專利名稱：從原料中分離角蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種從角蛋白原料中分離角蛋白的方法和裝置，以及通過該方法得到的角蛋白。
背景技術：
本領域公開的多種從含有角蛋白的原料分離角蛋白的方法包括在導致蛋白水解的極端條件下處理含有角蛋白的原料。結果，由這些方法得到的角蛋白的分子量低于原始蛋白(original protein)。Harrap和Woods(Biochem J.902，1964，16)報道了來自羽毛的單體蛋白分子量為10.4kDa。結果，從現有技術方法得到的角蛋白分子量通常低于10.4kDa。
本發明的發明人假設，對于許多潛在應用，需要以使天然分子量降低最少或者保持天然分子量的方式制備蛋白。特別是在預期應用為當需要高分子量時提供聚合材料替代品的情況下。使所分離的蛋白分子量最大也會使后續的蛋白改性的化學可能性最大化。
本領域公開的多種從含有角蛋白的原料分離角蛋白的方法并不適用于放大的工業過程。例如，現有技術中公開的一些方法包括用“干酪包布(cheese cloth)”物理分離。一些方法涉及二氧化硫或硫化氫氣體，這樣盡管在實驗室規模上并不被禁止，然而當放大時就會造成嚴重的問題。而且，一些方法包括形成凝膠，這在工業規模的方法中是非常難處理的。
因此，需要一種以下述形式從角蛋白原料中分離角蛋白的方法其提供進一步化學或物理修飾的機會、并且利用對工業規模的處理來說可實施的方法。
發明內容
根據第一方面，提供了一種從含有角蛋白的原料中分離角蛋白的方法，該方法包括以下步驟i.將含有角蛋白的原料在液體介質中還原，在角蛋白水解最小化的條件下將角蛋白溶解，生成角蛋白溶液和不溶固體；ii.在不插入任何角蛋白沉淀步驟的情況下，對角蛋白溶液進行過氧化物氧化；和iii.在氧化步驟之前、同時或之后，將角蛋白溶液與不溶固體分離。
上文概述的方法消除了產生硫化氫或二氧化硫的危險。工業過程中產生這些氣體是非常成問題的。本發明的各個實施方式提供了相對于現有技術的進一步的優勢。
優選還原進行到如下程度角蛋白中存在的胱氨酸的二硫鍵被破壞，形成半胱氨酸殘基，但是未發生水解。通過在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(“SDS-PAGE”)中檢測對應于分子量10kDa以上的主要分子量譜帶，與已知標準物比較，可以對此進行可視化評價。該譜帶反映了步驟i.中溶解的角蛋白中大部分的分子量為10.4kDa或更高。通常，這種電泳結果反映了步驟i.中溶解的角蛋白中至少90％的分子量在該范圍內。在角蛋白源自木材的情況下，如果還原進行到胱氨酸殘基的二硫鍵還原成半胱氨酸而角蛋白未發生水解，這對應于步驟i.中溶解的角蛋白中至少90％、典型地至少94％的分子量高于11kDa。
根據第二方面，還提供了一種通過以上列出的方法生產的產品。
根據第三方面，提供了一種從含有角蛋白的原料制造角蛋白的裝置，該裝置包括i.洗滌設備，其用于洗滌含有角蛋白的原材料；ii.消化器(digestion vessel)，其用于還原含有角蛋白的原料以產生角蛋白溶液和不溶固體；iii.氧化處理區，其用于氧化角蛋白溶液；iv.分離設備，其用于將角蛋白溶液與不溶固體分離；v.超濾設備，其用于除去過量的鹽，并濃縮角蛋白溶液；和vi.輸送器，其用于將含有角蛋白的原料或物流通過該裝置的各個其它部件從洗滌設備輸送至超濾設備。
優選該裝置進一步包括vii.磨機，其用于在還原之前將含有角蛋白的原材料破碎。
該磨機在裝置中適合位于消化器之前。
氧化處理區可以由容器、輸送器、消化器或者其它任何角蛋白溶液可以在其中與過氧化物氧化劑接觸的設備部件或區域構成。分離設備在裝置中位于消化器(在其中產生角蛋白溶液和不溶固體)之后，但是可以位于氧化處理區之前或之后，或者與其結合。
圖1是說明根據本發明一個優選實施方式從含有角蛋白的原材料中分離角蛋白的方法步驟的示意圖。
圖2是顯示通過該方法得到的角蛋白樣品的Tris-Tricine凝膠電泳的照片，從左至右的條帶代表精確MW標準物；經氧化的羽毛@30℃；經氧化的羽毛@45℃；經還原的羽毛@30℃；以及多肽標準物。
圖3是顯示通過該方法得到的角蛋白樣品的Tris-HCl 15％凝膠電泳的照片，從左至右的條帶(條帶1和3為空)為條帶2-標準物，條帶4-pH11.3(1∶5)，條帶5-pH11.3(1∶10)，條帶6-pH10.8(1∶5)，條帶7-pH10.8(1∶10)，條帶8-pH10.1(1∶5)，條帶9-pH(1∶0)，條帶10-標準物。
具體實施例方式
現在，更詳細地說明本發明的優選實施方式。
含有角蛋白的原料含有角蛋白的原料可以來自任何角蛋白源，包括羽毛、羊毛、毛發、動物的蹄或爪、動物的角、動物的鱗片或任何其它角質表皮原料或上述原料的混合物。一種優選的含有角蛋白的原料來源是羽毛，例如雞和/或火雞的羽毛。另一種優選的來源是羊毛。提供至該方法步驟(i)的含有角蛋白的原料可以經受洗滌，并任選地經受破碎過程。下文中更詳細地說明這種原材料的制備步驟。
原材料的制備角質原材料優選地進行洗滌，并任選地破碎成較小的顆粒，以便處于適于經受該方法的還原步驟的形式。在非羽毛原料的情況下，制備有利地包括擦洗和洗滌，以除去外來的雜質、油脂和脂質。在這些原料如羊毛中，破碎通常可以是不必要的，盡管使用短羊毛可能會有實踐上或經濟上的優勢。
根據本發明的一個合適實施方式，角蛋白原料可以用含有適當的表面活性劑的溫水洗滌，并用水漂洗。如果不打算在洗滌步驟之后立刻處理角蛋白原料，則可以將其干燥。
在羽毛的情況下，有利地將其洗滌并破碎成更小的碎片，以便有助于在該方法的還原步驟中消化。洗滌可以通過在含有表面活性劑的水中洗滌而進行，如上文所述。之后，根據本發明的一個實施方式，通過剁碎和/或研磨將洗滌過的羽毛破碎。類似地，在還原步驟中的消化之前，還可以通過剁碎或研磨將干羽毛破碎。破碎可以在任何合適的設備中進行，例如屠夫所用類型的剁碎機、或者旋轉刀片(如Wiley)磨。破碎使得更大量的角蛋白能夠從羽毛原料中被提取出來，但其代價是進行破碎的能量和設備成本。在多數情況下，破碎步驟會是允許的。
還原步驟根據一個實施方式，含有角蛋白的原料可以是羽毛或羊毛原料，將其在液體介質中還原，使角蛋白溶解。該方法的這一步驟有時也稱為“消化”。
還原步驟將含有角蛋白的原料中角蛋白的胱氨酸殘基中的二硫鍵還原成半胱氨酸(含有末端硫醇基團)，將聯結的角蛋白鏈破壞成較小的鏈。在羽毛角蛋白的情況下，較小的鏈的長度為大約10.4kDa，盡管可能保留了一些較大的鏈，但優選大多數產物是10.4kDa的產物(即，正好高于10.0kDa)。在羊毛角蛋白的情況下，有許多種二硫鍵之間的分子量不同的蛋白。其中的大多數，大約94％以上，大于11kDa。大約6％的蛋白被稱為“高Gly/Tyr”蛋白，其分子量為9-13kDa，因此還原蛋白中的非常少的百分比(低于6％)將包括一些分子量為9-11kDa的蛋白。但是，凝膠電泳的直觀評價結果反映了主要分子量部分高于10kDa。
還原步驟合適地在使角蛋白水解最少的條件下進行。換句話說，還原條件破壞二硫鍵，但沒有劇烈到使角蛋白水解。參考還原步驟后角蛋白的分子量，可以測量角蛋白的水解程度。如果蛋白產物的分子量低于上述特定角蛋白類型的水平，則還原條件沒有做到使角蛋白水解最少。特別是，對于羽毛來說如果多數角蛋白的分子量低于10.4kDa，或者對于羊毛來說如果多數角蛋白的分子量低于10.4kDa(或更具體地說11kDa)(注意，當條件符合要求時，高達6％的羊毛蛋白將在9-13kDa)，則還原條件太過苛刻了。在本發明方法的典型條件下，實施例中所述類型的直觀評價表明，產物的主要分子量部分對應于分子量為10.4kDa或更高的產物。該直觀評價對應于下述產物該產物的至少90％、通常為至少95％在該分子量范圍內。由于來自所收取羽毛的雜質材料如碎片或翎管中粘附的肉組織和血，產物可能不會100％不含低分子量的物質。
蛋白的大小通常使用所提取的羽毛蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行定性評價，其分子量下限為5kDa。注意到所有提到的分子量評價均基于聚丙烯酰胺凝膠電泳與用于比較的分子量部分已知的標準物比較，其分子量下限為5kDa。對羽毛蛋白產物進行定性PAGE時，觀察到對應于10.4kDa的重條帶，以及在大約25kDa、35kDa和50kDa的輕條帶。在10.4kDa的條帶下至5KDa的下限，不能檢測到明顯的條帶。對于羊毛角蛋白產品，條帶通常反映了能夠被溶解的羊毛的組成角蛋白部分，如下
參考文獻Wool Science-The Chemical Reactivity of the Wool Fibre.John AMaclaren and Brian Milligan，Science Press(1981)page 13.
為使角蛋白的水解最少，還原時間和溫度之間必須達到適當的平衡。以下數字應用于在大氣壓下進行的還原，如果在壓力下進行，相應地應當對時間和溫度進行修改。通常，在羽毛角蛋白的情況下，對于反應溫度為50℃或更低，還原時間應當為1小時或更少，例如，對于在大氣壓下持續消化大約45分鐘，還原溫度適當地為45℃。但是，如果還原溫度為25℃或更低，則還原階段可以進行超過高達1.5小時或更長的一段時間。在羊毛角蛋白的情況下，25℃下還原時間可以是1小時至72小時，溫度更低使還原溫度能夠更長，溫度更高使還原時間能夠更短。假設在大氣壓下，對于25℃至50℃的溫度，時間適當地為30分鐘至1.5小時。
還原階段可以在空氣或含氧氣氛中進行，或者另外可選地，可以在減氧(oxygen-reduced)或不含氧的氣氛中進行。還原可以在惰性氣體氣氛如氮氣氣氛中進行。假設在氮氣氣氛中還原可以進一步減少角蛋白溶液形成凝膠的傾向。隨后的試驗表明，凝膠化性質的差異不足以觀察得到。
還原劑可以是任何合適的使角蛋白消化同時使其水解最少的還原劑。根據本發明的優選實施方式，還原劑為堿金屬硫化物，例如硫化鈉或硫化鉀。在堿金屬硫化物還原劑的情況下，其適當的用量為5克/100升到1,000克/100升，這取決于含有角蛋白的原料(例如羽毛或羊毛)的性質、溫度、壓力、pH和時間條件。使用來自還原產物的分子量信息作為指標，并結合本文所述的實施例，通過合理的反復試驗，可以確定適當的平衡。通常，對于羊毛基角蛋白原料條件將會更劇烈。
優選還原階段在堿的存在下進行，更優選在堿金屬氫氧化物的存在下進行。適當的堿的例子為氫氧化鈉和氫氧化鉀。
還原階段中還可以使用其它添加劑。適當的添加劑包括表面活性劑等。在某些情況下，在還原過程中的不同階段加入表面活性劑(包括陰離子、陽離子和非離子表面活性劑)可以用于改善最終角蛋白產品的特性。
根據一個實施方式，堿的加入量足以將pH調節至12.0-13.5。根據一個優選實施方式，pH被調節至13.0。
將原料從還原容器中排出之后角蛋白的還原將繼續發生，除非加入合適的試劑而將還原容器中的還原終止。因此，已經發現需要對后續步驟進行控制，以保證持續的還原不會進行到發生水解的程度。
不溶固體的分離使用避免過量凝膠形成的技術，通過角蛋白的聚集將角蛋白與不溶固體分離。
對于小規模過程，溶解蛋白與不溶固體的分離可以通過下述方式進行在離心之后，進行快速真空過濾除去殘余的細顆粒物質。但是，根據特別適合于較大規模過程的優選實施方式，使用真空或壓力過濾設備。所試驗的最適用設備是壓濾機，盡管預計其它持續或半持續地在進行分離的進料材料上呈現新鮮過濾表面的過濾器也是可行的。要注意，轉鼓過濾機不像壓濾機那樣適用于該方法。優選類型的壓濾機是混合板或全板型膜式壓濾機。大量這種類型的過濾器是市售的，例如，在Filters and Filtration Handbook(過濾器和過濾手冊)，第三版(1994)Christopher Dickenson，Elsevier Advanced Technology中所述的那些。
如果使用連續傾析式離心機，則需要G力高到足以實現固體與蛋白溶液的高度分離，以避免需要進一步的分離階段來除去殘余原料。
根據一個優選實施方式，分離步驟在溶解角蛋白的聚集之前進行。優選固體的分離在還原步驟之后不超過4小時的時間之內進行。
根據本發明的一個具體實施方式
，分離步驟在還原步驟結束后1小時的時間之內開始，且所分離的不溶固體經歷第二還原階段。該第二還原階段與第一階段類似，在液體介質中進行，在使角蛋白水解最少的條件下使角蛋白溶解于該液體介質中，從而得到質量與第一階段中所生成者類似的角蛋白溶液。第二還原階段的殘余固體可以被視作不溶固體廢料。
第二還原/消化階段可以在與第一或初級階段相同的條件下進行，或者在修改條件下進行，以便在該過程中進一步處理而進一步回收角蛋白。角蛋白的“二級溶液”可以與“初級溶液”合并，或者可以保持分開。使角蛋白二級溶液與初級溶液分開的一個原因是如下事實來自二級還原/消化的蛋白量和所提取的蛋白的分子量可以是可變的(通常低于初級階段)。在蛋白的堿消化過程中，特別是在硫化物的存在下，二硫鍵逐漸轉變成羊毛硫氨酸和溶素丙氨酸(lysinoalanine)殘基，其不能被額外的還原劑如硫化物切割。
優選如果進行二級還原/消化，則在步驟i的初級還原階段完成后不超過4小時的時間內進行。如果在進一步消化之前固體在堿性條件下保留4小時以上，羊毛硫氨酸和溶素丙氨酸殘基的量對二級收率具有顯著影響。
過氧化物氧化過氧化物氧化步驟可以用任何適當的過氧化物氧化劑進行，例如選自過氧化氫、過氧化鈉、過酸、過硼酸鈉和過碳酸鈉的那些。出于經濟原因，優選過氧化氫。過氧化氫通常以溶液形式提供。水溶液的濃度可以變化，但合適地為10％至50％，例如大約30％。
過氧化物氧化步驟有效地終止了含有角蛋白的原料中的角蛋白還原。過氧化物與溶液中殘余的還原劑反應或使其淬滅。因此，開始(初級)還原階段和開始氧化階段之間的時間優選少于6小時。
過氧化物氧化步驟將半胱氨酸殘基中的硫醇鍵氧化成磺丙氨酸。因此，氧化程度優選足以完全轉化成磺丙氨酸。
優選過氧化物的用量將pH降低至不低于10.0，優選不低于10.5，更優選不低于10.8。根據所進行的氨基酸分析的結果，優選用過氧化物將pH降低至大約11.3。
根據本發明的一個實施方式，從還原步驟開始到完成過氧化物氧化步驟之前，角蛋白溶液的pH沒有降低至低于pH10，優選11。
根據本發明的優選實施方式，在進行過氧化物氧化步驟之前，溶液中的角蛋白不會沉淀。
固體處理當從最初的含有角蛋白的原料中提取的角蛋白仍處于溶液中時，殘余的不溶固體(“固體廢料”)被分離出來。該分離可以在氧化步驟之前、同時、或之后進行。在一個適合的實施方式中，固體在還原之后、氧化之前被分離出來。
這些“不溶固體”可以進行上述的第二還原，或者廢棄。
在進行過氧化物還原之前將不溶固體(固體廢料)與角蛋白溶液分離的情況下，優選在分離和過氧化物氧化之間不插入其它處理步驟。此外，角蛋白溶液的過氧化物氧化優選在分離步驟完成后不超過1小時的時間之內開始。
為避免任何混淆，要注意此處所稱的“固體”并不是沉淀的角蛋白，而是在角蛋白從其中提取出來之后的殘余固體。盡管這些固體廢料可能含有殘余的角蛋白，它們被方便地稱作“無角蛋白固體”，因為要進行進一步處理的角蛋白已經從中除去。
可以對固體廢料進行處理以除去殘余的硫化物、中和、并作為添加劑提供給飼料或廢料制造廠。具體地根據包括從羽毛中提取角蛋白的實施方式，將固體在這些用途中再利用以使環境廢物最少。根據該實施方式，在消化液氧化之后僅有擦洗洗滌物和鹽需要排放到廢水處理。
任選的中和根據本發明的一個實施方式，在過氧化物氧化階段結束時，將蛋白溶液的pH調節至中性pH或在pH7-10之間，以避免肽鍵通過堿水解斷裂。蛋白溶液的pH可以通過任何適當的酸中和或調節。該酸包括無機酸如鹽酸、硫酸、碳酸、硝酸和硼酸，或者有機酸如甲酸、乙酸和乙醇酸。
在某些不會被溶液中殘余的鹽影響的應用中，這種中和的蛋白溶液可以不經進一步處理而使用。中和的蛋白溶液可以以溶液形式使用，或者可以任選地進行干燥。與未氧化的蛋白相反，干燥的蛋白很容易溶于水。
干燥中和的含鹽蛋白溶液的可能技術與下文中在涉及脫鹽和濃縮的角蛋白溶液的實施方式中所述者相同。
因此，根據本發明的優選實施方式，該方法還包括以下步驟iv.中和經氧化的角蛋白溶液。
脫鹽如上所述，中和的含鹽角蛋白溶液在某些應用中可以不經進一步處理使用。但是，根據本發明的優選實施方式，該方法還包括以下步驟v.對中和的角蛋白溶液脫鹽。
脫鹽是指除去在中和階段中產生的鹽。存在的鹽取決于中和步驟中使用的堿。
一種尤其適合對角蛋白溶液脫鹽的技術是使用超濾技術通過滲濾(diafiltration)脫鹽。滲濾有效地將大約1kD到1000kD的蛋白與小肽和鹽分離。滲濾使用交叉流超濾膜進行。優選使用3體積或更多倍體積的交換水(pH7)或緩沖溶液除去過量的鹽。但是，5體積或更多倍體積的交換水或緩沖液產生純度更高的產物。目前，正在使用大約10體積的交換。
在滲濾過程中引入純水或弱緩沖水溶液，以置換起始溶液中的鹽。
已經發現，根據本發明的方法產生的氧化蛋白的滲濾以優異的收率進行，且濾膜的阻塞最小。
濃縮任選對脫鹽的角蛋白溶液進行濃縮。
濃縮可以通過任何適當的技術進行。超濾是一種這樣的方法。具體地說，可以使用超濾設備將一些水從角蛋白溶液中除去或分離，從而對溶液進行濃縮。
超濾技術較大規模的超濾設備是可獲得的，其用于乳品工業。已經進行了多次嘗試，以測定在不堵塞膜或發生蛋白聚集的情況下超濾有效地將大于或等于10.4kDa的角蛋白與鹽分離并且使溶液濃縮的能力。通過如上所述地對處理步驟加以控制而實現這一點，其中將過去導致蛋白聚集或沉淀的官能團轉化成穩定的官能團。
能夠進行所需分離和濃縮的膜柱(membrane cartridge)或膜匣(membrane cassette)可獲自多個供應商如Millipore公司。這些膜的極限分子量通常略低于經還原和氧化的角蛋白的水平10.4kDa。本發明所使用膜的通常極限值低于10kDa但高于5kDa。
超濾階段中的滲濾和濃縮可以連續或半連續、或分批進行。半連續處理特別適合，使得一定量的溶液能夠在處理下一批量之前多次通過設備。
任選的角蛋白修飾在產生脫鹽并任選地濃縮的角蛋白溶液之后，可以進行蛋白側鏈的加成或修飾，如任意具體應用所要求的那樣。因此，根據本發明的一個實施方式，該方法還包括以下步驟vi.修飾角蛋白，以產生修飾的角蛋白基產品。
作為例子，可以通過獨立或結合地引入羧基、酰胺、羥基、芳基、烷基或芳香性基團而對角蛋白進行化學修飾。根據所做修飾的類型，修飾的角蛋白基產品可以保持可溶于水或基本可溶于水。
任選的干燥根據本發明的一個實施方式，該方法還包括以固體形式從溶液中回收角蛋白的步驟，例如，通過對經氧化的角蛋白的溶液進行干燥。該干燥步驟合適地在對角蛋白溶液進行脫鹽和/或濃縮之后進行。
用于干燥蛋白的合適技術包括冷凍干燥或噴霧干燥。出于經濟上的原因，噴霧干燥是優選的方法。但是，大規模冷凍干燥設備是市售的，其可以在24-36小時內處理大約1,000升溶液。由于資金和運行成本，冷凍干燥干燥通常僅用于高附加值的應用。
實施例實施例1圖1圖示說明了根據本發明的一個實施方式的方法。
圖1所示的實施方式涉及從羽毛A中提取角蛋白。羽毛A在洗滌設備(1)中洗滌和擦洗以除去血、污物和其它雜質。使用Dose GmbH公司制造的容量為250L的不銹鋼滾筒容器作為洗滌設備。然后，將洗滌過的羽毛在磨機(2)中破碎或研磨。所用的磨機是澳大利亞Butcher’sSuppliers Pty Ltd提供的屠夫剁碎機。
然后，將磨碎的羽毛產品轉移到消化器(3)中，在該消化器中還原磨碎的羽毛，產生含有角蛋白溶液和不溶固體的產物。消化器是另一種容量為250L的不銹鋼轉筒。產物混合物被轉移至Chemical Plantand Engineering Pty Ltd提供的0.87m2轉筒真空過濾器(4)，以便將固體與角蛋白溶液分離。該設備后來在裝配(assembly)中已經被壓濾機代替。壓濾機是例如意大利Diemme公司提供的膜式壓濾機。固體收集在容器(5)中，并且經歷第二還原/消化階段。在圖1中，箭頭表示固體返回到消化器(3)中，但通常返回第二消化/還原的固體被單獨處理。
在轉筒真空過濾設備(4)(現在被壓濾機4a代替)中的固體過濾階段之后，過濾器中排出的液流在氧化器(6)中經受氧化。氧化器是250L HDPE攪拌槽。
根據圖1所示的方法，氧化階段產物的中和在氧化器(6)中進行。但是，對此進行變化是可以的，中和可以在加工廠的獨立容器或區域中進行。
在該步驟之后，在超濾設備(7)中，對(中和)氧化的角蛋白溶液進行滲濾和濃縮。所用超濾設備具有MilliporeTM纖維素濾筒陣列，其分子量極限(MWCO)為5kDa。
如圖1中向左的箭頭所示，濃縮的角蛋白溶液可以是提取過程的產物(9)。另外可選地，如圖1中向右的箭頭所示，可以在噴霧干燥設備(8)中對濃縮的角蛋白溶液進行干燥。
該方法可以作為連續法或作為分批法進行。但是，優選連續法。術語“連續”包括半連續。
盡管圖1中沒有直接描述，在適當的設備如轉筒真空過濾設備或優選的壓濾機中，對二級消化/還原階段的產物進行固體過濾。該設備中分離出的固體廢料送至廢物處理，并用于制造飼料或肥料。
實施例2以下方法在圖1所示的設備和上文所述的設備中進行。
在洗滌設備中，用水和獲自Bayer公司的表面活性劑Baymol ATM洗滌和擦洗10kg羽毛。將洗滌過的羽毛在磨機中研磨，并將切碎的產品轉移至轉筒式混合機中。在轉筒式混合機中，將磨碎的羽毛在25℃用320克硫化鈉(以100％Na2S計)/100升水的溶液(因此，濃度為3.2克/升)消化。還原混合物的pH用氫氧化鈉調節至pH13。
磨碎的羽毛進行45分鐘以上的消化。消化之后，產物立即轉移到過濾設備中，在其中將固體與含有角蛋白的溶液分離。分離階段進行1小時以上。
將角蛋白溶液轉移至氧化器。在該容器中，向溶液中加入30％過氧化氫，直至pH降低至11.3。
然后，使用正切流過濾針對數倍體積的交換水(pH7)對氧化的溶液進行滲濾，對溶液進行脫鹽，pH降低至大約10。使用相同的超濾設備濃縮脫鹽的蛋白溶液，生成10％蛋白溶液。蛋白收率為40％。
實施例3以下方法在圖1所示的設備和上文所述的設備中進行，不同之處洗滌之后沒有將羊毛在磨機中破碎。
在轉筒式混合機中，將擦洗過的羊毛在25℃用100克硫化鈉(以100％Na2S計)/20升水(因此，濃度為5克/升)的溶液消化。還原混合物的pH用氫氧化鈉調節至pH13。
羊毛進行24小時以上的消化。消化之后，產物立即轉移到過濾設備中，在其中將固體與含有角蛋白的溶液分離。分離階段進行多達60分鐘以上。
將角蛋白溶液轉移至氧化器。在該容器中，向溶液中加入30％過氧化氫，直至pH降低至11.3。氧化之前未發生沉淀，因為從還原步驟開始到過氧化物氧化步驟完成，pH保持在10以上(實際上在11以上)。
然后使用正切流過濾針對數倍體積的交換水(pH7)對氧化的溶液進行滲濾，對溶液進行脫鹽，pH降低至大約10。使用相同的超濾設備濃縮脫鹽的蛋白溶液，生成5％蛋白溶液。
對該方案可以進行各種修改。具體地，可以撤去氧化器(6)，并且在同一容器(3)中進行氧化與還原。這將導致設備設置中進一步的后續變化。
實施例4
以下方法在圖1所示的設備和上文所述的設備中進行。
在洗滌設備中，用水和獲自Bayer公司的表面活性劑Baymol ATM洗滌和擦洗1.5kg羽毛。將洗滌過的羽毛在磨機中研磨，將切碎的產品轉移至轉筒式混合機中。在轉筒式混合機中，將磨碎的羽毛在45℃用65克硫化鈉(以100％Na2S計)/15升水的溶液(因此，濃度為4.3克/升)消化。還原混合物的pH用氫氧化鈉調節至pH 13。
磨碎的羽毛進行45分鐘以上的消化。消化之后，產物立即轉移到過濾設備中，在其中將固體與含有角蛋白的溶液分離。分離階段進行1小時以上。
將角蛋白溶液轉移至氧化器。在該容器中，向溶液中加入30％過氧化氫，直至pH降低至11.3。
然后使用正切流過濾針對數倍體積的交換水(pH7)對氧化的溶液進行滲濾，對溶液進行脫鹽，pH降低至大約10。使用相同的超濾設備濃縮脫鹽的蛋白溶液，生成17％蛋白溶液。蛋白收率為31％。
實施例5進行多次試驗，以優化從含有角蛋白的原料中提取角蛋白的條件，重點是還原溫度和氧化步驟的具體pH條件。實施例5a和5b優選用于羽毛優選，而5c和6d優選用于羊毛。條件在所附表格中列出，注意未提及的任何條件或實施例方面均如實施例4所述。
實施例5a
實施例5b
實施例5c
實施例5d
對于羊毛和羽毛，結果表明在45℃的較高溫度下，所消化的原料量增加了多達14％。表1和表2詳細列舉了結果。如果溫度進一步升高，預計所消化的原料體積也會增加。考慮到放大到工業生產的能量消耗，選擇溫度為45℃。注意羊毛需要更高的固液比來消化(還原)。對時間和溫度條件進行優化時還考慮到避免蛋白水解和實現適當的蛋白分子量。
表1不同溫度下(氧化至pH11.3)所消化的羊毛(300g，70分鐘)
表2不同溫度下(氧化至pH11.3)消化的羽毛(500g，45分鐘)
進行進一步試驗，以評估氧化蛋白的適當條件，對硫醇基團轉化成磺基丙氨酸殘基進行定量。當氧化蛋白溶液時，需要顯著更多的過氧化氫以氧化至更低的pH值。表3和4含有這些試驗的數據，并說明了這一點。實施例7中報道的氨基酸分析結果也顯示氧化至低于pH11.4是不需要的。
表3氧化至不同pH(30℃下)下所消化的羊毛(300g，70分鐘)
表4不同pH下(30℃下)消化的羽毛(500g，45分鐘)
實施例6通過SDS-PAGE電泳對從以上各實施例2-5分離的蛋白樣品進行分析，以評價所分離的蛋白的分子量。以下列出各樣品的結果。
方法使用現成的凝膠小型凝膠系統(Ready Gel Mini Gel System)。該技術通過分子量來分離蛋白混合物。與已知樣品比較時，可以推測未知蛋白樣品的分子量。(更進一步的信息參見Bio-Rad 2004/2005 LifeScience Research Products catalogue中關于SDS-PAGE凝膠方面的內容)。
在含有2-巰基乙醇的還原變性樣品緩沖液中制備待分析的蛋白樣品。使用兩種Bio-Rad預制凝膠Tris-HCl和Tris-Tricine。這些分別精確地確定羊毛和羽毛蛋白的分子量。Tris-HCl 15％預制凝膠用Tris/甘氨酸/SDS緩沖液操作。Tris-Tricine/肽現成凝膠具體用于分離低于10kDa的蛋白。Tris-Tricine 10-20％線性梯度凝膠用Tris-Tricine/SDS緩沖液操作。兩種凝膠對羊毛蛋白和羽毛蛋白均具有良好的溶解能力。溶解能力的說明可獲自Bio-Rad。
由多肽制備Bio-Rad多肽SDS-PAGE標準物。它們在1.4、3.4、6.5、14.4、16.9和26.6kDa具有低分子量標記。
Precision Plus蛋白標準物是重組蛋白，在10、15、20、25、37、50、75、100、150、250kDa含有10個蛋白標記，包括3個參比帶(25、50和75kDa)。
凝膠用Coomassie Brilliant Blue R-250染色30分鐘，之后脫色，以顯示出分子量譜帶。
結果Tris-Tricine凝膠在羽毛蛋白的分子量方面產生明顯的指征。圖5顯示了3個氧化的羽毛蛋白樣品，其在Tris-Tricine 10-20％梯度凝膠中的分子量在10kDa以上。圖2中的5個條帶從左至右如下條帶1-精確標準物，條帶2-經氧化的羽毛@30℃；條帶3-經氧化的羽毛@45℃；條帶4-經還原的羽毛@30℃；條帶5-多肽標準物。
6.56kDa和10kDa的標準標記表明沒有分子量低于10kDa的蛋白。凝膠在大約50kDa處不會表示出一些輕質量譜帶。凝膠用精確標準物和多肽標準物運行，其表現略有不同，因此沒有精確對齊。這并不會有損于試驗樣品高于10kDa的清晰譜帶。
圖3表示了Tris-HCl 15％凝膠中的從羊毛提取的角蛋白的分子量分析結果。有10個條帶，條帶1和3為空。從左至右的條帶如下條帶2一標準物，條帶4-pH11.3(1∶5)，條帶5-pH11.3(1∶10)，條帶6-pH10.8(1∶5)，條帶7-pH10.8(1∶10)，條帶8-pH0.1(1∶5)，條帶9-pH(1∶10)，條帶10-標準物。
圖3表明羊毛中的低分子量蛋白非常少。文獻表明多數羊毛蛋白在15-60kDa的范圍內。結果還說明所用的消化和氧化技術不會產生大量分子量低于10kDa的蛋白。
實施例7進行試驗，以優化實施例4中所述方法的氧化步驟的pH，對所提取的蛋白的氨基酸水平進行定量分析，以確認結果。
方法使用Waters Alliance HPLC系統，通過Waters proprietary Enpower軟件進行控制。采用Waters陽離子交換柱(Wat080002)和如下兩種洗脫緩沖液緩沖液ApH 2.96
Na+緩沖液BpH 6.50[1.2M]Na+
洗脫溫度為65℃。
使用反應溫度為125℃的水合茚三酮柱后反應生成通過Waters2487紫外/可見光檢測器檢測的發色團。一級氨基酸在570nm處檢測，二級氨基酸在440nm處檢測。使用Enpower軟件進行數據采集和計算。
結果所有角蛋白均具有大量二硫鍵(-S-S-)，其必須被破壞以使蛋白溶解。羽毛具有獨特的氨基酸組成，甘氨酸、絲氨酸和脯氨酸的比例非常高。而且它們的組氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸的水平很低。在堿性消化過程中，胱氨酸殘基上的二硫鍵被還原成半胱氨酸。氧化過程防止了半胱氨酸殘基重新形成這些二硫鍵。
對于氧化蛋白的消化條件進行比較，以對胱氨酸硫醇-SH基團向磺丙氨酸殘基的轉化進行定量。原料羽毛含有100％胱氨酸二硫鍵。消化和隨后氧化至不同pH水平改變了硫醇-SH基團與磺丙氨酸殘基的比例。表5中的數據表明，pH11.3是獲得最大轉化率的最佳pH。在較低的pH下，該比例更接近50∶50，表明重新形成了二硫鍵。少量的這種情況通常是可接受的，因此在該方法中可以使用較低的pH，但是不低于10.0。不同的溫度30℃和45℃對轉化率沒有影響。
表5
如預計的那樣，羊毛的結果與此類似并遵照相同的趨勢。表6對此進行了詳細說明。
表6
本領域技術人員將會認識到可以在不偏離本發明精神和范圍的情況下對實施例中所述的優選實施方式進行任何改變。
權利要求
1.一種從含有角蛋白的原料中分離角蛋白的方法，所述的方法包括以下步驟i.將所述的含有角蛋白的原料在液體介質中還原，在角蛋白水解最小化的條件下使角蛋白溶解，生成角蛋白溶液和不溶固體；ii.在不插入任何角蛋白沉淀步驟的情況下，對所述的角蛋白溶液進行過氧化物氧化；和iii.在所述的氧化步驟之前、同時或之后，將所述的角蛋白溶液與所述的不溶固體分離。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的還原破壞角蛋白中的二硫鍵而不會使蛋白水解。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中對用所述的方法分離的角蛋白進行凝膠電泳試驗，與標準物相比，其含有反映出所分離的角蛋白的主要分子量部分在10kDa以上的主要譜帶。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中所述的含有角蛋白的原料是羽毛和/或羊毛。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中所述的含有角蛋白的原料在還原之前被洗滌。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述的含有角蛋白的原料在還原之前被破碎。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中在大氣壓下，還原時間為30分鐘至1.5小時，且還原溫度為25℃至50℃。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的方法，其中所述的還原劑包括堿金屬硫化物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述的堿金屬硫化物的用量為5到1000克/100升液體介質。
10.根據權利要求1-9中任意一項所述的方法，其中所述的還原在堿的存在下進行。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述的堿的用量將pH值調節到12.0-13.5的范圍內。
12.根據權利要求1-11中任意一項所述的方法，其中所述的分離通過壓濾機進行。
13.根據權利要求1-12中任意一項所述的方法，其中所述的分離步驟在所述的還原步驟之后不超過4小時的時間內進行。
14.根據權利要求1-13中任意一項所述的方法，其中在過氧化物氧化之前將角蛋白溶液與所述的不溶固體分離。
15.根據權利要求14所述的方法，其中在過氧化物氧化之前將所述的角蛋白溶液與所述的不溶固體分離，并且不插入任何處理步驟。
16.根據權利要求1-15中任意一項所述的方法，其中所述的過氧化物氧化劑的形式是濃度為10％到50％的溶液。
17.根據權利要求1-16中任意一項所述的方法，其中所述的過氧化物氧化步驟在所述的還原步驟開始后不超過6小時開始。
18.根據權利要求1-17中任意一項所述的方法，其中所述的過氧化物氧化的程度足以將半胱氨酸殘基的硫醇基完全轉化成磺丙氨酸。
19.根據權利要求1-18中任意一項所述的方法，其中所述的過氧化物的用量將pH降低至不低于10.0的水平。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的過氧化物的用量將pH降低至大約11.3。
21.根據權利要求1-20中任意一項所述的方法，其中從所述的還原步驟開始到所述的過氧化物氧化步驟結束之前，所述的角蛋白溶液的pH不會降低至低于pH 10。
22.根據權利要求1-21中任意一項所述的方法，所述的方法還包括以下步驟iv.對所述的氧化的角蛋白溶液進行中和。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述的方法還包括以下步驟v.對所述的中和的角蛋白溶液進行脫鹽。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述的脫鹽通過滲濾進行。
25.根據權利要求23或24所述的方法，其中所述的脫鹽的角蛋白溶液進行濃縮。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述的濃縮通過超濾進行。
27.根據權利要求22-26中任意一項所述的方法，其中所述的方法還包括以下步驟vi.對所述的角蛋白進行修飾，產生修飾的角蛋白基產品。
28.通過根據權利要求1-27中任意一項所述的方法制造的角蛋白產品。
29.一種用于從含有角蛋白的原料生產角蛋白的裝置，所述的裝置包括i.洗滌設備，其用于洗滌含有角蛋白的原材料；ii.消化器，其用于還原所述的含有角蛋白的原料，產生角蛋白溶液和不溶固體；iii.氧化處理區，其用于氧化所述的角蛋白溶液；iv.分離設備，其用于將所述的角蛋白溶液與所述的不溶固體分離；v.超濾設備，其用于除去過量的鹽并濃縮所述的角蛋白溶液；和vi.輸送器，其用于將含有角蛋白的原料或流通過所述的裝置的各個其它部件從所述的洗滌設備輸送至所述的超濾設備。
30.根據權利要求29所述的裝置，其中所述的裝置包括vii.磨機，其用于在還原之前將所述的含有角蛋白的原材料破碎。
31.一種基本如本文所述并參考所附實施例和/或附圖的方法或裝置。
全文摘要
一種從含有角蛋白的原料中分離角蛋白的方法，該方法包括以下步驟將含有角蛋白的原料在液體介質中還原，在角蛋白水解最小化的條件下將角蛋白溶解，生成角蛋白溶液和不溶固體；在不插入任何角蛋白沉淀步驟的情況下，對角蛋白溶液進行過氧化物氧化；以及在氧化步驟之前、同時或之后，將角蛋白溶液與不溶固體分離。進行還原步驟的優選條件包括使含有角蛋白的原料與堿金屬硫化物還原劑在25℃至50℃的溫度接觸30至90分鐘，假設在大氣壓下。過氧化物氧化優選在還原步驟后不超過4小時內進行，包括將溶液的pH值降低至不低于pH為10的水平，盡管最優選pH為11.3。產物被證實具有分子量在10kDa以上的主要部分，反映了角蛋白中的二硫鍵在蛋白不水解的情況下被破壞。
文檔編號C07K14/435GK101087802SQ200580041890
公開日2007年12月12日 申請日期2005年10月21日 優先權日2004年10月21日
發明者R·W·克蘭斯頓, J·M·普爾, M·B·希基 申請人:澳大利亞羊毛發展有限公司