關于脊髓損傷疼痛的外周遞送的谷氨酸脫羧酶基因治療的制作方法

專利名稱：關于脊髓損傷疼痛的外周遞送的谷氨酸脫羧酶基因治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療疼痛的方法和組合物。
背景技術：
脊髓損傷后的疼痛是不利地影響生活質量并且阻礙有效的康復的重 要問題。幾乎患有脊髓損傷(SCI)的每一名患者都患有SCI疼痛。SCI疼痛 可以在損傷平面(level)或在損傷平面以下。對于每個人，疼痛在強度、頻 率、發作持續時間和經歷的疼痛類型上不同。經歷的疼痛類型已經被患者 描述為麻刺感、麻木、疼痛、悸痛、灼痛或壓痛。它通常描述在具體的機 體區域并且發生在機體的一側或兩側。它可以是持續的或斷續的，并且與 機體姿勢或活動無關。
慢性SCI疼痛可以在脊髓損傷時發生，或者在SCI后緩慢地發展幾個 月或幾年的時間。慢性SCI疼痛持續長期的時間，并且通常對常規疼痛治 療反應不好。根據一些報道，多達90%的患有SCI的人還經歷了慢性SCI 疼痛。對于患者，SCI疼痛的水平可以從只是小煩惱到難以忍受的范圍。 己經描述了 SCI后的兩類慢性疼痛。平面(at-levd)神經性SCI疼痛是指在 脊髓損傷位點附近的皮區。平面以下(below-level)神經性SCI疼痛是指在 脊髓損傷位點平面以下的皮區。前者通常在脊髓損傷的早期階段存在，并 且隨著時間過去而減輕，而后者逐漸發展，并且通常是藥物治療難以控制的。脊髓損傷后的慢性SCI疼痛是不利地影響生活質量并且阻礙有效的康 復的重要問題。
SCI疼痛可以分類為肌肉骨骼或神經性疼痛。肌肉骨骼SCI疼痛由于 機體組織諸如骨骼、關節和肌肉的過度使用引起。它通常隨著運動而加重， 并且隨著休息而減輕。
神經性SCI疼痛可能是由于神經系統對于疼痛的正常感覺的異常處理引起。例如，脊髓和大腦可以另外將正常感覺認為是疼痛。損傷平面的神經性SCI疼痛可能是由于對真實神經根的損傷或者對脊髓本身的損傷 引起。醫生和其它保健專家可以將這叫作"部分傳入神經阻滯(segmental deafferentiation)"或"帶區疼痛(girdle zone pain)"。這種類型的神經性 SCI疼痛通常是兩側的，并且按照圓周模式，例如，從你的胃部環繞到你 的背部。如其它類型的慢性疼痛，這可以在初始脊髓損傷后的剛開始的幾 周內發展，或者可以隨著時間更加緩慢地發展。損傷平面以下的發散性神 經性SCI疼痛可能是由于己經發生在中樞神經系統的實際損傷引起。這種 SCI神經性疼痛通常與異常性疼痛(來自通常不是疼痛的事物的疼痛，例 如，光接觸)或痛覺過敏(由通常引起輕微疼痛的事物引起的極度疼痛， 例如，大頭針刺痛)有關。
再現這種臨床病癥的主要特征的動物模型的建立已經允許鑒定損傷 的脊髓中的神經化學變化。在一種模型SCI模型中，實驗室大鼠經受在 T13的脊髓的側半切斷。實驗室大鼠在T13脊髓的側半切斷在雙后肢半切 面以下產生兩側疼痛-相關的行為。SCI模型提供了檢測SCI疼痛新型治 療的獨特的動物模型。
在SCI后報道了脊髓中，氨基丁酸(GABA)-ergic抑制機制的機能減退 和降鈣素基因相關肽(CGRP)的增加。在突觸前和突觸后都作用的GABA-介導的抑制作用，發揮對初級傳入神經和次級脊髓丘腦束狀神經元 (second-order spinothalamic tract neurons)之間疼痛神經傳遞的增強調控 作用。脊髓GABA-ergic神經傳遞的藥理拮抗作用導致與在神經性SCI疼 痛中發現的相似的機械性超敏反應。GABA激動藥物(例如，巴氯芬)核 準用于選擇性神經性疼痛綜合征的治療，但是中樞神經系統中GABA受 體的普遍分布導致副作用，其加強了對施用巴氯芬的嚴重限制，即使當鞘內施用時，也是如此。
先前已經證明，通過皮下接種遞送的基于重組單純皰疹病毒(HSV)的 載體可以用來表達所選的背根神經節(DRG)的神經元中的神經遞質。構建
表達腦啡肽原的HSV載體在炎癥疼痛、神經性疼痛和由骨骼癌癥引起的 疼痛的嚙齒動物模型中產生局部疼痛-減輕作用。通常觀察到SCI疼痛抗 阿片樣物質治療，但是它可以應答鞘內巴氯芬。
其它的研究巳經證明，加工包含編碼GAD基因的腺伴隨病毒或皰疹 擴增子載體可以用來在轉導細胞中表達GABA。然而，這些研究中的載體 是直接注射到大腦神經核中，但是不是用于疼痛模型或實驗。
目前，對于SCI疼痛沒有始終成功的藥物或手術治療。目前的SCI 疼痛治療包括阿片樣物質和神經藥物治療。對于這些治療的反應率通常受 到副作用的限制。不幸地，神經性SCI疼痛通常不對阿片樣物質(例如， 嗎啡)反應。在一些情形中，SCI疼痛也不與神經性藥物治療(例如，某 些抗驚厥藥物或抗抑郁藥物)反應。 一些醫生推薦可以使得疼痛區域麻木 的神經根阻斷劑。這種麻木作用只持續短時間。有時推薦另一種方法，進 行手術途徑，諸如DREZ (背根進入區(dorsal root entry zone))、脊神經根 切斷術或脊髓前側柱切斷術。這些方法最終使得SCI疼痛水平升高，并且 長期可能加重神經性SCI疼痛。
外周神經性疼痛是另一種常見的并且難以治療的多神經病或結構神 經損傷的并發癥。阿片樣物質相對無效，并且它們的應用受到副作用的限 制。已經證明，抗抑郁藥物和抗驚厥藥物在隨機控制的試驗中有效，但是 在不到一半的治療患者中只提供50%的減輕作用。在神經性疼痛中潛在 的復雜機制中，局部神經損傷導致脊髓中GABAergic抑制性突觸電流的 選擇性丟失，這引起異常疼痛敏感性和神經性疼痛綜合征的表型特征。由 于這些試劑的治療機會不多，并且劑量受到副作用的限制，所以 GABAergic試劑還沒有廣泛用于治療神經性疼痛。
因此，存在對于治療SCI和神經性疼痛的治療方法的需求。
發明簡述
本發明提供一種載體，優選地單純皰疹病毒(HSV)載體，其包括編碼
谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列。本發明還提供這樣的載體的 儲液和包括這樣的載體的藥物組合物。本發明還提供治療哺乳動物中的疼 痛諸如脊髓損傷疼痛或外周神經性疼痛的方法，所述方法包括給哺乳動物施用有效治療脊髓損傷疼痛的量的包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的核酸序列的載體。這些優點，以及其它的創造性特征將從本發明的下述描 述和附圖中顯而易見。
附圖簡述


圖1是可以用于本發明的示例性載體構建體的圖示。
圖2是QHGAD67轉導的圖示，其通過爪墊接種增加腰部背根神經節 (DRG)中的GAD67 mRNA。在皮下接種30 jil 1 X 109 pfii/ml QHGAD67或 Q0ZHG到一個后爪后一周，從收集的L4-L6 DRG中提取總RNA (500 ng)， 通過實時PCR擴增，并且使用GAPDH作為標準物進行定量。描述了相 對于QOZHG-轉導的神經節的量。平均值士標準誤差平均值(SEM)， N = 6。
圖3表示來自腰部脊髓的背象限區的蛋白，其通過使用(3-肌動蛋白作 為內部標準物的蛋白質印跡而確定，并且通過相對光學密度進行定量。平 均值土SEM， N = 6， *P<0.05。在轉導QHGAD67后增加了 GAD67-樣免 疫反應性。
圖4A圖示與對照或QOZHG-感染的細胞相比較，在QHGAD67-感染 的細胞中基本上增加的Y氨基丁酸(GABA)的量，Y氨基丁酸釋放于以感染 復數(m.o丄)1體外轉導的初級DRG神經元。如在材料和方法中所述那 樣，通過HPLC確定5 min釋放的GABA。 GABA濃度/孔的檢測進行3 次，并且對于每種情況使用一式三份樣品。平均值土SEM, *P<0.01對 QOHG或賦形劑(vehicle)。圖4B圖示在體內從脊髓神經末梢釋放的GABA 的量，其通過HPLC在背角質的微量透析液中確定。在皮下接種30 pi 1 X109 pfii/ml QHGAD67到一個后爪后一周，與對照動物相比，在 QHGAD67-接種的動物中，GABA的量(pmo1/10 pl微量透析液的級分) 基本上增加了。平均值士SEM，N-6， *P<0.05。
圖5A-D圖示機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏通過QHGAD67接種顯 著減少。圖5A和5B顯示，在半切斷后一周，在爪退縮閾值(機械性異常性疼痛)中存在減小，在賦形劑-處理的動物(x)中，其持續了 15周。用 QHGAD67接種產生由增加的閾值所(空心圓圈)反映的抗異常性疼痛作 用。初始接種后7周，QHGAD67的抗異常性疼痛作用減小，但是將 QHGAD67重新接種到同一動物中重新建立了抗異常性疼痛作用^PO,05: **P<0.01對Q0ZHG-接種的，N-6)。相對于半切斷，(A)在身體同側和(B) 在身體對側。圖5C和5D顯示，在半切斷后一周，在爪退縮潛伏期(熱 痛覺過敏)中存在顯著減少，并且注射載體導致爪退縮潛伏期的顯著增加 (空心圓圈)。初始接種后7周，QHGAD67的抗痛覺過敏作用減小，但 是重新接種QHGAD67重新建立了抗痛覺過敏作用。P0.05， **P<0.01對 Q0ZHG-接種的，N = 6)。相對于半切斷，(C)在身體同側和(D)在身體對 側。在所有情形中(A-D)， QOZHG-接種的動物(空心三角形)與載體-處 理的對照動物沒有區別。
圖6A和6B顯示在半切斷后3周和爪墊接種后2周鞘內施用比枯枯 靈堿(0.5昭)或phaclofen (0.8昭)部分地逆轉了載體接種的(A)抗異 常性疼痛和(B)抗痛覺過敏作用。點線表示用對照載體或賦形劑接種的 SCI后動物中的平均閾值(A)和潛伏期(B)。平均值士SEM,N二6， *P<0.05， **P<0.01對賦形劑-處理的。
圖7是背角質中CGRP-樣免疫反應性的相對光學密度測定的柱狀圖。 相對光學密度測定取自每只動物L5部分中的一系列6個連續切片。點線 表示，在用賦形劑或Q0ZHG接種的動物中相對于T13半切斷，在身體同 側和身體對側，正常脊髓中的CGRP-IR密度都基本上增加了，并且用 QHGAD67接種顯著地消弱了這種增加。與賦形劑或Q0ZHG相比，平均 值士SEM,N二6， *P<0.051。
圖8描述本文討論的SEQ ID NO:l 。
圖9描述本文討論的SEQIDNO:2。
圖10描述本文討論的SEQIDNos:3-8。
圖ll(a)和ll(b)描述證明QOGAD67在神經性疼痛中的防感受傷害作 用的數據。(A)L5脊神經連接(SNL)引起對觸覺刺激閾值的顯著減小，其 持續了4個多月。QHGAD67的皮下接種(箭頭)產生了以機械性閾值的 增加為反映的抗異常性疼痛作用。在初始接種后7周重新接種QHGAD67(箭頭)重新建立了抗異常性疼痛作用。結果表示為平均值土平均值的標準誤差。(空心圓圈)QHGAD67;(實心圓圈)QOZHG; *p<0.05; **p < 0.01; 11 = 8只動物每組。(B)L5SNL還引起顯著的熱痛覺過敏，其持續6 周。用QHGAD67接種(箭頭)，而不是QOZHG，逆轉了由脊神經損傷 誘導的熱痛覺過敏。*p < 0.05; **p < 0.01相對QOZHG-接種的；n = 8只動 物每組。差異的統計學顯著性通過變量分析(StatView 5.2; SAS Institute, Cary, NC)確定，使用Scheffe's F檢驗校正尤其是(hoc)比較后的數目。
圖12是描述關于QHGAD67對背角質中Fos-LI的作用的數據的柱狀 圖。脊神經連接(SNL)后1周并且在2周后(SNL后3周)檢測，通過10 分鐘溫和的觸覺刺激誘導的背角質中的Fos-LI在用QOZHG接種的大鼠 中顯著地增加。(SNL)后1周并且在2周后(SNL后3周)檢測，在用 QHGAD67接種的具有SNL的大鼠中，這種增加被阻滯，并且它在背角 質的I-VI層中發現。結果表示為平均值士平均值的標準誤差。**p<0.01; n=5只動物每組。假-手術和用QOZHG接種的SNL動物之間的差異也 是統計學顯著的(p<0.01)。
圖13圖示關于QHGAD67對磷酸化胞外信號-調控激酶1和2 (p-ERKl/2)在背角質中表達的作用的數據。結果表示為平均值士平均值的 標準誤差。**p<0.01; ***p<0.001; n二5只動物每組。
圖14描述具有ICP4和ICP27基因座的延長缺失和UL55缺失的HSV 載體的構建。
發明詳述
本發明提供包括編碼谷氨酸脫羧酶蛋白的多聚核苷酸序列的載體。所 述載體可以是任何適宜的基因轉移載體。適宜的載體的實例包括質粒、脂 質體、分子綴合物(例如，運鐵蛋白)、以及病毒。優選地，所述載體是 病毒載體。適宜的病毒載體包括，例如，反轉錄病毒載體、基于皰疹病毒 的載體和基于細小病毒的載體(例如，基于腺伴隨病毒(AAV)的載體,AAV-腺病毒嵌合載體和基于腺病毒的載體)。本領域的普通技術人員具有必需 的理解以確定用于具體情形的適當載體。
在一個優選的實施方案中，所述載體是基于皰疹病毒的載體，諸如基于HSV的載體。基于HSV的病毒載體適于用作將核酸序列引入眾多細胞類型的載體。成熟的HSV病毒體由包膜的二十面體衣殼組成，所述衣殼 具有由152 kb的線性雙鏈DNA分子組成的病毒基因組。在一個優選的實 施方案中，基于HSV的病毒載體缺失至少一種必需HSV基因。當然，所 述載體可以備選地或者另外刪除非必需基因。優選地，缺失至少一種必需 HSV基因的基于HSV的病毒載體是復制缺陷型的。大部分復制缺陷型 HSV載體含有去除一種或多種中間-早期(intermediate-early)、早期或晚 期HSV基因的刪除以防止復制。例如，HSV載體可以缺失選自由下列各 項組成的組的早早期基因(immediate early gene): ICP4, ICP22, ICP27, ICP47以及它們的組合。HSV載體的優點是它們進入可以導致長期DNA 表達的潛伏期的能力，以及它們可以容納高達25 kb的外源DNA插入片 段的大的病毒DNA基因組。例如，基于HSV的載體在美國專利5,837,532， 5,846,782, 5,849,572和5,804,413，以及國際專利申請WO 91/02788，.WO 96/04394, WO 98/15637和WO 99/06583中描述，它們通過參考結合于此。 優選地，HSV載體是"多缺陷型的"，意指所述HSV載體缺失多于一種 的病毒復制所需要的基因功能。HSV的序列可從互聯網www. ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query,fcgi cmd=Retrieve&db=nucleotide&list—uid s=9629378&dopt=GenBank&term=hsv-l&qty=l上獲得，其可以輔助在設計 的載體中產生需要的突變。
HSV載體可以只缺失HSV基因組早期區域的復制-必需的基因功能， 只缺失HSV基因組早早期區域的復制-必需的基因功能，只缺失HSV基 因組晚期區域的復制-必需的基因功能，或者缺失HSV基因組早期和末期 區域的復制-必需的基因功能。HSV載體還可以使得基本上整個HSV基因 組被移除，在這種情形中，優選地至少病毒反向末端重復(ITRs)和一種或 多種啟動子，或者病毒ITRs和包裝信號保持完好(即，HSV擴增子)。 移除的HSV基因組區域越大，可以插入到所述基因組的外源核酸序列片 段就越大。然而，優選本發明的載體應該是非擴增子HSV載體。
應該理解，HSV載體的不同區域的缺失可以改變哺乳動物的免疫應 答。特別地，不同區域的缺失可以減少由HSV載體產生的炎性反應。此 外，可以修飾HSV載體的蛋白外殼，以減少HSV載體被針對野生型蛋白
外殼的中和抗體識別的能力或無能。
當多種復制缺失時，HSV載體優選地包括間隔元件，以在類似于通 過單一復制缺陷型HSV載體獲得的細胞系的互補細胞系中提供病毒生 長。所述間隔元件可以包含理想長度的任何一種或多種核酸序列。關于HSV基因組，所述間隔元件序列可以是編碼的或不編碼的以及天然的或非天然的，但是沒有恢復缺失區域的復制必需功能。另外，在任何或全部缺失HSV區域包含間隔元件將減小HSV載體容納大插入片段的能力。 HSV載體的產生包括應用本領域公知的標準分子生物學技術。
復制缺陷型HSV載體典型地在互補細胞系中產生，所述互補細胞系 以適當的水平提供復制缺陷型HSV載體中不存在但是病毒增殖需要的基 因功能，以產生高滴度的病毒載體儲液。優選的細胞系與復制缺陷型HSV 載體中不存在的至少一種復制必需基因功能互補，并且優選地與所有復制 必需基因功能互補。所述細胞系還可以互補非必需基因，當所述非必需基 因丟失時，其可以減少生長或復制效率(例如，UL55)。互補細胞系可以 互補于由早期區域、早早期區域、晚期區域、病毒包裝區域、病毒-相關 區域、或它們的組合所編碼的至少一種復制必需基因功能的缺陷，其包括 所有的HSV功能(例如，使得包括最少的HSV序列諸如只有反向末端重 復和包裝信號或者只有ITRs和HSV啟動子的HSV擴增子能夠增殖)。所 述細胞系優選地還是特征在于，它以不與HSV載體重疊的方式包含互補 基因，這最小化并且部分地消除了 HSV載體基因組與細胞DNA重組的 可能性。因此，如果在載體儲液中不能避免的話，能夠復制的HSV的存 在減到最小，因而它適用于某些治療目的，特別是基因治療目的。互補細 胞系的構建包括本領域公知的標準分子生物學和細胞培養技術。
當所述載體是復制缺陷型HSV時，編碼蛋白(例如，GAD蛋白)的 核酸序列優選地位于必需HSV基因的基因座上，更優選地位于HSV基因 組的ICP4或ICP27的基因座上。將核酸序列插入到HSV基因組(例如， HSV基因組的ICP4或ICP27基因座)可以由已知方法促成，例如，通過 在給定的HSV基因組位置引入獨特的限制性位點。
用于本發明情形的優選的HSV載體包含延伸的ICP4，或ICP27缺失 體，并且優選地包含兩者。在這種情形中"延伸的"缺失體，意指所述優選的載體相對于用于它們生產的互補細胞系在這些基因座中的任一個或 兩者都沒有同源序列。理想地，所述病毒沒有剩余的ICP4或ICP27(或兩 者)編碼或啟動子序列。優選地，ICP27中的缺失還延伸到UL55基因座， 并且理想地，兩種基因都被刪除。因此，用于本發明的最優選的病毒包含 在ICP4、 ICP27和UL55中的延伸的缺失，以致與用于互補細胞系的這些 基因沒有病毒同源性。理想地，所述載體還不包括與互補細胞系中所用的 序列同源的任何DNA序列(例如，甚至使用不同的調控序列和多聚腺苷 化序列)。
如上文所述，與從HSV載體中刪除的基因的功能特別是必需基因的 基因功能互補的細胞系對于復制載體是理想的(并且在必需HSV基因的 情形中，是必需的)。因此，為了應用缺少ICP4和ICP2兩者的優選的載 體，應該應用加工成與兩種必需基因互補的細胞系。此外，由于UL55— HSV 毒株生長不好，所以，當它從載體骨架中刪除時，理想地應用與其互補的 細胞系。產生互補細胞系的方法是本領域的普通技術人員己知的。
如上文所述，所述本發明的載體還包括編碼GAD蛋白的核酸序列 (即， 一種或多種編碼一種或多種GAD蛋白的核酸序列)。編碼GAD蛋 白的核酸序列可以從任何來源獲得，例如，從天然的分離，合成產生，從 遺傳加工的生物體分離等。普通技術人員應該理解，可以插入到載體中的 任何類型的核酸序列(例如，DNA，RNA禾口cDNA)可以與本發明聯系應 用。
所述本發明載體的核酸序列可以編碼分泌蛋白，例如，由感染的細胞 天然分泌的蛋白。備選地，所述核酸序列可以編碼蛋白，諸如GAD，其 通過在細胞內的酶促催化作用而產生分泌產物(例如，GABA)或肽。備 選地，所述核酸序列可以編碼不是由細胞天然分泌的蛋白(即，非分泌蛋 白)，但是其包括促使蛋白分泌的信號肽。以這種方式，例如，所述核酸 序列編碼內質網(ER)定位信號肽和非分泌蛋白。ER定位信號肽作用是將 DNA、 RNA和/或蛋白導向內質網膜上，其中蛋白被表達并且耙向進行分 泌。ER定位信號肽理想地作用是增加細胞分泌(即，分泌潛力)下列各 項(i)通常不是由細胞分泌的(即，分泌型)蛋白，和/或(ii)通常由細胞 分泌但是以低量(即，低于需要的量)分泌的蛋白。由所述多聚核苷酸編
碼的ER定位信號肽可以是任何適宜的ER定位信號肽或多肽(即，蛋白)。例如，由核酸序列編碼的ER定位信號肽可以是選自由下列各項組成的組 的肽或多肽(即，蛋白)神經生長因子(NGF)、免疫球蛋白(Ig)(例如， Ig K鏈前導序列)、和中期因子(MK)、或其片段。適宜的ER定位信號肽 還包 舌Ladunga, Current Opinaions in Biotechnology, 13-18 (2000)中所描述的那些。
盡管所述核酸序列可以編碼任何蛋白，但是所述蛋白優選地是GAD 蛋白或腦啡肽。存在一些由一些不同的基因編碼的哺乳動物GAD的同種 型，具體地為GAD25、 GAD65禾n GAD67。 GAD65，主要靶向膜和神經 末梢，受到吡哆醛-5-磷酸和其它輔因子的調控。認為GAD65在制備突觸 釋放中負責將GABA包裝成小泡。另一種哺乳動物GAD的同種型GAD67 主要是在細胞質中，并且其酶促活性似乎受蛋白水平的調控。GAD25是 GAD67的備選剪接的變體。所述載體優選地包括編碼GAD67的核酸序 列。人GAD67基因的編碼序列和所編碼的基因產物(即，所編碼的蛋白) 的氨基酸序列在National Center for Biotechnology Information (NCBI)網址 上分別作為GenBank登記號NM—000817 (SEQ ID NO: l)和NP—000808 (SEQIDNO:2)而可以公共獲得。類似地，人腦啡肽基因的編碼序列和所 編碼的基因產物(即，所編碼的蛋白)的氨基酸序列作為GenBank登記 號NMJ)06211可以公共獲得。
所述核酸序列可以編碼前面提及的蛋白的任何變體、同系物或功能片 段。所述蛋白的變體可以包括來自相應的天然存在的蛋白的一個或多個突 變(例如，點突變、缺失、插入等)。"天然存在"意指所述蛋白可以在自 然界中找到，并且沒有進行合成修飾。因此，在將突變引入到編碼所述蛋 白的核酸序列中的情形中，這樣的突變理想地將影響所編碼的蛋白中的取 代，其中編碼正電荷殘基(H、 K和R)的密碼子用編碼正電荷殘基的密碼 子取代，編碼負電荷殘基(D和E)的密碼子用編碼負電荷殘基的密碼子取 代，編碼中性極性殘基(C、 G、 N、 Q、 S、 T和Y)的密碼子用編碼中性 極性殘基的密碼子取代，以及編碼中性非極性殘基(A、 F、 I、 L、 M、 P、 V和W)的密碼子用編碼中性非極性殘基的密碼子取代。另外，蛋白的同 系物可以是任何肽、多肽或其片段，其與所述蛋白在氨基酸水平上有大于約70%的相同性(優選地大于約80%的相同性，更優選地大于約90%的
相同性，并且更優選地大于約95%的相同性)。氨基酸相同性的程度可以 使用本領域已知的任何方法確定，諸如BLAST序列數據庫。"功能片段" 是在檢測水平上保留天然存在的、全長GAD蛋白的生物活性的GAD蛋 白的任何部分。通過表達所述載體的核酸序列而產生的GAD蛋白的功能 片段可以使用標準分子生物學和細胞培養技術進行鑒定，諸如在瞬時轉染 編碼GAD蛋白片段的核酸序列的人細胞中檢測所述GAD蛋白片段的生 物活性而進行鑒定。
編碼所述蛋白的核酸序列的表達受到可操作性地連接到所述核酸序 列上的適當的表達控制序列的控制。"表達控制序列"是促進、增強或控 制另一種核酸序列表達(典型地和優選地是轉錄)的任何核酸序列。適宜 的表達控制序列包括組成型啟動子、可誘導的啟動子、抑制性啟動子和增 強子。在載體中編碼所述蛋白的核酸序列可以受到其內源啟動子的調控， 或者優選地受到非內在的啟動子序列的調控。適宜的非內在的啟動子的實 例包括人巨細胞病毒(HCMV)啟動子，諸如HCMV早早期啟動子(HCMV IEp)、來源于人免疫缺陷病毒(HIV)的啟動子諸如HIV長末端重復啟動子、 磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子諸如RSV長末 端重復、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、Lap2啟動子、或皰疹胸苷激酶 啟動子(Wagner等.，A^/.5W, 7S, 144-145 (1981))、來源于SV40 或埃巴病毒的啟動子等。在一個優選的實施方案中，所述啟動子是HCMV IEp。 HCMV正p啟動子可以插入到重組HSV的ICP4基因座。備選地， 編碼所述蛋白的核酸序列的表達可以受嵌合啟動子序列的控制。如果它包 括獲自、源于、或者基于至少兩種不同來源(例如， 一種生物體基因座的 兩個不同區域、兩種不同的生物體或與合成序列組合的生物體)的至少兩 種核酸序列片段，那么啟動子序列是"嵌合的"。可操作性地將序列連接 到一起的技術在本領域是公知的。
所述啟動子可以是可誘導的啟動子，即，應答適當的信號進行上調和 /或下調的啟動子。例如，由藥劑上調的表達控制序列特別用于疼痛處理 應用。例如，所述啟動子可以是藥物-誘導的啟動子(例如，應答四環素)。 這樣的啟動子的實例在市場上由Ariad銷售。所述啟動子可以通過本領域己知的方法引入到載體的基因組中，例如，通過在基因組的給定區域引入 獨特的限制性位點進行。備選地，可以插入所述啟動子，作為包括編碼蛋 白諸如GAD的核酸序列的表達盒的部分。在一個優選的實施方案中，所
述可誘導的啟動子可操作性地連接到編碼GAD蛋白的多聚核苷酸序列上。
優選地，編碼蛋白的核酸序列還包括轉錄-終止區域，諸如位于編碼
所述蛋白的區域的3'的多聚腺苷化序列。可以使用任何適宜的多聚腺苷化 序列，包括合成的最優化序列，以及下列各項的多聚腺苷化序列BGH(牛 生長素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(埃巴病毒)、和乳頭瘤病毒包 括人乳頭瘤病毒和BPV (牛乳頭瘤病毒)。
除了編碼蛋白的核酸(包括啟動子和轉錄-終止區)，所述載體可以包 括編碼至少一種其它基因產物的至少一種其它的核酸序列，例如其本身行 使預防或治療功能，或者增加或增強所述蛋白的預防或治療潛力。由其它 核酸序列編碼的基因產物可以是具有需要的活性的RNA、肽或多肽。如 果所述其它核酸序列賦予預防或治療益處，那么所述核酸序列可以在 RNA或蛋白水平上行使其功能。備選地，所述其它核酸序列可以編碼反 義分子、核酶、影響剪接或3'加工(例如，多聚腺苷化)的蛋白、或影響 細胞內另一種基因的表達水平(即，其中廣泛認為基因表達包括從轉錄起 始到產生加工蛋白的所有步驟)的蛋白，諸如通過調控mRNA累積或轉 運的變化速率或者轉錄后調控的改變而進行。其它的核酸序列可以編碼賦 予預防或治療益處的許多基因產物中的任何一種，這取決于組合物的想要 的最終用途。與由載體的核酸序列編碼的蛋白相比，所述其它的核酸序列 還可以編碼作用于不同靶點的因子，因而提供多因子的治療。所述其它核 酸序列可以編碼嵌合蛋白用于組合治療。其它基因產物可以是被分泌的， 或者保留在細胞內，在細胞內，除非或者直到細胞裂解它才產生。許多基 因產物可以增強所述載體的治療潛力。
所述其它核酸序列可以編碼一種基因產物或多種基因產物。備選地， 每種編碼一種或多種基因產物的多種其它核酸序列，可以插入到載體中。 在每種情形中，基因產物的表達可以獨立地受各自的表達控制序列的調 控，或者同時受一種共有表達控制序列的調控。備選地，其它核酸的表達可以由同一表達控制序列調控，所述同一表達控制序列調控由載體的核酸 序列編碼的蛋白的表達；然而，可以消除在編碼所述蛋白的核酸中存在的 任何轉錄終止區，以允許所述其它核酸序列的連讀轉錄。所述其它核酸序 列可以包括本文所討論的任何適宜的表達控制序列和任何適宜的轉錄-終 止區，其與所述載體的核酸序列表達而產生的蛋白的表達相聯系。
在產生所述載體后，將所述載體純化。載體純化增加所述載體在組合 物中的濃度，這可以通過任何適當的方法實現，諸如通過密度梯度純化， 通過層析技術，或者有限稀釋純化而進行。將所述載體，優選地復制缺陷
型HSV載體，理想地從感染復制缺陷型HSV載體的細胞中純化，純化使 用包括將感染HSV載體的細胞裂解并且收集含有HSV載體的級分的方法 進行。
可以使用任何適當的方法裂解細胞，諸如暴露于去污劑、冷凍-解凍 以及細胞膜破裂(例如，通過弗氏壓碎器或微觀流體化作用)。然后，任 選地使用任何適當的方法諸如溫和的離心、過濾或切向流過濾(TFF)，將 細胞裂解物澄清化，以去除大塊的細胞碎片。然后，任選地將澄清的細胞 裂解物用能夠消化DNA和RNA的酶("DNase/RNase")處理，以去除澄 清的細胞裂解物中不包含在載體顆粒中的任何DNA或RNA。
一般地，當可以將足夠的病毒遞送到細胞群以保證所述細胞面臨預先 確定數量的病毒時，本發明的重組HSV是最有用的。因此，本發明提供 一種儲液，優選地一種均勻的儲液，其包括本發明的HSV載體。HSV儲 液的制備和分析在本領域內是公知的。例如，病毒儲液可以在包含用HSV 載體轉導的細胞的搖瓶中制備。然后，可以在連續的尼可登梯度上純化所 述病毒儲液，并且等分和保存直到需要時。病毒儲液在滴度上變化很大， 這主要取決于病毒的基因型和用于制備它們的流程和細胞系。優選地，這 樣的儲液具有至少約1()S個蝕斑形成單位(pfiO，諸如至少約106pfb，或者 甚至更優選地至少約107 pfU的病毒滴度。在更優選的實施方案中，滴度 可以至少約108pfo，或者至少約109pfU，并且最優選至少約10"pfu或者 至少約1011 pfo的高滴度儲液。
本發明另外提供一種組合物，所述組合物包括HSV載體(vector)和 媒介物(carrier),優選地生理學可接收的媒介物。所述組合物的媒介物可以是用于載體的任何適宜的媒介物。所述媒介物典型地將是液體，而且可 以是固體、或液體和固體成分的組合。所述媒介物理想地是藥用(例如， 生理學上或藥物學上可接受的)媒介物(例如，賦形劑或稀釋劑)。藥用 媒介物是公知的，并且容易獲得。媒介物的選擇將至少部分地由具體的載 體和用于施用所述組合物的具體的方法所確定。所述組合物還包括任何其 它適宜的成分，特別用于增強所述組合物的穩定性和/或其最終用途。因 此，存在本發明組合物的廣泛種類的適宜的制劑。下述制劑和方法只是示 例性的，并且決不是限制性的。
適于腸胃外施用的制劑包括水性的和非水性的、等滲的無菌注射溶 液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得所述制劑與目的受體 的血液等滲的溶質，以及水性的和非水性的無菌混懸液，其可以包括混懸 劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。所述制劑可以以單位劑型或多劑 型密封容器諸如安瓿和小瓶存在，并且可以以冷凍-干燥(凍干)狀態保 存，在使用之前，只需要立即加入無菌液體賦形劑如水就可用于注射。臨 時注射溶液和混懸液可以從先前所述的類型的無菌粉劑、粒劑和片劑制備。
另外，所述組合物可以包括其它治療的或生物活性劑。例如，可以存 在用于具體指征治療的治療因子。控制炎癥的因子，諸如布洛芬或類固醇， 可以是組合物的成分，以減少與體內施用所述載體以及生理窘迫有關的腫 脹和炎癥。免疫系統抑制劑可以與所述組合物方法一起施用，以減少針對 所述載體本身的或者與疾病相關的任何免疫反應。備選地，所述組合物可 以包含免疫增強劑，以上調機體針對疾病的自然防御。
可以存在抗生素，即，殺微生物劑和殺真菌劑，以減少與基因轉移步 驟相關的感染以及其它疾病的危險。
本發明還提供在哺乳動物中治療脊髓損傷疼痛或外周神經性疼痛的 方法，所述方法包括給哺乳動物施用本發明的載體或組合物，所述載體或 組合物包括有效治療脊髓損傷疼^或外周神經性疼痛的量的編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的核苷酸序列。在一個優選的實施方案中，所施用的載 體是病毒載體。在一個優選的實施方案中，所述哺乳動物是人。
治療脊髓損傷疼痛或外周神經性疼痛的方法還可以包括其它治療和/或藥劑的施用(即，施用前、同時施用和/或施用后)以改進(例如，增 強)所述方法的效用。本發明的方法還可以包括施用局部或全身性地改變 (即，消除或增強)所述組合物對宿主的作用的其它物質。例如，消除通 過在宿主中表達所述載體的核酸序列而產生的蛋白的任何全身性作用的 物質可以用來控制在宿主內的全身性毒性水平。類似地，增強通過在宿主 中表達所述載體的核酸序列而產生的蛋白的局部作用的物質可以用來減 少在宿主中產生預防性或治療性作用所需要的蛋白的水平。這樣的物質包 括拮抗劑，例如，可溶受體或針對通過表達所述載體的核酸序列而產生的 蛋白的抗體，以及所述蛋白的激動劑。
本領域的技術人員應該理解，給動物(特別是人)施用本發明的創造 性載體和組合物用于治療或預防目的如基因治療、接種等(參見，例如，Rosenfeld等，5We"ce， 252, 431-434 (1991), Jaffe等，C"". L, "(2), 302A (1991), Rosenfeld等.，C"".39(2), 311A(1991), Berkner,歷orec/2m々wes， 6, 616-629 (1988))的適當方法是可用的，并且，盡管不止一種途徑可以用 來施用所述組合物，但是， 一種特別的途徑可以提供比另一種途徑更直接 的和更有效的反應。優選的施用途徑包括通過外周接種轉導DRG神經元， 以在背角質中釋放GABA。在許多實施方案中，這可以通過皮下接種遞送 GAD載體而實現，這是所述治療SCI疼痛或外周神經性疼痛的創造性方 法的吸引人的特征。
在本發明的情形中，施用給動物特別是人的劑量將隨著具體的載體、 含有所述載體和其媒介物(如上文所述)的組合物、施用的方法、以及具 體的位點和要治療的生物體而不同。所述劑量應該足以在理想的時限內引 發理想的反應，例如，治療性或預防性反應。因此，所述本發明組合物的 載體的劑量典型地為大約1乂105或更多顆粒單位(例如，大約1乂106或 更多顆粒單位、大約1乂107或更多顆粒單位，1X1()S或更多顆粒單位、1 X 109或更多顆粒單位、1 X 101Q或更多顆粒單位、1 X 1011或更多顆粒單位、 或者大約1X1(^或更多顆粒單位)。載體的劑量典型地將不是1乂1013或 更少的顆粒單位(例如，4乂1012或更少的顆粒單位、1X10"或更少的顆粒單位、ixio"或更少的顆粒單位、或者甚至ixi(r或更少的顆粒單位)。
下述實例進一步舉例說明本發明，但是，當然，不應該以任何方式解釋成限制本發明的范圍。在這些實例中，記錄并且統計學分析了一些檢測。
使用變量的多變量分析和用于無參量檢測的Kmskal-Wallis檢驗，確定在 載體處理的動物和對照動物之間的差異的統計學顯著性。用斯氏t檢驗 (Student's t test)進行單一比較，使用<0.05的尸值作為顯著性。所有的數 據都表示為平均值士平均值的標準誤差(SEM)。
實施例1
本實例說明GAD載體的構建。
非復制型HSV載體QHGAD67在HSV早早期(正)基因ICP4、ICP22、 ICP27和ICP47的表達上是缺陷型的，并且包含人GAD67基因，其受控 于在Ujl基因座的人巨細胞病毒早早期啟動子(HCMVIEp)(圖1)。對 照載體Q0ZHG (按照在Chen等. / P ra/, 7《21)， 10132-41 (2000)中所述的 方法構建)缺失相同的基因，但是在相同的位置含有大腸桿菌(^&c/^n'c/n^ co//) lacZ報告基因(圖1)。
將GAD67 cDNA (按照Bu， D.F.,等.，尸rac. A^/.爿cW. f/W,砂， 2115-2119 (1992)所述的方法構建)作為人巨細胞病毒早早期啟動子下游 的Clal/Xbal片段單獨地亞克隆到穿梭質粒p41H中，其包含啟動子和充 分的HSV兩側DNA序列，以使得能夠在所述載體的Ul41基因座進行有 效的同源重組。通過用Pmel-消化的病毒和靶點質粒DNA同時轉染互補 的7b細胞，而將表達/靶點盒重組到載體QOZHG的UWl基因座，以用 GAD表達構建體取代LacZ標記基因。重組QHGAD67通過3輪限制稀釋 純化法進行純化，并且遺傳結構通過DNA印跡進行確定。載體儲液在搖 瓶中在7b細胞中生產，在連續的尼可登梯度上純化，并且等分并保存在 -80°C，直到使用時解凍。最終載體產物的滴度按照Krisky, D.，等.，In MeA。(is /"她/ecw/ar AfWc/"e， Human Press, Totowa， NJ (1996)中所述的 方法進行確定。
實施例2
本實例說明具有ICP4和ICP27基因座的延長缺失以及UL55的缺失 的HSV載體的構建。
構建這一載體的圖示在圖14中列出。具體地，將質粒d106(Hadjipanayis和DeLuca， Can Res 65(12): 5310-6 (2005))與質粒TOZ.l (Arafat等.，Clin Can Res 6: 4442-8 (2000))病毒性雜交，產生QOZHG,l。載 體QOZHG.l的詳情在實施例1中所述，并且它的構建在Chen等.,J Virol 74(21)， 10132-41 (2000)中所述。
將質粒pPXE (Niranjan等.，Mol Ther 8(4):530-42 (2003))重組至U QOZHG.l的ICP27基因座中，以挽救先前的ICP27缺失，并且去除 HCMV-eGFP基因。然后，分離單一的重組子，純化，并且通過選擇在熒 光顯微鏡下不表現出綠色熒光的蝕斑而進行驗證。重組子叫作E1。 El對 于GFP基因是陰性的，對于LacZ基因是陽性的。
通過將含有UL41編碼序列的Hind III到Not I片段(HSV-1基因座 核苷酸90145到93858)克隆到pBSSK (Stratagene)的Hind III和Not I位 點，而產生質粒41HN。然后將質粒41HN重組到E1的UL41基因座，以 挽救野生型UL41基因，并且去除LacZ。將得到的命名為El-l的載體通 過標準方法分離，純化，并且驗證。這一載體對于gQ)和lacZ基因都是陰 性的。
質粒pSASB3的構建，是通過將HSV-1 KOS毒株基因組的Sph I到 Afl III (Sal I連接的)片段(1928 bp)(核苷酸124485-126413)克隆到Sph I/Sal I消化的pSP72中，然后將695 bp的Bgl II到BamH I片段(核苷酸131931 到132626)插入到所述載體質粒的Bgl II到BamH I位點而實現的，其中 所述695 bp的Bgl II到BamH I片段含有ICP4啟動子上游區域，所述ICP4 啟動子包括在短反向重復區域所含有的病毒起點。
通過將HCMV-eGFP片段克隆到pSASB3的BamH I位點而構建質粒 pSASB3gfj)。然后，將質粒pSASB3gfiD重組到El-l的ICP4基因座，以 擴展ICP4缺失。然后，將得到的命名為ElG6/dl06-4HG的載體通過標準 方法分離，純化，并且驗證。
質粒pSASB3-HPPE通過將來自Dr. Steven Wilson, University of South Carolina (Liu F, Housley PR， Wilson SR [J Neurochem. 1996 Oct;67(4): 1457-62]的質粒pCMV-hPPE的EcoR I到Sal I片段在獨特的Sal I位點克 隆到質粒pSASB3中而產生，其中所述質粒pCMV-hPPE含有HCMV早早期啟動子、來自SV40的16s/19s RNA的SV40內含子(180 bp Xhol-Pstl)、完整的hPPE編碼序列和SV40多聚腺苷化信號(SV40堿基 2533-2729)。通過先前的EcoR I消化，然后通過克列諾片段補平EcoR I 位點，并且用SalI接頭連接，而使得hPPE表達構建體的SalI釋放成為 可能。然后，將這一連接的產物用SalI消化，以純化SalI兩側的表達構 建體。pCMV- hPPE從來自Dr. Barbara Spruce的cDNA克隆pUR292亞克 隆而來，其作為來自pUR292的946 bp的BamH I-Hind III片段，所述片 段末端被補平，加上NotI接頭，并且克隆到表達質粒pCMV卩的獨特Not I位點。
最終的腦啡肽表達/ ICP4靶點構建體(pSASB3-HPPE)含有下述元件 1) HSV基因組的堿基131931-132626，以提供靶向ICP4基因座的5'重組 側翼序列，2)人巨細胞病毒(HCMV)早早期啟動子(正p)， 3)SV40 16s/19s 內含子剪接供體和受體位點，4)前腦啡肽原cDNA， 5)SV40晚期多聚腺 苷化信號，6) HSV基因組的堿基124485-126413，以提供耙向ICP4基因 座的3'重組側翼。
然后將質粒pSASB3-hppe重組到ElG6/dl06-4HG的ICP4基因座， 以產生NurelPl'(NPl)載體，其通常叫作6221。
質粒PS-UB6R-6通過將兩側為Bgl II - BamH I的泛蛋白啟動子驅動 的Red2 (Invitrogen)克隆到PSP4的BamH I位點而產生。PSP.4的BamH I 位點位于5' ICP27側翼片段和UL56編碼序列之間。
將質粒PS-UB6R-6重組到NP1的ICP27基因座，以擴展ICP27缺失 使其包括所有的ICP27和UL55，并且插入UB6-Red基因。將命名為 HPPE6221R的得到的載體分離，純化，并且通過選擇紅色蝕斑進行驗證。
質粒PSP4通過將ICP27編碼序列5'的EcoR I到BamH I (HSV-1基 因組110095到113322)序列克隆到質粒PS.2中而產生。PS.2含有連接到 pBSSK (Stratagene)的Not I位點的Dde I到Sma I (HSV-1基因組片段 116156到117119)平端。
將質粒PSP4重組到HPPE6221R載體的ICP27基因座中，以去除 UB6-Red并且保留ICP27/UL55缺失。將得到的命名為NurelP2 (NP2)的載 體通過標準方法分離，純化，并且驗證。
將質粒pSASB3GFP重組到NP2的ICP4基因座中，以用HCMV-eGFP 取代HCMV-hppe。將得到的命名為SAS2的質粒通過標準方法分離，純 化并且驗證。
將質粒pRC2 (Invitrogen)順序地通過改變下列各項進行修飾1)將 HinDIII位點變成ClaI位點，2)將BbvII位點變成HinDIII位點，3)將得 到的HinDIII位點變成BglII位點，以制備質粒pRC2HB2。將大約1200 個堿基對的pRC2HB2的BglII片段克隆到質粒pSASB3的BamHI位點， 產生質粒pSHB3。獨立地，通過將HinDIII位點轉變成BamHI位點而修 飾GAD67克隆，產生pGADHB2。將得到的來自pGADHB2的2.8kb BamHI 片段克隆到pSHB3的BamHI位點，以產生pGADLl。
將質粒pGAD-Ll重組到SAS2的ICP4基因座，以產生載體NurelG2 (NG2)。
載體NP2， SAS2和NG2是與所述細胞系沒有同源性的載體，以致在 所述細胞系和載體之間不會發生同源重組。因此，這些載體理想地與細胞 ICP4、 ICP27、 IL55互補株系組合用于載體產生。
實施例3
本實例說明通過GAD載體轉導的細胞表達GAD蛋白。 在將QHGAD67皮下接種到實驗室大鼠后爪的足底表面后一周，在收 集的L4-L6 DRG中通過實時RT-PCR檢測的GAD67 mRNA的量比用 QOZHG轉導的對側DRG高出5倍(圖2)。此外，與對側(注射賦形劑 的)DRG相比，在轉導的DRG中的GAD67免疫反應性以所有大小的廣 譜DRG神經元存在于神經元中。與假接種的對照(0.025士0.006OD單位, P〈0.01二相比，通過蛋白質印跡確定的GAD67蛋白在兩者腰部DRG中 顯著增加(0.048士0.009 OD單位)。
在皮下接種30 pl的11X10、fU/mlQHGAD67后一周，與對側(注射
賦形劑的)背角質相比，在層ii和in顯著地觀察到增加的免疫反應性。
在對照大鼠的淺表背角質中，GAD67免疫反應性顯著地位于層III的小圓 細胞中，具有似乎是淺表背角質中的內源GABA-ergic中間神經元的極少 的神經炎性延伸，以及似乎是靜脈曲張或小軸突末梢的一些更小的、加點的、濃密染色的、不規則的輪廓。在含有來自用QHGAD67轉導的DRG 的軸突中樞末梢的背角質中，免疫染色的密度基本上增加，并且增加的免 疫反應性似乎位于代表軸突末梢的不規則的輪廓中。通過蛋白質印跡，與 假接種對照(0.027士0.004OD單位)相比，在含有這些軸突的中樞末梢的 腰節背部脊髓中的GAD的量(0.041±0.008 OD單位)顯著地增加(尸< 0.01，圖3)。
通過實時RT-PCR分析GAD RNA進行如下將L4-6 DRGs快速移出， 并且使用TriReagent (Sigma)從收集的L4-6中提取總RNA。在DNase I消 化后，使用Omniscript反轉錄酶(Qiagen, Valencia, CA， USA)產生第一鏈 cDNA。使用Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)設 計針對GAD67和GAPDH的引物和探針(Synthegen, Houston, TX， USA)。 GAD67正向引物SEQIDNO:3;反向引物SEQ ID NO: 4;探針，SEQ ID NO: 5 (Synthegen);和CAPDH正向引物SEQ ID NO: 6;反向引物SEQ ID NO: 7;探針SEQ ID NO: 8 (Invitrogen)。 PCRs以50 jal的總體積在ABI Prism 7700序列檢測系統(Applied Biosystems)中進行。RNA的量使用 GAPDH作為內部參照進行確定，并且相對于用Q0ZHG轉導的DRG進行 計算。每一PCR擴增在3個孔中進行，使用下述條件50°C 2分鐘和90 °C 10分鐘，然后在95'C 15s和在60'C l分鐘進行40個循環。
GAD67蛋白的量通過蛋白質印跡法確定，其按照下述流程將L4-L6 DRG或脊髓的腰部放大(lumbar enlargement) (L4到L6片段)的背部象限 區在勻漿緩沖液(100 mg組織/ml)中超聲，所述勻漿緩沖液由60 mM磷酸 鹽緩沖液，pH 7.4， 1 mM苯甲基磺酰氟和0.5% TritonX-100組成。使用 TL100超高速離心機(Beckman)將勻漿物在100,000 g離心15分鐘，并且 通過Bradford檢測法(BioRad, Hercules， CA, USA)測定上層清液中的總蛋 白。將蛋白在4-15% SDS梯度聚丙烯酰胺凝膠上分離，轉移到硝基纖維 素膜(Immobilon-P， Millipore， Billerica， Ma, USA)上，用兔抗-GAD67 (1:4000, Chemicon, Temecula， CA， USA)溫育，然后用辣根過氧化物酶-綴合 的山羊抗-小鼠(l: 10,000， Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)溫育， 并且通過增強的化學發光(NEN， Boston, MA， USA)進行檢測。將膜去除條 帶，并且用兔抗p-肌動蛋白作為上樣對照再次檢測。每一條帶的密度通過使用基于PC的成像分析系統(MCID， Imaging Research, Brock, Ontario, Canada)進行定量密度計量而確定。
實施例4
本實例說明GABA在GAD載體轉導的細胞中的增加的釋放。
在體外以感染復數(m.o.i.) 1轉導QHGAD67的初級DGR神經元向 培養基中以基本大于從對照釋放的那些(2.3肚0,22pmmo1/10 μ1，P<0.01) 或從QOZHG-轉導的DRG神經元釋放的那些(2.56±0.54 pmol/10 pl， PO.Ol)的量釋放GABA (9.53±2.15pmol/10|il)(圖4A)。從通過提早1 周皮下接種到足部而轉導的DRG中樞末梢釋放到背部脊髓中的GABA的 體內的量，通過從移植到身體同側腰部背角質的導管的微量透析而確定。 與來自用QHGAD67接種的動物的透析物(其含有1.46±0.25 pmol/10 pi) 相比，包含在從接種QOZHG的動物收集的透析物中的GABA含有 0.74±0.24 pmol/10 μl (P<0.05) C圖4B)。
將從17天大的大鼠胚胎分離的DRG神經元以10S個細胞/孔的密度接 種到24孔平板的聚-D-賴氨酸-處理的蓋玻片上。每個孔含有500 μl Neurobasal培養基，其包含B27、 Glutamax I、 Albumax II、和青霉素/鏈 霉素(Gibco-BRL, Carlsbad, CA)，補充了 100 ng/ml的7.0S NGF (Sigma, St. Louis，MO)。在培養的第14天，將所述細胞用m.ol 為1的QHGAD67或 Q0ZHG感染1小時，之后將病毒去除。48小時后，將培養基換成100pl 人造腦脊液，并且在5分鐘的收集時間后，將水浴溶液在10,000 g離心5 分鐘，并且提取上層清液用于通過HPLC確定GABA。 DRG細胞通過免 疫細胞化學檢驗GAD67蛋白的表達。
在體內從背角質神經末梢釋放的GABA的量通過微量透析物的 HPLC而確定，其使用下述流程將大鼠用水合氯醛(400mg/kg)麻醉，將 位于脊髓腰節之上的Til和T12椎骨層去除，使硬膜保持完好，并且將 動物固定在立體定位裝置上。使用加熱燈防止熱量損失，并且使用反饋傳 感器將體溫保持在37.5°C。使用尖針做出從側面到中線的小的硬膜切口， 并且將微量透析探針(CMA/11，銅紡透析膜，長度lmm，直徑0.24mm， 分子截留6kDa， CMA/Microdialysis, Stockholm, Sweden)通過硬膜切口插入到背角質中，并且以1μl/min的速度灌注人造腦脊液 (CMA/Microdialysis)。允許與細胞外流體平衡lh后，收集樣品1 h。在實 驗后期，檢驗探針氣泡的存在，并且通過顯微鏡檢灌注-固定的切片而檢 驗在脊髓背角質中的位置。
接著，使用具有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯衍生 作用(AccQ.Fluor Reagent Kit; Waters, USA)的HPLC，確定從轉導的細胞 體外釋放的GABA的量，或者從微量透析物體內收集的GABA的量。將 20微升培養物溶液與20μl衍生劑在60 pi硼酸鹽緩沖液中混合；將10μl 樣品允許在55'C反應10分鐘，并且通過梯度HPLC (Waters 2695 Separations Module)在AccQ.Taq column (3.9 x 150mm; Waters)柱上分離， 移動相由洗脫液A(Waters)和乙腈組成，流速為1 ml/min。使用250 nm的 激發波長和395 nm的發射波長，通過在37。C的熒光(Waters 2475 Detector) 而檢測峰值。
按照下述流程，將鞘內導管手術移植到實驗室大鼠內使用Storkson 方法的改良方法，在T13左脊髓半切斷后1周，放置鞘內導管。簡要地， 將動物用水合氯醛(400 mg/kg)重新麻醉，從中線左側幾毫米的L2到L6 做出縱向切口，并且將聚乙烯導管(PE-10, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA)從L4-L5的椎骨間隙引入到腰部蛛網膜下空間，以便導管末端位于 脊髓的腰部放大附近。導管的遠端皮下穿行，出現在頸部，留下7pl的死 空間(deadspace)。在移植鞘內導管后，將大鼠籠養在單個的籠中，并且 將表現出運動功能障礙的那些動物處死。導管末端的位置通過灌注15 pl 的利多卡因(20 mg/ml)，然后灌注8 pl的鹽水產生持續20-30分鐘的運動 麻痹而檢驗。通過使用與清醒的暫時受約束的大鼠中鞘內導管連接的微量 注射器(Hamilton Co.， Reno， NV, USA)進行鞘內藥物施用。
實施例5
本實例說明在實驗室大鼠中皮下接種GAD載體減少SCI后的機械性 異常性疼痛和熱痛覺過敏。
在T13左側脊髓半切斷后1天，所有動物都表現出同側后肢麻痹，在 與脊髓半切斷的對側的后肢中沒有運動功能障礙。脊髓半切斷后2周，有相當多的運動功能恢復(BBB得分12-13，數據未顯示)。BBB得分12， 其與頻繁-到-始終 一 致的重量-支持幻覺(frequent-to-consistent weight-supporting phantom)步驟和臨時的前腿-后腿協調相對應，足以允 許體覺-誘導的爪收縮的完全行為測試。脊髓半切斷后1周，在兩只后爪 中觀察到機械性異常性疼痛，當與手術前的閾值(11.2±1.68 g身體同側, 11.6±1.71 g身體對側)相比時，其表現為后爪退縮閾值顯著減少到等級系 列的vonFrey纖絲刺激(1.71士0.35g身體同側，1.9±0.52 g身體對側)。脊髓 半切斷后1周在兩側后爪的足底表面皮下接種QHGAD67 (1 x 109 pfU/ml, 30pl/爪)，在接種后l周(損傷后2周)檢測，顯著增加了后爪退縮閾值
(4.4±1.12 g身體同側，4.1±0.75 g身體對側)。接種Q0ZHG的對照動物在 它們的機械性閾值中沒有表現出變化(與QHGAD67比較，1.8士0.28g身 體同側，L6士0.34g身體對側，尸O.01)。最大抗異常性疼痛作用(g卩，爪退 縮閾值的增加)發生在QHGAD67接種(5.19±0.82 g身體同側和5.8±1.14 g身體對側)后兩周，并且抗異常性疼痛作用持續5周，在接種后六周減 少到2.86土0.63g身體同側和3,2士0.47g身體對側(圖5A和5B)。在初始 接種后六周用相同劑量的QHGAD67重新接種到兩側足墊重新建立了抗 異常性疼痛作用。通過重新接種獲得的作用的數量級至少同通過初始注射 所述載體而產生的作用的數量級一樣大，并且通過重新接種產生的作用的 持續時間比由初始接種引起的作用的持續時間略微長一些(6-7周)。在所 有時刻，在QOZHG-接種的和賦形劑-處理的大鼠之間的爪退縮閾值中不 存在顯著差異(圖5A和5B)。
在脊髓半切斷后，動物還表現出熱痛覺過敏，與手術前的值(12.6±1.23 s身體同側，12.1±1.25 s身體對側)相比，其表現出應答有害熱刺激的退縮 潛伏期的減少(6.7士0.51 s身體同側，6.9±0.6 s身體對側)。QHGAD67接種 后1周(脊髓半切斷后2周)，與Q0ZHG-接種的對照(6.5士0.43 s身體同側， 7.1±0.42 sec身體對側)相比，在熱潛伏期中存在統計學顯著的增加
(8.8±0.48 s身體同側，8.7±0.71 s身體對側)。除了峰值作用發生在接種后 4周(9.7士0.71 s身體同側，9.62士0.78s身體對側)以外，抗痛覺過敏作用 的時間過程與所述載體的抗異常性疼痛作用的時間過程相似(圖5C和 5D)。在第6周重新接種QHGAD67載體也重新建立了抗痛覺過敏作用。
第二次接種后的抗痛覺過敏作用的持續時間和數量級比在初始接種后的 那些更久和更大。在任何時間階段，在賦形劑-處理的和Q0ZHG-接種的動物之間的兩只后爪退縮潛伏期中沒有顯著差異(圖5C和5D)。
對于這些測試，使用雄性Sprague-Dawley大鼠，體重175-200 g。籠 養條件和實驗方法受到University of Pittsburgh, Institutional Animal Care and Use Committee的核準。將大鼠在水合氯醛麻醉(400 mg/kg)下，通過 觸摸最末的肋骨(與T13附著)而定位T11-T12脊椎層。做出縱向切口， 暴露一些片段，并且在兩個椎節(T11-T12)進行椎板切除術。通過伴隨 的背部血管而確定腰部放大，并且使用11號解剖刀在T13進行脊髓半切 斷，小心不要損傷主要的背部血管和血管分支。將具有28-線規針頭的結 核菌素注射器背腹地置于脊索中線，并且側面推進，以保證完成脊髓半切 斷。將肌肉和筋膜縫合關閉，并且將皮膚用自動小夾封閉。手術后，將動 物保持在相同的手術前條件下。在手術后3小時內所有的動物都進食和飲 水。使用BBB運動等級量表(Locomotor Rating Scale)觀察并記錄運動功 能，以保證與脊髓半切斷同側的肢體的運動恢復足以允許體覺行為測試。 在那時將在兩只后肢都表現出運動損失的動物(這表明兩側皮層脊髓束反 式作用)排除在研究外。然后，將符合標準的動物用載體接種。每組6只 動物用載體接種，并且通過重現接種進行檢驗。
機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的行為測試在生理周期的白天部分 (8:00 AM到5:00 PM)進行。通過使用一系列von Frey纖絲(0.4， 0.7， 1.2， 1.5， 2.0， 3.6, 5.5, 8.5， 11.8和15.1 g)檢測應答等級性機械刺激的爪退縮閾 值，而評估機械性異常性疼痛。將大鼠置于底部有網孔的透明的塑料室中， 持續至少30分鐘，以使之適應環境，之后將vonFrey纖絲以強度上升的 順序連續應用到足的足底表面，力量足以引起爪輕微彎曲并且保持6 s。 將針對von Frey纖絲應用的敏銳的足退縮視為陽性反應，并且引起進行下 一次更弱的刺激。熱痛覺過敏通過檢測針對輻射熱源的爪退縮的潛伏期而 進行評估。在這種測試中，將大鼠置于燈箱上的玻璃盤上。10分鐘的適 應期后，將爪的足底表面暴露于一束通過玻璃板應用的輻射熱。當大鼠舉 起四肢時，通過光電池自動關閉光束，允許檢測光束開始和爪退縮之間的 時間。這一時間定義為爪退縮時間。測試總是在5分鐘的時間間隔進行3次，并且將20秒用作截斷時間。
實施例6
本實例說明GAD載體接種的行為作用被比枯枯靈堿和phaclofen逆轉。
使用GABAA受體-選擇性拮抗劑比枯枯靈堿和GABAB受體-選擇性拮 抗劑phaclofen，檢驗QHGAD67-介導的抗疼痛作用的藥理學基礎。給手 術后兩周的假手術動物鞘內施用比枯枯靈堿(0.5昭；Sigma)或phaclofen (0.8 pg; Sigma)沒有改變機械閾值或熱潛伏期。給接種QHGAD67的具有 脊髓半切斷的大鼠施用相同劑量的比枯枯靈堿，在藥物施用后10-15分鐘 檢測，將與脊髓半切斷同側的機械閾值從4.87±1.13 g減小到3.5±0.7 g (尸<0.05)，將與脊髓半切斷對側的機械閾值從5.75±1.41 g減小到3.38±0.9 g(尸O.Ol)(圖6A)。鞘內phaclofen將與脊髓半切斷同側的機械閾值減小 到3.6±0.78 g (尸<0.05)，將與脊髓半切斷對側的機械閾值減小到4.05±0.75 g (尸<0.05)(圖6A)。熱退縮潛伏期，通過施用比枯枯靈堿，在身體同側 從9.28±1.39 s減小到7.23±1.21 s (P<0.05)，在身體對側從9.56±1.5 s減小 到7.4U1.29 s (P<0.05)，并且通過施用phaclofen,在身體同側減小到 7.54±1.16s(P<0.05)，在身體對側減小到7.66±1.24s(P<0.05)(圖6B)。在 每種情形中，藥物的作用通過在藥物施用后30分鐘的峰值作用進行檢測。 接種后1小時，不再存在任何可檢測到的藥物作用。在用Q0ZHG接種并 且用相同劑量的比枯枯靈堿或phaclofen處理的大鼠脊髓半切斷中，在機 械閾值或熱潛伏期中沒有顯著變化。
實施例7
本實例說明用GAD載體進行細胞轉導減小了背角質中的CGRP免疫反應性。
在假手術的動物中，在L5部分的CGRP免疫反應性是微弱的，主要 限制在身體兩側脊髓的淺表背角質內的層I和11。左側T13半切斷后1周， CGRP免疫反應性增加，并且可以延伸到兩側背脊髓的層III和IV而檢測 到染色。在兩只后爪接種QHGAD67后1周，在脊髓半切斷的大鼠中，與用QOZHG接種的脊髓半切斷的大鼠(107.3±22.4 OD單位身體同側， 86±23.5單位身體對側，P〈0.05)或賦形齊lJ-處理的動物(96.7土21.8OD 單位身體同側，104.6士22.6 0D單位身體對側，P〈0.05)相比較，CGRP-樣免疫反應性減小(76.5士13.3 0D單位身體同側，63.6士12.40D單位身 體對側)。在QOZHG-接種的和賦形劑-處理的動物之間在染色上不存在顯 著差異(圖7)。
通過免疫組織化學確定GAD蛋白在未損傷的轉導動物中的分布以及 CGRP肽在損傷的轉導動物中的分布。將大鼠心內(intracardially)灌注4% 低聚甲醛的O.l M磷酸緩沖液，將脊髓L5片段和附著的根部去除，而后 在相同的溶液中固定2小時，并且用30%蔗糖的PBS溶液冷凍保護2天。 將20微升冷凍液解凍，包埋在冷的Superfrost顯微鏡載玻片(Fisher, Pittsburgh, PA, USA)上，并且在4。C與兔抗-GAD67 (1:2000， Chemicon)或 兔抗-CGRP (1:500， PLI, San Carlos, CA， USA)溫育過夜，然后在室溫下與 熒光抗-兔IgG (Alexa Fluor 594, 1:500， Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 溫育2小時。通過共聚焦顯微鏡(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI USA)捕獲熒光成像。
實施例8
本實例說明，使用單純皰疹病毒載體將編碼GAD的基因轉移到背根 神經節減輕了外周神經性疼痛。
重225-250 gm的雄性Sprague-Dawley大鼠進行選擇性L5 SNL (按照 Hao等.，Pain; 102: 135-42 (2003)所述)。SNL后一周，將30 pi載體 (QHGAD67或QOZHG，每毫升4X 108個蝕斑形成單位)皮下注射到與 連接在身體同側的左后爪的足底表面。通過評估針對等級抗張強度的von Frey毛發的爪退縮反應(參見Hao等.，supra,和Chaplan等.，J Neurosci Methods, 53:55-63 (1994))，而確定由SNL誘導的機械性異常性疼痛，觸 覺剌激產生使用上-下方法(up-down method)(參見Dixon等,，Annu Rev Pharmacol Toxicol; 20:441-62 (1980))確定的50%的退縮可能性。熱痛覺過 敏使用Hargreaves裝置(如Hargreaves等.，Pain; 32:77-88 (1988)中所述)進 行確定，所述裝置記錄從直接放置在后爪下的輻射熱刺激的退縮時間。
在L5 SNL后，大鼠表現出激發針對vonPrey毛發刺激的敏銳的退縮 反應所必需的機械刺激的量級的顯著減小(圖IIA)，以及在從熱刺激隨后 的對退縮的潛伏期中的顯著減小(熱痛覺過敏；參見圖IIB)。接種 QH-GAD67的大鼠從接種后1周開始在機械閾值上表現出統計學顯著的 增加。QHGAD67-介導的GABA表達的抗異常性疼痛作用保持并且繼續， 持續5-6周，并且在接種后2周達到峰值(參見圖IIA)。機械閾值的峰 值，8.6gm，接近手術前的值。到接種后7周，載體轉導的抗異常性疼痛 作用消失，并且QHGAD67-注射大鼠的機械性閾值與對照大鼠的相同。 用相同劑量的QHGAD67重新接種到同一爪重建了抗異常性疼痛作用(參 見圖11A)。 SNL誘導熱潛伏期從10.7減小到6.5秒，其在逐漸恢復之前 持續3周。接種QHGAD67的大鼠從接種后1周開始在身體同側爪的熱潛 伏期中表現出統計學顯著的增加(參見圖IIB)，所述作用保持并且繼續， 持續3-4周(參見圖IIB)。假手術的動物在機械性閾值或熱潛伏期中沒 有變化。
由溫柔觸摸誘導的c-Fos和磷酸化胞外信號-調控激酶1和2 (p-ERKl/2)的表達是疼痛過程的一種間接生物標記(Catheline等.，Pain; 92:389-98 (2001))。 SNL后3周，進行溫柔觸摸，每4秒鐘1次，持續10 分鐘，用實驗者拇指的平面觸摸大鼠的爪，并且免疫反應細胞(抗-c-Fos 或抗-p-ERK1/2抗體；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)的數目檢 測抗生物素蛋白-生物素辣根過氧化物酶，然后是鎳-增強的二氨基聯苯胺 (Vector Laboratories, Bur- lingame， CA)。與假手術的對照大鼠相比，在與 SNL的身體同側，Fos-LI-陽性神經元的數目基本上增加了，并且接種載 體QHGAD67顯著地減少了層I-VI中Fos-LI-陽性神經元的數目(參見圖 12)。在溫柔觸摸刺激后，在具有SNL的大鼠中p-ERKl/2在層I和II中 的表達也增加了，并且所述增加在接種QHGAD67的動物中得到阻滯。在 假手術動物中，p-ERK沒有受到IO分鐘的溫柔觸摸刺激的誘導，但是在 接種QOZHG的動物中在脊神經連接(SNL)后，p-ERK基本上得到誘導。 在接種QHGAD67的動物中，觸摸誘導的p-ERKl/2的表達受到抑制，這 通過計數在背角質中的p-ERKl/2-陽性神經元而證實(圖13)。
這些結果表明，在外周神經性疼痛模型中，皮下接種表達GAD的HSV載體以便在體內轉導DRG減弱了機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的行為表現；對行為的作用由表明在身體同側脊背角質中誘導c-Fos和p-ERKl/2 表達的組織學檢測而證實。
討論
實驗室大鼠脊髓在T13的側面半切斷在兩只后肢中損傷以下產生兩 側的SCI疼痛相關的行為("SCI模型")。SCI疼痛相關的行為表現為機 械性異常性疼痛和熱痛覺過敏。這一現象伴隨兩側的脊髓重組。在上文提 及的實驗中，這種SCI模型用來檢驗由于GAD載體介導的基因轉移到腰 部DRG引起的GABA的局部生產和釋放在減輕一些SCI疼痛表現中的作 用。
用編碼GAD的HSV載體("GAD載體")轉導DRG神經元。這些 轉導的DRG神經元在體外和體內表達GAD。 GAD在這些細胞中的表達 導致GABA的釋放。在進行T13脊髓側面半切斷然后皮下接種GAD載體 的實驗室大鼠中，來自轉導的DRG神經元的局部GABA釋放減輕了后肢 的機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏。這一作用可以被GABAa或GABAb 受體拮抗劑逆轉，所述拮抗劑被給予的劑量不改變正常動物的痛覺或進行 T13脊髓側面半切斷而沒有皮下接種GAD載體的實驗室動物的痛覺。此 外，GAD載體介導的GABA釋放還減弱在腰部背角質中SCI后發生的 CGRP免疫反應性的增加。因此，包括GAD載體介導的基因轉移到DRG 的所述本發明的方法可以有效地用于治療平面以下神經性SCI疼痛。
在含有60 mM K+的培養基中，GABA從體外轉導GAD載體的初級 DRG神經元的釋放沒有增加，并且不被從培養基中移除02+而受影響， 這表明GABA釋放不是囊泡式的，而是組成型發生的，可能通過GABA 轉運體的翻轉而發生。盡管在體內從神經末梢釋放的GABA的量足以顯 著升高背角質微量透析物中的GABA水平，但是在這些動物中沒有運動 缺點的證據，這表明轉基因介導GABA釋放局限于背角質。這與下述觀 察一致，即，通過皮下接種表達腦啡肽原的HSV載體轉導的動物獲得局 限于與所述接種在身體同側的肢體的止痛作用。
在具有未損傷的脊髓的實驗室大鼠中，低閾值傳入輸入的增強的GABA-ergic抑制作用調節感覺處理，并且GABA受體功能的比枯枯靈堿 阻斷產生疼痛相關的行為。電生理學研究表明，GABAa和GABAb受體都 引起脊髓水平的疼痛神經傳遞的增強的調控。外周神經損傷導致背角質中 GABA水平的減少，和部分神經損傷后在背角質中初級傳入激發的抑制性 后突觸電流的減少。然而，這些現象是否是由GABA-ergic中間神經元的 丟失或如在中樞致敏作用中發現的GABA受體的脫敏作用所引起，沒有 完全確定。已經報道了在脊髓缺血的光化誘導后腰部脊髓中的GABA免 疫反應性的瞬時減少，但是先前的研究沒有檢驗半切斷平面以下的GABA 免疫反應性。但是，由于GAD載體轉導DRG神經元引起GABA向半切 斷平面以下的背角質的組成型遞送減弱了 SCI后機械性異常性疼痛和熱 痛覺過敏的行為檢測。這表明，SCI疼痛對GABA的調控敏感。
己經在一些試驗中評估了 baclofen對中樞神經性疼痛的作用，通常在 簡短(brief)試驗中有陽性結果，但是只有較少顯著的長期減輕。在SCI缺 血性模型中，鞘內施用baclofen部分減輕了慢性機械性和冷異常性疼痛。 在神經性疼痛的慢性收縮性損傷模型中，鞘內移植GABA-釋放細胞逆轉 了神經性疼痛的一些表現。己經發現，GAD載體介導的GABA釋放的疼 痛減輕作用持續幾個星期的過程。
沒有檢測GABA隨時間釋放的量。然而，觀察到，在止痛作用后重 新接種GAD載體減弱了重新建立機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的減 輕。這一觀察證明治療作用的丟失不是由于耐受性的發展，而是由于基因 表達的減少。這與先前的研究的發現一致，所述先前的研究檢驗其中轉基 因表達受到瞬時活化的人巨細胞病毒早早期啟動子(HCMV正p)推動的載 體。
沒有疼痛和疼痛減輕的"客觀(objective)"檢測。然而，在實驗室中， 已經用在SCI模型中損傷水平以下脊髓片段中CGRP免疫反應性的量的 增加的檢測來檢測疼痛和疼痛減輕。不幸地，關于SCI模型中增加的脊髓 CGRP的現象所知甚少。還沒有確定負責水平以下CGRP增加的機制。免 疫反應性的增加是否與在CGRP翻轉上增加的釋放相關是未知的。CGRP 是否在SCI疼痛現象中起任何作用或者是否作為SCI的副現象而發生也是 未知的。但是，在這些研究中發生在SCI后的CGRP的增加作為與疼痛
行為檢測的組織學相關性，類似于在外周神經性疼痛的脊髓神經連接模型 中由無害性觸摸誘導的c-fos免疫反應性的增加。因此，CGRP檢測可以
用來確定GAD載體在治療SCI疼痛中的作用。盡管不希望受到任何具體 理論的束縛，但是由于CGRP位于主要投射到背角質的層I、 II和V的無 髓鞘的和稀疏有髓鞘的傳入神經處，所以據信CGRP的增加由初級傳入神 經的萌發導致。GABA從GAD轉導的細胞釋放防止CGRP表達增加的機 制是未知的。
從前文，按照本發明，成功構建了設計成表達人谷氨酸脫羧酶(GAD) 的非復制性HSV載體，并且將這一載體用于治療SCI疼痛以及外周神經 性疼痛。這些實例說明包括包括應用基因轉移方法的本發明方法可以用來 轉導DRG神經元，通過外周接種在背角質中釋放GABA。這些實例還說 明包括使用GAD載體的基因轉移的本發明方法減輕SCI后的平面以下的 機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏。通過皮下接種遞送GAD載體的能力是 治療SCI疼痛以及外周神經性疼痛的本發明方法的吸引人的特征。
除非另外指明，本發明的實踐應用本領域技術內的病毒學、微生物學、 分子生物學的方法和重組DNA技術的常規方法。這樣的技術在文獻中有 充分地解釋。(參見，例如，Sambrook，等.Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames禾卩S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames禾卩S. Higgins， eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Virology,第二版，Vol. I & II (B. N. Fields和D. M. Knipe, eds.))。
本文引用的所有的參考文獻，包括出版物、專利申請和專利，都通過 參考結合于此，它們以好像每一參考文獻單獨地并且具體地指明通過參考 結合并且在本文中完全提出一樣的程度結合。
術語"a"(—個)禾口"an"(—個)禾口"the"(這個)以及類似的指示詞在 描述本發明的情形中(特別是在下述權利要求的情形中)的應用應該解釋 為涵蓋單數和復數，除非在本文中另外指明或者與上下文明顯地相互抵 觸。除非另外指明，術語"comprising"(包括)，"having"(具有)，"including"(包括)以及"containing"(含有)應該解釋成開放的術語(即，意指"包 括，但不限于")。除非本文另外指明，本文值的數值范圍的引用僅僅意欲 作為獨立地參考落入所述范圍內的每一獨立值的速記方法，并且每一獨立 值如其在本文中獨立地引用那樣結合在說明書中。本文所述的所有方法可 以以任何適宜的順序進行，除非本文另外指明或者另外與上下文明顯地相 互抵觸。任何以及所有實例的應用，或者本文所提供的示例性語言(例如，"諸如")的應用，僅僅是意欲更好地舉例說明本發明，并且不構成本發 明的范圍的限制，除非另外要求。說明書中沒有語言應該被解釋成是指實 施本發明重要的任何非要求的元素。
本文描述了本發明的優選實施方案，其包括本發明人已知的實施本發 明的最佳方式。當考慮到前面的描述時，這些優選實施方案的改變對于本 領域的普通技術人員是顯而易見的。本發明人希望熟練的技術人員適當地 應用這些改變，并且本發明人意欲按照與本文詳細描述所不同的方式實施 本發明。因此，本發明包括按照適用的法律允許的在附上的權利要求中引 用的主題的所有改進和等價物。此外，在所有可能的改變中的上述元素的 任何組合都包含在本發明內，除非本文另外指明或者另外與上下文明顯地相互抵觸。
權利要求
1.一種包括非擴增子重組單純皰疹病毒(HSV)的載體，所述單純皰疹病毒包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列，所述載體包括ICP4、ICP27的延長的缺失以及UL55的缺失。
2. 權利要求1的載體，其中所述GAD蛋白是GAD67。
3. 權利要求1的載體，其還包括與編碼GAD蛋白的多聚核苷酸序列可操 作地連接的可誘導的啟動子。
4. 權利要求1的載體，其還包括與編碼GAD蛋白的多聚核苷酸序列可操 作地連接的人巨細胞病毒早早期啟動子(HCMVIEp)。
5. 權利要求1的載體，其中所述編碼GAD蛋白的序列插入到重組HSV 的UL41、 ICP4或ICP27基因座。
6. 權利要求l的載體，其還缺失至少一種必需HSV基因。
7. 權利要求6的載體，其中所述必需HSV基因是早早期、早期或晚期 HSV基因。
8. 權利要求1的載體，其還缺失選自由下列各項組成的組的早早期基因 ICP22和ICP47，以及它們的組合。
9. 權利要求l的載體，其中所述重組HSV是復制缺陷型的。
10. —種病毒儲液，其包括權利要求1或9的載體。
11. 一種組合物，其包括權利要求1或9的載體和生理學可接受的媒介物。
12. 權利要求1-11中任一項的載體在用于制備治療哺乳動物內的脊髓損 傷疼痛或外周神經性疼痛的藥物中的應用。
13. 權利要求12的方法，其中所述哺乳動物是人。
14. 一種HSV載體，其包括ICP4、 ICP27的延長的缺失以及UL55的缺 失。
15. 權利要求14的HSV載體，其還包括缺失至少一種其它必需HSV基 因。
16. 權利要求15的載體，其中所述必需HSV基因是早早期、早期或晚期 HSV基因。
17. 權利要求16的載體，其中所述早早期基因選自由下列各項組成的組:ICP22、 ICP47以及它們的組合。
18. 權利要求14的載體，其中所述重組HSV是復制缺陷型的。
19. 權利要求14的載體，其還包括轉基因。
20. 權利要求19的載體，其中所述轉基因編碼GAD。
21. 權利要求19的載體，其中所述轉基因編碼腦啡肽。
22. 權利要求14-21中任一項的載體在制備藥物中的應用。
23. 與HSVICP4、 ICP27和UL55基因互補的細胞系。
全文摘要
本發明提供一種載體，優選單純皰疹病毒(HSV)載體，其包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列。本發明還提供這樣的載體的儲液以及包括這樣的載體的藥物組合物。本發明還提供治療哺乳動物中的疼痛諸如脊髓損傷疼痛的方法，所述方法包括給哺乳動物施用有效治療脊髓損傷疼痛的量的包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的核苷酸序列的載體。
文檔編號C07K14/435GK101203530SQ200580044783
公開日2008年6月18日 申請日期2005年10月28日 優先權日2004年10月28日
發明者戴維·J·芬克, 戴維·克里斯基, 約瑟夫·C·格格廖索, 達瑞恩·沃爾夫 申請人:匹茲堡大學高等教育聯邦體系;美國退伍軍人事務部