專利名稱：一種柴胡藥材的提取分離方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域，具體而言是涉及柴胡提取、分離標準化。
背景技術：
目前，在全球范圍內，中草藥都有一定的市場，隨著人們對健康要求認識水平的增高以及人口的老齡化，亞健康狀態化，人們更加渴望回歸自然，利用純天然程度高的藥物治療、預防一些化學合成藥物所不能解決的問題，因此天然植物藥的應用超出它原來民族傳統文化的背景。從天然藥物中尋求副作用小、且物美價廉的藥物成為世界各國醫藥企業所追逐的目標。歐共體對草藥進行了統一立法，加拿大和澳大利亞等國草藥地位已經合法化，美國政府也已起草了植物藥管理辦法，開始接受天然藥物的復方混合制劑作為治療藥，這些為中藥作為治療藥進入國際醫藥市場提供了良好的國際環境。另一方面，隨著全球經濟一體化進程的加快，特別是我國正式加入WTO，中國醫藥市場融入國際醫藥大市場的廣度和深度將進一步加劇。面臨強大跨國醫藥集團的激烈競爭以及日本、韓國、印度、泰國等亞洲國家傳統醫藥產品和德國、法國等歐洲國家植物藥的巨大沖擊，我國傳統中藥產生的眾多產品由于尚不能符合國際醫藥市場的標準和要求而被拒之門外。
中藥材提取的標準化和中藥制備方法的標準化是中成藥走向國際市場或者真正實現大工業生產的關鍵環節，也是中國醫藥工作者和國外研究天然植物藥的科研人員一直努力研究的方向。目前關于中藥的提取方法是中藥領域研究的重點，科研人員一直將研究的目光著重于采用何種方法才能從中藥材中獲得的更多的有效成分，因此目前的中藥材提取的局面是針對不同的中藥材其有效成分的提取方法也不同，而針對不同的中藥材采用不同的提取方法需要有大量不同的提取設備用于支持中藥材的提取，這不適于中藥材提取的標準化。
柴胡，為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)植物。全世界有柴胡屬植物200種，我國已報道有42種，17變種及7變形(程必強，喻學儉.云南熱帶亞熱帶香料植物.昆明云南大學出版社，1995.69-73)。《中華人民共和國典》(1995年版)規定北柴胡Bupleurum chineseDC.和南柴胡B.scorzonerifolium Willd.為藥用柴胡。前者主產于遼寧、甘肅、河北、河南、山東等地，后者主產于湖北、四川、江蘇、安徽等地。柴胡根中主要成份為柴胡皂苷，其次含有植物甾醇、側金盞花醇，以及少量揮發油、多糖；地上部分主要含黃酮類、少量皂苷類、木脂素類、香豆素類成分。柴胡皂苷具有鎮痛、鎮靜、抗炎等生理活性；目前發現柴胡多糖有抗炎、降血脂、增強免疫功能和抗病毒等作用，還有較強的抗潰瘍作用(張永文.柴胡果膠多糖的結構與藥理活性研究進展J.國外醫學中醫中藥分冊，1996，18(4)20-23.)，對肝炎以及SLE、腎炎及類風濕等自身免疫疾病具有重要的臨床價值。黃酮類具有增強毛細管功能的作用等。
如何確定一種提取、分離標準化方法，使柴胡中的藥物活性成分不僅能夠提取完全，還可以通過分離方法進一步分離所獲得的藥物活性成分。該提取、分離標準化的確立是目前中藥實現現代化的關鍵因素。
發明內容
本發明的目的在于提供一種柴胡提取、分離標準化。具體的說就是將柴胡提取物分成若干組分，每個組分包含幾個主要化合物，由這些藥材組分構成了一個藥材組分庫。對藥材組分庫能夠進行藥物篩選，從而發現新藥。
為了實現柴胡提取的現代化、標準化，本發明人通過大量的試驗，對目前柴胡的有效成分的提取方法進行歸納和整理，以尋求一種可標準化的提取方法，即在該提取條件下采用該標準提取方法對柴胡進行提取，可以最大限度的獲得中藥中的有效成分。
本發明所采用的柴胡提取、分離標準化是本發明人通過試驗，對同一味中藥材采用不同的提取方法進行比較后，所得到的可適于工業化生產的柴胡提取、分離標準化。
本發明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取柴胡藥材，將其粉碎后過篩，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1；在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱提取得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝用制備液相色譜繼續分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過了進一步分離的各個組分。
優選地，本發明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取柴胡藥材，將其粉碎后過篩，然后加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用2～10％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝用制備液相色譜繼續分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為10ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過進一步分離的各個組分。
最佳地，本發明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取柴胡藥材，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏，用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換70％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為90％的水，流動相B為10％的乙腈溶液；
40min時，流動相A為25％的水，流動相B為75％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間3.0-7.0min；組分fr.52，收集時間7.0-14.9min；組分fr.53，收集時間14.9-21.0min；組分fr.54，收集時間21.0-26.8min；組分fr.55，收集時間26.8-32.2min；組分fr.56，收集時間32.2-41.0min；組分fr.57，收集時間41.0-47.0min；組分fr.58，收集時間47.0-50.0min；fr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為98％的水溶液，流動相B為2％的乙腈溶液；10min時，流動相A為95％的水溶液，流動相B為5％的乙腈溶液；15min時，流動相A為85％的水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；35min時，流動相A為50％的水溶液，流動相B為50％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水溶液，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.8分離結果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間4.0-7.0min；組分fr.82，收集時間7.0-9.0min；組分fr.83，收集時間9.0-17.8min；組分fr.84，收集時間17.8-24.0min；組分fr.85，收集時間24.0-33.3min；組分fr.86，收集時間33.3-38.0min；組分fr.87，收集時間38.0-45.0min；為了獲得具體的柴胡有效成分，最佳的本發明提取分離方法為(1)提取工藝稱取柴胡藥材250g，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得36.6g浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得6.3g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得29.3g浸膏，取3.0g浸膏用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換70％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得2.8g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為90％的水，流動相B為10％的乙腈溶液；40min時，流動相A為25％的水，流動相B為75％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果取組分fr.5共1.1g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間3.0-7.0min；23mg；組分fr.52，收集時間7.0-14.9min；35mg組分fr.53，收集時間14.9-21.0min；27mg組分fr.54，收集時間21.0-26.8min；22mg組分fr.55，收集時間26.8-32.2min；20mg組分fr.56，收集時間32.2-41.0min；50mg組分fr.57，收集時間41.0-47.0min；108mg組分fr.58，收集時間47.0-50.0min；31mgfr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為98％的水溶液，流動相B為2％的乙腈溶液；10min時，流動相A為95％的水溶液，流動相B為5％的乙腈溶液；
15min時，流動相A為85％的水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；35min時，流動相A為50％的水溶液，流動相B為50％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水溶液，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.8分離結果取組分fr.8共1.6g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間4.0-7.0min；560mg；組分fr.82，收集時間7.0-9.0min；10mg；組分fr.83，收集時間9.0-17.8min；90mg；組分fr.84，收集時間17.8-24.0min；86mg；組分fr.85，收集時間24.0-33.3min；91mg；組分fr.86，收集時間33.3-38.0min；16mg；組分fr.87，收集時間38.0-45.0min；15mg.
本發明中，柴胡各組分中所含化合物見表1，其分析鑒定方法參見實施例三。
表1.柴胡各組分中所含化合物
以上柴胡、提取溶液在工業化提取時可按照相應的比例增大或減少，如大規模生產可以以公斤或以噸為單位，小規模生產也可以以克為單位，重量可以增大或減小，但其重量配比比例不變。
本發明所建立的提取、分離標準化可以適用于目前中藥中的任何一種中藥材，例如可用于阿魏、艾葉、安息香、柏子仁、鱉甲、檳榔、薄荷、蓖麻子、萹蓄、補骨脂、板藍根、蓽茇、巴豆、巴戟天、北豆根、北沙參、白及、白頭翁、白芍、白芷、白附子、白茅根、白果、白前、白扁豆、白蘞、白鮮皮、白薇、半邊蓮、半枝蓮、半夏、百合、冰片、蟬蛻、楮實子、常山、椿皮、穿山甲、穿心蓮、赤小豆、赤石脂、赤芍、蒼術、蒼耳子、沉香、垂盆草、側柏葉、草烏、草烏葉、草豆蔻、草果、川貝母、川牛膝、川烏、川芎、川楝子、車前子、丹參、淡豆豉、黨參、淡竹葉、杜仲、獨活、膽南星、大薊、大腹皮、牡丹皮、煅石膏、冬瓜皮、冬蟲夏草、地龍、地膚子、地骨皮、熟地黃、地錦草、地榆、當歸、燈心草、丁香、刀豆、大青葉、大棗、大黃、鵝不食草、莪術、兒茶、榧子、浮萍、萆解、覆盆子、佛手、附子、茯苓、防己、防風、番瀉葉、蜂蜜、蛤蚧、桂枝、葛根、藁本、高良姜、骨碎補、谷芽、谷精草、狗脊、枸杞子、枸骨葉、鉤藤、甘松、甘草、甘遂、瓜蔞、瓜蔞子、瓜蔞皮、關木通、干姜、炮姜、干漆、鶴虱、黃芪、黃精、海藻、槐花、海風藤、荷葉、黃芩、黃連、黃柏、花椒、何首烏、虎杖、胡黃連、厚樸、化橘紅、火麻仁、合歡皮、合歡花、紅大戟、紅花、黑芝麻、菊花、僵蠶、桔梗、橘核、姜黃、雞血藤、雞冠花、金果欖、金沸草、金蕎麥、金錢草、金銀花、降香、荊芥、韭菜子、決明子、款冬花、訶子、苦杏仁、苦參、苦楝皮、萊菔子、雷丸、凌霄花、鹿銜草、漏蘆、路路通、蓮子、絡石藤、蘆薈、蘆根、兩頭尖、兩面針、連翹、靈芝、羅布麻葉、羅漢果、荔枝核、龍膽、龍眼肉、老鸛草、墨旱蓮、麻黃、蔓荊子、滿山紅、滿山紅油、密蒙花、梅花、麻黃、麥冬、麥芽、玫瑰花、明黨參、馬鞭草、馬兜鈴、馬錢子、馬錢子粉、馬勃、馬齒莧、木瓜、木香、木賊、南沙參、女貞子、牛蒡子、牛膝、藕節、蒲公英、蒲黃、枇杷葉、佩蘭、片姜黃、瞿麥、秦皮、拳參、芡實、羌活、青木香、青風藤、青皮、青葙子、青蒿、青黛、茜草、牽牛子、前胡、千年健、千金子、秦艽、蕤仁、肉豆蔻、肉蓯蓉、肉桂、人參、人參葉、石菖蒲、鎖陽、桑葉、商陸、桑椹、蛇床子、桑白皮、桑枝、桑枝、桑寄生、娑羅子、酸棗仁、射干、蘇合香、沙苑子、使君子、柿蒂、砂仁、山豆根、山茱萸、山藥、山慈菇、山楂、小薊、升麻、水牛角、水牛角濃縮粉、石韋、石決明、石斛、石榴皮、生姜、絲瓜絡、三七、三棱、葶藶子、菟絲子、桃仁、通草、檀香、天花粉、天竺黃、天南星、天麻、天葵子、太子參、土荊皮、土茯苓、吳茱萸、威靈仙、王不留行、五加皮、五味子、五倍子、瓦楞子、烏藥、烏梅、夏天無、續斷、旋覆花、豨薟草、薤白、夏枯草、辛夷、香加皮、香附、香櫞、香薷、小茴香、仙茅、仙鶴草、玄參、玄明粉、西洋參、血余炭、血竭、徐長卿、淫羊藿、益母草、銀杏葉、薏苡仁、銀柴胡、遠志、芫花、郁李仁、郁金、魚腥草、茵陳、鴉膽子、月季花、玉竹、延胡索、浙貝母、豬牙皂、紫蘇子、紫菀、紫花地丁、紫草、豬苓、皂角刺、知母、澤蘭、澤瀉、珍珠母、枳實、梔子。
按照本發明方法所獲得的柴胡有效成分可以制成藥劑學上任何一種形式，包括針劑和口服制劑。其中針劑包括注射液、滴注液、粉針劑；口服制劑包括顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
對于本領域技術人員而言，根據本發明所公開的技術內容，本領域技術人員將很清楚本發明的其它實施方案，本發明實施例僅作為示例。在不違反本發明主旨及范圍的情況下，可對本發明進行各種改變和改進，例如所選用的溶液可以是其他低級醇或者是其他有機溶劑，但只要使用本發明所述的提取方法，均在本發明保護范圍之內。
下面給出柴胡指紋圖譜，柴胡水溶性各組分紫外光譜圖、柴胡水溶性各組分質譜圖、柴胡脂溶性各組分紫外光譜圖、柴胡脂溶性各組分質譜圖旨在進一步說明本發明，但對本發明并不構成限制。
圖1柴胡指紋圖譜圖2柴胡水溶性各組分紫外光譜3柴胡水溶性各組分質譜4柴胡脂溶性各組分紫外光譜5柴胡脂溶性各組分質譜圖具體實施方式
以下通過具體實施方式
來進一步說明本發明，不以任何形式構成對本發明的限制。
實施例一(1)提取工藝稱取柴胡藥材250g，將其粉碎后過篩，然后加入5倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流2小時，提取3次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入10倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流1.5小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得35.6g浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得5.8g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得26.3g浸膏，取2.6g浸膏用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換70％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得2.6g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為90％的水，流動相B為10％的乙腈溶液；40min時，流動相A為25％的水，流動相B為75％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果取組分fr.5共1.2g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間3.0-7.0min；22mg；組分fr.52，收集時間7.0-14.9min；36mg組分fr.53，收集時間14.9-21.0min；25mg組分fr.54，收集時間21.0-26.8min；20mg組分fr.55，收集時間26.8-32.2min；19mg組分fr.56，收集時間32.2-41.0min；46mg組分fr.57，收集時間41.0-47.0min；100mg組分fr.58，收集時間47.0-50.0min；33mgfr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為98％的水溶液，流動相B為2％的乙腈溶液；10min時，流動相A為95％的水溶液，流動相B為5％的乙腈溶液；15min時，流動相A為85％的水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；35min時，流動相A為50％的水溶液，流動相B為50％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水溶液，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.8分離結果取組分fr.8共1.6g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間4.0-7.0min；530mg
組分fr.82，收集時間7.0-9.0min；12mg組分fr.83，收集時間9.0-17.8min；92mg組分fr.84，收集時間17.8-24.0min；88mg組分fr.85，收集時間24.0-33.3min；90mg組分fr.86，收集時間33.3-38.0min；16mg組分fr.87，收集時間38.0-45.0min；16mg實施例二(1)提取工藝稱取柴胡藥材500g，將其粉碎后過篩，然后加入10倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流3小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流2小時，提取3次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流2.5小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得70.6g浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得5.3g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得27.3g浸膏，取3.0g浸膏用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換70％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得2.8g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為90％的水，流動相B為10％的乙腈溶液；40min時，流動相A為25％的水，流動相B為75％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果取組分fr.5共2.4g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間3.0-7.0min；43mg組分fr.52，收集時間7.0-14.9min；65mg組分fr.53，收集時間14.9-21.0min；47mg
組分fr.54，收集時間21.0-26.8min；42mg組分fr.55，收集時間26.8-32.2min；40mg組分fr.56，收集時間32.2-41.0min；90mg組分fr.57，收集時間41.0-47.0min；208mg組分fr.58，收集時間47.0-50.0min；51mgfr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為98％的水溶液，流動相B為2％的乙腈溶液；10min時，流動相A為95％的水溶液，流動相B為5％的乙腈溶液；15min時，流動相A為85％的水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；35min時，流動相A為50％的水溶液，流動相B為50％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水溶液，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.8分離結果取組分fr.8共2.7g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間4.0-7.0min；760mg組分fr.82，收集時間7.0-9.0min；19mg組分fr.83，收集時間9.0-17.8min；160mg組分fr.84，收集時間17.8-24.0min；156mg組分fr.85，收集時間24.0-33.3min；171mg組分fr.86，收集時間33.3-38.0min；26mg組分fr.87，收集時間38.0-45.0min；25mg。
實施例三一、柴胡藥材的提取分離(1)提取工藝稱取柴胡藥材250g，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得36.6g浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得6.3g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得29.3g浸膏，取3.0g浸膏用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換70％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得2.8g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為90％的水，流動相B為10％的乙腈溶液；40min時，流動相A為25％的水，流動相B為75％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果取組分fr.5共1.2g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間3.0-7.0min；23mg；組分fr.52，收集時間7.0-14.9min；35mg組分fr.53，收集時間14.9-21.0min；27mg組分fr.54，收集時間21.0-26.8min；22mg組分fr.55，收集時間26.8-32.2min；20mg組分fr.56，收集時間32.2-41.0min；50mg組分fr.57，收集時間41.0-47.0min；108mg組分fr.58，收集時間47.0-50.0min；31mgfr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為98％的水溶液，流動相B為2％的乙腈溶液；10min時，流動相A為95％的水溶液，流動相B為5％的乙腈溶液；15min時，流動相A為85％的水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；35min時，流動相A為50％的水溶液，流動相B為50％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水溶液，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.8分離結果取組分fr.8共1.6g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下
組分fr.81，收集時間4.0-7.0min；560mg；組分fr.82，收集時間7.0-9.0min；10mg；組分fr.83，收集時間9.0-17.8min；90mg；組分fr.84，收集時間17.8-24.0min；86mg；組分fr.85，收集時間24.0-33.3min；91mg；組分fr.86，收集時間33.3-38.0min；16mg；組分fr.87，收集時間38.0-45.0min；15mg.
二、分析2.1試劑與儀器Agilent 1100高效液相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)，配在線真空脫氣機、四元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、1946D電噴霧四級桿質譜檢測器、Chemstation色譜工作站；R-200型旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；飛鴿牌TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；METTLER-AE240型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。
乙腈為色譜純試劑(MERCK)，水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團)，乙酸為分析純(杭州試劑廠)。
2.2分析方法樣品來源柴胡組分fr.51 1.37mg、fr.52 1.06mg、fr.53 1.05mg、fr.54 1.40mg、fr.551.20mg、fr.56 1.05mg、fr.57 1.00mg、fr.58 1.22mg。
樣品制備樣品用1ml乙醇溶解，超聲，離心(10000r/min)，備用。
HPLC條件色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18型色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，以二元流動相進行梯度洗脫。流動相A為0.2％HAc-H2O，流動相B為0.2％HAc-CH3CN；線性梯度為0min，10％B；10min，50％B；30min，95％B。流速為0.5mL/min；柱溫為30℃；DAD檢測在190-400nm范圍內掃描；進樣量5μL。
質譜條件正負離子掃描模式，掃描范圍100-2000；干燥氣(N2氣)流速10L/min，霧化溫度350℃，毛細管電壓3500V，裂解電壓100V。
ELSD條件氮氣1.41/min，漂移管溫度100℃。
樣品來源柴胡組分fr.81 1.30mg、fr.82 1.46mg、fr.83 1.20mg、fr.84 1.20mg、fr.851.09mg、fr.86 0.95mg、fr.87 1.30mg。
樣品制備樣品用1ml 50％甲醇水溶解，超聲，離心(10000r/min)，備用。
HPLC條件色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18型色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，以二元流動相進行梯度洗脫。流動相A為0.01％HAc-H2O，流動相B為0.01％HAc-CH3CN；線性梯度為0min，5％B；5min，20％B；30min，50％B；35min，50％B。流速為0.5mL/min；柱溫為30℃；DAD檢測在190-400nm范圍內掃描；進樣量5μL。
質譜條件正負離子掃描模式，掃描范圍100-2000；干燥氣(N2氣)流速10L/min，霧化溫度350℃，毛細管電壓3500V，裂解電壓100V。
ELSD條件氮氣1.8l/min，漂移管溫度105℃。
2.3分析結果分析結果圖2是柴胡水溶性各組分紫外光譜圖，圖3是柴胡水溶性各組分質譜圖，圖4是柴胡脂溶性各組分紫外光譜圖，圖5是柴胡脂溶性各組分質譜圖。
柴胡組分中各化合物鑒定結果[1-3]見表2。
表2柴胡各組分鑒定結果
1.文獻1孟青，郭曉玲，馮毅凡，陳耕夫，梁漢明.柴胡超臨界二氧化碳萃取物化學成分氣相-質譜聯用分析；2005 VOL.16 NO.1；2.文獻2李穎等.銀川柴胡的化學成分研究；中國野生植物資源，1995年第四期；3.DNP(Dictionary of Natural Products)天然產物數據庫。
權利要求
1.柴胡提取、分離標準化方法，包括以下步驟(1)提取工藝稱取柴胡藥材，將其粉碎后過篩，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1；在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱提取得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)制備分離工藝用制備液相色譜分離fr.5和fr.8；色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過了進一步分離的各個組分。
2.如權利要求1所述的柴胡提取、分離標準化方法，包括如下步驟(1)提取工藝稱取柴胡藥材，將其粉碎后過篩，然后加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用2～10％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)制備分離工藝用制備液相色譜分離fr.5和fr.8；色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為10ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過進一步分離的各個組分。
3.如權利要求2所述的柴胡提取、分離標準化方法，包括如下步驟(1)提取工藝稱取柴胡藥材，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏，用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換70％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)制備分離工藝用制備液相色譜離fr.5和fr.8；fr.5的分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為90％的水，流動相B為10％的乙腈溶液；40min時，流動相A為25％的水，流動相B為75％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間3.0-7.0min；組分fr.52，收集時間7.0-14.9min；組分fr.53，收集時間14.9-21.0min；組分fr.54，收集時間21.0-26.8min；組分fr.55，收集時間26.8-32.2min；組分fr.56，收集時間32.2-41.0min；組分fr.57，收集時間41.0-47.0min；組分fr.58，收集時間47.0-50.0min；fr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為98％的水溶液，流動相B為2％的乙腈溶液；10min時，流動相A為95％的水溶液，流動相B為5％的乙腈溶液；15min時，流動相A為85％的水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；35min時，流動相A為50％的水溶液，流動相B為50％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水溶液，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.8分離結果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間4.0-7.0min；組分fr.82，收集時間7.0-9.0min；組分fr.83，收集時間9.0-17.8min；組分fr.84，收集時間17.8-24.0min；組分fr.85，收集時間24.0-33.3min；組分fr.86，收集時間33.3-38.0min；組分fr.87，收集時間38.0-45.0min。
4.如權利要求3所述的柴胡提取、分離標準化方法，其特征在于組分fr.51中主要化合物為2，9-Heptadecadiene-4，6-diyn-1-ol，8CI；(all-Z)form；組分fr.52中主要化合物為Massoialactone或dibenzoburan；組分fr.55中主要化合物為(E，E)-farnesylacetone或podocarp-12-en-14-one或hexahydrofaresylacetone；組分fr.56中主要化合物為2，8，10-Heptadecatriene-4，6-diyn-1-ol；(E，E，E)-form，Ac和decyl decanate；組分fr.57中主要化合物為十八碳烯酸甲酯。
5.如權利要求3所述的柴胡提取、分離標準化方法，其特征在于組分fr.82中主要化合物為3，3’，4，4’-Tetrahydroxylign-7-en-9，9’-olide；(R，E(Z))-form，3’，4’-Methylene，4-Me ether和Guayarol；3’-Me ether和2，9-Heptadecadiene-4，6-diyne-l，8-diol，8CI；(2Z，8S，9Z)-form；3，5，7，9-Tridecatetraene；(3E，5Z，7Z，9E)-form；組分fr.83中主要化合物為agaruspirol；組分fr.84中主要化合物為2-Phenylethanol；O-[b-D-Glucopyranosyl-(1→2)-b-D-glucopyranoside]；組分fr.85中主要化合物為2-Phenylethanol；O-[b-D-Glucopyranosyl-(1→2)-b-D-glucopyranoside]；組分fr.86中主要化合物為13，28-Epoxy-11-oleanene-3，16，23-triol；(3b，13b，16a(b))-form，3-O-[b-D-Glucopyranosyl-(1→3)-b-D-fucopyranoside]；組分fr.87中主要化合物為(E，E)-farnesylacetone或podocarp-12-en-14-one或hexahydrofaresylacetone和13，28-Epoxy-11-oleanene-3，16，23-triol；(3b，13b，16a(b))-form，3-O-[b-D-Glucopyranosy]-(1→3)-b-D-fucopyranoside]。
全文摘要
本發明公開了柴胡標準化提取分離方法，采用該方法可較大程度地將中藥材中化學成分提取出來并進一步分離獲得柴胡中不同極性的化學組分；具體的說就是將柴胡藥材按極性分成若干化學組分，每個組分中僅包含幾個主要化合物，由這些藥材組分構成一個藥材組分庫。對藥材組分庫能夠進行藥物篩選，從而發現新藥。該標準化提取分離方法不需要對每個藥材都建立一套提取分離方法，大大縮短了藥材提取分離的周期，同時也減少人力物力的消耗；該方法簡便、推廣性好，適用大部分藥材。
文檔編號C07B63/00GK101073587SQ20061001374
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月18日 優先權日2006年5月18日
發明者程翼宇, 賀慶, 王毅, 王學偉, 李云飛, 水文波, 胡興江, 葛志偉 申請人:天津天士力制藥股份有限公司