專利名稱：對化學合成多肽進行折疊的方法
技術領域：
本發明涉及一種對化學合成多肽進行折疊的方法。另外，本發明還涉及一種生產生物活性蛋白質的方法。
背景技術：
自從成功地對全活性HIV-蛋白酶進行了化學合成后，近幾十年，對合成蛋白質的需求在逐步增加，所述HIV-蛋白酶是通過高度優化的固相肽合成(SPPS)的方法制備的一種由99個殘基組成的酶，該方法以標準的Boc/Bzl方法為基礎。
1994年對晶狀遍在蛋白質的合成進一步表明高純度蛋白質可通過基于Fomc/t-Bu方案的SPPS方法來合成，該方法在操作上比Boc/Bzl方法簡單而且在化學方面沒Boc/Bzl方法復雜，其中所述晶狀遍在蛋白質是一種由76個殘基組成的小分子蛋白質。
到2000年為止，大量的實驗證據表明借助肽合成儀通過化學合成可快速、可靠和經濟地生產含有60至100個氨基酸殘基的單結構域蛋白質，生產量足以進行結構和功能的研究。
通過化學合成制備的含二硫鍵的蛋白質一旦進行了折疊，就具有與天然和基因工程形式的蛋白質相同的特性。蛋白質的二硫鍵可形成單個或多個鏈內和/或鏈間的環狀結構，該環狀結構給予分子大量的構象限制，因此對穩定生物活性構象起著決定性的作用。
結構已知的單結構域折疊蛋白可通過半胱氨酸殘基的區域選擇性配對來制備。已經對適合于常用保護方案的多種組合形式的半胱氨酸保護基團進行了研究從而使得半胱氨酸殘基以分步和成對的方式進行完全選擇性的去保護和/或共氧化。
然而，最近對一種胰島素樣肽，即人松弛素進行的合成表明在含有多個半胱氨酸殘基的蛋白質中進行的半胱氨酸殘基的區域選擇性配對所涉及的化學過程是多么的復雜。利用SPPS方法、Fmoc/t-Bu方法和對-烷氧基苯甲醇基的樹脂來合成A鏈前體，同時利用PAM樹脂(與聚苯乙烯基的樹脂連接的4-羧基酰氨基甲基芐基酯)按照Boc/Bzl方法來合成B鏈前體。將A鏈前體的四個半胱氨酸殘基中的兩個半胱氨酸殘基以S-Trt(S-三苯基甲基)衍生物的形式保護起來，同時將另外兩個半胱氨酸殘基分別以S-Acm(S-乙酰氨基甲基)和S-Meb(S-對-甲基芐基)的形式保護起來。B鏈前體中的兩個半胱氨酸被S-Acm和S-Meb保護基團保護起來。首先通過在AcOH中進行碘氧化來形成A鏈的分子內的S-S鍵。然后，通過以下兩個步驟來形成兩個連接A和B鏈的分子間二硫鍵在第一個步驟中，通過對A鏈前體中的S-Meb保護基團進行HF去保護而獲得的游離巰基與B鏈中的被活化的Cys(Npys)(S-3-硝基-2-吡啶亞磺酰基)殘基進行反應(目的在于形成分子間的異源二硫鍵)，以及在第二個步驟中，通過與碘發生共氧化反應來去除S-Acm基團從而獲得其余的S-S鍵。
SPPS方法為化學合成制備各種含有用相同保護基團保護的半胱氨酸殘基的多肽提供了可能性。一旦利用多種氧化試劑去除了保護基團，就能直接形成二硫鍵。通過對溶劑、pH和反應時間進行精心調控從而將對氧化反應敏感的Tyr、Met和Trp發生改變的程度降到最低以及避免半胱氨酸的巰基被過氧化成相應的磺酸，在這種條件下利用碘、N-碘代琥珀酰亞胺和碘化氰進行處理，結果含有被S-Trt或S-Acm保護的半胱氨酸的多肽和/或蛋白質都能進行有效的折疊。
有時三氟乙酸鉈(III)可替代上述氧化劑從而得到較高產率的二硫鍵。該試劑的主要缺陷在于它的毒性、從靶多肽中去除鉈的難度以及需要對Met和Trp殘基進行保護以避免被氧化。
含有亞砜/甲硅烷基化合物與三氟乙酸的混合物的氧化試劑已被成功地用來將含有S-Acm、S-But、S-Met和S-Mob(S-對-甲氧基芐基)半胱氨酸殘基的多肽前體直接氧化形成二硫鍵。然而，為了避免在氧化條件下的氯化作用需要利用甲酰基對Trp的吲哚環進行保護，這一點嚴重制約了該混合物的應用。
對合成的線性多巰基前體(多肽的還原形式)進行氧化折疊的方法比較普遍而且使用的頻率最高。通過該最簡單的方法，可在有空氣或一些其它溫和氧化劑存在的條件下自然形成合適的二硫鍵。而且，在有被還原形式的(RSH)和被氧化形式的(R-S-S-R)低分子量的巰基化合物同時存在的條件下完成折疊和半胱氨酸的配對。
對于由單結構域組成的合成多肽和小分子蛋白質來說，由于H-鍵合、離子配對和疏水性作用的聯合效應而造成折疊所需的熱力學推動力顯然足以在隨機變性氧化反應過程中自然產生天然的異構體。
通過對含有多個半胱氨酸的小分子蛋白質如酶、抑制劑、毒素或激素進行氧化折疊研究，獲得了有關特定結構基元如被半胱氨酸穩定的β-轉角、被半胱氨酸穩定的聚(Pro)-II螺旋折疊和被半胱氨酸穩定的α-β-結構折疊的有用信息，其中所述特定結構基元的穩定作用是形成正確二硫鍵的主要推動力，即使在較小的肽分子中也如此。如果注意選擇對二級結構基元起穩定作用的緩沖液、溫度和添加劑，那么即使在體外也能對部分折疊的或不規則的(錯折疊的)蛋白質進行完全正確的折疊。
為了將分子內半胱氨酸的錯誤配對減到最少以及盡可能地避免分子間二硫鍵的隨機形成，已經設計了多種適用于多巰基多肽種類的折疊方案，所述分子內半胱氨酸的錯誤配對導致錯折疊的非天然異構體的產生，所述分子間二硫鍵的隨機形成促使發生聚集和沉淀。
因此，一般是在中性或弱堿性條件下對高稀釋度(1mg/ml或低于1mg/ml)的多巰基形式的前體進行空氣氧化。在反應過程中通常需要持續很長時間而且還產生一種無害的副產物，即水。然而，由于痕量金屬離子對空氣氧化速率影響很大，所以很難對空氣氧化進行控制。更重要的是，折疊過程中在或接近它們的堿性或中性等電點時，堿性和疏水性前體分子容易發生聚集作用并從溶液中沉淀出來。而且，由于Met發生氧化而產生的副產物在折疊過程中蓄積。盡管將折疊多巰基前體所需的化學操作步驟減至最少，但是在許多情況下由空氣的分子氧促進的二硫鍵的形成產率非常低，有時根本就不能形成二硫鍵。
DMSO和鐵氰化鉀也已被用作氧化劑。然而，鐵氰化鉀必須在暗處使用并且，如果多肽鏈中含有Met和Trp，那么在折疊過程中積累氧化副產物。由于在酸性條件下能有效進行氧化折疊同時在反應中不生成有害的產物，所以使用DMSO通常能夠獲得較好的結果。由于進行氧化的堿性和疏水性多肽前體在酸性緩沖液中具有較高的溶解特性，所以該方法特別適用于堿性和疏水性多肽前體的折疊。然而，常常有這樣的報道，即從終產物中去除DMSO存在著難度以及對二硫鍵形成的選擇性很低。而且，即使對實驗條件進行精心的調控，也總是不能避免形成無規則二硫鍵，該無規則二硫鍵導致錯折疊的異構體的產生和低聚反應的發生。
通過利用氧化還原緩沖液如被氧化的(GSSG)和被還原的(GSH)谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸(Cys/Cys)大都能夠以較高的產率獲得小分子蛋白質的多巰基前體中的半胱氨酸的正確配對和折疊。
因此，在由GSSG/GSH或Cys/Cys誘導的核糖核酸酶A(R.R.Hantgan等，生物化學(Biochemistry)13，613，1974)，水蛭素的49個氨基酸核心結構域(B.Chatrenet和J.Y.Chang，生物化學雜志(J.Biol.Chem).267，3038，1992)和牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)(T.E.Creighton，酶學方法(Methods Enzymol).131，83，1986)的氧化折疊過程中，形成游離巰基和二硫基并且在整個折疊過程中不斷地進行改構。由于通過硫醇鹽中間體進行的巰基/二硫基交換反應可促進非天然二硫鍵向天然二硫鍵的改組，所以總的速率和產率通常高于在空氣中進行氧化折疊的速率和產率。對于在空氣中進行氧化折疊的情況，為了避免聚集和低聚物和聚合物的形成以及最大限度地提高靶蛋白的產率，高稀釋度的多巰基前體是必需的。
在水蛭素1-49進行體外折疊的第一階段中，未折疊的還原形式(多巰基)循序而且不可逆地進行折疊，形成含有一個和兩個二硫鍵的平衡異構體并且還形成含有三個二硫鍵的平衡異構體(無規則異構體)(J.Y.Chang，生物化學雜志(Biochem.J).300，643，1994)。已經鑒定出包括天然種類在內的幾乎全部75個可能的蛋白質種類15個具有一個S-S鍵的異構體、45個具有兩個S-S鍵的異構體和15個具有三個S-S鍵的異構體。在折疊的第二個階段中，無規則種類通過改組非天然二硫鍵進行改構而獲得天然蛋白質種類。主要通過利用被氧化的谷胱甘肽或胱氨酸來加快二硫鍵的形成，而二硫鍵的改組需要一種巰基催化劑如被還原的谷胱甘肽或半胱氨酸或巰基乙醇。
巰基試劑促進改組的有效性顯然與它們的氧化還原電勢有關并且每種催化劑都具有一個最佳濃度。在無規則水蛭素積累的過程中，胱氨酸/半胱氨酸的效力約比GSSG/GSH高10倍。這一差異已經通過GSSG/GSH(-0.24V)與Cys-Cys/Cys(-0.22V)系統之間的相對氧化還原電勢而得到解釋。通過選擇一組最適條件(溫度、緩沖液、鹽和氧化還原混合物)，將水蛭素1-49的折疊過程加快到15分鐘內就能完成的程度。
一般來說，含有數個二硫鍵的合成蛋白質的天然構象在最適于多巰基形式進行折疊的條件下應該自然形成。然而，在許多情況下，即使在最適條件下由上述氧化還原緩沖液介導氧化折疊，也產生大量的副產物和錯配形式。這種情況尤其涉及那些僅在特定膜表面或在特定陪伴分子的協助下易于形成天然構象的蛋白質(S.Sakakibara生物聚合物，肽科學(Biopolymers，Peptide Science)51，279，1999)。
而且，盡管已經廣泛使用，但是正如合成趨化因子和趨化因子類似物的折疊實驗所表明的，由空氣或GSSG/GSH和胱氨酸/半胱氨酸氧化還原對促進的多巰基前體的氧化折疊反應大都進行過反復試驗。事實上，盡管天然趨化因子及其多種類似物容易折疊，所產生的折疊結構由兩個或三個二硫鍵來穩定，在與相應的天然分子產生部分折疊形式的條件相同的條件下有幾種類似物還是不能完全折疊。這些觀察資料有力地表明多巰基前體的一級結構的改變可能會對在待折疊多肽鏈中局部進行正確折疊(β-轉角、聚脯氨酸螺旋基元等)產生不利的影響。因此，許多巰基前體的折疊傾向主要在于多肽鏈的內在特性而不在于作用于該分子的特定氧化系統的功能。
通過向低離子強度的緩沖液中添加醇類、乙腈和DMSO來增強二硫鍵的選擇性配對也已經得到報道。該方案包括將介質中的靜電因子調節成有利于帶相反電荷氨基酸的并置，該氨基酸鄰接被選半胱氨酸殘基，從而增進特定二硫鍵的形成。
酶如肽基二硫鍵異構酶(PDI)和脯氨酰基異構酶(PPI)也已被用作催化和調節二硫鍵轉化的添加物。如果將PDI加到重折疊緩沖液中，那么體外折疊水蛭素所需要的時間就能被縮短到10小時至30秒鐘。在這種情況下，體外折疊效率與體內折疊效率的差別不大。
當半胱氨酸殘基被對酸不穩定的基團如Trt所保護時，通過對多肽-樹脂進行酸解裂解來直接得到多巰基多肽前體。或者優選地，首先通過對多肽-樹脂進行酸解裂解將其中全部半胱氨酸都被耐酸基團如乙酰氨基甲基基團(Acm)所保護的多肽以S-半胱氨酸衍生物的形式分離出來，然后在乙酸中采用Hg(AcO)2進行處理來去掉Acm基團，接著在有大大過量巰基乙醇存在的條件下通過凝膠過濾來去除Hg離子。
然而，在兩種情況下，已經有關于半胱氨酸和色氨酸殘基發生數種副反應的報道。色氨酸中的吲哚環可以通過巰基乙醇進行衍生化并且半胱氨酸會產生多種副反應，最重要的是在通過酸解使多肽鏈脫離樹脂的過程中利用叔丁基陽離子進行的氧化反應和烷基化反應。
因此，由于現有方法中存在著不足，所以需要更有效和更簡單的折疊化學合成多肽和通過化學合成制備生物活性蛋白質的方法。
發明內容
因此本發明的目的在于提供一種簡單有效和快速折疊多肽和/或蛋白質的方法，其中特別是含有錯配二硫鍵的異構體的生成被減到最少，而且可以省去使用昂貴的二硫鍵-改組試劑如谷胱甘肽或酶，并且該方法具有可重復性、穩定性和規模性。這些以及其它目的對于本技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
本發明通過提供一種折疊化學合成多肽的方法來實現該目的，所述方法包括在一種預先設定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理含有兩個或多個衍生半胱氨酸殘基的多肽。
還提供一種制備生物活性蛋白質的方法，該方法包括(a)化學合成一種含有兩個或多個衍生半胱氨酸殘基的多肽；(b)在一種預先設定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理所述多肽；和(c)純化所獲得的折疊蛋白質。
優選地，所述衍生半胱氨酸殘基相當于一種S-丁基-硫代-半胱氨酸(S-t-Bu)殘基。因此，根據本發明，出乎意料地發現S-t-Bu-衍生半胱氨酸可以被去保護，即去掉S-t-Bu部分，當在一種溫度和pH合適的適當折疊緩沖液中進行溫育時與其它半胱氨酸形成二硫鍵。
根據本發明，所述還原劑優選地是游離半胱氨酸。可以將過量的半胱氨酸加到所述緩沖液中(如實施例1-5所示)或者可以從多肽中衍生得到半胱氨酸(如實施例6所示)。
在本發明方法的一個優選的實施方案中，所述折疊緩沖液含有一種或多種離液序列高的鹽，從而使得所述肽處于能夠發生自然折疊的平衡狀態。這一點例如可以通過將所述多肽和/或蛋白質置于完全變性的條件下來實現，例如通過利用高濃度的離液序列高的鹽，然后將離液序列高的鹽稀釋到適于進行折疊的較低濃度來實現。所述離液序列高的鹽優選地選自鹽酸胍和尿素，在折疊過程中，優選地以0.1-1M的濃度存在。
優選地，折疊緩沖液的溫度介于25℃和40℃之間，更優選地在27℃和38℃之間，以便當相當于自然體溫時，使肽降解的變化程度減弱。最優選地是在折疊過程中所述溫度約為37℃。
根據本發明方法的另一個優選的實施方案，所述折疊緩沖液具有弱堿性pH。優選地，所述pH介于7和9之間，更優選地是，介于7和8.5之間以便促進折疊過程。從以上可以清楚地看到，蛋白質的折疊取決于一組復雜的相互作用。例如在酸性pH下不與半胱氨酸發生反應，而且較高的pH值會增加多肽發生降解的風險。
折疊后，靶蛋白可以通過本技術領域中的已知方法進行純化，所述方法包括陰離子和陽離子交換色譜、疏水相互作用色譜、反相色譜、親和色譜、親水相互作用/陽離子交換色譜(HILIC/CEC)、頂替色譜(DC)和樣品頂替色譜(SDM)。最優選地是利用洗脫法的(反相)高效色譜以及頂替色譜。
在生產生物活性蛋白質方法的一個優選的實施方案中，所述方法包括以下步驟(a)通過分步鏈延伸的方法將S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽裝配到一種不溶性聚合載體上；(b)通過酸解將所述S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽鏈從所述載體上裂解下來；(c)純化所獲得的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽；(d)在含有離液序列高的鹽，優選地是鹽酸胍，堿性pH和約37℃的折疊緩沖液中利用摩爾過量的半胱氨酸處理所述多肽從而使被純化的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽進行折疊；和(e)利用反相高效液相色譜來純化所獲得的折疊蛋白質。
在本發明方法的一個有利的實施方案中，聚合載體是一種被對酸不穩定的羥甲基苯氧基乙酸連接物所官能化的聚酰胺或聚苯乙烯基的樹脂，因為這些載體能夠適用于全自動肽合成儀，而且通常能夠合成出長多肽鏈。
如上所釋，本發明基于S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽的分步固相裝配和以下發現通過在有還原劑，優選地是半胱氨酸存在、在弱堿性pH以及約37℃的條件下對所述多肽進行折疊能夠產生大量的天然生物活性蛋白質。
令人驚奇地發現在除掉S-叔-丁基保護基團從而形成二硫鍵的過程中利用高度摩爾過量的半胱氨酸可以產生生物活性蛋白質。這一操作方法比現有技術中描述的用于折疊含半胱氨酸多肽的操作方法更簡單更有效，其中所述含半胱氨酸多肽是通過化學合成得到的。因此S-叔-丁基的去除是在與多肽折疊相同的步驟中完成的。
或者，還可以通過聯合使用S-叔-丁基-硫代半胱氨酸和被適當對酸不穩定的基團保護的半胱氨酸來獲得相同的折疊物質，所述對酸不穩定的基團是對多肽鏈上的選定位點進行保護的從而不需要向折疊緩沖液中另外加入還原劑就能形成適當的二硫鍵。在這種情況下，當在酸性pH下將肽從樹脂上裂解下來的同時除掉對酸不穩定的基團。因此產生了游離的半胱氨酸，該游離的半胱氨酸又被作為能夠除掉S-叔-丁基和形成二硫鍵的分子內“還原劑”(如實施例6所示)。
本發明的本質在于-將S-硫代-叔-丁基化多肽鏈快速裝配到聚合載體上；-在弱堿性條件下半胱氨酸催化所述衍生物進行巰基-二硫鍵的交換反應，結果產生半胱氨酰化的多肽，該多肽是典型的氧化還原胱氨酸/半胱氨酸對的氧化的大分子形式(蛋白質-S-S-半胱氨酸；多肽-S-S半胱氨酸)；-在整個折疊過程中，氧化的大分子形式的濃度始終被保持在很低的水平以便將分子間的二硫鍵交換反應降低到最低程度；和由于優先和迅速地形成具有正確的半胱氨酸配對的形式(天然結構)而不發生錯折疊的中間體的聚集。
按照本發明的用于折疊多肽的方法，例如，第一步，在室溫下將10mg的S-叔-丁基衍生物溶解在1ml的緩沖液中，將得到的溶液在室溫下保留約20分鐘，所述緩沖液的pH為8.0并且含有6M的鹽酸胍、10mM Tris和0.1M的Na2HPO4。第二步，先用水將所述溶液稀釋10倍以便達到pH7.2，(0.6M鹽酸胍，1.0mM Tris，10mMNa2HPO4以及多肽衍生物的最終濃度為1mg/ml)，然后在攪拌條件下加入強烈摩爾過量的半胱氨酸(高出多肽或蛋白質衍生物的濃度約100倍)。為了使所述多肽發生折疊，逐漸將溫度升高到37℃并且維持約24小時恒定不變。
本發明的折疊方法能夠產生高度均質的產物而且只需要進行很小改動就能適用于由固相化學合成法生產的任何多肽如半胱氨酸硫代-叔丁基衍生物。另外，與現有技術的方法相比，本發明采用多巰基前體形式的方法還具有許多其它的優勢，諸如-鏈上的半胱氨酸殘基在酸解裂解多肽-樹脂的過程中不被烷基化；-不發生半胱氨酸轉化為磺酸的過氧化反應，也不發生導致分子間二硫鍵形成的氧化反應；-避免了Trp的吲哚環被巰基乙醇衍生化的危險性，所述巰基乙醇是去除污染物Hg離子所必需的，該污染物Hg離子是利用Hg(AcO)2進行Acm去保護時產生的。實際上，在本發明的折疊混合物中的半胱氨酸硫醇鹽一點也不改變Trp；-對氧化敏感的Met，Trp和Tyr殘基在折疊過程中不發生改變；-最終折疊產物的生產成本一般比利用多巰基多肽和氧化還原緩沖液的生產成本低。
本技術領域的技術人員很清楚，盡管靶蛋白通常是利用本發明的方法以高產率制備的，但在某些情況下，例如對于具有多個二硫鍵的復雜蛋白質來說，未完全轉化為天然結構的特定種類的中間體形式(錯折疊種類)以平衡狀態保留在溶液中。利用RP-HPLC可將錯折疊種類從正確折疊種類中方便地分離出來并且在本發明的所述條件下再次進行折疊以便增加所述方法的總產率。
根據本發明，術語多肽是指通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸聚合物。術語蛋白質是指具有三維結構的多肽種類，如存在于活生物體的細胞和生物流體中的蛋白質。蛋白質例如可由單個折疊的多肽鏈組成或可以是由多個折疊的多肽鏈組成的復雜結構。
提供下列實施例和附圖旨在對本發明進行說明而非限制，本發明被限制在權利要求的保護范圍內。
圖1表示去除S-叔-丁基以及折疊hu-I-309之前的HPLC曲線圖(實施例4)。
圖2表示圖1產物的質量測定結果。
圖3表示被去保護的折疊hu-I-309的HPLC曲線圖(實施例4)，表明保留時間較短。
圖4表示圖3產物的質量測定結果。
圖5表示利用NEM處理后，圖3所示產物的質量測定結果。與圖4相比，觀察不到質量的變化，表明不存在游離的-SH基團。
圖6是重組I-309的生物活性與本發明合成的折疊I-309的生物活性進行比較的曲線圖。生物學活性通過125I標記的趨化因子與人淋巴細胞之間的結合來評定。
圖7表示實施例5的蛋白質折疊以后的分析型HPLC曲線圖。
圖8表示折疊的實施例5的蛋白質的制備型HPLC曲線圖。
圖9表示實施例5的純化產物的質量測定結果，表明具有預期的分子量。
圖10表示實施例6的多肽在去除S-叔-丁基和折疊之前的HPLC曲線圖。
圖11表示圖10所示多肽的質量測定結果(M＝H)。
圖12表示實施例6的蛋白質在折疊之后的HPLC曲線圖，表明具有較短的保留時間。
圖13表示圖12所示蛋白質的質量測定結果(M＝H)，表明具有預期的分子量。
實施例實施例1Cys10，11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC(胸腺和活化調節的趨化因子)的合成和折疊利用Fmoc/t-Bu化學方法和聚苯乙烯基的樹脂將具有71個氨基酸殘基的趨化因子衍生物裝配到433A肽合成儀(Perkin Elmer/ABI)上，其中所述樹脂被對酸不穩定的羥甲基苯氧基乙酸連接物所官能化(Wang樹脂)，Fmoc-Ser(t-Bu)通過由DMAP(4-二甲基氨基吡啶)催化的酯化反應被連接到所述的樹脂上。取代度是0.57mmole/g。所述合成反應是以0.27mmole的規模通過利用五倍過量的Fmoc-氨基酸和DCI(N，N′-二異丙基碳化二亞胺)/HOBt(1-羥苯并三唑)活化試劑在DMF中進行的。在利用分光光度法對Fmoc去保護進行監測的條件下，偶聯反應的時間大約為60分鐘。
用S-叔-丁基基團對四個半胱氨酸巰基進行保護并且將最大保護方案用于所有其它側鏈Ser(t-Bu)，Thr(t-Bu)，Tyr(t-Bu)，Asp(O-t-bu)，Glu(O-t-Bu)，Lys(Boc)，Trp(Boc)，Asn(Trt)，Gln(Trt)和Arg(Pmc)。每次偶聯后，在DMF中利用乙酸酐和DIEA進行加帽反應。
在室溫下利用新制備的TFA/水/TIS(三異丙基硅烷)/苯酚(78∶5∶12∶5，v/v/v/w，10ml/g樹脂)混合物將產生的多肽-樹脂處理2.5-3.0小時。通過將裂解混合物直接過濾到冷卻甲基-叔-丁基醚(MTBE)中來將所述的裂解多肽衍生物沉淀出來，并通過離心分離出沉淀，用乙醚沖洗兩遍并在空氣中進行干燥。
然后將粗產物溶解在被稀釋的乙酸中，凍干，再溶解在50％的乙酸中，然后被加載到以50％乙酸作為流動相的Sephadex G-50色譜柱(70×25cm)上。利用MALDI-TOF質譜測定法對收集的級分進行分析并將含有所需多肽衍生物的那些級分(MW 8，436.9Da)合并起來，用水稀釋后進行凍干。
將被合并的級分再次溶解到50％的乙酸中并加載到250×10mm的半制備型Vydac C4色譜柱上進一步進行純化。在60分鐘內利用線性梯度為20-80％的B以3ml/分鐘的流速對樣品進行洗脫，其中B是0.1％的TFA乙腈溶液而A是0.1％的TFA水溶液。在280nm下進行檢測，只合并含有靶多肽的級分并在折疊之前進行凍干。
通過RP-HPLC純化的趨化因子衍生物的折疊反應按照以下步驟進行首先在pH＝8.0和室溫下將10mg的產物溶解在1mg的6MGnHCl、0.1M Na2HPO4和10mM Tris中。20分鐘后，通過加入10ml的水將溶液稀釋到最終濃度為0.6M GnHCl、10mM Na2HPO4、1mM Tris，pH＝7.2以及肽濃度為1mg/ml。通過以約20mM(相對肽濃度約100倍的摩爾過量)的濃度加入半胱氨酸來啟動折疊反應并將溫度逐步升高到37℃。
通過利用Waters 2690分離組件對25微升的溶液等分樣品進行RP-HPLC分析來監控在37℃的恒定溫度下于空氣當中進行的折疊反應，其中利用乙酸對所述等分樣品進行了酸驟冷，所述組件配備了Waters 996光電二極管陣列檢測器，所述RP-HPLC分析采用了VydacC4分析柱以及以在0.1％TFA/水中的20-60％乙腈梯度和1.0ml/分鐘的流速進行了40分鐘的洗脫。收集1微升每種HPLC峰值洗出液(對應于巰基-二硫鍵交換反應的折疊中間體)，然后與芥子酸溶解在1∶2乙腈/1％TFA的水溶液中的1微升飽和溶液進行混合，真空干燥后利用Voyager-DE分光計(Perseptive Biosystem，Framingham，MA)通過MALDI-TOF質譜測定法進行分析，所述分光計配備了氮氣激光器。24小時后形成了78％的折疊多肽。通過與N-乙基馬來酰亞胺(NEM)進行反應來進一步檢驗其分子量相當于折疊產物分子量的峰從而檢測游離巰基(對于每個SH來說是+125Da)的存在。
通過本發明的方法獲得的hu-TARC的生物學活性按照Imai方法(T.Imai等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，271，21514，1996)來測定。
評定人T細胞系，即Hut78，Hut102和Jurkat，以及新鮮的單核細胞，嗜中性白細胞和淋巴細胞響應TARC而遷移過聚碳酸酯濾紙的情況。無論是通過化學合成制備的TARC還是通過重組的TARC在單核細胞或嗜中性白細胞中都沒有引發趨化反應。在T細胞系Hut78和Hut102中，由合成的TARC以及重組的TARC誘導的遷移呈現一種典型的鐘形曲線，在100ng/ml時的誘導作用最強。
實施例2Cys10，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC和Cys11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC的合成和折疊進行Cys10，34，50(S-t-Bu)hu-TARC和Cys11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC衍生物的合成、純化和折疊所采用的條件與Cys10，11，34，50(S-t-Bu)hu-TARC(實施例1)所采用的條件相同，唯一的區別在于分別對Cys10和Cys11進行了Trt保護，該保護基團在將多肽前體從樹脂上裂解下來的同時被去除。最終的折疊趨化因子的產率分別是80％和79％。
實施例3Cys34，50(S-Bu)-hu-TARC的合成和折疊除了利用Trt對Cys10和Cys11進行了保護之外，進行Cys34，50(S-Bu)-hu-TARC衍生物的合成、純化和折疊所采用的條件與實施例1和實施例2的衍生物所采用的條件相同，所述Trt在利用TFA進行最終樹脂裂解的過程中被除去。折疊產物的產率約為75％。
實施例4Cys10，11，26，34，68(S-t-Bu)-hu-I-309的合成和折疊在與實施例1相同的條件下利用Fmoc-Lys(Boc)Wang樹脂(0.61mmol/g的取代度)0.12mmole的規模合成含有6個被(S-t-Bu)保護的半胱氨酸的hu-I-309。將產生的多肽-樹脂按照實施例1中所述的方法進行處理，然后通過將G50純化的物質加載到250×10mmVydac C18柱上來進一步進行純化(如圖1和圖2所示)。
通過將65mg的產物溶解于pH8.0的60ml的0.6M GuHCl，10mM NaHPO4和1mM Tris中并以相對所述肽是100倍摩爾過量的濃度加入半胱氨酸來對經RP-HPLC純化的趨化因子衍生物進行折疊。所述多肽溶液在37℃下保持4天。用TFA酸化后，利用250×10mmVydac C18柱通過RP-HPLC來分離所述的折疊物質(如圖3和圖4所示)。與N-乙基馬來酰亞胺(NEM)發生反應后利用質譜測定法檢驗完全的半胱氨酸配對。沒有發現分子量增大，這表明不存在游離的巰基基團(如圖5所示)。折疊的最終趨化因子的產率接近25％。合成的折疊hu-I-309具有等同于重組蛋白質的生物學活性(圖6)。
按照以下條件進行分析型色譜
色譜柱C18250×4.6mm(Vydac#238TP54)流動相A＝100％ H2O 0.1％TFAB＝100％ CH3CN 0.1％ TFA梯度B的％組成顯示在色譜圖上。
檢測器214nm實施例5間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)C-末端片段的合成和折疊在與實施例1相同的條件下合成和純化含有4個被(S-t-Bu)保護的半胱氨酸的間日瘧原蟲環子孢子蛋白(PvCS)303-372。
通過將27mg的所述肽加到2.7ml的6M GuHCl的0.1M Tris緩沖液(pH8.5)中來進行折疊。將該溶液攪拌10分鐘。然后加入以0.2M Tris緩沖液將pH緩沖在8.8的13.5ml的1mM EDTA，0.2M NaCl。最后，加入以0.2M Tris緩沖液將pH緩沖在8.8的10.8ml的35mM半胱氨酸/1mM EDTA，0.2M NaCl。將所述反應混合物升溫到37℃。然后通過反相HPLC來進行折疊反應(3-6小時)(圖7A)并且通過在4℃下冷卻5分鐘來終止反應，然后通過加入4℃的10％TFA來達到1％TFA的最終濃度(3ml的10％TFA)。接著通過反相HPLC來純化產物(圖8)并確定終產物的質量(圖9)。被氧化的最終產物的產率是70-80％。
利用下列條件進行分析型色譜色譜柱C4250×4.6mm(Vydac#214TP54)流動相A＝100％H2O 0.1％ TFAB＝100％CH3CN 0.1％ TFA梯度B的％組成顯示在色譜圖上。
檢測器214nm實施例6惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)C-末端片段的大規模合成和折疊除了下列條件以外，對僅含有4個中的2個被(S-t-Bu)保護的半胱氨酸的惡性瘧原蟲環子孢子蛋白(PfCS 282-383)的大規模合成和純化是在與實施例1相同的條件下進行的。
通過將1.1g的部分純化的肽溶解在pH8.0的1.0L的0.1MCH3COONH4中來進行折疊，不需要向折疊緩沖液中加入游離半胱氨酸。所述反應混合物在32℃下維持18小時。然后通過反相HPLC來純化所述產物(圖12和圖13)。被氧化的最終產物的產率接近37％。
利用下列條件進行分析型色譜色譜柱C18250×4.6mm(Vydac#238TP54)流動相A＝100％H2O 0.1％ TFAB＝100％CH3CN 0.1％ TFA梯度 B的％組成顯示在色譜圖上。
檢測器214nm
權利要求
1.用于折疊化學合成多肽的方法，包括在一種預先設定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理含有兩個或多個衍生半胱氨酸殘基的多肽和/或蛋白質。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述衍生半胱氨酸殘基相當于S-丁基-硫代-半胱氨酸殘基。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述還原劑是半胱氨酸。
4.如權利要求1、2或3所述的方法，其中所述折疊緩沖液含有一種或多種離液序列高的鹽。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述離液序列高的鹽選自鹽酸胍和尿素。
6.如權利要求4或5所述的方法，其中所述折疊緩沖液中的離液序列高的鹽以0.1-1M的濃度存在。
7.如權利要求1-6中任一權利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液具有堿性pH。
8.如權利要求7所述的方法，其中pH介于7和9之間。
9.如權利要求7或8所述的方法，其中pH介于7和8.5之間。
10.如權利要求1-9中任一權利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液的溫度介于25℃和40℃之間。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述溫度介于27℃和38℃之間。
12.如權利要求10或11所述的方法，其中所述溫度約為37℃。
13.用于制備生物活性蛋白質的方法，包括(a)化學合成一種含有兩個或多個衍生半胱氨酸殘基的多肽；(b)在一種預先設定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理所述多肽；和(c)純化所獲得的折疊多肽和/或蛋白質。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述衍生半胱氨酸殘基相當于S-丁基-硫代-半胱氨酸殘基。
15.如權利要求13或14所述的方法，其中所述還原劑是半胱氨酸。
16.如權利要求13、14或15所述的方法，其中所述折疊緩沖液含有一種或多種離液序列高的鹽。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述離液序列高的鹽選自鹽酸胍和尿素。
18.如權利要求15或16所述的方法，其中所述折疊緩沖液中的離液序列高的鹽以0.1-1M的濃度存在。
19.如權利要求13-18中任一權利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液具有堿性pH。
20.如權利要求19所述的方法，其中pH介于7和9之間。
21.如權利要求20所述的方法，其中pH介于7和8.5之間。
22.如權利要求13-21中任一權利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液的溫度介于25℃和40℃之間。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述溫度介于27℃和38℃之間。
24.如權利要求22或23所述的方法，其中所述溫度約為37℃。
25.如權利要求13-24中任一權利要求所述的方法，包括步驟(a)通過分步鏈延伸的方法將S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽裝配到一種不溶性聚合載體上；(b)通過酸解將所述S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽鏈從所述載體上裂解下來；(c)純化所獲得的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽；(d)在含有離液序列高的鹽和具有堿性pH以及約37℃的折疊緩沖液中利用摩爾過量的半胱氨酸處理所述多肽衍生物從而使被純化的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽處理折疊；和(e)利用反相高效液相色譜來純化所獲得的折疊蛋白質。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述離液序列高的鹽是鹽酸胍。
27.如權利要求25或26所述的方法，其中所述聚合載體是一種被對酸不穩定的羥甲基苯氧基乙酸連接物所官能化的聚酰胺或聚苯乙烯基的樹脂。
28.權利要求13的方法，其中所述還原劑是由多肽鏈內的游離半胱氨酸形成的分子內還原劑，當在酸性pH下從樹脂上切割所述多肽鏈時，所述游離半胱氨酸產生于在所述多肽鏈的選定位點用酸不穩定基團保護的半胱氨酸。
全文摘要
本發明涉及一種用于折疊化學合成多肽的方法，包括在一種預先設定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理含有兩個或多個衍生半胱氨酸殘基的多肽和/或蛋白質，其中所述衍生半胱氨酸殘基相當于S－丁基－硫代－半胱氨酸殘基而且所述還原劑是半胱氨酸。
文檔編號C07K1/04GK1830999SQ20061000475
公開日2006年9月13日 申請日期2001年11月27日 優先權日2000年11月27日
發明者A·瓦爾狄尼, G·克拉丁, M·洛戈羅 申請人:Rmf迪克塔吉恩有限公司