專利名稱：外消旋或光學活性的4－(羥甲基)－2－環戊烯衍生物的制備方法
技術領域：
本發明涉及用式I或II表示的(1S，4R)-或(1R，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環戊烯-1-甲醇或其鹽的新穎制備方法， 以及用通式XVI或XVII表示的光學活性化合物的新穎制備方法。
背景技術(1S，4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環戊烯-1-甲醇是制備2-氨基嘌呤核苷的重要中間體，例如制備(1S，4R)-4-(2-氨基-6-環丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-環戊烯-1-甲醇(WO/95/21 161)或制備1592U89(J.Org.Chem.，1996，61，4192-4193；J.Org.Chem.，1996，61，7963-7966)。
WO/95/21 161中描述了一種由(1S，4R)-4-氨基-2-環戊烯-1-甲醇制備(1S，4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環戊烯-1-甲醇的方法。該方法的缺點是前體(1S，4R)-4-氨基-2-環戊烯-1-甲醇只能通過被貴重的BOC保護基(叔丁氧羰基保護基)取代的(±)-2-氮雜-雙環[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮制得(J.Org.Chem.，1995，60，4602-4616)。
發明內容
本發明的目的是提供(1S，4R)-或(1R，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環戊烯-1-甲醇或其鹽的簡單、低成本和更經濟的制備方法。
本發明的目的已由權利要求1所述的新穎方法達到。
本新穎方法的第一步是將用式III表示的(±)-2-氮雜-雙環[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮酰化， 產生用通式IV表示的(±)-2-氮雜-雙環[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物， 式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基。
C1-4烷基可被取代或未被取代。下文中，取代的C1-4烷基是指被鹵原子取代的C1-4烷基。鹵原子可用F、Cl、Br或I。C1-4烷基的實例是甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、叔丁基、異丙基、氯甲基、溴甲基、二氯甲基、二溴甲基。用作C1-4烷基的較好是甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基或氯甲基。
可以用作C1-4烷氧基的例如是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基或異丁氧基。優選使用的C1-4烷氧基是叔丁氧基。
可以用作芳基的例如是苯基或芐基，較好是苯基。芐氧基或苯氧基例如可用作芳氧基。
前體(±)-2-氮雜-雙環[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮可按EP-A 0508352中揭示的方法制備。
酰化可用通式XI表示的羰基鹵化物(carbonyl halide) 或用通式XII表示的羧酸酐進行， 式中R1具有上述的含義，X表示鹵原子。氟、氯、溴或碘可用作鹵原子。較好使用氯或氟。
羰基鹵化物的實例是乙酰氯、氯乙酰氯、丁酰氯、異丁酰氯、苯基乙酰氯、氯甲酸芐酯(Cbz-Cl)、丙酰氯、苯甲酰氯、氯甲酸烯丙酯或叔丁氧羰基氟。羧酸酐的實例是過二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)、丁酸酐、乙酸酐或丙酸酐。
所述的酰化可在沒有溶劑或加入非質子傳遞溶劑的條件下進行。
酰化宜在非質子傳遞溶劑中進行。合適的非質子傳遞溶劑的實例是二異丙醚、吡啶、乙腈、二甲基甲酰胺、三乙胺、四氫呋喃、甲苯、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮或它們的混合物。
酰化宜在-80-50℃，較好0-25℃的溫度下進行。
在本新穎方法的第二步中，將用通式IV表示的(±)-2-氮雜-雙環[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物還原產生用通式V表示的環戊烯衍生物， 式中R1具有上述的含義。
還原宜用堿金屬硼氫化物或堿土金屬硼氫化物、堿金屬鋁氫化物或堿土金屬鋁氫化物或Vitride(二(2-甲氧基乙氧基)二氫鋁酸鈉)進行。氫化鋁鈉或氫化鋁鉀可用作堿金屬鋁氫化物。硼氫化鈉或鉀可用作堿金屬硼氫化物。硼氫化鈣可用作堿土金屬硼氫化物。氮化鋁例如可用作氮化物。
還原宜在質子傳遞溶劑中進行。可以使用的質子傳遞溶劑是低級脂肪醇，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇、異丁醇或水，或這些醇與水的混合物。
還原宜在-40-40℃，較好為0-20℃的溫度下進行。
本新穎方法的第三步用微生物、具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶或青霉素G酰基轉移酶將用通式V表示的環戊烯衍生物轉化為用式VI或VII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環戊烯， 。這種生物轉化將酰化的(1S，4R)或(1R，4S)-氨基醇衍生物轉化成(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環戊烯(通式VI、VII)。
所有能將通式V表示的環戊烯衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物都適合于該生物轉化。這些微生物可用常規的微生物學技術從土壤樣品、污泥或廢水中分離。通過用常規方法在含用通式V表示的環戊烯衍生物
式中R1具有上述的含義，·作為唯一碳源和氮源·作為唯一氮源和合適碳源或·作為唯一碳源和合適氮源的營養培養基中培養這些微生物而進行分離。
具體實施例方式
用通式V表示的合適環戊烯衍生物的實例是N-乙酰-、N-丙酰-、N-異丁酰-、N-叔丁氧羰基-(N-BOC)、N-丁酰-或N-苯基乙酰-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯。
所述的微生物例如可將銨、硝酸鹽、氨基酸或脲繁殖基質用作合適的氮源。所述的微生物例如可將糖、糖醇、C2-C4-羧酸或氨基酸繁殖基質用作合適的碳源。葡萄糖之類的己糖或戊糖可用作糖。甘油例如可用作糖醇。乙酸或丙酸例如可用作C2-C4-羧酸。亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺例如可用作氨基酸。
可以使用的選擇基和培養基是本領域中普通技術人員常用的培養基(如表1中所述的培養基)或完全培養基(含酵母提取液的培養基)(如營養酵母湯(NYB)，較好使用表1中所述的酵母湯)。
在培養和選擇過程中，方便地誘導了微生物的活性酶。用通式V表示的環戊烯衍生物可用作酶的誘導物。
培養和選擇一般在20-40℃，較好在30-38℃的溫度和在5.5-8，較好在6.8-7.8的pH值的條件下進行。
該生物轉化宜用將環戊烯衍生物的(1R，4S)異構體用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物進行。
該生物轉化較好用產堿桿菌/博代特氏桿菌屬、紅球菌屬、節細菌屬、產堿桿菌屬、土壤桿菌/根瘤菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬或戈登氏菌屬微生物進行，特別是產堿桿菌/博代特氏桿菌屬FB 188(DSM 11172)、紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)、節細菌屬HSZ5(DSM 10328)、紅球菌屬FB 387(DSM 11291)、木糖氧化產堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、惡臭假單胞菌K32或戈登氏菌屬CB 100(DSM 10687)以及它們功能等同的變異體和突變體。按布達佩斯條約，微生物DSM 10686和10687于20.05.1996保藏在德國微生物保藏和細胞培養股份公司(Mascheroderweg 1b，D38124Braunschweig)，微生物DSM 10328和10329于06.11.1995保藏于該公司，微生物DSM 11291于08.10.1996保藏于該公司，微生物DSM 11172于20.09.1996保藏于該公司。
“功能等同的變異體和突變體”是指具有與原微生物基本上相同的性質和功能的微生物。這種變異體和突變體例如可用紫外輻射偶然產生。
產堿桿菌/博代特氏桿菌屬FB 188(DSM 11172)分類說明細胞形狀 桿菌寬度，微米 0.5-0.6長度，微米 1.0-2.5能動性 +鞭毛突出 周毛的革蘭氏反應 -被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny)+芽胞 -氧化酶 +過氧化氫酶 +ADH(醇脫氫酶)-來源于NO3的NO2-反硝化作用 -脲酶 -明膠的水解 -由下列化合物產生的酸(OF試驗)葡萄糖 -果糖 -阿拉伯糖 -己二酸酯(鹽) +癸二酸酯(鹽) +檸檬酸酯(鹽) +蘋果酸酯(鹽) +甘露糖醇 -紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)的分類說明1.菌落的形態和顏色短分支菌絲，老化時，它分裂成桿菌(rods)和球菌，菌落閃光和部分融合，帶淡粉紅色的原色，RAL 1001；2.從肽聚糖中檢出的氨基酸內消旋-二氨基庚二酸；3.霉菌酸紅球菌屬霉菌酸；測定霉菌酸的鏈長(C32-C44)和將該數據與DSM霉菌酸數據庫中的數據登記項比較，發現與紅串紅球菌菌株圖譜(pattern)有很大的相似性(相似性0.588)。
4.脂肪酸圖譜直鏈、飽和和不飽和脂肪酸和結核硬脂酸。
5.菌株的16S rDNA部分測序時，發現與紅串紅球菌特定區域的序列高度一致(100％)。
這種鑒定結果是明確的，因為三種相互獨立的方法(霉菌酸、脂肪酸、16SrDNA)已確定該菌株是紅串紅球菌。
戈登氏菌屬sp.CB 100(DSM 10687)的分類說明1.菌落的形態和顏色短分支菌絲，老化時，它分裂成桿菌和球菌，菌落為淡橙黃色，(RAL 2008)；2.從肽聚糖中檢出的氨基酸內消旋-二氨基庚二酸；3.甲基萘醌類圖譜MK-9(H2)100％；4.霉菌酸戈登氏菌屬霉菌酸；用高溫氣相色譜測定霉菌酸的鏈長(C50-C60)。該圖譜相當于在戈登氏菌屬樣本中發現的圖譜。
5.脂肪酸圖譜直鏈、飽和和不飽和脂肪酸和結核硬脂酸。
6.菌株的16S rDNA部分測序時，僅發現與深紅戈登氏菌特定區域的序列較低的一致性(98.8％)。
根據這些可得的結果(甲基萘醌類圖譜、霉菌酸、脂肪酸、16S rDNA)，雖然可明確地將此分離物確定為戈登氏菌屬，但不能根據這些結果確定它是已知的戈登氏菌屬。因此，將菌株DSM10687假定為新的，未曾描述過的戈登氏菌屬物種。
木糖氧化產堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)的分類說明該菌株的性質細胞形狀桿菌寬度，微米 0.5-0.6長度，微米 1.5-3.0能動性 +鞭毛突出 周毛的革蘭氏反應被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny) +芽胞 -氧化酶 +過氧化氫酶 +厭氧生長 -ADH(醇脫氫酶) +來源于NO3的NO2+反硝化作用 +脲酶 -明膠的水解 -Tween 80的水解 -由下列化合物產生的酸(OF試驗)葡萄糖需氧 -木糖80 -基質利用葡萄糖 -果糖 -阿拉伯糖 -檸檬酸酯(鹽) +蘋果酸酯(鹽) +甘露糖醇 -節細菌屬HSZ5(DSM 10328)的分類說明表征鑒定 具有顯著桿菌-球菌生長循環的革蘭氏陽性不規則桿菌；嚴格需氧；在葡萄糖中沒有形成酸或氣體。
能動性 -芽胞 -過氧化氫酶 +細胞壁中的內消旋-二氨基庚二酸無肽聚糖類型 A3α，L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
16S rDNA序列相似性 用滋養節桿菌，分枝節桿菌和氧化節桿菌對變異性最大的區域進行測序時發現的最大值為98.2％土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30的分類說明細胞形狀多型桿菌寬度(微米) 0.6-1.0長度(微米) 1.5-3.0革蘭氏反應 -被3％KOH溶解 +氨肽酶 +芽胞-氧化酶 +過氧化氫酶 +能動性 +厭氧生長-由硝酸鹽產生的亞硝酸鹽 -反硝化作用 -脲酶+明膠的水解 -從如下物質中產生酸L-阿拉伯糖 +半乳糖 -松三糖 -巖藻糖 +阿糖醇 -甘露糖醇-赤蘚醇 -石蕊汁的堿化+酮乳糖 -16S rDNA的部分測序揭示與土壤桿菌屬和根瘤菌屬的樣本具有較大的相似性，約為96％。明確地將其確定為這些屬內物種是不可能的。
單純桿菌K2的分類說明細胞形狀 桿菌寬度(微米) 0.8-1.0長度(微米) 3.0-5.0芽胞 -橢圓體 -圓形體 -孢子囊 -過氧化氫酶 +厭氧生長 -VP反應 n.g.
最大溫度正生長時溫度，℃ 40負生長時溫度，℃ 45在pH為5.7培養基中的生長 -NaCl 2％+5％ -7％ -10％ -溶菌酶培養基 +由下列物質產生酸(ASS)D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 -D-甘露糖醇 +D-果糖 +由果糖產生的氣體 -卵磷脂酶 -下列物質的水解淀粉 +明膠 +酪蛋白 -
Tween 80 +七葉苷-利用下列物質檸檬酸鹽 +丙酸鹽-由硝酸鹽產生的亞硝酸鹽+吲哚 -苯丙氨酸脫氨基酶 -精氨酸脫羥基酶-對細胞脂肪酸的分析確定它是芽胞桿菌屬。
16S rDNA部分測序表明與單純芽胞桿菌的相似性為100％。
惡臭假單胞菌K32的分類說明細胞形狀 桿菌寬度(微米)0.8-0.9長度(微米)1.5-4.0能動性+鞭毛突出 極性＞1革蘭氏反應-被3％KOH溶解+氨肽酶(Cerny) +芽胞 -氧化酶+過氧化氫酶+厭氧生長 -色素熒光性的 +膿青素-ADH +來源于硝酸鹽的亞硝酸鹽-反硝化-脲酶 -明膠的水解-
基質利用己二酸酯(或鹽)-檸檬酸酯(或鹽)+蘋果酸酯(或鹽)+D-扁桃酸酯(或鹽) +苯基乙酸酯(或鹽) +D-酒石酸酯(或鹽) -D-葡萄糖 +海藻糖酶 -甘露糖醇 -苯甲酰甲酸酯(或鹽)-丙二醇+丁胺 +芐胺 +色胺 -乙酰胺+馬尿酸鹽(或酯)+細胞脂肪酸的分布型是惡臭假單胞菌屬特有的。
16S rDNA的部分測序表明與門多薩假單胞菌和產堿假單胞菌的相似性約為98％。與惡臭假單胞菌的相似性為97.4％。
紅球菌屬sp.FB 387(DSM 11291)的分類說明1.菌落的形態和顏色短分支菌絲，老化時，它分裂成桿菌(rods)和球菌，菌落無光澤，淡粉橙紅色RAL 2008；2.從肽聚糖中檢出的氨基酸內消旋-二氨基庚二酸；3.霉菌酸紅球菌屬霉菌酸；測定霉菌酸的鏈長(C32-C44)和將該數據與DSMZ霉菌酸數據庫中的數據登記項比較表明與紅球菌屬紅菌株圖譜僅有很小的相似性(相似性0.019)。這個相關系數太小，不能用于物種鑒定。
4.脂肪酸圖譜直鏈、飽和和不飽和脂肪酸和結核硬脂酸。
該脂肪酸圖譜對于所有紅球菌屬樣本及其緊密相關物(如分支桿菌屬、諾卡氏菌屬和戈登氏菌屬)的判斷是有價值的。為了區分到物種水平，通過計入脂肪酸圖譜的定性和定量差別作了嘗試。用數值方法將紅球菌屬sp.FB 387的脂肪酸圖譜與數據庫中的數據登記項進行比較。由于與上述的紅球菌屬物種只有小的相似性(0.063)，用這種方法無法確認紅球菌屬sp.FB 387。
5.菌株的16S rDNA部分測序時，96-818由于相關性為97.9％而確認為混濁紅球菌。這種順序一致性遠低于分類時明確確定物種所需的99.5％。
根據所得結果，可以假定菌株紅球菌屬sp.FB 387是一種新的、未曾描述過的紅球菌屬物種。
在這些微生物的常規初始培養后，生物轉化可用休眠細胞(不再需要碳源和能源的非生長細胞)或生長細胞進行。這種生物轉化較好用休眠細胞進行。
適于這種生物轉化的具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶例如可用本領域中常用的破裂法從上述的微生物細胞中分離出來。為此例如可用超聲法或弗氏壓榨法。較好從紅串紅球菌CB101(DSM 10686)微生物中分離這些酶。
合適的青霉素G酰基轉移酶可從許多微生物中得到，如細菌和放線菌綱；具體地可從如下微生物中得到大腸桿菌ATCC 9637、巨大芽胞桿菌、淡紫鏈霉菌ATCC 13664、諾卡氏菌屬sp.ATCC 13635、雷氏普羅威登斯菌ATCC 9918、粘性節細菌屬ATCC 15294、藤黃紅球菌ATCC 12975、產裼色鏈霉菌ATCC21289、無色桿菌屬ATCC 23584和玫瑰色微球菌ATCC 416。特別地使用市售的青霉素G酰基轉移酶，如來源于大腸桿菌(Boehringer Mannheim)或巨大芽胞桿菌的青霉素G酰基轉移酶EC 3.5.1.11。
在優選的實施方式中，使用固定化的青霉素G酰基轉移酶。
所述的生物轉化可在本領域中常用的培養基中進行，如低摩爾濃度的磷酸鹽、檸檬酸鹽或Hepes緩沖液、水、營養酵母汁之類或表中所示的完全培養基。該生物轉化較好在表1所示的培養基或低摩爾濃度磷酸鹽緩沖液中進行。
該生物轉化宜在一次或連續加入環戊烯衍生物(式V)使其濃度不超過10％重量，較好不超過2％重量的條件下進行。
生物轉化時的pH可以為5-9，較好為6-8。該生物轉化時的溫度宜為20-40℃，較好為25-30℃。
在第四步中，用式VIII表示的N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺
將環戊烯衍生物(式VI或VII)轉化為用通式IX或X表示的(1S，4R)-或(1R，4S)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-環戊烯1-甲醇。
N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺可按WO95/21161中揭示的方法制備。
第四步的反應宜在堿的存在下進行。可以使用有機堿或無機堿。三烷基胺可用作有機堿。所用三烷基胺的實例是三乙胺、三丁胺、三芐胺、吡啶或N-甲基吡咯烷酮。可用無機堿的實例是堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽、或堿金屬碳酸氫鹽或堿土金屬碳酸氫鹽，如碳酸鉀和碳酸氫鈉。
第四步中的反應宜在質子傳遞溶劑中進行。低級烷基醇可用作質子傳遞溶劑，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或異丁醇。
進行第四步反應的溫度宜為0-150℃，較好為20-100℃。
在第五步中，按WO 95/21161中揭示的已知方法將(1R，4S)-或(1S，4R)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-環戊烯1-甲醇(式IX、X)環化，產生用式I或II表示的最終產物。
環化一般在濃的含水酸(aqueous acid)存在下溶解在原甲酸三烷基酯中進行。可以使用的原甲酸三烷基酯是原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯。例如鹽酸、硫酸或甲磺酸可用作含水酸。
本發明還涉及用通式XVI或XVII表示的光學活性化合物的制備方法， 式中R1具有上述的含義。這些化合物可通過用上述的微生物、N-酰氨基醇水解酶或青霉素G酰基轉移酶將用通式V表示的環戊烯衍生物
式中R1具有上述的含義，轉化成用式VI或VII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環戊烯， 后者被酰化成用式XVI或XVII表示的化合物。
微生物轉化和酰化都在與上述相同的條件下進行。
酰化時的溫度宜為20-100℃，較好為0-80℃。
用本方法制備的光學活性化合物的實例是對映體過量為98％的(1R，4S)-N-叔丁氧羰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯、對映體過量為98％的(1R，4S)-N-乙酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯、對映體過量為98％的(1R，4S)-N-丁酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯以及光學活性的(1S，4R)-N-乙酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯和光學活性的(1S，4R)-N-丁酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯。
在這些化合物中，光學活性的(1R，4S)-N-丁酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯是文獻中還未報道過的化合物。因此，本發明也涉及對映體過量大于0％，較好至少為80％、90％或95％，特別至少為98％的光學活性N-丁酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯。這些光學活性的化合物可用本領域中普通技術人員已知的方法外消旋化，產生文獻中還未報道過的外消旋-N-丁酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯。
用通式XIII表示的外消旋或光學活性的4-(羥甲基)-2-環戊烯衍生物的制備方法如下 式中R1具有上述的含義，在第一步中用通式XI表示的羰基鹵化物
式中R1和X具有上述的含義，將用通式XIV表示的環戊烯-4-羧酸外消旋體或其光學活性異構體之一 酰化形成用通式XV表示的外消旋或光學活性的環戊烯-4-羧酸衍生物， 第二步中將后者還原產生用通式XIII表示的所需產物。
光學活性的4-(羥甲基)-2-環戊烯衍生物(通式XIII)和光學活性的環戊烯-4-羧酸衍生物(通式XV)是指相應的(1R，4S)或(1S，4R)異構體。
本方法的第一步(酰化)用通式XI表示的羰基鹵化物進行。可以使用的羰基鹵化物與上述的相同。優選使用叔丁氧羰基氟。
進行第一步反應的pH宜為8-14，較好為12-14，溫度宜為0-50℃，較好為15-25℃。
合適的溶劑是水與醚的混合物。可以使用的醚是二噁烷、四氫呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚或乙二醇二乙醚。
本方法的第二步(還原)可用堿金屬鋁氫化物、硼烷/二C1-4烷基硫醚加成物或硼烷/四氫呋喃加成物進行。氫化鋁鋰、氫化鋁鈉或氫化鋁鉀可用作堿金屬鋁氫化物。優先使用氫化鋁鋰。硼烷/二甲硫、硼烷/二乙硫、硼烷/二丙硫或硼烷/二丁硫加成物可用作硼烷/二C1-4烷基硫醚。優選使用硼烷/二甲硫加成物。
第二步中，宜將上述無水醚之一用作溶劑。
第二步反應的溫度可為-50-5℃，較好-25至-10℃。
實施例實施例1(±)-2-乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮氣氛下將100克(±)-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(800毫升)和吡啶(161.26毫升)中。12℃時，滴加104.5克乙酰氯，歷時2小時。然后在室溫下將該混合物攪拌4.5小時。在此混合物中加入800毫升水，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次400毫升。合并的有機相用1N HCl(400毫升)、水(400毫升)、飽和氯化鈉(400毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，蒸發至干。將殘余物溶解在二氯甲烷中，用硅膠過濾。將濾液濃縮，蒸餾純化產物。得到107.76克透明液體產物。產率為71％。
沸點(0.07乇)51℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400HHz 2.25(AB syst.，2H)2.8(s，3H)3.42(m，1H)5.30(m，1H)6.89(m，1H)6.92(m，1H)實施例2(±)-2-丁酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮氣氛下將100.3克(±)-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(720毫升)和吡啶(142毫升)中。12℃時，滴加141.8克丁酰氯，歷時1小時。然后在室溫下將該混合物攪拌3小時。在此混合物中加入720毫升水并分相，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次300毫升。合并的有機相用1N HCl(350毫升)、飽和氯化鈉(500毫升)和水(400毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，完全蒸發。蒸餾純化產物。得到107.76克透明液體產物。產率為85％。
沸點(0.05乇)70℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400HHz 0.98(t，J＝8.5Hz，3H)1.58-1.65(2H)2.23(AB syst.，2H)2.82-2.90(23H)3.42(m，1H)5.30(m，1H)6.62(m，1H)6.90(m，1H)實施例3(±)-2-苯乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮氣氛下將33.4克(±)-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(240毫升)和吡啶(48.3毫升)中。12℃時，滴加68.6克苯乙酰氯，歷時30分鐘。然后在室溫下將該混合物攪拌3.5小時。在此混合物中加入240毫升水，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次150毫升。合并的有機相用1N HCl(150毫升)、飽和氯化鈉(150毫升)和水(150毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，完全蒸發。粗產物用硅膠過濾(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。得到78.34克黃色油粗產物。
實施例4(±)-2-丙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮氣氛下將47克(±)-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(325毫升)和吡啶(41毫升)中。12℃時，滴加43.9克丙酰氯，歷時1小時。然后在室溫下將該混合物攪拌5小時。在此混合物中加入145毫升水，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次115毫升。合并的有機相用1N HCl(140毫升)、飽和碳酸氫鈉(40毫升)和氯化鈉溶液(40毫升)洗滌，用硫酸鈉干燥，完全蒸發。蒸餾純化殘余物。得到55.8克標題產物。放置時固化。產率為81.6％。
沸點(2.8毫巴)75-80℃熔點54-56℃1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400HHz 0.95(t，3H)；2.10(quart.1H)；2.28(quart.1H)；2.64(m，2H)；3.42(s，1H)；5.16(s，1H)；6.78(m，1H)；6.96(m，1H).
實施例5(±)-2-異丁酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮氣氛下將45.1克(±)-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(310毫升)和吡啶(39毫升)中。10℃時，滴加54.1克異丁酰氯，歷時1小時。然后在室溫下將該混合物攪拌5小時。在此混合物中加入140毫升水并分相，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取四次，每次120毫升。合并的有機相用1N HCl(50毫升)、碳酸氫鈉飽和溶液(50毫升)和氯化鈉(50毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，完全蒸發。將殘余物放在已加入活性炭的正己烷(240毫升)中回流沸騰，濾去活性碳，將濾液冷卻到0℃，過濾標題化合物。得到54.5克產物。產率為76％。
熔點41-42℃1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400HHz 0.92(d，3H)1.06(d，3H)2.10(m，1H)2.28(m，1H)3.40(m，2H)5.16(s，1H)6.78(m，1H)7.92(m，1H)實施例6(±)-2-氯乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備10℃時，在氮氣氛下將10.1克(±)-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在二氯甲烷(10毫升)、吡啶(8.4毫升)和0.22克4-N，N-二甲氨基吡啶的混合物中。滴加13.5克氯乙酰氯，歷時1小時。將溫度升至44℃。然后在室溫下將該混合物再攪拌2小時。在此溶液中加入100毫升水。分相后，水相用100毫升二氯甲烷萃取。合并的有機相用硫酸鈉干燥，完全蒸發。在1克活性炭存在下將殘余物放在100毫升異丙醚中回流沸騰10分鐘。熱過濾后，將濾液冷卻至室溫，過濾出固體并加以干燥。得到10.35克標題產物。產率為60％。
熔點為86-88℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400HHz 2.28(d，1H)；2.40(d，1H)；3.48(s，1H)；4.56(d，2H)；5.30(s，1H)；6.70(d，1H)；6.94(m，1H).
實施例7(±)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的制備氮氣氛下將79.56克(±)-2-乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450毫升)中，冷卻到-10℃。分批加入19.8克硼氫化鈉，歷時45分鐘。
在0℃攪拌反應3小時，然后用濃硫酸將pH調節到1.8。在此混合物中加入乙酸乙酯(200毫升)，過濾掉固體。然后完全蒸發。將殘余物放在水中，用二氯甲烷洗滌，并蒸發。粗產物用硅膠過濾提純。得到51.83克白色固體產物。按所用的(±)-2-乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮計，產率為64％。
1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.18(m，1H)；1.78(s，3H)；2.29(m，1H)；2.66(m，1H)；3.25(s，2H)；4.58(s，1H)；4.72(m，1H)；5.61(d，1H)；5.85(d，1H)；7.83(d，1H).
實施例8(±)-1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的制備氮氣氛下將73.87克(±)-2-丁酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(400毫升)中，冷卻到-10℃。分批加入15.68克硼氫化鈉，歷時45分鐘。在0℃攪拌反應3小時，然后用濃硫酸將pH調節到1.5。在此混合物中加入乙酸乙酯(200毫升)，過濾掉固體。然后完全蒸發。將殘余物放在水中，用二氯甲烷洗滌，并在真空下蒸發干燥。得到60.55克產物。按所用的(±)-2-丁酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮計，產率為80％。熔點71-72℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400MHz 0.98(t，J＝8.5Hz，3H)；1.40-1.50(1H)；1.58-1.68(2H)；2.10-2.18(2H)；
2.42-2.55(1H)；2.85(m，1H)；3.62(AB syst.，2H)；4.98(m，1H)；5.78-5.82(2H)；6.38(m，1H).
實施例9(±)-1-苯乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的制備氮氣氛下將77克粗的(±)-2-苯乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450毫升)中，冷卻到-10℃。分批加入13.2克硼氫化鈉，歷時1小時。室溫下攪拌反應3.5小時，然后用濃硫酸將pH調節到1.8。該混合物用硅膠過濾法純化(己烷∶乙酸乙酯＝2∶8)。用乙酸乙酯重結晶后，得到15.89克白色固體。按所用的(±)-2-苯乙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮計，產率為80％。
1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400MHz 1.28-1.35(1H)；1.40(m，1H)；2.38-2.45(1H)；2.79(m，1H)；3.50(AB syst.，2H)；3.52(s，3H)；4.98(m，1H)；5.75(m，2H)；5.98(m，1H)；7.20-7.38(5H).
實施例10(±)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的制備(BOC＝叔丁氧羰基)室溫時，在氮氣氛下將15克粗的(±)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽(按J.Org.Chem.1981，46，3268中所述的方法制備)溶解在150毫升水和150毫升二噁烷的混合物中。用1N NaOH將該溶液的pH調節到14，然后加入叔丁氧羰基氟(BOC-F，20％過量)的乙醚溶液，讓該混合物在室溫下攪拌3小時(BOC-F按Synthesis 1975，599中所述的方法制備)。用濃鹽酸將pH調節到2。蒸餾掉有機溶劑后，在殘余物中加入50毫升水，用乙酸乙酯對該混合物萃取3次，每次100毫升。將合并的有機相完全蒸發。殘余物放在100毫升二異丙醚和80毫升正己烷的混合物中結晶。得到11.95克標題產物。產率為56％。熔點68-70℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.18(m，1H)；1.38(s，9H)；2.26(m，1H)；2.65(m，1H)；3.33(t，2H)；4.45(m，1H)；4.55(t，1H)；5.62(m，1H)；5.79(m，1H)；6.73(d，1H).
實施例11(±)-1-丙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的制備氮氣氛下將16.6克(±)-2-丙酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(140毫升)和2-丁醇(66毫升)中，冷卻到-5℃。分批加入3克硼氫化鈉，歷時2小時。在10℃將此混合物攪拌2.5小時，然后用濃鹽酸和水的混合物(1∶1)將pH調節到2.2。將此溶液蒸發至40克，用2N NaOH將pH調節至6.2。該混合物用二氯甲烷萃5次，每次50毫升。將合并的有機相完全蒸發，殘余物放在甲苯(150毫升)中重結晶。得到11.1克標題產物。產率為65％。
熔點67-68℃。
1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 0.96(t，3H)；1.16(quint.，1H)；2.04(quart.，2H)；2.26(m，1H)；2.66(m，1H)；3.34(m，2H)；
4.58(t，1H)；4.72(m，1H)；5.61(m，1H)；5.84(m，1H)；7.72(d，1H).
實施例12(±)-1-異丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的制備氮氣氛下將9克(±)-2-異丁酰基-2-氮雜二環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(32毫升)和2-丁醇(84毫升)中，冷卻到0℃。分批加入1.37克硼氫化鈉，歷時3.5小時。在20℃將此混合物再攪拌3小時，然后用濃鹽酸和水的混合物(1∶1)將pH調節到2.5，然后用2N NaOH中和。將此溶液蒸發至40克。殘余物用二氯甲烷萃3次，每次80毫升。將合并的有機相完全蒸發，將產生的固體放在甲苯(25毫升)中結晶。得到6.8克標題產物。產率為73.6％。
熔點80-81℃。
1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 0.98(d，3H)；1.16(quint.，1H)；2.30(m，2H)；2.68(m，1H)；3.32(t，2H)；4.58(t，1H)；4.70(m，1H)；5.61(m，1H)；5.82(m，1H)；7.68(d，1H).
實施例13用青霉素G酰基轉移酶制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯來源于大腸桿菌的青霉素G酰基轉移酶EC 3.5.1.11(Boehringer Mannheim)165U(單位)/克或來源于巨大芽胞桿菌的青霉素G酰基轉移酶3.5.1.11被用于生物轉化。
為此，在37℃用1％重量非外消旋的1-苯基乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯和400毫克合適的青霉素G酰基轉移酶在50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH 5-9，4毫升)中溫育。
在一定的時間間隔后取樣，用薄層色譜(硅膠60，丁醇∶水∶冰醋酸＝3∶1∶1；茚三酮檢測)、氣相色譜(毛細管柱，HP-5，5％苯基甲基硅氧烷)或高壓液相色譜(HPLC)進行分析。該酶高活性地除去苯基乙酰基，從而釋放出高達40％的相應氨基醇。得到對映體過量為80％的游離氨基醇。
實施例14用微生物制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯14.1 37℃和搖動下將來自Visp的ASA水處理廠的污泥培育在含0.5％重量1-乙酰、1-丙酰、1-異丁酰或1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的A+N培養基中(參見表1)。用薄層色譜跟蹤(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的生成。
用1％的富集物進行1-3轉移，在固體培養基(表1中所示培養基中的平板計數瓊脂；20克/升)上進行分離。用這種方法分離微生物產堿桿菌屬/博代特氏桿菌屬FB 188(DSM 1172)、紅球菌屬erythropolis CB 101(DSM 10686)、戈登氏菌屬sp.CB 100(DSM 10687)和紅球菌屬sp.FB 387(DSM 11291)。
14.2將用這種方法分離得到的微生物培養在在含0.5％重量1-乙酰、1-丙酰、1-異丁酰或1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的培養基中(參見表1)。在24-36小時內它們生長到光學密度(OD)為2-3。將用這種方法獲得的細胞在后指數生長期中收集，并用10mM磷酸鹽緩沖溶液洗滌。
在含1％重量1-乙酰、1-異丁酰或1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的50mM磷酸鹽緩沖溶液中(pH4.5-9)進行隨后的生物轉化。用薄層色譜檢測發現，50％的底物被水解成(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯。高壓液相色譜分析揭示的對映體過量為80-93％。
當1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯用作底物時，并在A+N培養基上進行培育時，菌株DSM 10686的生物轉化速率為0.14(g/l/h/OD)，當在含1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的NYB(酵母營養汁)培養基上進行培育時，其生物轉化速率為0.03(g/l/h/OD)。
當在底物(1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯)濃度為200mM的條件下用菌株DSM 10687進行相同的轉化時，生物轉化速率為0.161(g/l/h/OD).
表1A+N培養基
MgCl20.4克/升CaCl20.014克/升FeCl30.8毫克/升Na2SO40.1克/升KH2PO41克/升Na2HPO42.5克/升NaCl 3克/升維生素溶液1毫升/升微量元素溶液 1毫升/升pH7.514.3 30℃時，在6升發酵桶中的將乙酸銨(3克/升)用作碳源和氮源的最低培養基(參見表2)上把紅串紅球菌DSM 10686培養到OD650＞25的細胞密度。在細胞生長過程中，連續加入50％乙酸，作為附加碳源。然后為了誘導酶活性，加入60克(+/-)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯，繼續培養幾小時。最后再加入40克(+/-)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯，然后再培養10小時。生物轉化過程用線上高壓液相色譜跟蹤。當按所用的外消旋底物計算分析產率為40％，對映體過量達85％時，加入酸使發酵停止。
表2培養基組成組分 濃度酵母萃取物 0.5克/升胨M66 0.5克/升KH2PO44.0克/升Na2HPO42H2O 0.5克/升K2SO42.0克/升乙酸銨 3.0克/升CaCl20.2克/升MgCl2·6H2O 1.0克/升微量元素溶液 1.5毫升/升(見下)PPG(聚丙二醇) 0.1克/升微量元素溶液KOH 15.1克/升EDTA·Na2·2H2O 100.0克/升ZnSO4·7H2O 9.0克/升MnCl2·4H2O 4.0克/升H3BO32.7克/升CoCl2·6H2O 1.8克/升CuCl2·2H2O 1.5克/升NiCl2·6H2O 0.18克/升Na2MoO4·2H2O0.27克/升14.4 按類似于實施例14.3的方法，在含或不含1-乙酰、1-丙酰、1-異丁酰或1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯(下文中縮寫為氨基醇)的培養基(表1)中的乙酸鈉上培養微生物節細菌屬sp.HSZ 5(DSM 10328)、紅球菌屬sp.FB 387(DSM11291)、木糖氧產堿桿菌反硝化亞種HSZ 17(DSM 10329)、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ 30、單純桿菌K2和惡臭假單胞菌K32。
用沒有氨基醇存在下培養的指數細胞得到如下結果(高壓液相色譜分析)菌株 速度[mmol/OD.h] ee/轉化(％)HSZ 5(DSM 10328) 0.05 88.7/16HSZ 17(DSM10329) 0.00595/23K320.05 54/1CB101(DSM 10686) 0.1 84/39培養和收集菌株K2和K17，并進行60小時生物轉化。
菌株 速度[mmol/OD.h] ee/轉化K2 -92/10HSZ 30 -93/3.5收集各批的指數細胞(exponential cell)和靜態細胞(stationary cell)，并用作生物轉化的休眠細胞(quiescent cell)。根據薄層色譜分析，用氨基醇誘導或不用氨基醇誘導的細胞的初始速度沒有明顯的區別。
實施例15從紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)中提純N-乙酰氨基-醇水解酶按下述方法提純酶，直到SDS-PAGE(Pharmacia Phast凝膠，10-15％梯度)只有一個分子量為50kD的蛋白帶為止。
紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)細胞用50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH6.2)洗滌，然后濃縮到光學密度OD650nm為190。加入苯基甲磺酰氟(PMSF)到最后濃度為1mM及DNA酶后，用弗氏壓榨機處理細胞，以獲得粗的提取液。離心產生蛋白濃度為4.8毫克毫升-1的不含細胞的提取液。
將960毫克無細胞提取液裝入一根HiLoad 26/10 Q-Sepharose離子交換色譜柱(Pharmacia)中。該色譜柱已用含1mM二硫蘇糖醇(DTT)的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.0)平衡。
該柱用相同的緩沖液洗滌后，蛋白質用線性緩沖液梯度洗脫(linear buffergradient)(1500毫升；梯度含1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.0)-含1mM DDT和1M NaCl的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)。該酶在370-430mM NaCl間和pH為7.6處從柱中洗脫。收集活性部分，并濃縮到9毫升。蛋白含量為41毫克。
為進一步提純，將該蛋白溶液裝在HiLoad 26/60 Superdex 75凝膠過濾色譜柱(Pharmacia)中。該柱已用含50mM NaCl和1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液平衡。合并活性部分，總的蛋白含量為10.9毫克。
將該蛋白溶液裝在Mono Q HR5/5柱(Pharmacia)中。該柱已用含1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.5)平衡。蛋白質用含1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.5)-含1mM DDT和1M NaCl的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.5)線性梯度(40毫升)洗脫。該酶在390-440mM NaCl間洗脫。活性部分含1.4毫克蛋白。
在最后的提純步驟中，使用用相同緩沖液平衡后的相同柱。所用的洗脫梯度是含0-500mM NaCl和pH為7.0-8.5的相同緩沖液。用這種方法可以分離430微克純酶。
從蛋白印跡直接確定酶的N-末端順序。得到如下20個氨基酸的順序Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn。
這種順序與已知的蛋白沒有同源性。
實施例16酶的表征用純化的酶和已用Sephadex G-25柱(PD-10，Pharmacia)脫鹽的無細胞提取液進行酶特性表征。
無細胞提取液中蛋白濃度為7.3毫克毫升-1，純化酶中的蛋白濃度為135微克毫升-1。在無細胞提取液中不加入PMSF。
16.1 Km測定在無細胞提取液中進行Km測定。底物1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯在pH為7.0和溫度為30℃的條件下的反應Km為22.5mM。
16.2 最佳pH值在如下緩沖溶液中，用純化的酶和無細胞提取液在pH為6.2-9.0的范圍內測定1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯(25mM)水解時的最佳pH值。
三羥甲基氨基甲烷緩沖液100mM pH9.0；8.5；8.0；7.5；7.0檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液100mM pH7.0；6.55；6.2活性測量進行24小時。
制備1R，4S和1S，4R對映體的反應的最佳pH值為pH7.0-7.5。
無細胞提取液活性的最佳pH值為pH7.0。然而在pH為6.0至7.0之間，選擇性更好。
圖1表示從紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)提取的N-乙酰氨基醇水解酶(無細胞的提取液)的活性與pH的關系。實施例16.2所示的反應最佳溫度為25-30℃。
圖2表示從紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)提取的N-乙酰氨基醇水解酶(無細胞的提取液)的活性與溫度的關系。
16.4 用SDS-PAGE測得的分子量為50kD。
16.5 將如下底物水解1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯、1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯、1-丙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯、1-異丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯。
實施例17制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽將374.1克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯溶液(按與實施例14相似的方法制備)蒸發至123.7克。用30％強度的NaOH將含60.2毫摩爾上述化合物(高壓液相色譜)的溶液從pH2調節到pH11.7。然后用異丁醇萃取三次，每次70毫升。用氯化氫氣體將合并的異丁醇萃取液調節到pH為1，濃縮到65克，過濾(除去固體雜質)。20℃時，在激烈攪拌的濾液中滴加60毫升丙酮。在混濁的混合物中加入標題化合物的晶種，在5℃攪拌1小時。過濾和干燥后得到5.2克產物，產率為58％。
熔點125-127℃對映體過量為98％(校準的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400Mhz 1.44(m，1H)2.35(m，1H)；2.83(m，1H)p3.42(m，2H)；4.10(s，1H)；4.80(d，1H)；5.80(d，1H)；6.06(d，1H)；8.13(s，3H).
實施例18制備(1R，4S)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯用30％強度的NaOH將75克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯(按與實施例14相似的方法制備；44.6毫摩爾化合物)溶液調節至pH為8，加入6克碳酸氫鈉。將混合物加熱至52℃。激烈攪拌下，加入60毫升二異丙醚，然后在2小時內滴加11.12克叔丁氧羰基酸酐在18.2毫升二異丙醚中的溶液。用硅藻土(Celite)過濾該混合物，然后分相。水相用65毫升二異丙醚萃取。合并的有機相用45毫升水洗滌，然后蒸發至37.5克，加熱至50℃。在該溶液中滴加31毫升正己烷。然后慢慢冷卻到0℃(2小時)，過濾出標題產物，用12毫升正己烷/二異丙醚(1/1)洗滌，并干燥。得到6.75克產物。產率為71％。
熔點70-71℃對映體過量為98％(校準的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400Mhz 1.18(m，1H)；1.27(s，9H)；2.28(m，1H)；2.63(m，1H)；
3.33(q，2H)；4.43(m，1H)；4.56(t，1H)；5.62(m，1H)；5.78(m，1H)；6.72(d，3H).
實施例19制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽將87.8克(1R，4S)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯溶解在270毫升2N鹽酸和1340毫升甲醇中。將此混合物加熱回流4.5小時。蒸餾掉甲醇后，將殘余物溶解在800毫升水中。該水溶液用乙酸乙酯萃取二次，每次340毫升。完全蒸發水相(50℃/60毫巴)。50℃時將固體真空干燥，將其懸浮在150毫升乙醚中，過濾，并用50毫升乙醚洗滌二次。干燥后產生標題產物，產率為95％(58.4克)。
產物的物理數據和光譜數據與實施例17中相同。
實施例20制備(1R，4S)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯將25克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽溶解在182毫升乙酸酐中，0℃時，加入18.25克三乙胺在60毫升乙酸酐中的溶液。80℃時，將此混合物攪拌3小時，然后冷卻至室溫。過濾掉三乙胺鹽酸鹽，用120毫升正己烷洗滌。將濾液蒸發。殘余物與300毫升甲苯混合，加入5.2克活性炭和13硅藻土后，在室溫下攪拌20分鐘。過濾和洗滌濾餅后(3×40毫升)甲苯，將溶劑完全蒸發掉。殘余物與180毫升甲醇和15.5克碳酸鉀混合，在室溫下攪拌10小時。過濾懸浮液，并蒸發濾液。將殘余物懸浮在750毫升乙酸異丙酯中，加入0.5克活性炭后加熱回流1.5小時。過濾掉活性炭后(70-80℃)，將濾液在0℃冷卻過夜。過濾出標題化合物，用80毫升冷的乙酸異丙酯洗滌，真空干燥。得到17.2克產物。產率為66％。
熔點77-80℃對映體過量為98％(校準的手性高壓液相色譜柱)
1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.15(m，1H)1.78(s，3H)；2.25(m，1H)；2.66(m，1H)；3.35(m，2H)；4.58(t，1H)；4.70(m，1H)；5.62(m，1H)；5.85(m，1H)；7.80(d，3H).
實施例21制備(1S，4R)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯用25克(1S，4R)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽原料按實施例18的方法可以制備標題對映體(產率為68％)。產物的光譜數據和物理數據與實施例20相同。
實施例22制備(1R，4S)-1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯將34.7克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽和2克4-N，N-二甲氨基吡啶溶解在600毫升二氯甲烷中。將溶液冷卻至0℃。然后滴加入52克三乙胺(5分鐘)。將此混合物再攪拌30分鐘。0℃時，將35.2克丁酰氯溶解在60毫升二氯甲烷中生成的溶液滴加到該混合物中，歷時1小時。在0-20℃，將混合物再攪拌1.5小時，然后加入600毫升水。分相后，用600毫升二氯甲烷萃取水相。合并的有機相用10％強度氫氧化鈉洗三次，每次500毫升。然后將其完全蒸發。將干燥的固體溶解在120毫升甲醇中。將此溶液與5克碳酸鉀混合，在室溫下再攪拌2小時。過濾掉無機鹽，用20毫升甲醇洗滌。濾液用2N鹽酸中和。過濾懸浮液，濾餅用20毫升甲醇洗滌。將濾液完全蒸發。將固體殘余物干燥，并放在150毫升甲苯中結晶。得到28.5克標題化合物。產率為67％。
熔點71-72℃對映體過量為98％(校準的手性高壓液相色譜柱)
1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 0.85(t，3H)；1.15(m，1H)；1.50(q，2H)；2.03(d，2H)；2.28(m，1H)；2.67(m，1H)；3.35(d，2H)；4.62(s，1H)；4.76(m，1H)；5.63(m，1H)；5.85(m，1H)；7.77(d，1H).
實施例23制備(1S，4R)-1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環戊烯用34.7克(1S，4R)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽原料按實施例20的方法可以制備標題對映體(產率為63％)。產物的光譜數據和物理數據與實施例22相同。
實施例24制備(1R，4S)-1-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)氨基]-4-羥甲基-2-環戊烯在40毫升異丁醇中將2.07克N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺加熱到80℃(白色懸浮液)。在此混合物中加入1.97克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯鹽酸鹽、3.8克三乙胺和15毫升異丁醇的溶液。將此混合物在80℃再攪拌13小時。20℃時在此透明溶液中加入10毫升1N氫氧化鈉，然后蒸發至干。對殘余物進行閃蒸色譜(硅膠60柱、長度8厘米、直徑為6.5厘米、洗脫劑為乙酸乙酯/甲醇95/5)。蒸發掉洗脫劑和干燥殘余物后，得到2.1克標題產物。產率為74％。
熔點174-176℃對映體過量為98％(校準的手性高壓液相色譜柱)
1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.37(m，1H)；2.35(m，1H)；2.73(m，1H)；3.38(t，2H)；4.68(m，1H)；5.08(m，1H)；5.70(d，1H)；5.85(d，1H)；6.40；6.55和6.65(s，dd，共3H)；7.78和8.10(d和s，共1H)；8.55和8.95(d和s，共1H).
實施例25制備(1R，4S)-1-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)氨基]-4-羥甲基-2-環戊烯將145.2毫升(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯的溶液(按與實施例14相似的方法制備)濃縮到25.5毫升，用硅藻土過濾。濾餅用7.5毫升水洗滌。用濃鹽酸將含17.7毫摩爾上述的化合物(HPLC)的濾液的pH由6.6調節到1，然后用異丁醇萃取三次，每次20毫升。丟棄有機相。用30％強度的氫氧化鈉將水相的pH調節到12，用異丁醇萃取3次，每次10毫升。將合并的有機相蒸發至15毫升，加入2.53克三乙胺。按實施例24中的方法在此混合物中加入2.07克N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺在40毫升乙醇中的溶液。將此混合物在80℃攪拌16小時。按實施例22的方法進行后處理，得到2.4克標題產物。產率為85％。
產物的物理和光譜數據與實施例24相同。
實施例26制備(±)-1-BOC-氨基-2-環戊烯-4-羧酸在氮氣氛保護下，室溫時將16.4克粗的(±)-1-氨基-2-環戊烯-4-羧酸鹽酸鹽(按J.Org.Chem.1981，46，3268中所述的方法制備)溶解在80毫升水和80毫升二噁烷的混合物中。用1N氫氧化鈉將此混合物的pH調節到14，然后加入叔丁氧羰基氟(BOC-F，20％過量)的乙醚溶液(BOC-F按Synthesis 1975，599中所述的方法制備)。室溫下將此混合物再攪拌5小時。用濃鹽酸將pH調節至2。蒸餾掉有機溶劑后，在殘余物中加入50毫升水。該混合物用乙酸乙酯萃取三次，每次100毫升。將有機相蒸發到50毫升，用25毫升甲苯稀釋。冷卻(0-10℃)后，過濾標題產物，并加以干燥。得到14.3克產物。產率為63％。
熔點126-127℃1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.14(s，9H)；1.70(m，1H)；2.40(m，1H)；3.40(m，1H)；4.47(m，1H)；5.70(t，1H)；4.87(t，1H)；6.88(d，1H)；12.30(d，1H).
實施例27由(±)-1-BOC-氨基-2-環戊烯-4-羧酸制備(±)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯將250毫升四氫呋喃和10.02克(0.164摩爾)LiAlH4加入一個500毫升攪拌裝置中，在-10℃時，滴加30.0克(0.132摩爾)(±)-1-BOC-氨基-2-環戊烯-4-羧酸在75毫升四氫呋喃中的溶液，歷時1小時。然后加入10克水，10克15％強度氫氧化鈉溶液和20克水，再進行過濾。殘余物用叔丁基甲醚洗兩次，每次100毫升，將合并的有機相蒸發至干。加入80毫升己烷和實施例10化合物的晶種后，分離出標題化合物結晶固體。產率為15.84克(56％)。物理數據和光譜數據與實施例10相同。
實施例28由(1R，4S)-1-BOC-氨基-2-環戊烯-4-羧酸制備(1R，4S)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環戊烯將80毫升四氫呋喃和11.38克(50.07毫摩爾)(1R，4S)-1-BOC-氨基-2-環戊烯-4-羧酸(按TetrahedronAsymmetry 1993，4，1117中所述的方法制備)加入500毫升攪拌裝置，在-15℃時，滴加5毫升硼烷/二甲硫加成物，歷時1小時。然后將此混合物在這溫度下攪拌3小時。加入4克氫氧化鈉溶解在60毫升水中生成的溶液，溫熱至室溫。用甲苯萃取，用硅膠過濾并隨后在乙酸乙酯/正己烷1∶1中結晶產生5.4克標題產物白色結晶固體，相當于產率57％。物理數據和光譜數據與實施例10中相同。對映體過量為99％(相同的手性高壓液相色譜柱)。
權利要求
1.用通式XIII表示的外消旋或光學活性的4-(羥甲基)-2-環戊烯衍生物的制備方法， 式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，其特征在于在第一步中用通式XI表示的羰基鹵化物 式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，和X表示鹵原子，將用式XIV表示的環戊烯-4-羧酸外消旋體或其光學活性異構體之一 酰化形成用通式XV表示的外消旋或光學活性的環戊烯-4-羧酸衍生物， 第二步中將后者還原產生用通式XIII表示的所需產物。
全文摘要
本發明公開一種用通式XIII表示的外消旋或光學活性的4－(羥甲基)－2－環戊烯衍生物的制備方法。
文檔編號C07C231/00GK1827591SQ20061000438
公開日2006年9月6日 申請日期1998年5月13日 優先權日1997年5月13日
發明者C·貝爾內格爾, E·M·烏爾班, O·M·伯奇, K·伯格多爾夫, F·布魯克斯, K·S·埃特, P·博薩德, W·布列登, L·迪克, J·戈登, C·奧穆爾丘, Y·格吉斯伯格 申請人:隆薩股份公司