專利名稱：一種快速提取微孢子蟲dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取微孢子蟲DNA的方法，屬于微孢子蟲分子診斷、鑒定技術領域。
背景技術：
微孢子蟲是一種無線粒體的單細胞原生動物，細胞內寄生。自上個世紀發現引起家蠶毀滅性病害的家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)之后，在許多真核生物中都發現有微孢子蟲的寄生。由于其與動物及人類的健康關系密切，引起了廣泛研究興趣。而微孢子蟲的分子生物學研究尤其具有重要的生物學意義和經濟意義。其一方面有利于豐富生物種群，為生物防治提供較好的資源；同時有助于探討檢測蠶感染微孢子的實用技術，提高蠶種檢疫的質量，對家蠶微粒子病的防治具有重要的科學意義。
目前有關PCR技術用于微孢子蟲感染，特別是蠶蛾、蠶卵感染的分子診斷研究已有報道。其關鍵技術是高質量模板DNA的獲得。模板DNA是PCR反應的初始底物，盡管用量極少(至少104DNA分子)，但對PCR產物的特異性、產量都有重要影響。由于昆蟲微孢子蟲孢子外被堅硬的幾丁質和外殼蛋白質層組成孢子壁，不易破裂，用常規的酚/氯仿法很難提取到足夠量的微孢子蟲模板DNA。目前的方法大多數是先通過一些化學物質的處理，讓孢子發芽彈出孢原質，或者讓孢子破壁，然后再粗提DNA。這些成功的方法主要有鉀離子在堿性條件下的裂解法、液氮研磨法、玻璃珠研磨法、CTAB(Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide，C16H33N(CH3)3Br，簡稱CTAB)法等。特別是應用鉀離子在堿性條件下的裂解法在家蠶微孢子蟲研究方面比較多，如KOH法(Ishihara et al.，1968)、H2O2+KCl法(Iwano et al.，1979)、KOH+EDTA法(潘敏慧等，2001)、KCl法、K2CO3法、KHCO3+K2CO3法、SDS-蛋白酶K法等等(陳秀，1997)。但這些方法普遍存在提取步驟復雜、操作時間長(一般需要4-7小時)，限制了其在實際生產中的大規模應用。
發明內容
本發明在比較國內外各種微孢子蟲抽提方法的基礎上，建立了一種快速提取微孢子蟲DNA的方法。
本發明的技術方案，首先配制含有KCl的堿性裂解液，使用前在110-126℃溫箱內孵育15-30分鐘，備用。然后取100μL裂解緩沖液加入1.5mL離心管后，加入100μL待提取的樣品，混勻。沸水浴5-15分鐘后，13,000rpm離心10分鐘，取上清液即為微孢子蟲核酸模板DNA。上清液可以直接作為PCR檢測反應的模板DNA。裂解后的DNA樣品保存在-20℃。每次重復實驗前，都要將樣品以13,000rpm/分鐘，離心10分鐘后取用。
按照本發明，含有KCl的堿性裂解液配制方法如下900mL所說的裂解液含有9mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)、1.8mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)、18mL 5mol/L KCl、90mL 1％Tritonx-100，其余體積用水補足。
本發明之微孢子蟲DNA提取方法適用于蜜蜂微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)孢子、感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾組織或者小菜蛾微孢子蟲等材料。
有益效果本發明使用煮沸法能夠有效地提取到微孢子蟲DNA。操作簡單，操作過程只需15分鐘左右。同時本發明方法的另一顯著效果是適用范圍廣，可用于多種微孢子蟲DNA的提取，如蜜蜂微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)孢子、感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾組織或者小菜蛾微孢子蟲等。使用本發明方法制備的DNA樣品能夠滿足PCR方法對微孢子蟲進行分子診斷的需要。
圖1以煮沸法及其他兩種方法(常規法和CTAB法)提取的DNA為模板的PCR反應電泳檢測結果。其中A常規方法提取的DNA的PCR電泳檢測結果；BCTAB法提取的DNA的PCR電泳檢測結果；C煮沸法提取的DNA的PCR電泳檢測結果。泳道1蜜蜂微孢子蟲；2斜紋夜蛾微孢子蟲；3家蠶微孢子蟲孢子；4感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾組織研磨液；5小菜蛾微孢子蟲；圖中Nb為陽性對照；M和M1均為自制的標準DNA Marker，其中M1為400bp的酶切片段，用作陽性對照。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1以煮沸法及其他兩種方法(常規法和CTAB法)提取的DNA為模板進行微孢子蟲的PCR分子檢測以蜜蜂微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、家蠶微孢子蟲孢子、感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾組織研磨液和小菜蛾微孢子蟲的孢子懸浮液為材料，分別通過本發明的煮沸法、已報道的常規法(Terry R.S.；Smith J.E.；Bouchon D.；Rigaud T.；Duncanson P.；Sharpe R.G.；DunnA.M.，Ultrastructural characterisation and molecular taxonomicidentification of Nosema granulosis n.sp.，a transovarially transmittedfeminising(TTF)microsporidium，Journal of Eukaryotic Microbiology，1999，46(5)492-499)；曹廣力，張志芳，貢成良等.家蠶微粒子孢子DNA的制備方法，蠶業科學，1995，21(4)260)和CTAB法(劉吉平，曹陽，Smith J E，徐興耀.模擬感染家蠶微粒子病的PCR分子診斷技術研究.中國農業科學，2004，37(2)1925-1931)提取微孢子蟲的DNA，經PCR進行微孢子蟲的分子檢測鑒定。
1.煮沸法提取微孢子蟲DNA的過程取100μL裂解緩沖液加入5個1.5mL離心管中，做好標記，再向每個管中分別加入100μL濃度為108個/mL的蜜蜂微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、家蠶微孢子蟲孢子、感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾組織研磨液和小菜蛾微孢子蟲的孢子懸浮液，混勻。沸水浴10分鐘，13000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清液即為微孢子蟲核酸模板DNA。
2.常規方法提取微孢子蟲DNA的過程微孢子蟲DNA的常規抽提方法基本參照Terry et al(Terry R.S.；Smith J.E.；Bouchon D.；Rigaud T.；Duncanson P.；Sharpe R.G.；DunnA.M.，Ultrastructural characterisation and molecular taxonomicidentification of Nosema granulosis n.sp.，a transovarially transmittedfeminising(TTF)microsporidium，Journal of Eukaryotic Microbiology，1999，46(5)492-499)和曹廣力等(曹廣力，張志芳，貢成良，吳祥甫.家蠶微粒子孢子DNA的制備方法.蠶業科學，1995，21(4)260)的方法進行1)取108個/mL孢子液100μL與400μL細胞裂解液(0.1mol/LNa2CO3，0.15mol/L NaCl，0.1mol/L SDS，0.1mol/L EDTA，0.1mol/LDTT，過濾滅菌)于無菌的1.5ml離心管中，在勻漿器上混勻，每隔30分鐘，在振蕩器上振蕩離心管一次；然后離心去上清，沉淀用100μL ddH2O重懸，2)加5μL蛋白酶K，然后在37℃水浴鍋里孵育12小時，每隔30分鐘，在振蕩器上振蕩離心管一次；3)加入等體積的飽和酚溶液，混勻，離心，提取上層水相溶液移入新的無菌的1.5ml離心管中；4)加入等體積的飽和酚∶氯仿(1∶1)，混勻，離心，提取上層水相溶液移入新的無菌的1.5ml離心管中；重復此步驟2次，直至組織的蛋白質被完全分離去掉；5)加入等體積的氯仿，混勻，離心，提取上層水相溶液移入新的無菌的1.5ml離心管中；6)加入1/10體積的3mol/LNaCl或乙酸鈉溶液，混勻后加入2.5倍體積的冷無水乙醇，在冰盒內置放120分鐘，4℃ 13200rpm離心60分鐘，小心棄去上清液，得到DNA沉淀。
最后樣品的DNA沉淀溶于50μL去離子無菌水(或TE pH8.0)中，4℃冰箱保存過夜，即可作為PCR模板DNA；如要保證較長時間使用DNA的質量，則必須置-20℃冰箱保存。
3.CTAB裂解法提取微孢子蟲DNA的過程1)取取108個/mL孢子液100μL于無菌的1.5ml離心管中；6000rpm離心5分鐘，棄上清；2)孢子沉淀用2％ CTAB抽提緩沖液(2％ CTAB，20mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1.4mmol/L NaCl，2％β-巰基乙醇)400μL重懸，用玻璃棒研磨3分鐘；加蛋白酶K(20mg/ml)約20μL，然后在振蕩器上振蕩30秒，55℃保溫4小時，間或在振蕩器上振蕩30秒。
3)酶消化后的抽提液不經離心，待其冷卻至室溫后，直接加300μL氯仿，在振蕩器上振蕩混勻，13200rpm離心10分鐘。
4)將上清液吸到新的無菌1.5ml離心管中(注意不要吸到氯仿層！)，加300μL室溫保存的100％異丙醇溶液，在振蕩器上振蕩混勻，置于4℃冰箱里保持1小時以上，然后13200rpm離心5分鐘；小心棄去上清液。
6)DNA沉淀再用75％乙醇300μL洗離2次。(注意小心棄去上清液，不要敲動DNA沉淀)。然后將離心管倒置于干凈的紙巾上，讓其自然涼干(約15min)或者37℃烘干(約10min)。
最后每樣品的DNA沉淀溶于50μL去離子無菌水(或TE pH8.0)中，4℃冰箱保存過夜，即可作為PCR模板DNA；如要保證較長時間使用DNA的質量，則必須置-20℃冰箱保存。
由以上兩種方法可以看出，常規法和CTAB法提取DNA的步驟都較復雜，花費的時間比較長，一般都需要一天以上才能得到目的DNA。特別是在常規法中，應用了苯酚，這是一種劇毒性和高度腐蝕性的化學物質，吸入、攝入、皮膚吸收可造成傷害；以上兩種方法均用到氯仿，這是一種致癌劑，有肝、腎毒性，有揮發性，需要在通風柜內操作；此外蛋白酶K有刺激性，β-巰基乙醇、SDS、DTT甚至是乙酸鈉等接觸皮膚都可能造成傷害，使用時必須小心，都要求在通風柜內操作。而煮沸法則操作非常簡單，并減少了接觸以上各種化學物質的機會和時間，且在短時間內(約10分鐘左右)完成模板DNA的制備。
分別以上述三中方法提取的DNA為膜板，通過PCR方法進行微孢子蟲的分子診斷。
選用微孢子蟲SSU-rRNA基因序列高度保守區的V1F/530R引物作為PCR診斷微孢子蟲的通用引物，反應擴增的目的片段約為400bp引物V1F/530R的堿基序列為VIF5’-CAC CAG GTT GAT TCT GCC TGA C-3’530R5’-CCG CGG CTG CTG GCA C-3’25μl PCR反應體系為5×Green GoTaqTM PCR反應液(Promega，UK)5μL，1μL 10mM dNTPs(PCR grade，Cat.#10297-018，Invitrogen，UK)混合液(即各2μL的dNTPs加92μLddH2O混合均勻)，5U/μL GoTaqTM DNA聚合酶0.125μL，以及終濃度為1.5mM MgCl2，ddH2O 15.875μL，10pmol引物V1f(正向引物)和530r(反向引物)各1μL，1μL模板DNA(約10.0ng/μl)。
PCR反應條件，即95℃變性8分鐘后，35次循環為95℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘。最后72℃延伸10分鐘。
取PCR反應產物6μL加3μL 0.5％溴酚藍混合，點樣于1.5％瓊脂糖凝膠(225mg瓊脂糖熔于15mL TAE緩沖液)的凝膠孔中(含溴化乙錠EtBr染色劑)電泳，100V電泳30min，紫外凝膠成像儀下觀察并記錄結果(圖1)。
結果表明使用本發明方法提取的DNA，與其他兩種提取方法相比，不但操作簡單，而且DNA質量同樣能滿足PCR方法對微孢子蟲的分子鑒定的需要。
權利要求
1.一種快速提取微孢子蟲DNA的方法，包括使用堿性含鉀離子的裂解液，其特征在于通過煮沸法提取微孢子蟲的DNA。
2.如權利要求1所述的方法，其中所說的裂解液配方如下Tris-HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)1mmol/LKCl100mmol/LTritonx-1000.1％。
3.如權利要求1所述的方法，其中所說的裂解液使用前可以在110-126℃溫箱內孵育15-20分鐘。
4.如權利要求1所述的方法，其中所說煮沸法采用的沸水浴時間為5-15分鐘。
5.如權利要求1-4之任一所述的方法，其特征在于所述的微孢子蟲可選自蜜蜂微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)、感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾組織或者小菜蛾微孢子蟲之任一材料。
全文摘要
本發明涉及一種提取微孢子蟲DNA的方法，屬于微孢子蟲分子診斷、鑒定技術領域。使用堿性含鉀離子的緩沖裂解液，通過煮沸法提取微孢子蟲的DNA。本發明方法操作簡單，快速，適用的微孢子蟲范圍廣，且能夠制備足量的核酸。
文檔編號C07H21/04GK1810818SQ20061001137
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月24日 優先權日2006年2月24日
發明者劉吉平, 曾玲, 曹陽 申請人:華南農業大學