鍵。其二級結構可形成2個反平行的α螺旋結構和2個反平行的β片層結構。thionins抑制多種植物致病細菌和真菌，但是對假單胞菌屬和歐文氏菌屬的細菌不起作用(Castro andFontes，2005)。因此，很少有與人體細菌有關的研究。科學家們闡明了另外一種叫做抗菌肽J25(microcin MccJ25)天然小分子的復雜抗菌機制，這種抗菌肽能夠阻斷細菌的酶，有可能導致新一代抗生素的出現。MccJ25穩定的結構使之可以耐受各種極端環境，它有可能成為一種消毒劑。盡管MccJ25能夠抑制細菌的RNAP從而殺死細菌，但是它并不能抑制人類的RNAP，因此不會危害人體細胞。不過，MccJ25也有一些缺點，它僅作用于大腸桿菌和相關的菌屬，而且細菌很容易產生抗性。目前，所有的常規抗生素都出現了相應的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經日益嚴重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一種有效途徑。抗菌肽因為抗菌活性高，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產生抗性突變等原因，而被認為將會在醫藥工業上有著廣闊的應用前景。目前，已有多種多肽抗生素正在進行臨床前的可行性研究。
臨床應用方面還有許多問題，其中最主要的問題是毒性作用。例如，Colimycin，一種脂性多肽，臨床上已經成功的用來治療Pseudomonasaeruginosa肺部感染。似乎病人可以耐受colimycin的治療。主要可能是因為化學結構的修飾降低了藥物的毒性作用。可能是在該多肽的后面加了脂(Robert E.，et al.，1999)。現在大多數臨床試驗是用于局部治療，這種治療應該是安全和有效的。一些毒性更強的多肽和脂多肽，如短桿菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮膚軟膏。這些多肽也可用于那些常規抗生素和常規療法無效的地方。利用粉劑的方法治療肺部感染是一個很有前途的發展方向。口服藥物可能會被用于治療腸道感染，Nisin正在進行抗螺旋桿菌的臨床試驗。盡管對抗菌肽進行了大量的研究，可進入臨床治療細菌感染仍然存在許多問題。比如毒性、吸收和合成成本等問題仍待解決。
目前還需要解決一些問題。首先是毒性問題。這包括抗菌肽能否專一造成有害病菌的裂解而不影響正常組織細胞。其次，抗菌肽會不會產生基因突變。
另外考慮到成本問題抗菌肽的合成要方便經濟，抗菌肽分子要具有高活力。我們發明的是一組合成多肽，除其序列不同于現有的抗菌多肽，并具有更強的抗菌作用，同時無致突變作用，更適合用來治療細菌感染，尤其是耐藥細菌的感染。

發明內容
本發明目的在于提供一組可用于制備抗菌組合物的無致突變作用的抗菌多肽、其制備方法及含有抗菌多肽的復合物。
為達上述目的，本發明采用對天然抗菌多肽的序列、抗菌活性以及結構分析、研究的基礎上，設計并合成了一組無致突變作用的抗菌多肽，所述抗菌多肽無致突變作用。
所述抗菌多肽至少含22氨基酸。
所述抗菌多肽含有(AFVKLLKK)或(AFVKIMKK)。
所述抗菌多肽的氨基酸序列為CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKLLKK-NH2(以下簡稱DK-1)或CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKIMKK-NH2(以下簡稱DK-2)。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第1，3，13位氨基酸為Gly。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第4，7，10，11，14，18位氨基酸為Lys。
所述抗菌多肽氨基酸A19 Lys連接20A為Lys。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第2氨基酸為Ile。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第5，12，16位氨基酸為Phe。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第6，20位氨基酸為Leu。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第9，15位氨基酸為Ala。
所述抗菌多肽22個氨基酸中第17位氨基酸為Val。
所述抗菌多肽第20位氨基酸為L或M。
所述抗菌多肽含有AFVKLLK或AFVKIMKK的15位氨基酸為Ala。
無致突變作用的抗菌多肽的制備方法，采用固相化學合成。
無致突變作用的抗菌多肽的制備方法，采用生物合成方法。
所述含有抗菌多肽的復合物，其特征在于該復合物至少含有一種所述的抗菌多肽。
所述復合物含有兩種多肽。
兩種多肽的一種為CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKLLKK-NH2(DK-1)；另一種為CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKIMKK-NH2(DK-2)。
所述復合物是霜劑，油劑，或水劑的外用藥劑型。
所述復合物是口服，肌肉注射，靜脈注射劑型。
一種治療革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和耐藥菌感染的方法，給細菌感染病人使用所述復合物的任何一種的劑型。
一種消毒劑，含有所述復合物的任何一種消毒劑劑型。
本發明中的多肽可采用成熟的化學合成方法進行合成。多肽合成采用FMOC化學方法。儀器為Applied-432多肽合成儀，又叫Synergy多肽合成儀。我們采用的具體方法是FMOC和HBTU活化結合在一起的固相合成方法。合成從靠近C末端的氨基酸開始。每次加一個氨基酸，合成至N末端為止。每加一個氨基酸都要重復以下三個步驟1)、從固相中去除靠近N末端的氨基酸的保護基團，2)、加下一個氨基酸，3)、去除新的靠近N末端氨基酸保護基團。在上述每一過程之間均有清洗步驟。合成儀會自動對去除保護基團和偶聯的質量進行監控。基本質量控制采用printouts方法。合成和合成產物處理措施的質量控制方法如下在合成結束時，收集帶有保護性基團的多肽包括淋洗液。然后，將合成的多肽切下來，并去除側鏈上的保護基團。上述過程均在有90％TFA、5％thioaisole和ethanedithiol條件下進行。用玻璃棉(glass wool)過濾，然后用MTBE將多肽基團沉淀下來。并用MTBE洗三次，以便去除殘留的保護基團。接著中和殘留的酸性物質。抗菌多肽也可采用生物合成方法獲得。最終用MS鑒定產物純度或用測序方法控制質量。
本發明可提供一種新的抗菌方法，其特征在于所述復合物可是口服、肌肉注射、靜脈注射及各種劑型。是一種治療革蘭氏陽性，革蘭氏陰性細菌和耐藥菌感染的方法。
本發明可提供一種新的抗菌方法，抗菌多肽可制成軟膏劑，藥物劑量10-20ug/ml，包括乳膏劑和糊劑。具體方法舉例如下抗菌多肽軟膏劑是將抗菌多肽加入適宜基質中制成的一種容易涂布于皮膚、粘膜、或創面的具有適當稠度的膏狀外用制劑。軟膏劑的質量要求為均勻、細膩、涂于皮膚上無粗糙感覺；有適當的粘稠度，易涂布而不熔化；無酸敗變質、不發生油水分離或分層，能保持固有療效；應無刺激及其它反應。用于創面的軟膏還應無菌。對基質的要求如下潤滑無刺激，稠度適宜，易于涂布；性質穩定，不發生配伍變化；具有吸水性，能吸收傷口分泌物；不妨礙皮膚的正常功能，具有良好釋藥性能；易洗除，不污染衣服。適用于感染性皮膚病。其種類有油脂性基質、乳劑型基質和含有大量(25-70％)吸濕、收斂性粉末的糊劑三種軟膏劑(中國藥典)。
油脂性基質包括烴類、類脂類、油脂類三種；乳膏的基質為乳劑型基質；糊劑含有大量吸濕、收斂性粉末。
烴類基質中凡士林(軟石蠟)熔點為38-60℃，無臭無刺激，不酸敗，性質穩定。適用于遇水不穩定的藥物。不適用于急性而且多量滲出液的患處。其特點是有適宜的粘稠度。固體石蠟是油脂性基質的一種，其熔點為50-65℃，可用來調節軟膏的稠度。液體石蠟也是油脂性基質的一種。它能與多數脂肪油或揮發油混合，調節軟膏的稠度。硅酮也是油脂性基質的一種，其粘度隨分子量的增大而增大，為無色無臭的液體，無毒、無刺激、易涂布，性質穩定，可保護皮膚并作為透皮促進劑。類脂類有羊毛脂，呈淡棕黃色粘稠半固體，熔點為36-42℃，吸水性強，可吸收約2倍其重量的水并形成W/O型乳劑。與凡士林合用，可改善凡士林的吸水性。油脂類基質來源于動植物高級脂肪酸甘油脂及其混合物。易受溫度、光線、氧氣的影響而分解、氧化。
乳劑型基質組成水相+油相+乳化劑，適用于亞急性、慢性、無滲出液的皮損。忌用于糜爛、潰瘍、水皰及膿皰癥。以下是乳劑配方的例子一價皂配方硬脂酸100g、蓖麻油100g、液體石蠟100g、三乙醇胺8g、甘油40g、蒸餾水452g。適用乳膏。
多價皂(W/O型乳劑型基質)配方鈣、鎂、鋅和鋁氧化物+脂肪酸多價皂。特點解離毒小，親水性小于一價皂，親油性強，HLB＜6，易形成，穩定性高。具體配方硬脂酸12.5g、單硬脂酸甘油脂17.0g、蜂臘5.0g、地蠟75.0g、液體石蠟410.0ml、白凡士林67.0g、雙硬脂酸鋁10.0g、氫氧化鈣1.0g、羥苯乙酯1.0g、蒸餾水401.5ml。制法油相熔化(85℃)+水相(85℃)邊加邊攪拌。
脂肪醇硫酸(酯)鈉類配方十二醇硫酸(酯)鈉，性質陰離子乳化劑，常用量0.55-2％(重量百分比)，適宜的pH值為6-7，不得＜4、＞8。配伍常與其它W/O型乳化劑合用。加入1.5％-2％(重量百分比)氯化鈉可使之喪失乳化作用。具體配方硬脂醇220g、十二烷基硫酸鈉15g、單硬脂酸甘油脂17.0g、白凡士林250g、羥苯甲酯0.25g、羥苯丙酯0.15g、丙二醇120g、加蒸餾水至1000g。制法油相熔化75℃+水相(75℃)邊加邊攪拌。
高級脂肪醇及多元醇酯類配方高級脂肪醇中，十六醇熔點45-50℃，不溶于水，用于O/W型乳劑基質，可增加穩定性和粘稠度；十八醇熔點56-60℃，不溶于水，可增加凡士林吸水性；月桂醇硫酸鈉，O/W乳劑乳化劑，用量0.5％-2％(重量百分比)，刺激性較小，HLB值40，能與酸堿性藥物、Ca、Mg離子配伍，忌與陽離子藥物配物。
聚氧乙烯醚的衍生物類配方水溶性基質，特點釋放藥物較快，無油膩感，易涂展，無刺激性，能吸收組織滲出物。用途用于濕潤，糜爛創面，有利于分泌物的排除，也可用于腔道粘膜或防油保護性軟膏的基質。缺點潤滑作用較差，其中水分易蒸發，易霉變。
甘油明膠，制法明膠1-3％+甘油10-30％+水(余量，重量百分比)。
特點形成一層保護膜，使用時較舒適。
纖維素衍生物MC溶于冷水，CMC冷熱均溶，其CMC-Na與重金屬離子不能配伍。PEG類，常用分子量300-6000，呈液體或蠟狀固體，特點易溶于水，易與滲出液混合易洗除，性質較穩定，不易霉變。
軟膏劑的制備1、藥物加入的方法水溶性藥物水相2、制備方法A.研和法半固體+液體藥物+部分基質(或液體)研至細膩糊狀，遞加其余基質，檢查無顆粒感覺為止。
B.熔和法熔點較高的基質，基質熔化、過濾+藥物攪勻、冷凝。
C.乳化法油溶性基質，熔化、濾過、濾液+抗菌多肽+水，溶液加熱(80℃)，攪拌、冷凝。
軟膏劑的質量控制1、抗菌多肽的含量測定；2、物理性質的測定熔點、酸堿度、物理外觀、粘稠度；3、刺激性；4、穩定型；5、藥物釋放、穿透及吸收的測定方法。
軟膏劑的包裝及貯藏1、包裝軟膏管(錫、鋁、塑料)；塑料盒；2、包裝器械自動裝置。軋尾、裝盒聯動機；3、貯藏避光陰涼干燥處，溫度不宜過高過低。
本發明的兩種多肽均溶于水。利用本發明多肽可制成霜劑、油劑、或水劑等外用藥，還可制成口服劑、注射劑。可用于治療革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和耐藥菌感染。本發明的多肽無致突變作用。
本發明多肽的化學結構可通過質譜鑒定，抗菌活性可用抑菌實驗所檢驗，其毒性作用可用急性毒理實驗、長期毒理實驗、局部毒理實驗和致突變試驗進行評估。
本發明兩種合成抗菌多肽組成的復合物，其中含有兩種多肽DK-1和DK-2，其比值為1∶1，這兩種合成抗菌多肽組成的復合物DK-1+DK-2＝DK(以下簡稱為DK)。每種多肽由22-L氨基酸組成。這兩種多肽均溶于水。其特征在于所述抗菌肽具有DK-1或DK-2的氨基酸序列。抗菌肽還包括個別氨基酸的取代而得到功能等同或抗菌作用更強的多肽。可殺滅革蘭陽性和革蘭氏陰性細菌。
本發明中，多肽氨基酸帶正電大，可與革蘭性陰性細菌的lipopolysaccharide(LPS)結合或與革蘭性陽性細菌的lipoteichoic酸結合，增加細菌細胞壁的通透性，對細菌產生殺傷作用。為了證明這類抗菌多肽的一般抗菌作用和抗耐藥菌作用，利用美國GenScript Corporation生物技術公司采用固相化學合成方法所制備的一組多肽(DK)進行研究。
利用96孔板法檢測一組多肽(DK)的殺菌作用，并與合成的天然抗菌多肽(Pexiganan)進行對照比較，以評價本發明中抗菌多肽DK的殺菌活性。結果表明本發明合成的抗菌多肽DK殺菌活性強于上述預先合成的天然抗菌多肽(Pexiganan)。菌株復蘇后接種，37℃培養過夜；然后，挑菌于普通培養基中，37℃培養過夜；將菌液稀釋成104-105CFU/毫升，96孔板中每孔接種10ul菌液，96孔板37℃培養過夜，用酶標儀測定OD620值(Park et al，1998)。殺菌活性的測定結果見表1。含有抗菌多肽細菌的生長濃度(OD620值)與不加抗菌多肽細菌的生長濃度的比值大于90％時的抗菌多肽濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度，MIC是指顯著抑制細菌生長的最低濃度)。
表1.比較兩種抗菌多肽(DK和Pexiganan)對不同細菌的抗菌活性的最小抑菌濃度(MIC)。肉眼觀察未見細菌生長的藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)的觀察結果見下表。
最低抑菌濃度(MIC)微克/ml(2005.11實驗結果記錄單)


另外，在DK與Pexiganan致突變的比較中發現DK無致突變作用。采用Aims實驗方法對DK與Pexiganan致突變進行比較。研究結果發現Pexiganan的Aims實驗呈陽性，而DK的Aims實驗呈陰性。結果表明DK不產生致突變，而Pexiganan會產生致突變。
在觀察DK對皮膚感染模型的作用時發現DK有治療作用。取兔稱重，并于實驗前1d在背部脫毛，脫毛面積150cm2，實驗時皮膚常規消毒，用2％普魯卡因2ml局部浸潤麻醉后切除2.0cm×2.0cm面積的皮膚，徹底止血后，皮下組織內注射金黃色葡萄球菌菌液0.2ml，同時創面涂抹0.2ml菌液，塑料薄膜覆蓋創面，連續2d。第3d取創面膿液作細菌培養，并隨機分組給藥(王芃，徐淑蘭，朱燕等，2000；蘭樹敏，盧慧勤，陳孝等，2004；狄寧，狄鳳桐，王荔等，2001)。DK高劑量組創面涂抹，DK 32微克/ml、低劑量組創面涂抹DK 16微克/ml糊劑，每次1ml。陽性組涂抹慶大霉素糊劑，每次1ml。模型組涂抹羥乙基纖維素糊劑，每次1ml。以上各組均每日2次，連續5天，每天記錄各組創面情況，于末次藥后24小時處死動物，局部取皮做病理切片，觀察創面愈合情況。研究發現第3天各組創面邊緣紅腫、大量膿性分泌物，創面細菌培養證實為金黃色葡萄球菌感染，模型制作成功。藥后第2d高劑量組、陽性組輕度紅腫，分泌物明顯減少；模型組紅腫明顯伴大量分泌物；低劑量組紅腫明顯、中等量分泌物。藥后第6天，高、低劑量組、陽性組創面結痂，邊緣有少量滲出，肉芽組織增生；模型組創面結痂，邊緣仍有少量分泌物，肉芽組織輕度增生。鏡下觀見較多肉芽組織、炎性滲出物、未見再生表皮。
陽性組見部分表皮被覆上皮生長、真皮乳頭內有少量炎細胞浸潤逐漸過渡到肉芽組織、有少量炎性滲出物。低劑量組見有部分正常皮膚過渡為肉芽組織、表面有表皮再生、再生部分缺少毛囊。
高劑量組部分正常皮膚延續為肉芽組織及表面被覆增生的表皮缺乏皮膚附屬器、表面積周圍少量炎性滲出物。因此DK對皮膚感染模型有治療作用。
由于抗菌多肽主要作用在細菌的細胞壁，因此，有可能會影響到正常細胞的功能，產生一般毒性作用，包括心血管方面的副作用。DK作為外用藥，本實驗對DK進行一般藥理學研究，觀察通過皮膚給藥途徑對實驗動物的心率、心電圖、血壓、呼吸的影響，以了解抗菌多肽的其它藥理作用或毒性作用(藥理作用研究方法見周秀梅等，2004；徐叔云等，2003；李楓、蔣長松1995；李華等，2004)，為臨床使用提供研究依據。對抗菌多肽的心血管方面的副作用進行觀察實驗。實驗觀察未發現有任何心血管方面的副作用。
長時間使用抗菌多肽也有可能產生毒性作用。因此，對抗菌多肽的毒性進行慢性毒理觀察，在慢性毒理實驗中未觀察到任何毒性作用。具體各種慢性毒理實驗結果如下給家兔皮膚局部涂抹10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的DK，1ml/次，1次/天，連續28天，觀察局部反應和全身反應，血常規、血細胞計數與分類、血液生化檢驗、臟器指數。結果未發現DK對家兔有慢性毒性反應(局部反應和全身反應)。
實驗動物為健康成年白色家兔30只，體重為2.00±0.2kg，雌雄各半，雌性為未產及無孕，由湖北省武漢市湖區全耀動物養殖廠提供。合格證號0036417。實驗室溫度22-25℃，相對濕度50％-60％，常規飼料分籠喂養，自由采食，飲水量不限。將家兔隨機分成5組每組6只，雌雄各半，每組分完整皮膚和破損皮膚2種情況，各3只。正常組只用生理鹽水。賦形劑組用藥物的賦形劑、低劑量組用10μg/ml的DK、中劑量組為50μg/ml的DK、高劑量組為100μg/ml的DK。觀察指標為每日觀察局部毒性反應(紅、腫情況)，并按皮膚刺激評分標準評分；觀察全身毒性反應(中樞神經系統、呼吸系統、植物神經系統、大小便)；每周測量一次體重。試驗結束時首先心臟取血分別送檢血常規、血細胞計數與分類、血液生化檢驗(肝功能、血尿素氮、電解質、血脂、凝血時間等)；處死家兔，取出重要臟器并稱臟器重量、計算臟器指數(腦、心、肝、脾、腎、肺、腎上腺)，同時對重要臟器進行病理學檢查(腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、腸系膜淋巴結、胰腺、子宮、卵巢、睪丸、胸腺、腎上腺、甲狀腺、給藥局部皮膚)。先對正常組和高劑量組進行病理學檢查，如果高劑量組檢查結果無異常者，則中低劑量組可不做。組織病理學檢查長期接觸受試藥物DK 28天后，對腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、腸系膜淋巴結、胰腺、子宮、卵巢、睪丸、胸腺、腎上腺、甲狀腺以及給藥局部皮膚的病理學檢查結果如下高劑量組1.皮膚表皮正常，扁平上皮(1-2層)有角化，真皮內有較多毛囊。
2.腦見神經元細胞結構正常、周圍有膠質細胞、未見炎細胞浸潤和灶性壞死。
3.心心肌纖維排列整齊、結構清晰，橫向、縱向斷面未見異常、無炎細胞浸潤4.肝肝索排列整齊，肝細胞結構正常，肝小葉結構清晰、未見肝細胞變性、壞死，匯管區結構正常，中央靜脈無擴張。
5.脾脾小體及紅髓結構清晰、未見明顯異常。
6.腎腎小球結構清晰、腎小管未見明顯異常。
7.肺肺泡結構正常、肺泡壁無增厚、肺泡腔內無炎性滲出物。
8.胸腺皮質、髓質結構清晰、胸腺小體未見異常變化。
9.唾液腺見大量漿液性腺泡，少量粘液性腺泡及導管，無異常。
10.胃各層結構完整、粘膜上層部分脫落、腺體基本完整、正常。
11.小腸絨毛結構清晰正常、腸壁各層未見異常。
12.胰腺腺泡、導管、胰島均可見、未見異常。
13.腸系膜淋巴結輕度反應性增生、副皮質區有些增寬。
14.腎上腺皮質各帶及髓質內細胞均未見異常。
15.子宮內膜及腺體均正常，未見異常。
16.卵巢見各級卵泡及間質腺。
17.睪丸大量曲細精管有許多生精細胞(各級)，少量精子。
長期給家兔皮膚局部涂抹10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml DK，1ml×1次/d×28d，完整皮膚組和破損皮膚組局部皮膚無明顯刺激表現(具體方法見廖曉燕、李亞潔、蔡文智等，2004；劉亞千、陳華、李春海等，2002；鄒毅、楊芳炬、韓旭等，2004；唐繼坤、劉敏、潘正興，2002；)，接觸受試藥時，家兔全身一般狀態飲食、肌力、活動等均正常；血液檢查和生化檢測以及臟器重量和指數等指標給藥組和對照組之間相比，P值均大于0.05，無顯著性差異；病理學檢查高 劑量組未見組織異常改變；由上述結果提示DK的長期毒性試驗未發現局部皮膚和全身毒性反應。
單次眼刺激實驗實驗結果發現低劑量和中劑量DK-1滴眼后未見有刺激反應；但高劑量滴眼后，6-48h可見角膜彌漫性混濁、虹膜結膜均充血、眼內分泌物多，眼瞼和睫毛潮濕，刺激分值在3.0-9.5之間，48h后基本消失，該藥在高劑量時對眼有輕中度刺激。
由肉眼法觀察10μg/ml和100μg/ml DK溶液無溶血作用。為消除肉眼觀察的誤差性，又進行了比色法測定(于蓮、蘇瑾、田海霞等2003；吳堅、姚健、朱順興等，2003)，結果可見加藥后吸光度較好，溶血度(％)分別在0.93±0.72、1.10±0.78，明顯低于國家標準的5％，無溶血作用。
給DK過程中動物全身一般狀態、四肢活動、進食、排便、皮毛、眼睛 黏膜、呼吸、行為等情況均未見異常(研究方法見王北嬰、李儀奎主編.中藥新藥研制開發技術與方法，上海科學技術出版社p809；劉亞千、陳華、李春海等2002)，在實驗中觀察到涂抹DK溶液組動物抗感染能力強，結痂愈合快。多次給DK試驗，完整皮膚涂抹賦形劑和DK，均未見紅斑和水腫，刺激分值為0，表明該藥對完整皮膚無刺激；破損皮膚組涂抹賦形劑和DK賦形劑組一至七天均勉強可見紅斑和水腫，刺激分值0.5，DK 1-3天紅斑和水腫勉強可見，于第三天后基本消失，表明該藥對破損皮膚基本無刺激。
具體實施例方式
實施例1、水包油抗菌多肽乳膏配方硬脂酸150g、蓖麻油50ml、液狀石蠟32ml、甘油80ml、尼泊金乙脂1g、三乙醇胺120ml、外用香精適量，蒸餾水加至1000g(蒸餾水約650ml)，抗菌多肽DK 65-100ug。
配制方法目前采用油水相混合加熱配制法，抗菌多肽直接加入蒸餾水中，將蒸餾水置加熱鍋內，加入硬脂酸、蓖麻油、液狀石蠟、甘油、尼泊金乙脂加熱使之熔融，稍放冷至70℃左右，緩緩加入三乙醇胺，邊加邊攪拌，降溫攪拌使之成膏，然后加入香精攪拌均勻即得。此法較前法配制簡單易行，易控制溫度，油相、水相溫度絕對相同，不需水浴加溫，成品質地也較好，這種方法適用于絕大部分水包油型乳膏的配制。
實施例2、抗菌多肽糊劑配方淀粉150g、氧化鋅粉100g、乙醇適量、凡士林加至1000g、抗菌多肽DK 10-50ug。
配制方法加溫至60℃左右的凡士林糊膏基質混合攪拌均勻，按上述配方比例，將氧化鋅與淀粉置入大型塑料盆內，混合均勻搓細過3號篩。分次加抗菌多肽，待冷即得。
權利要求
1.無致突變作用的抗菌多肽，所述抗菌多肽為無致突變作用。
2.根據權利要求1所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽至少含22氨基酸。
3.根據權利要求1所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽含有(AFVKLLKK)或(AFVKIMKK)。
4.根據權利要求1所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽的氨基酸序列為CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKLLKK-NH2或CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKIMKK-NH2。
5.根據權利要求3所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第1，3，13位氨基酸為Gly。
6.根據權利要求3所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第4，7，10，11，14，18位氨基酸為Lys。
7.根據權利要求3所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽中氨基酸A19 Lys連接20A為Lys。
8.根據權利要求3的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第2氨基酸為Ile。
9.根據權利要求3所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第5，12，16位氨基酸為Phe。
10.根據權利要求3所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第6，20位氨基酸為Leu。
11.根據權利要求3的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第9，15位氨基酸為Ala。
12.根據權利要求3的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽22個氨基酸中第17位氨基酸為Val。
13.根據權利要求3的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽第20位氨基酸為L或M。
14.根據權利要求4所述的無致突變作用的抗菌多肽，其特征在于所述抗菌多肽含有AFVKLLK或AFVKIMKK的15位氨基酸為Ala。
15.無致突變作用的抗菌多肽的制備方法，其特征在于采用固相化學合成。
16.無致突變作用的抗菌多肽的制備方法，其特征在于采用生物合成方法。
17.一種含有無致突變作用的抗菌多肽的復合物，其特征在于該復合物至少含有一種1-14所述的抗菌多肽。
18.根據權利要求17所述的含有無致突變作用的抗菌多肽的復合物，其特征在于含有兩種多肽。
19.根據權利要求18所述的含有無致突變作用的抗菌多肽的復合物，其特征在于兩種多肽的一種為CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKLLKK-NH2；另一種為CH3CO-GIGKFLKKAKKFGKAFVKIMKK-NH2。
20.根據權利要求17-19任一項所述的含有無致突變作用的抗菌多肽的復合物，其特征在于所述復合物是霜劑、油劑或水劑的外用藥劑型。
21.根據權利要求17-19任一項所述的含有無致突變作用的抗菌多肽的復合物，其特征在于所述復合物是口服、肌肉注射或靜脈注射劑型。
22.一種治療革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和耐藥菌感染的方法，其特征在于給細菌感染病人使用含有根據權利要求1-16所述復合物的任何一種的劑型。
23.一種消毒劑，其特征在于含有根據權力要求1-16所述復合物的任何一種消毒劑劑型。
全文摘要
無致突變作用的抗菌多肽，所述抗菌多肽為無致突變作用。所述抗菌多肽至少含22個氨基酸。所述抗菌多肽含有(AFVKLLKK)或(AFVKIMKK)。本發明可用于制備抗菌組合物，抗菌效果好。
文檔編號C07K1/00GK101070341SQ200610017750
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月8日 優先權日2006年5月8日
發明者張磊 申請人:徐永強