專利名稱：：對表面表達有mcsp的細胞的細胞毒性的介導的制作方法
技術領域：
：本發明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及對腫瘤細胞的細胞毒性介導；更特別涉及使用癌癥緩解性抗體(CDMAB)來啟動細胞毒性反應，可根據情況選擇與一種或多種化療劑聯合使用。本發明進一步涉及使用本發明CDMAB進行結合分析。
背景技術：
：許多開發針對人轉移性黑色素瘤細胞系的抗體的研究人員們各自獨立鑒定出黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白多糖(MCSP)。他們發現有一些抗體能與黑色素瘤細胞表面的特定抗原發生反應。由于各自獨立開發，靶抗原出現多種叫法，后來統一確定為MCSP。因此MCSP又稱為高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、人黑色素瘤蛋白多糖(HMP)、黑色素瘤相關蛋白多糖抗原(MPG)和黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白多糖(mel-CSPG)，現己鑒定出MCSP是各種特定抗體的抗原，其中一些抗體會在下文闡述。還發現MCSP與大鼠蛋白多糖NG2之間的同源性達80%以上，所以MCSP又稱為大鼠蛋白多糖NG2。MCSP是一種糖蛋白-蛋白多糖復合體，由一個250kDa的N連接糖蛋白和一個大于450kDa的蛋白多糖成分組成。核心糖蛋白以游離或硫酸軟骨素修飾的形式存在于黑色素瘤細胞表面。由于成功克隆到MCSP，所以它的一些結構特征被鑒定出來，它有3個胞外域，共包含10個半胱氨酸(5個可能的二硫橋)、15個可能的N連接糖基化位點和11個潛在的硫酸軟骨素連接位點。跨膜部分有1個半胱氨酸，其功能還不清楚。胞質域有3個蘇氨酸殘基，可能是蛋白激酶C進行磷酸化的位點，不過至今還未發現MCSP被磷酸化。已發現大多數惡性黑色素瘤中都表達有MCSP，最初認為它在正常細胞和其它類型的腫瘤上很少見。早先得出此結論的研究曾采用免疫組化技術(IHC)，用抗MCSP抗體B5檢測經甲醛或甲醇固定的正常組織和腫瘤組織上MCSP的分布。這一研究發現，所檢測的22例黑色素瘤和2例星形細胞瘤中與抗體B5發生反應的分別為17例和2例，而檢測的23例癌癥中無一發生反應。檢測的22例正常組織中，發現B5只與皮膚角化細胞、肺泡上皮、毛細血管內皮結合。另一項研究是利用抗MCSP抗體9.2.27和冰凍組織切片檢測MCSP的組織分布。再次發現檢測的所有黑色素瘤組織和細胞系中都發生反應，而6例不同類型的癌腫瘤中均無反應。7例胎兒組織中只觀察到皮膚內有反應，主動脈中有微弱反應，而成人組織中，13例組織中只看到3例有反應。后續研究是利用識別MCSP不同表位的抗MCSP抗體9.2.27、225.28S和A0122和冰凍組織來檢測MCSP分布。研究發現，所有抗MCSP抗體的染色圖譜近似，并且與神經、間充質、上皮來源的正常細胞和惡性腫瘤都發生反應而以前認為是MCSP陰性結果。尤其是，抗體B5與檢測的24例器官中的各種上皮、結締、神經和肌肉組織都發生反應，并且所檢測的34例各種類型的腫瘤中有28例發生反應。研究者解釋說，出現這種差異是由于他們使用的IHC技術經過了改進，變得更加穩定，他們注意到固定方法的選擇非常重要，并且猜測，MCSP抗原的一個重要特征是對IHC技術中的方法歩驟很敏感。為搞清楚MCSP在超微結構水平的定位，研究者們又開展了進一步研究。借助電子顯微鏡的免疫定位研究證實，MCSP幾乎專一性存在于黑色素瘤細胞表面的微區——微端絲中，而微端絲可能在細胞-細胞接觸和細胞-基質粘連中發揮作用。1996年，MCSP被克隆出后，即以MCSPcDNA作探針，對腫瘤細胞系和正常人組織中分別表達的MCSP進行了northern印跡分析。所檢測的8例不同腫瘤細胞系中，只在黑色素瘤細胞系中觀察到MCSP表達而在所檢測的16例正常成人和4例正常胎兒組織中未發現MCSP表逸MCSP在組織中定位的不同研究結果所表現出的這種不一致說明，可能還需要進一步研究以闡明該抗原真正的表達圖譜，或者對報道結果之間的差異作出解釋。因為已知蛋白多糖能介導細胞-細胞和細胞-胞外基質(ECM)間的相互作用，所以MCSP在這些過程中發揮的作用業已研究清楚。研究顯示，MCSP能促進ci4卜整合素介導的粘連及黑色素細胞的擴散。還有研究指出，MCSP核心蛋白發出信號，誘導pl3(T"募集及酪氨酸磷酸化，從而可調節細胞粘連和運動，幫助腫瘤侵入和轉移。綜合這些研究成果可見，MCSP可通過激活整合素和激發細胞骨架重排路徑來促進黑色素細胞粘連。研究還發現MCSP可能通過其硫酸軟骨素成分與膜3型基質金屬蛋白酶(MT3-MMP)建立某種聯系。有研究暗示，體內黑色素瘤表達的MT3-MMP有可能促進正在生長的腫瘤附近的ECM蛋白的降解，從而為腫瘤提供擴張空間。所以，MT3-醒P與MCSP之間可能存在促進黑色素瘤侵入的激活步驟。使用抗MCSP抗體進行的體外分析試驗也已陸續展開，以査明MCSP在腫瘤侵入和轉移過程中所起的作用。抗體9.2.27被用來評價MCSP在不依賴錨定生長(anchorage-ind印endentgrowth)中所發揮的作用。黑色素瘤細胞在含抗體9.2.27的軟瓊脂中進行培養，結果顯示形成的細胞克隆數量特異性減少67-74%。這些研究結果暗示，MCSP可能參與細胞間相互作用，使細胞不依賴錨定生長。上述研究作者還通過測定牛主動脈內皮(BAE)細胞基膜上黑色素瘤細胞M14粘連的試驗來檢測9.2.27對MCSP的抑制效果。該試驗中，對9.2.27與單克隆抗體W6/32(針對所有I類組相容性抗原)對照的療效進行比較。將M14對照細胞和經抗體預先處理的M14細胞鋪在BAE細胞基膜上。結果顯示，9.2.27處理的細胞中，27%的細胞粘連受到明顯抑制，而W6/32處理的細胞中沒有觀察到顯著影響。通過掃描電子顯微術在超微結構水平上證實用9.2.27進行細胞預處理所獲得的另一更顯著作用是細胞擴散受到抑制。針對黑色素瘤細胞開發的、經證實能特異性識別MCSP的許多抗體己進行了體外和體內試驗來確定其抗癌效果。單克隆抗體9.2.27識別MCSP的核心糖蛋白成分，是最早用于研究其腫瘤抑制特性的抗體之一。Bumol等人就9.2.27與9.2.27-白喉毒素A(DTA)結合物對裸鼠黑色素瘤的免疫治療效果開展了研究。最先進行的是體外細胞毒性試驗，該試驗通過向蛋白中摻入[35S]蛋氨酸標記來檢測9.2.27和9.2.27-DTA結合物對M21人黑色素瘤細胞中蛋白合成的影響。結果顯示，9.2.27-DTA結合物能顯著抑制M21黑色素瘤細胞的蛋白合成不過未結合的DTA產生的影響更大一些。而單使用9.2.27所產生的影響極小。另外，又對9.2.27和9.2.27-DTA結合物抗裸鼠中人黑色素瘤的效果進行了研究。將M21腫瘤碎塊植入小鼠皮下，讓其生長3天，然后在第3天用9.2.27或9.2.27-DTA結合物治療小鼠，并每隔3天治療一次。比較受治小鼠和未受治對照小鼠的腫瘤體積。第18天(數據報告的最后一天)，與未治療對照相比，分別經9.2.27治療和9.2.27-DTA結合物治療的小鼠顯示其腫瘤生長抑制率分別為64%和52%。在最初的這項研究中，作者得出結論說，9.2.27和9.2.27-DTA結合物對裸鼠中M21黑色素腫瘤生長的抑制效果大致相同。雖然這項最早的研究報告說9.2.27能抑制體內腫瘤生長，但后續研究(包括前一研究作者開展的后續研究)卻證實裸露的9.2.27在體內沒有任何抗腫瘤效果。總而言之，研究9.2.27對人腫瘤療效的實驗已證實，雖然9.2.27能耙向癌細胞，但用裸露的9.2.27治療不產生抗癌活性。隨后，預期用9.2.27免疫結合物治療的研究中，嘗試在I期臨床試驗中加大9.2.27的劑量。經流式細胞術和/或免疫過氧化物酶染色技術確定其腫瘤與9.2.27反應的8例惡性黑色素瘤患者接受每周2次、劑量按1、10、50、100和200mg逐漸遞增的抗體靜脈注射。雖然患者未出現明顯毒性癥狀，而且9.2.27靶定在轉移性黑色素瘤結上，但是并未觀察到臨床反應。再后面的研究是將9.2.27與化療藥物阿霉素(DXR)結合，然后研究該結合物對體內和體外黑色素瘤的生長抑制效果。利用[:iH]胸苷摻入試驗，檢測DXR-9.2.27結合物對M21細胞的生長抑制效果。結果顯示，該結合物對靶細胞M21的生長呈現依賴特定劑量的抑制效果，對MCSP陰性對照細胞系沒有效果。沒有進行體外試驗來檢測單使用7.2.27的效果。為搞清楚DXR-9.2.27結合物在體內的作用，給小鼠皮下注射M21細胞，讓腫瘤生長8-10天。第10天開始靜脈注射結合物，并每隔3天注射一次，持續30天。最后只在經DXR-9.2.27結合物治療的小鼠中看到明顯的腫瘤生長抑制效果，而分別單獨使用DXR和9.2.27沒有顯示對腫瘤生長的抑制結果；9.2.27和DXR的混合物同樣顯示陰性結果。另外，還開展了一項有關9.2.27結合物效果的研究。Schrappe等人將化療劑4-去乙酰長春花堿-3-羧基酰肼(DAVLBHY)與9.2.27結合后檢測其對人神經膠質瘤的作用。向裸鼠皮下注射U87MG(人神經膠質瘤細胞系)，然后在第2、5、7和9天進行治療。結果顯示DAVLBHY-9.2.27結合物使腫瘤體積大大減小，而分別單獨用PBS或9.2.27治療的對照組中，腫瘤快速生長，與PBS相比，用9.2.27治療的小鼠的腫瘤體積沒有減小。據最初記載，針對人黑色素瘤細胞系M21的抗體225.28S與高分子量黑色素瘤相關抗原發生反應。該抗原分子隨后證實是MCSP。一項早期的研究對225.28S(IgG2a)溶解人黑色素瘤細胞系的能力進行了檢測，并與另一個抗MCSP的抗體653.40S(IgGJ予以比較。結果確定225.28S和653.40S能識別MCSP上相同或空間上鄰近的抗原決定簇。體外試驗發現抗體與補體結合后不能溶解黑色素瘤細胞。兩個抗體在抗體依賴的細胞毒性試驗中都可能介導黑色素瘤靶細胞溶解，其中225.28S的細胞溶解活性高于653.40S。但是，只有效應物/耙細胞比例顯著高于其他研究報道的使用抗黑色素瘤抗原的抗體比例時才能發生黑色素瘤細胞溶解。研究作者得出的結論是，這些抗體與人補體結合不具有細胞溶解活性以及ADCC中發生溶解需要很高的效應物/耙細胞比例的研究結果暗示將單克隆抗體注入黑色素瘤患者體內可能不會破壞腫瘤細胞。作者建議，應用這些抗體進行免疫治療時，其作用應只局限于做放射性同位素、化療劑或毒性劑的載體。為弄清裸露抗體225.28S在I期臨床試驗中的治療能力，開展了向2例黑色素瘤晚期患者靜脈注射該抗體10mg的研究。雖然注射抗體并未產生臨床毒副作用，但亦未出現陽性治療反應。研究人員將抗體225.28S與一種尤其對正在分裂的細胞產生毒性的低分子量多肽——嘌呤硫素結合后檢測其對人黑色素瘤細胞系Colo38的體外毒性作用。結果發現Colo38細胞與225.28S-嘌呤硫素結合物在一起培養24小時后，3H胞苷攝入受到抑制。另外，與結合物共培養7天后培養物中Colo38細胞的活性明顯降低。雖然觀察到體外毒性作用，但仍有一部分黑色素瘤細胞在225.28S-嘌呤硫素治療后存活。作者暗示，惡性疾病可能得依靠作為毒性劑載體的抗不同腫瘤相關抗原的單克隆抗體雞尾酒療法來進行免疫治療，這說明癌癥治療中僅使用225.28S結合物是不夠的。225.28S-嘌呤硫素結合物的治療效果是根據裸鼠體內人黑色素瘤的生長情況來評定的。首先向裸鼠皮下或腹腔植入Colo38細胞。腹腔植入的小鼠在第l、3和5天接受治療，皮下植入的小鼠在第l、3、5和20天接受治療。監控所有小鼠的生存情況。只在經225.28S-嘌呤硫素結合物治療的腹腔植入小鼠中觀察到生存期明顯延長的統計學效果。僅使用225.28S^嘌呤硫素或225.28S和嘌呤硫素的混合物均沒有提高腹腔或皮下植入小鼠的生存期。記錄皮下植入小鼠的腫瘤體積，發現只有225.28S-嘌呤硫素結合物的治療使腫瘤體積顯著減小，而單使用225.28S治療腫瘤體積沒有減小。研究人員還將225.28S與化療藥物甲氨蝶呤(MTX)結合，并研究其對體內腫瘤生長的抑制效果。給裸鼠皮下接種人黑色素瘤細胞M21，然后第1、47、10和14天予以治療，結果顯示只有MTX-225.28S結合物能抑制腫瘤生長。而僅使用225.28s、氨甲蝶呤或225.28s和氨甲蝶吟混合物均不能抑制腫瘤生長。在一項研究中，225.28s被用來確定施用異種制劑是否對人有潛在毒性影響。向85例轉移性皮膚黑色素瘤患者施用經1311、l2:'I、mIn或"Tc標記的完整抗體225.28S或其F(ab'h片段。抗體注射量為14-750yg。各患者均未觀察到臨床副作用。該研究也未報道有臨床反應，不過，因為這項研究主要用于毒理檢測，所以沒有必要預測該項結果。225.28s被用來產生鼠抗獨特型單克隆抗體，其包括產生MCSP鏡象的抗體MF11-30。研究顯示，醒Fll-30既能誘導同種系統又能誘導異種系統產生抗MCSP抗體。有兩項臨床試驗中對晚期惡性黑色素瘤患者按遞增劑量施用MMFll-30以檢測其毒性和治療反應。該兩項研究中均未產生副作用，而且治療耐受性良好。第二項試驗中，有7例患者所產生的抗-抗獨特型抗體的效價至少為1:8，血清中MCSP水平無顯著變化，平均生存期為55周(16-95周之間)，而其余患者(所產生的抗抗獨特型抗體的效價為l:4或更ffc血清中MCSP水平增加)的平均生存期為19周(8-57周之間)，前者明顯高于后者。抗體763.74也抗黑色素瘤細胞并識別MCSP。還沒有見到有關抗體763.74具有體外或體內抗癌效果的任何報道、但使用該抗體也可產生鼠抗獨特型單克隆抗體。MK2-23屬于這類抗體，具有抗MCSP抗體763.74限定的決定簇的內影像。臨床前實驗顯示，MK2-23可免疫誘導同種宿主(BALB/c小鼠)和異種宿主(兔)產生抗MCSP抗體。MK2-23與鑰孔血藍蛋白(KLH)載體結合并與佐劑一并施用后，14免疫原性顯著提高。臨床試驗中用區2-23免疫黑色素瘤患者，觀察體液反應特征。將MK2-23與KLH結合并與卡介苗(BCG)混合后免疫25例IV期黑色素瘤患者，分別于第0、7和28天皮下注射2mg。如果抗抗獨特型抗體的效價低，就再增加注射次數。在MK2-23免疫的患者中大約60%都產生了抗MCSP抗體，盡管抗體的親和力和效價都比較低。研究發現，患者經區2-23免疫產生抗MCSP抗體后，生存期明顯比未經MK2-23免疫的患者延長。產生抗MCSP抗體的患者的平均生存期為52周(19-93周之間)，而血清中沒有陽性抗MCSP抗體的9例患者的平均生存期為19周(9-45周之間)。3例產生抗MCSP抗體的患者的病情出現部分緩解。雖然本研究結果的前景看好，但是用區2-23免疫的患者中仍有40%沒有與陽性抗MCSP抗體發生免疫應答。而且，3例出現部分緩解的患者最后又全部復發。曾嘗試用低劑量的環磷酰胺(CTX)對患者進行預處理，以增加區2-23的免疫原性，據文獻報道，環磷酰胺通過選擇性抑制某些抑制性細胞活性來提高細胞和體液對腫瘤相關抗原的免疫反應。但是，CTX預處理并沒有使區2-23的免疫原性發生變化。單克隆抗體48.7是針對人轉移性黑色素瘤細胞系M1733產生的一類抗體，據文獻報道，它能與MCSP分子發生免疫反應。I期臨床試驗中聯合施用了48.7與鼠單克隆抗體96.5后一抗體能抵抗人黑色素瘤上的轉鐵蛋白樣細胞表面糖蛋白p97。5例患者接受了治療，第1、10天注射mAbs96.5和48.7各2mg，第2天各10mg，第3-10天各25mg。結果顯示，治療耐受性良好；但是所有患者對治療無臨床反應，而且均出現疾病進展。另一項臨床試驗中對這兩個抗體也進行了研究，其中，用帶有放射性標記的兩個抗體中任一抗體的Fab片段治療3例黑色素瘤已轉移到中樞神經系統的患者。向2例患者施以5mg標記有'311的48.7Fab片段，并使患者血腦屏障(BBB)滲透性開放，試圖提高進入腦腫瘤的抗體量。雖然改變血腦屏障滲透性能增加Fab向腫瘤所在腦半球和腦脊液的釋放量，但并未發現該抗體明顯、持久地在腫瘤部位局部釋放。研究者們猜測這可能是由于抗體劑量不足導致。Melimmune是兼具兩個模擬MCSP不同表位的鼠抗獨特型抗體，Melimmune-l(I-Mel-l)和Melimmune-2(I-Mel-2)牛寺點的制劑。I-Mel-l是針對抗MCSP抗體225.28(前面己討論)產生的抗獨特型抗體MFll-30的亞克隆。研究顯示，I-Mel-1誘導兔發生抗MCSP免疫應答。I-Mel-2是針對抗MCSP抗體MEM136產生的抗獨特型抗體，MEM136與MCSP上作用的表位和225.28不同。I-Mel-2也誘導兔產生抗MCSP免疫應答。包含1:1的I-Mel-1禾nI_Mel-2的Meli腿une制劑被用來對21例黑色素瘤被切除且未轉移的患者進行I期試驗。該項研究對一個機構的12名患者作了詳細的免疫反應分析。按照兩項治療方案中的一項方案，向患者施與0.2-0.4mgmelimmune(I-Mel-l和I-Mel-2各0.1-2.Omg)。所有患者均產生抗I-Mel-1和抗I-Mel-2的抗體，其中10例患者產生的抗I-Mel-2的抗體反應峰大于I-Mel-1。但是，該研究不能證明誘導產生了MCSP特異性抗體，因為患者血清不能抑制帶有放射性標記的225.28或MEM136與表達MCSP的Mel-21細胞結合。還進行了一項直接細胞結合試驗，來檢測患者血清中是否存在抗MCSP抗體；但是在基于FACS的試驗中，免疫前血清和免疫后血清與M21細胞的結合沒有差別。又在另一項臨床試驗中對I-Mel-2進行了試驗，其中向26例轉移性黑色素瘤患者肌內注射2mgI-Mel-2和100或250yg佐劑SAF-m，每兩周注射一次，持續4周，然后每兩月一次，直到出現疾病進展。通過抑制放射免疫分析法檢測到5例患者產生抗MCSP抗體。在這5例產生陽性抗MCSP抗體的患者中，1例完全緩解，1例病情穩定另3例病情出現進鳳病情完全緩解的患者產生的抗MCSP抗體的效價最高(1:1500)。在先專利US5270202(及其相關專利:W09216646A1、EP0576570A1)i井授了一種針對抗人黑色素瘤相關蛋白多糖(亦稱HMW-MAA)抗體MEM136的抗獨特型抗體頂elpg2(亦稱頂32)。文中指出頂elpg2抗體特異性靶向MEM136，建議將其用于診斷和治療表達MPG抗原的相關疾病。雖然體外試驗確定IMelpg2能抵抗腫瘤細胞侵入，但它并不是所試驗的最有效的抗體，而且盡管出現Ab3應答，也不能證明它在體內具有抗腫瘤療效。EP0380607B1講授了一類針對Mab225.28的抗獨特型抗體，它對H麗-MAA的一個未知表位有特異性。這類抗體被用于黑色素瘤自動免疫治療。文中報道通過動物模型對針對225.28產生的MFll-30和IMelpgl以及抗獨特型多克隆抗體予以評價，其中使用MF11-30對黑色素瘤患者進行了臨床試驗，但沒有數據支持。MFll-30能誘導產生獨特型抗體225.2&在用BM-Cycline處理MF11-30細胞系并檢測支原體污染清除效果時，獲得頂elpgl細胞系。雖然兔血清中能誘導產生抗IMelpgl抗體，而且該抗體能與Colo38黑色素瘤細胞結合，但并不表明它具有體內或體外抗腫瘤活性。US4879225講授從不可溶的免疫復合物中制備抗體。該專利中，抗HMW-MAA的抗體Mab9.2.27被固定在蛋白A-瓊脂糖上用作抗原，誘導產生抗Mab9.2.27的大鼠抗獨特型抗體，多種與瓊脂糖結合的細胞或細胞溶解產物復合物產生抗黑色素瘤細胞抗體。將與黑色素瘤細胞結合、但不與正常T細胞或B細胞結合的鼠單克隆抗體與9.2.27進行比較，從中選擇與9.2.27特性類似的抗體，進一步表示為NR-ML-02、NR-ML-03、NR-ML-04、NR-ML_05、NR-ML_06。這些抗體在用9.2.27作捕獲抗體、用可溶性SKMEL-28黑色素瘤膜作抗原的夾心ELISA試驗中均表現為陽性。另外這些抗體還能識別黑色素瘤細胞并且可與平滑肌和內皮細胞反應。另外還產生61種抗蛋白多糖抗體，其中10種抗體識別與NR-ML-02/NR-ML-04相同的決定簇，3種抗體識別與NR-ML-03或NR-ML-05相同的決定簇；45種抗體識別的決定簇與該5種抗體確定的決定簇不同。US5084396中，這些抗體經放射性標記后與9.2.27比較攜帶黑色素瘤異種移植物的裸鼠中的腫瘤攝取量。結果顯示，腫瘤對NR-ML-05和NR-ML-02產生的攝取量最大，9.2.27次之，NR-ML-02最小。這些發明既不能說明這些抗體能減小癌癥的腫瘤負荷，也不能說明這些抗體能延長患癌癥的哺乳動物的生存期。US5034223講授一種通過用未結合的封閉抗體預處理來增加結合抗體向攜帶腫瘤相關抗原的組織釋放量的方法。該方法中，先施用未標記的MabNR-2AD(僅對一例患者的B細胞淋巴瘤有特異性的抗獨特型抗體)，然后再在臨床上施用與technicium99(Tc_99)結合的抗匿W-MAA、9.2.27和NR-ML-05的抗體。由于這些研究是利用既沒有細胞毒性、也沒有放射性效果的Tc-99作報告同位素，雖然用這種方法可以提高抗HMW-MAA抗體的攝取量，但并沒有證據證明抗腫瘤效果產生。US5580774講授利用編碼Mab9.2.27的抗體基因構建嵌合抗體。文中沒有公開用該嵌合抗體進行癌癥診斷或治療的內容。US5493009和US5780029講授針對抗HMW-MAA抗體763.74的鼠抗獨特型抗體MK2-23及其結合物。文中記載，MK2-23可以直接與763.74結合而抑制763.74與黑色素瘤細胞Colo38結合。另外，MK2-23誘導產生的Ab3可以與H麗-MAA直接結合，并能競爭性抑制763.74與Colo38黑色素瘤細胞結合。在臨床試驗中用離2_23對IV期黑色素瘤患者進行自動免疫治療。89%患者的免疫后血清與Colo38黑色素瘤細胞發生反應從而抑制763.74與Colo38細胞結合，這暗示患者血清中誘導產生了Ab3抗體。文中報告15例患者中有6例患者的轉移病灶尺寸減小，但沒有提供研究細節。患者血清中只有部分抗體的特異性予以確定，仍不清楚Ab3抗體的存在是否在一定程度上與觀察到的臨床反應有關，因為763.74抗體原本不具有抗腫瘤效果。US5866124講授來源于匿2-23的針對抗HMW-MAA抗體763.74的抗獨特型嵌合抗體MK2-CHy1及其衍生物。說明書第12/47頁US5017693、US5707603、US5817774、US6248870、US5112954、US6238667等眾多發明講授了與抗HMW-MAA抗體結合的化合物，但沒有揭示它們在癌癥治療方面的應用。重要地是，單獨使用這些抗體就能產生抗癌療效，它們并不需要通過結合來獲得細胞毒性或抑制細胞的作用。這些專利和專利申請雖然鑒定出MCSP抗原和相關抗體，但要么沒有公開本發明所分離的單克隆抗體，要么沒有講授或暗示本發明所分離的單克隆抗體的應用。
發明內容本發明人之前已取得名為〃患者個體特異性抗癌抗體〃的美國專利6，180，357，其涉及一種選擇癌癥治療個性化抗癌抗體的方法。本文中，術語"抗體"和"單克隆抗體〃(mAb)可以互換使用，都是指雜交瘤細胞(如老鼠或人)產生的完整免疫球蛋白、免疫結合物，有些情況下也指免疫球蛋白的片段和它的重組蛋白，如嵌合免疫球蛋白和人源化免疫球蛋白、F(油')和F(ab')2片段、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(Fv)s、融合蛋白等。本領域技術人員應該很清楚，多肽中某些氨基酸序列的變化不會顯著影響蛋白質的結構或功能。抗體分子重排中，一般可以容忍其骨架區核酸或氨基酸序列的修飾，這些修飾包括但不限于，取代(保守取代優先)，缺失或添加。另外，將標準化療形式(如放射性核素)與本發明CDMAB結合起來在所述化療方面予以應用也屬于本發明的范圍。CDMAB還能與毒素、細胞毒性組分(cytotoxicmoiety)、酶(如生物素結合酶)或血細胞結合在一起形成抗體結合物。本申請使用'357專利中講授的制備患者特定抗癌抗體的方法來分離編碼癌癥緩解性單克隆抗體的雜交瘤細胞系。這些抗體能特異性針對一個腫瘤，從而使定制癌癥治療方案具備可行性。本文中，以下具有細胞殺傷(細胞毒性)或細胞生長抑制(細胞抑制性)特性的抗癌抗體稱為細胞毒素。它們能輔助用于癌癥分期和診斷，還能用于治療腫瘤轉移。個性化抗癌治療的前景有望改變患者的治療方式。臨床設想如下在腫瘤發生時采集腫瘤樣本并存到腫瘤庫中。根據現有的癌癥緩解性抗體組，進行腫瘤樣本分型。先按傳統方法對患者分期，然后可再用相應抗體進一步分期。可以直接用已有抗體對患者盡速治療，或者用本文概括的方法或使用噬菌體表面呈現文庫并結合本文公開的篩査方法制備腫瘤特異性抗體組后進行治療。將制備的所有抗體加到抗癌抗體庫中，因為有可能其他腫瘤也會產生某些與正在治療的腫瘤一樣的抗原表位。根據本方法制備的抗體可用于治療能與其結合的癌癥。基本上使用專利US6，180，357和專利申i青No.10/348，231中公開的方法，用患者乳腺癌活檢細胞免疫小鼠獲得小鼠單克隆抗體11BD-2Ell-2。人不同組織來源的一些細胞系的細胞表面表達有HBD-2E11-2抗原。乳腺癌細胞系MCF-7和卵巢癌細胞系0VCAR-3在體外對11BD-2E11-2的細胞毒性作用比較敏感。根據11BD-2E11-2對培養的MCF-7和0VCAR-3細胞產生細胞毒性的研究結果，進一步將11BD-2E11-2植入小鼠內，以查明它對這些癌細胞是否有抗癌活性(如專利申請No.10/762，129所述)。臨床前異種移植腫瘤模型已公認為有效的療效預測模型。在預防人乳腺癌體內模型中，11BD-2E11-2能防止腫瘤生長并減小腫瘤負荷(據專利申請No.10/762，129記載)。第51天(最后一次治療后不久)，11BD-2E11-2治療組中腫瘤平均體積為同型對照組體積的20%。治療后持續監測280天。11BD-2E11-2治療組中40%自移植后生存期在7.5個月以上。相反，治療后6.5個月同型對照組的死亡率達100%。所以在較為成熟的人乳腺癌模型中，與對照治療組相比，11BD-2E11-2使生存期增加、腫瘤負荷減小。為確定11BD-2E11-2在其他人乳腺癌模型中也有同樣療效，在所建立的一個乳腺癌模型中檢測它對MDA-MB-468(MB-468)細胞的抗腫瘤活性(如專利申請No.10/810，744所述)。結果顯示，與緩沖液對照相比，11BD-2Ell-2抑制腫瘤生長達250/0。所以，11BD-2E11-2在所建立的預防乳腺癌異種移植模型中能防止腫瘤生長。另外，它在至少兩種不同的乳腺癌模型中表現出抗腫瘤活性。11BD-2E11-2治療除在人乳腺癌模型中產生有益效果外，還在預防卵巢癌模型中表現出抗0VCAR-3細胞的抗腫瘤活性(如專利申請No.10/762，129所述)。該模型中用體重作為腫瘤進展的檢測指標。移植后第80天(治療結束后第16天)治療組小鼠的平均體重占對照組的87.6%(p=0.015)。在一個較為成熟的人卵巢癌模型中，HBD-2E11-2與緩沖液對照治療組相比，能延緩腫瘤進展，因此HBD-2E11-2治療具有一定療效。11BD-2E11-2因具有抗腫瘤活性而在幾個不同癌癥模型中成為備受矚目的抗癌治療劑。為確定11BD-2E11-2在其他人卵巢癌模型中也有同樣療效，在建立的一個卵巢癌模型中檢測它對ES-2+SEAP細胞(經人胎盤分泌的堿性磷酸酶(SEAP)轉染的ES-2卵巢癌細胞)的抗腫瘤活性(如專利申請No.10/810，744所述)。與緩沖液對照相比，11BD-2E11-2使治療組中小鼠群的生存期延長。另外，11BD-2E11-2治療組內1只小鼠在治療后SEAP循環水平大大降ffcSEAP循環水平可用作腫瘤負荷指示因子。所以，11BD-2E11-2在建立的預防卵巢癌異種移植模型中能防止腫瘤生長。另外，它在兩種不同的人卵巢癌模型中均表現出抗腫瘤活性。生化數據表明11BD-2E11-2的抗原是MCSP(如專利申請No.10/810，744所述)，先前的免疫組織化學分析及其他實驗室開展的體外試驗均已證實黑色素瘤細胞上表達有MCSP，并且指出MCSP與腫瘤粘連、侵入和轉移有關。因此，11BD-2Ell-2在所建立的預防人黑色素瘤模型中被確定具有療效。在預防黑色素瘤模型中，第55天(治療結束后第5天)，11BD-2E11-2治療組中腫瘤平均體積占緩沖液對照治療組體積的58%(p=0.046)。在建立的模型中，療程結束后，抗體11BD-2E11-2與緩沖液對照治療組相比抑制腫瘤生長達491由于本次實驗中動物數量有限實驗結果沒有達到顯著水平(p二0.1272)，但趨勢卻一目了然。所以，11BD-2E11-2在建立的預防惡性黑色素瘤異種移植模型中能防止腫瘤生長，另外，11BD-2E11-2在兩種不同的人乳腺癌和卵巢癌模型以及人黑色素瘤模型中均表現出抗腫瘤活性。為確認11BD-2E11-2表位可作為藥物耙點，檢測冰凍正常人組織中是否表達有11BD-2E11-2抗原(如專利申請No.10/810，744所述)。通過用11BD-2E1卜2染色的IHC技術發現，大多數組織，包括肝、腎和心臟等活的器官的細胞，都不表達11BD-2E11-2抗原。雖然幾乎所有組織的血管平滑肌纖維被染色，但亦有某些組織上皮也被染了色。搞清楚乳腺癌患者體內11BD-2E11-2抗原的定位及分布對評價11BD-2E11-2的免疫療效和設計有效的臨床試驗至關重要。為確定癌癥患者的乳腺瘤中11BD-2E11-2抗原的表達位置，從來自8例(7份額外樣本或者完全分離，或者不代表微陣列切片上的腫瘤)乳腺癌患者的腫瘤組織樣本中篩選表達11BD-2E11-2抗原的樣本(據專利申請No.10/810，744所述)。研究結果顯示62%組織樣本染色呈陽性，說明存在11BD-2E11-2抗原。患者樣本內11BD-2E11-2的表達顯示為癌細胞特異性表逸因為只有惡性細胞被染色。另外，3份(再從微陣列切片中完全分離出2份額外樣本)乳腺癌患者正常組織樣本中均沒有出現11BD-2E11-2染色。根據癌癥期或進展程度分析腫瘤時，從結果中看不出11BD-2E11-2陽性表達量隨腫瘤期別增加而增加的趨勢。但由于樣本規模小，所以研究結果有一定局限性。由于11BD-2E11-2的抗原是MCSP(據專利申請No.10/810,744所述)，而且以前的免疫組織化學分析及其他實驗室開展的體外試驗均已證實黑色素瘤細胞上表達MCSP，所以進行實驗來確定惡性黑色素瘤患者群體中11BD-2E11-2抗原的定位及其分布。這有助于評價11BD-2E11-2對黑色素瘤患者的免疫療效和設計行之有效的臨床試驗。為確定癌癥患者黑色素瘤中IIBD-2E11-2抗原表達的位置，對來自33例惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織樣本進行IIBD-2E11-2抗原表達的評估。研究結果顯示67%組織樣本染色呈陽性，說明存在IIBD-2E11-2抗原。患者樣本內IIBD-2E11-2的表達顯示為癌細胞特異性表達，因為只有惡性細胞被染色。另外，6份惡性黑色素瘤患者正常組織樣本中均沒有出現11BD-2E11-2染色。生化數據表明11BD-2E11-2所識別的抗原是MCSP(據專利申請No.10/810，744所述)。研究顯示IIBD-2E11-2免疫沉淀蛋白被抗大鼠MCSP同源物的抗體識別，而抗MCSP免疫沉淀蛋白又被11BD-2Ell-2識別，從而支持了上述結論。這些IHC和生化結果均證實11BD-2E11-2與MSCP抗原結合。所以，確鑿證據顯示，11BD-2E11-2通過與MCSP上特定表位配接而介導抗癌作用。本文概述的其他生化數據也證實11BD-2E11-2所識別的抗原就是MCSP。這些抗體表位匹配結果表明11BD-2Ell-可能與具有兩個主要結合部位的一個不連續表位結合。總之，該數據證實IIBD-2E11-2抗原是癌癥相關性抗原，在人體內表達，在病理上與癌癥靶點相關。另外，還證實IIBD-2E11-2抗體與人癌組織結合，并且適用于診斷、治療預測或預后等分析。此外，由于該抗原在大多數非惡性細胞中不表達，所以其細胞定位可指示出細胞的癌癥狀態，利用這種定位觀察方法可將該抗原及其基因或衍生物、蛋白或蛋白變體應用于診斷、治療預測或預后等分析。目前已開發出許多不同的抗MCSP抗體，并己在許多體外和體內系統中進行了檢測。在臨床前模型中，除了一項研究結果不能重復外，其他結果均顯示，裸露的抗MCSP抗體在幾個不同的黑色素瘤模型和一個神經膠質模型中不能減小腫瘤或延長生存期；目前還沒有用抗MCSP抗體對其他癌癥類型展開研究。用裸露的抗MCSP抗體針對人進行的全部試驗均未產生任何臨床陽性結果。研究顯示，裸露的11BD-2E11-2在鼠人乳腺癌模型中能延長生存期和減小腫瘤負荷。11BD-2E11-2在鼠人卵巢癌模型中也能抑制腫瘤進展和延長生存期。已將抗MCSP抗體與許多毒性或化療劑結合，這些結合物經體內試驗證實在鼠黑色素瘤模型中均能取得陽性結果。還沒有關于抗MCSP結合物在人體內進行試驗的報道，所以這些結合物的安全性還不清楚。不過，僅用單克隆抗體治療沒有什么毒性，即使有一些相關毒性，其耐受性也良好。所以如果用裸露的抗MCSP抗體治療癌癥患者可獲得臨床陽性結果，這將是人類的福音，是現行醫療技術的一大進步。11BD-2Ell-2不與毒性制劑結合，也有抗癌活性；所以可以避免施用抗體-毒素結合物所要考慮的特定安全問題。另外，已用許多抗MCSP抗體產生了抗獨特型抗體，并對動物和人體進行了試驗。小規模的非盲試驗中，用抗獨特型抗體免疫患者出現陽性抗MCSP免疫應答時，與沒有產生特異性免疫應答的患者相比，患者的平均生存期延長。在所舉的實例中，通過抗獨特型抗體靶向MCSP可取得臨床陽性結果。這一方法的弊病在于并非所有經抗獨特型抗體免疫的患者都發生抗MCSP應答。所以如果直接施用抗MCSP抗體即可取得臨床陽性結果，就能克服這種需要依靠患者自身免疫應答才能獲得臨床益處的問題。11BD-2E11-2正是這樣一種能直接靶向MCSP、在公認能預測療效的臨床前異種移植腫瘤模型中表現出抗癌作用的抗體。總之，本發明講授利用11BD-2E11-2抗原作為治療劑靶點，向哺乳動物施用該治療劑后能減小表達該抗原的癌癥的腫瘤負荷(從而延緩疾病進展)，還可以延長該受治哺乳動物的生存期。本發明還講授利用C匿AB(11BD-2E11-2)及其衍生物靶向其抗原以減小哺乳動物中表達該抗原的癌癥的腫瘤負荷，和延長攜帶有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的生存期。此外，本發明還講授利用癌細胞中可檢測到HBD-2E11-2抗原這一特點，對攜帶表達該抗原的腫瘤的哺乳動物進行診斷、治療預測和預后。如果首次治療對患者無效或者腫瘤發生轉移，可以重復產生該腫瘤特異性抗體進行再次治療。另外，可以將抗癌抗體與取自患者的血紅細胞結合后再注射機體用于治療腫瘤轉移。目前轉移性癌癥還無法有效治療，而且癌癥一旦轉移通常預示著死亡。不過，轉移性癌癥通常伴有大量血管生成，通過血紅細胞輸送，抗癌抗體能聚集在腫瘤部位。由于大多數癌細胞需要依賴宿主血液供應來維持生存，所以抗癌抗體與血紅細胞結合后，甚至在轉移前就能原位抑制腫瘤。另外，抗體也可以與淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、天然殺傷細胞等其他血細胞結合。共有五類抗體，每一類抗體都與其重鏈功能相關。一般認為，裸抗體殺死癌細胞是通過抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)作用或者補體依賴性細胞毒性(CDC)作用完成。例如，老鼠IgM和IgG2a抗體能通過結合補體系統的C-1成分激活人補體，從而激活補體活化的典型途徑，繼而溶解腫瘤。人抗體中大多數有效的補體活化抗體通常是IgM和IgGl。老鼠的同型抗體IgG2a和IgG3能募集具有Fc受體的毒性細胞，從而通過單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和某些淋巴細胞將細胞殺死。人同型抗體IgGl和IgG3由ADCC介導。抗體介導的癌細胞殺傷作用的其他機理可能是抗體能將細胞膜中各種化學鍵及相關糖蛋白或糖脂水解(即催化抗體)。還有兩種普遍接受的有關抗體介導的癌細胞殺傷作用的機理。一是用抗體作疫苗，誘導機體產生對癌細胞表面抗原的免疫反應。二用抗體靶向生長受體，干擾其功能或者對該受體進行負調控使其功能喪失。癌癥藥物臨床應用的基礎是該藥物能在風險可接受狀況下使患者受益。生存通常是癌癥治療中追求的主要益處，但除延長生命外，還有一些其它公認的益處。在治療不影響生存前提下，其他益處包括癥狀減輕、防止不利事件、延長復發期或無病生存期和延長腫瘤進展時間。這些標準已被普遍接受，例如美國食品藥物管理局(FDA)等監管機關已批準能產生這些益處的藥物(Hirschfeld等CriticalReviewsinOncology/Hematology42:137-1432002)。除這些標準外，還有其他已得到認同的可預示這些益處的終點。美國FDA出臺的加快審批程序承認有一些可能預測患者受益的指標。2003年底，已有16種藥物根據這一程序獲批，其中4種獲完全批準，即這些替代終點預測的直接益處在后續研究中得到證實。確定藥物對固體腫瘤療效的一個重要終點是腫瘤負荷，一般通過測定治療反應對其進行評價(Therasse等，JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。固體腫瘤反應評價標準工作組(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumorsWorkingGroup)(國際癌癥專家小組)發布了進行上述評價的臨床標準(RECIST標準)。根據RECIST標準中客觀反應所示，與適當的對照組比較，經證實對腫瘤負荷有效的藥物應最終使患者產生直接益處。一般來說臨床前腫瘤負荷的評價和記錄更加直截了當。因為臨床前研究能轉化為臨床實踐，所以臨床前模型中延長生存期的藥物最有可能在臨床應用。與臨床治療產生的陽性反應類似，臨床前減小腫瘤負荷的藥物也可能對疾病產生明顯的直接影響。雖然癌癥藥物治療中延長生存期是追求的最重要臨床結果，但其他一些益處也具有臨床利用價值，顯然，可能延緩疾病進展的腫瘤負荷減小就能獲得直接益處，具有臨床價值(Eckhardt等，DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASC0EducationalBook,39thAnnualMeeting,2003，pages209-219)。因此，本發明的一個目的是使用一種從特定個體細胞中產生對癌細胞有毒性而對非癌細胞無毒性的癌癥緩解性抗體的方法，以期分離雜交瘤細胞系和相應的單克隆抗體及所述雜交瘤細胞系編碼的抗原結合片段。本發明的另一目的是講授CDMAB及其抗原結合片段。本發明的再一目的是產生其細胞毒性通過ADCC介導的CDMAB。本發明的還一目的是產生其細胞毒性通過CDC介導的CDMAB。本發明的再一目的是產生其細胞毒性與其催化細胞化學鍵水解能力成函數關系的CDMAB。本發明的又一目的是產生在用于癌癥診斷、預后和監測的結合分析法中所使用的CDMAB。本發明的其他目的及優點通過以下闡述、范例和特定實施例形式的說明將會顯而易見。本專利或申請文件包含至少一幅彩色附圖。若需要本專利或專利申請的含彩色附圖的出版文本副本，可請求美國專利商標局提供并支付必要費用。圖1:用11BD-2E11-2作探針與MDA-MB-231(泳道1)或0VCAR-3(泳道2)膜雜交所得的Western印跡圖譜。膜蛋白在還原條件下分離。右邊表示分子量標記。圖2:去糖基化作用對11BD-2E11-2與MDA-MB-231膜結合的影響。11BD-2E11-2與分別置于僅有去糖基化緩沖液(泳道1)，包含PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、0-內切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶(泳道2)，包含PNGase、O-內切糖苷酶和唾液酸酶(泳道3)，僅含唾液酸酶(泳道4)，僅含0-內切糖苷酶(泳道5)和僅含PNGase(泳道6)中的MDA-MB-231膜結合的情況。圖3用11BD-2E11-2免疫沉淀的膜蛋白MDA-MB-231的SDS-PAGE(A組)和Western印跡(B組)圖譜。泳道1表示分子量標準，泳道2表示MDA-MB-231膜蛋白，泳道3表示11BD-2E11-2免疫沉淀物，以及泳道4表示同型對照免疫沉淀物。圖4:探針分別為11BD-2E11-2(A組)、IgGl同型對照(克隆107.3，B組)、抗大鼠NG2(多克隆，C組)、正常兔IgG(D組)、抗MCSP(克隆9.2.27，E組)和IgG2a同型對照(克隆G155-228，F組)的蛋白Western印跡圖譜。泳道1:11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道2:IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物，泳道3:抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道4IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物，泳道5:MDA-MB-231膜和泳道6:僅樣本緩沖液(陰性對照)。圖5:11BD-2E11-2-HRP與MCSP肽陣列的結合強度(Boehringer燈光設備)。圖6:針對幾種癌細胞系和非癌細胞的11BD-2Ell-2、同型對照或抗EGFR抗體的典型的FACS直方圖。圖7:顯示了11BD-2E11-2(A)和同型對照抗體(B)分別與冰凍正常人組織陣列中的心臟組織切片的結合圖譜的典型顯微照片。圖中，11BD-2Ell-2沒有使心肌纖維染色。放大倍數是200X。圖8:顯示了11BD-2E11-2(A)、抗肌動蛋白(B)和同型對照抗體(C)分別與冰凍正常人組織陣列中的骨骼肌組織切片的結合圖譜的典型顯微照片。11BD-2E1卜2沒有使骨骼肌染色，但使血管平滑肌染色(箭頭)。放大倍數是200X。圖9:11BD-2E11-2(A)和同型對照抗體(B)分別與乳腺癌腫瘤(浸潤性導管癌)結合的典型顯微照片。A組中黑色箭頭指向腫瘤細胞。放大倍數是200X。圖10:顯示了11BD-2E11-2(A)、陽性對照抗CD63(NKI-C3)(B)和陰性同型對照抗體(C)分別與冰凍人黑色素瘤組織陣列中的惡性黑色素瘤組織切片的結合圖譜的典型顯微照片。放大倍數是200X。圖11:顯示了11BD-2E11-2分別與冰凍黑色素瘤人組織陣列中的惡性黑色素瘤(A)和正常皮膚組織切片(A)的結合圖譜的典型顯微照片。11BD-2E11-2使惡性黑色素瘤顯著染色而未使正常皮膚染色。放大倍數是200X。圖12:預防MDA-MB-468乳腺癌模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體施用療程。數據點表示平均+/-SEM。圖13:—項ES-2異種移植研究模型中攜帶腫瘤的小鼠經11BD-2E11-2或緩沖液對照抗體治療后的生存期。圖14:一項ES-2異種移植研究模型中攜帶腫瘤的小鼠在11BD-2E11-2或緩沖液對照治療前、中、后的SEAP水平。圖15:預防A2058惡性黑色素瘤模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體施用療程。數據點表示平均十/-SEM。圖16:—項A2058惡性黑色素瘤模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體施用療程。數據點表示平均十/-SEM。具體實施例方式實施例1:通過Western印跡法鑒定結合蛋白為鑒定11BD-2E11-2抗體所識別的抗原，將表達該抗原的細胞膜進行凝膠電泳，并利用Western印跡法將其轉移到膜上以確定通過該抗體檢測到的蛋白(據專利申請No.10/810，744所述)。1、膜的制備先前的研究工作已證實11BD-2E11-2的FACS與乳腺癌細胞系MDA-MB-231(MB-231)結合。并且還證實11BD-2E11-2具有抗卵巢癌細胞系0VCAR-3的功效。所以，制備這兩種細胞系的細胞膜進行抗原鑒忠另外Western印跡和免測沉淀研究也已證實11BD-2E11-2與制備的A2058細胞膜的結合圖譜類似。用MB-231乳腺癌或OVCAR-3卵巢細胞的鋪滿培養物制備總細胞膜。去除細胞團中的培養基，并用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞。用分離緩沖液(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)在振蕩器上37。C、振蕩20分鐘使細胞分離。收集細胞，4°C、900g離心10分鐘。離心后，細胞團重懸在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，4°C、900g再離心10分鐘以洗滌。然后保存在-80°C。細胞團按3ml緩沖液/克細胞的量重懸在勻漿緩沖液中，緩沖液中按1片/50ml緩沖液的量加入Complete蛋白酶抑制劑"雞尾酒"片(Roche，LavalQC)。裂解細胞前先用polytron勻漿器在冰上將細胞懸浮液勻漿粉碎。4°C、15，OOOg離心細胞勻漿液10分鐘以去除細胞核顆粒。收獲上清纟私分裝到幾管內，然后4。C、75，600g離心90分鐘。小心棄除管內上清液，將各膜團重懸在大約5ml勻漿緩沖液中。然后將各管合到一個管內，4°C、75，600g離心90分鐘。小心棄除管內上清液，并對細胞團稱重。將含1%TritonX-100'的溶解緩沖液按3ml緩沖液/克膜團的量加到細胞膜團中。300rpm冰上振蕩1小時，使膜團溶解。75，600g離心，將不溶物質離心成團。小心倒出含有膜蛋白的上清液用于蛋白質含量分析，并保存在-8(TC。2、SDS-PAGE禾nWestern印跡用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜蛋白。取20"g膜蛋白與含100mMDTT的SDS-PAGE樣本緩沖液混合，然后加到8%SDS-PAGE凝膠的點樣孔內。將預先染色的分子量標記(安大略省伯靈頓市Invitrogen公司)上樣到對照泳道內。IOOV、電泳10分鐘，然后電壓調到150V，直到看到預先染色的分子量標記完全分離為止。按電漬法(40V、16小時)將凝膠中蛋白轉移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上。根據預先染色的標記是否從凝膠完全轉移到膜上來估計轉移情況。轉移完后，用含50/。脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水(含O.5%Tween-20)封閉膜，2小時。之后用含O.5%Tween-20的Tris-緩沖鹽水(TBST)洗滌一次，置于經3%脫脂奶粉TBST稀釋的5ug/ml11BD-2E11-2中2小時。再用TBST洗滌3次后，將膜置于與辣根過氧化物酶結合(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Fc)(來自JacksonImmunologicals,WestGrovePA)中，之后用TBST洗滌3次，再置于HRP底物3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)(底物試劑盒購自安大略省伯靈頓Vector實驗室)。圖1清楚地顯示出，11BD-2E11-2與MB-231(泳道l)和OVCAR-3(泳道2)膜蛋白的3個分子量區結合。與分子量(MW)標準比照，該抗體與分子量大約為150、240和280kDa的蛋白結合。其他所有研究都用MB-231膜進行，因為該細胞系反應更強一些。實施例2:確定11BD-2E11-2結合的抗原的糖基化為確定11BD-2E11-2抗體識別的抗原是否是糖蛋白，將MB-231膜置于PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、0-內切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶的不同組合中。用SDS-PAGE電泳分離膜，然后按Western印跡法與11BD-2E11-2雜交。圖2為11BD-2E11-2與分別置于僅有去糖基化緩沖液(泳道1)，包含PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、o-內切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶(泳道2)，包含PNGase、0-內切糖苷酶和唾液酸酶(泳道3)，僅含唾液酸酶(泳道4)，僅含0-內切糖苷酶(泳道5)和僅含PNGase(泳道6)中的MDA-MB-231膜結合的情況。經糖苷酶處理的MB-231膜仍與11BD-2E11-2結合，但可以看到所有泳道中蛋白質分子量發生了變化，這說明11BD-2Ell-2識別的抗原是糖蛋白。實施例3:11BD-2Ell-2所結合的抗原的鑒定l.免疫沉淀本例中，將用11BD-2E11-2抗體與可溶性膜糖蛋白之間的免疫沉淀反應分離出相關配基，然后進行11BD-2Ell-2特異性抗原鑒定。取100uLProteinG.Dynabeads(DyrmlBiotech,LakeSuccess,紐約)用lml0.1M磷酸鈉緩沖液(p朋.0)洗滌3次。將含100ug11BD-2E11-2的100ixL0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)加入洗滌后的珠子中，轉動混合1小時。去除未結合的抗體，用0.5ml0.1M含0.l%Tween-20的磷酸鈉(pH7.4)將外面包裹11BD-2E1卜2的珠子洗滌3次。再用lml0.2M三乙醇胺(pH8.2)洗滌2次。加入lml含0.02M二甲基庚二胺鹽的0.2M三乙醇胺(pH8.2)，轉動混合30分鐘，使11BD-2E11-2與珠子化學交聯。最后將珠子置于lml0.05MTris(pH7.5)中轉動混合15分鐘，使反應終止。將HBD-2Ell-2交聯珠用lml含0.l%Tween-20的lmMKH2P04、10mMNa2HP04、137mMNaCl、2.7mMKC1溶液(PBS)洗滌3次。再用0.1M、pH3.0檸檬酸鹽預洗提3分鐘，然后用0.1M含0.l%Tween-20的PBS洗漆3次。用針對三硝基苯酚(不相干分子)的小鼠IgGi抗體(克隆107.3，安大略省Oakville市BDBiosciences公司提供，)作陰性IgG,同型對照，按上述同樣方法制備另一套抗體交聯珠。將11BD-2E11-2交聯珠置于含1%BSA的0.lM磷酸鈉溶液(pH7.4)中，轉動混合30分鐘進行封l迅然后用0.lM磷酸鈉溶液(pH7.4)洗滌3次。將500ugMB-231細胞膜制備物置于11BD-2E11-2交聯珠中，4。C轉動混合2.5小時。再用lml含1%TritonX-100的lmMKH2P04、10mMNa2HP04、287mMNaCl、2.7mMKC1溶液將該免疫復合物結合珠洗滌3次。將11BD-2E11-2結合珠置于30uL0.1M檸檬酸鹽(pH3.0)緩慢混合3分鐘，洗提出11BD-2Ell-2結合蛋白。加入9uL1MTris(pH9)將洗提出的蛋白pH調為中性，保存在-80°C。用3ml含0.l%Tween-20的PBS洗滌11BD-2E11-2交聯珠。將IgG,同型對照(克隆107.3)交聯珠置于MB-231膜蛋白中，按與11BD-2E11-2珠同樣的方法進行操作。利用MB-231膜蛋白按所述方法制備兩批11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白后合在一起。IgGl(克隆107.3)同型對照珠也進行同樣操作。將62%的免疫沉淀混合物(相當于620tigMB-231膜蛋白經免疫沉淀后所得蛋白量)上樣到4-20%SDS-PAGE梯度凝膠的1個泳道孔內。將相當于20ugMB-231膜蛋白的107.3交聯珠產物上樣到相鄰泳道內。在對照泳道中加入未染色的(安大略省伯靈頓Invitrogen)或預先染色的分子量標記。先100V電泳10分鐘，再150V、60分鐘。最后將凝膠置于SYPRORuby(安大略省米西索加市BioRad公司)中染色。在平行的Western印跡操作中，電泳分離出18%免疫沉淀混合物(相當于180tigMB-231膜蛋白經免疫沉淀后所得蛋白量)與等量IgGl同型對照(克隆107.3)交聯珠產物。通過電漬法在40V、16小時下將凝膠中蛋白轉移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上。之后用含5。/。脫脂奶粉的TBST封閉膜2小時。然后用含3%脫脂奶粉的TBST稀釋的11BD-2E11-2作探針與膜雜交2小時。用TBST洗滌3次后，將膜置于山羊抗小鼠IgG(Fc)-HRP結合物中1小時。再用TBST洗滌3次，然后置于HRP的底物TMB中。圖3為11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白的凝膠和Western印跡圖譜。凝膠上(A組)泳道1表示分子量標準，泳道2表示MB-231膜蛋白。在含有11BD-2E11-2免疫沉淀物的泳道中(泳道3)，有兩條不同的帶，分子量分別為240和280kDa，而含有107.3免疫沉淀物(泳道4)的泳道中沒有出現這兩條帶。在對應的Western印跡圖譜(B組)上，11BD-2E11-2與240和280kDa的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白反應明顯。11BD-2E11-2與另一條150kDa的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白帶同樣反應明顯；而在染色的凝膠上沒有檢測到這條蛋白帶。11BD-2E11-2與11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白的反應情況與整個MB-231細胞膜上所呈現的情況類似(泳道2)。11BD-2E11-2與IgGl同型對照(克隆107.3;泳道4)免疫沉淀蛋白沒有發生反應，這說明11BD-2E11-2與免疫沉淀蛋白的結合是特異性的，而并非雜蛋白所致。2.質譜分析用無菌解剖刀切出凝膠上相當于240和280kDa的11BD-2EU-2免疫沉淀蛋白區域(圖3A組泳道3X然后應用MALDI/MS和LC/MS/MS質譜分析技術鑒定凝膠塊中蛋白。在PROGEST工作站中用胰蛋白酶酶解樣本，然后取一部分酶解后上清液進行MALDI/MS分析。用ZipTips自動點樣(ProMS);用基質(a-氰基4-羥基肉桂酸)溶液(含60%乙腈、0.2%TFA)和C18填料洗提肽段。操作VoyagerDE-STR質譜儀(AppliedBiosystems，FosterCityCA)獲得MALDI/MS數據，觀察到的m/z數值提交給ProFound程序(Proteometrics程序包)進行肽質量指紋檢索。運用ProFound程序査詢當地保存的NCBInr數據庫備份。采用nanoLC/MS/MS方法在MicromassQ-Tof2質譜儀上使用75umC18柱以流速200nL/min對另一部分酶解上清液進行分析。用當地的MASCOT備份檢索MS/MS數據。利用MALDI/MS和LC/MS/MS鑒定的蛋白列于表1。表1.利用MDA-MB-231細胞膜的11BD-2E11-2免疫沉淀物鑒定的蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>兩份樣本均鑒定為黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白多糖(MCSP)。3、確認通過檢測已知的抗MCSP抗體是否與11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白發生反應來確定該抗原，反之亦然。同樣采用前述方法制備免疫沉淀物，不同的是，另外增加了小鼠抗MCSP單克隆抗體9.2.27(IgG2a)(Chemicon，TemeculaCA)，和用作陰性IgG2a同型對照的抗三硝基苯酚(不相干分子)小鼠IgG2a抗體(克隆G155-178由安大略省0akville市BDBiosciences公司提供)。用SDS-PAGE分離相同的6塊10%凝膠中的11BD-2E11-2免疫沉淀物、IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物、抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物、IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物和MB-231膜。按上述方法進行電泳、Western印跡操作。將膜置于含3%脫脂奶粉的TBST稀釋的5ug/ml11BD-2E11-2、IgGl同型對照(克隆107.3)、抗MCSP(克隆9.2.27)、IgG2a同型對照(克隆G155-228)、兔多克隆抗大鼠NG2抗體(MCSP是大鼠NG2的人同源物；Chemicon，TemeculaCA)和正常兔IgG(Sigma,SaintLouisM0)中2.5小時。Western印跡圖譜如圖4所示。圖4(A組)顯示了11BD-2E11-2分別與11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道1)、IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物(泳道2)、抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物(泳道3)、IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物(泳道4)、MB-231膜、(泳道5)和僅樣本緩沖液(陰性對照)(泳道6)結合的情況。MB-231膜和11BD-2E11-2免疫沉淀物中，11BD-2E11-2識別同樣的3條帶，分別約為150、240和280kDa。而在抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道中僅有上面280kDa的帶被識別。同型對照免疫沉淀物泳道均無反應，說明11BD-2E11-2與免疫沉淀物之間的反應是由于蛋白與11BD-2E11-2和9.2.27特異性結合和免疫沉淀蛋白所致。以IgGl同型對照(克隆107.3)為探針進行的平行雜交(B組)中，所有泳道都沒有觀察到反應，這說明在以11BD-2E11-2為探針進行雜交所觀察到的反應是特異性的。C組顯示出兔多克隆抗大鼠NG2抗體在平行雜交中的結合情況。抗NG2與UBD-2Ell-2免疫沉淀物(泳道l)中大約150和240kDa的兩條帶結合，但沒有與其他泳道中相同分子量的蛋白結合。在平行雜交(D組)中，正常的兔IgG與IgG2a免疫沉淀物(泳道4)和MB-231膜(泳道5)中蛋白略微發生非特異性反應。所以C組(以兔抗NG2為探針)泳道中出現的相同反應應視為非特異性的。在平行雜交(E組)中，抗MCSP(克隆9.2.27)僅與抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道(泳道3，箭頭所示)中的一條帶有很微弱的結合；在MB-231膜(泳道5)中沒有看到這條帶，說明9.2.27可能與該抗原的親合力低，所以只有在例如免疫沉淀樣本濃縮后才顯出反應。以lgG2a同型對照(克隆G155-228)為探針進行的平行雜交(F組)中，所有泳道均未觀察到反應，這說明在以抗MCSP(克隆9.2.27)為探針進行雜交所觀察到的反應是特異性的。這些結果證明與HBD-2E11-2免疫沉淀蛋白被大鼠MCSP同源物識別，而抗MCSP免疫沉淀蛋白又被11BD-2E11-2識別。質譜鑒定結果和已知商業抗體所證實的結果共同證明11BD-2E11-2特異性抗原是MCSP。這也與實施例2的去糖基化實驗證實MCSP核心蛋白是糖蛋白的結果一致。實施例4:抗體表位測定本實施例通過抗體表位測定實驗來確定HBD-2E11-2識別MCSP分子的區域。根據MCSP的氨基酸序列合成重疊肽陣列，將陣列與纖維素膜逐步共價結合，得到確定的排列。各肽段長18個氨基酸，有9個氨基酸相互重疊。將肽陣列置于封閉緩沖液中幾個小時。采用在Wilson和nakane方法基礎上改進的高碘酸法將11BD-2E1卜2與辣根過氧化物酶(HRP)結合。將封閉后的肽陣列置于含lug/ml11BD-2Ell-2-服P的封閉緩沖液中。另一個實驗中，用羊抗小鼠IgG-HRP溫育的肽陣列作陰性對照。肽陣列用TBST洗滌后，與化學發光底物進行作用。化學發光反應時，用電荷耦合成像系統(CCD成像系統)對肽陣列上各點發光進行定量分析，得到各肽的信號強度值(Boehringer燈光設備;BLU)。本實驗中低于7500BLU的信號視為背景。肽陣列的結合數據列于表2。表2,11BD"2S1和HCSP肽陣列的培合驟號氣綦酸序鄉肚U.醫,鵬夢鵬mi&L■■seeS70112804945避8袋!01,!2湖131禱,A窗TOSC腿SS紋1516微、，繊微20嫩,鵬誠jraT，M21ragMJW鼸鉱戰玄鼸亀遷CjtEf茲絲IWyiQ固23WETOX^膽鼸磁狩舊3378124<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>圖5表示該結合數據的示意圖。11BD-2E11-2與肽ft26(SEQIDNO.1)的結合最強，與tt71(SEQIDNO.2)結合較弱，僅稍高于背景，可以看到，11BD-2E11-2被肽#3(SEQIDNO.3)、恥6(SEQIDNO.4)、#170(SEQIDNO.5)、#251(SEQIDNO.6)、#252(SEQIDNO.7)柳256(SEQIDNO.8)所識別。這些結果表明11BD-2E11-可以與具有兩個主要結合位(肽#26和#71)的一個不連續表位及其他許多位點結合。實施例5如專利申請No.10/743,451所述，雜交瘤細胞系11BD-2E11-2已根據布達佩斯條約于2003年11月11日保藏于美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),地址馬納薩斯Blvd.大學10801，VA20110-2209，保藏號PTA-5643。根據CFR1.808規定，保藏人應確保專利授權后公眾獲取保藏材料不再受限制。抗體制備單克隆抗體11BD-2E11-2的制備在CL-1000瓶(安大略省0akville市BDBiosciences公司)中培養雜交瘤細胞(PTA-5643)，收集后，按1周兩次反復接種，最后根據標準的抗體純化步驟用純化柱ProteinGS印harose4FastFlow純化(AmershamBiosciences,Baied，Urfe，QC)。如專利申請10/348，231所述，在細胞毒性分析試驗(表2)中，將11BD-2E11-2與眾多陽性對照(抗Fas(E0S9.1，IgM，ka卯a型，20ug/ml，eBioscience，SanDiego,CA)、抗Her2/neu(IgGl，kappa型，10iig/ml，安大略省馬克姆InterMedico公司)、抗EGFR(C225,IgGl，kappa型，5yg/ml，Cedarlane，Hornby,0N)、環己酰亞胺(IOOpM，安大略省Oakville市Sigma公司)和N認3(0.1%，安大略省0akville市Sigma公司))和陰性對照(107,3(抗TNP，IgGl,kappa型，20ug/ml，安大略省0akville市Sigma公司BDBiosciences公司XG155-178(抗-TNP，IgG2a，kappa型，20ug/ml，安大略省Oakville市Sigma公司BDBiosciences公司XMPOll(抗原特異性未知，IgG2b，kappa型，20ug/ml)，J606(抗果聚糖，IgG3，kappa型，20ug/ml)，IgG緩沖液(2%))進行比較。用乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，MDA-MB-468(MB-468)，MCF-7)、結腸癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR-3(0VCAR))、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD27sk，Hs888Lu)細胞系進行試驗(均來自弗吉尼亞州馬納薩斯市ATCC)。Live/Dead細胞毒性檢測試劑盒購自MolecularProbe公司(Eugene,0R)，在操作該試劑盒時根據其產品說明書作了如下改動檢測前按預定的合適密度將細胞接種到孔板內。2天后，將純化后的抗體或對照用培養基稀釋，然后取lOOul轉到細胞孔板內，置5%0)2恒溫箱培養5天。之后將孔板倒空，并吸干液體。室溫下用多通道塑料擠瓶將含MgCl2和CaCL的DPBS分加到各孔內，輕敲3下，再倒空并吸干液體。將含MgCh和CaCl2的DPBS稀釋的熒光鈣黃綠素染料加到各孔內，置于37°C、50/oC(V恒溫箱內30分鐘。用PerkinElmerHTS7000自動熒光讀板機讀取孔板數據，然后用微軟Excel軟件分析數據，結果列于表3。表中數據表示四個實驗各重復三次的平均結果，并以下列方式定性表示4/4實驗大于細胞毒性閾值(+++)，3/4實驗大于細胞毒性閾值(++)，2/4實驗大于細胞毒性閾值(+)。表l中未標記的細胞表示矛盾或效果低于細胞毒性閾值。11BD-2E11-2對乳腺癌細胞和卵巢癌細胞有特異性細胞毒性，對正常細胞沒有影響。化學細胞毒性劑能產生預期的細胞毒性，而這里包括的其它許多抗體在生物細胞分析試驗的限制下也可以達到預期效果。總而言之，以上實驗顯示11BD-2E11-2抗體對兩種癌細胞類型表現出細胞毒性。該抗體的活性具有選擇性，因為并非所有類型的癌細胞都對該抗體敏感。另外，該抗體不對非癌細胞產生細胞毒性(治療中須考慮的一個重要因素)，說明該抗體具有功能特異性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如專利申請10/348，231和10/810，744所述，用流式細胞技術(FACS)評價11BD-2E11-2與上述癌細胞和正常細胞系組及以下卵巢癌細胞系^2780-0&A2780-s>C-140V200&Hey、OCOl、0VCA-429和ES-2+SEAP)的結合。FACS所用細胞的制備先用DPBS(不含Ca2+和Mg"洗滌細胞單層，然后在37。C用細胞分離緩沖液(安大略省伯靈頓INVITROGEN公司)將細胞培養板上細胞洗脫。離心收集后，將細胞重懸在4。C含MgC12、CaC"和2。/。或25呢胎牛血清(FBS)的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(洗滌培養基)中計數，并等分成適當細胞密度，再將細胞離心成團，重懸在4"C含有20ug/ml試驗抗體(11BD-2E11-2)或對照抗體(同型對照或抗EGFR)的染色培養基(含MgC12、CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS)中，置于冰上30分鐘。在加入與AlexaFluor488結合的第二抗體前細胞先用洗滌培養基洗滌1次。然后加到含AlexaFluor488結合抗體的染色培養基中20或30分鐘。之后細胞再洗滌最后一次，并重懸在含14g/ml碘化丙啶或1.5%多聚甲醛的染色培養基中。向流式細胞儀FACScan上樣，用CellQuest軟件(安大略省Oakville市BDBiosciences公司)評價獲取的細胞。通過調節FSC和SSC檢測器電壓和振幅增益，設定細胞前向角(FSC)和側向角(SSC)。運行先后以純化的同型對照抗體染色、再以AlexaFluor488結合的第二抗體染色以使細胞熒光強度峰相同、平均值均約為1-5單元的細胞，來調節檢測器的三個熒光通道(FL1、FL2和FL3)。結合FSC設門和碘化丙啶排除法(使用的話)，獲得活細胞。每份樣本獲得約10，000個活細胞，分析結果列于表4和5c表4和5列出了平均熒光強度相對同型對照增加的倍數，定性表示為小于5(-);5-50(+);50-100(++);大于100(+++)，以及括號內為染色細胞的百分比。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>圖6所示為11BD-2E11-2抗體的典型直方圖。11BD-2E11-2與乳腺癌細胞系MDA-MB-231(表4)和包括ES-2+SEAP在內的幾個卵巢腫瘤細胞系(表5)特異性結合。11BD-2E11-2也與非癌細胞結合，但這種結合并不產生細胞毒性。這一非顯而易見的研究發現進一步證明結合并不一定意味著抗體是與其相關抗原結合的隱含。這暗示抗體在不同細胞中的配接情況決定細胞毒性，而不是僅僅決定抗體^口口o實施例6:正常人組織染色本實施例通過IHC研究旨在査明11BD-2E11-2抗原在人體內的分布。之前已摸索了IHC的最佳操作條件，以此確定其他實驗條件。11BD-2E11-2單克隆抗體的制備和純化步驟如上所述。據專利申請No.10/810，744所述，采用冰凍人正常器官組織陣列(紐約Watervliet市Clinomics公司)使抗體與20個正常人組織結合。將玻片用冷丙酮(-2(TC)處理10分鐘后，置于室溫。然后用4"C冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗3次，每次2分鐘，再在3%過氧化氫中清洗10分鐘以抑制內源性過氧化物酶活性。接著用PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后置于Universal阻斷劑(安大略省多倫多Dako公司)中室溫5分鐘，HBD-2E11-2、抗人肌肉肌動蛋白抗體(克隆HHF35，安大略省多倫多Dako公司)或同型對照抗體(針對黑曲霉葡萄糖氧化酶，哺乳動物組織中不存在、也不誘導產生這種酶；安大略省多倫多Dako公司)用抗體稀釋緩沖液(安大略省多倫多Dako公司)稀釋到作用濃度(抗肌動蛋白抗體2ug/ml，其他抗體5yg/ml)，室溫下過夜l小時。玻片用PBS清洗3次，每次2分鐘。用所提供的結合服P的第二抗體(安大略省多倫多DakoEnvisionSystem公司)檢測或觀察第一抗體的免疫反應活性，室溫30分鐘。然后再用PBS清洗玻片3汰每次2分鐘。加入DAB(3,3'-二氨基聯苯胺鹽酸鹽，安大略省多倫多Dako公司)色原底物溶液，讓免疫過氧化物酶室溫染色10分鐘。然后用自來水清洗玻片，使顯色反應終止。再用Meyer蘇木精(安大略省Oakville市SigmaDiagnostics公司)復染色，然后用乙醇(95-100%)逐級脫水，并用二甲苯清除。使用封片劑(安大略省多倫多DakoFaramount公司)將玻片封住。用倒置顯微鏡Axiovert200(安大略省多倫多加拿大Zeiss公司)進行顯微鏡檢，NorthernEclipse成像軟件數碼成像并保存。最后由病理學家對結果進行分析、評分和解釋。表6概括出正常人組織陣列經11BD-2E11-2染色后的結果。從表中可看到，主要有2類組織被染色。有一組組織完全為陰性，包括正常甲狀腺、支氣管和左心室心肌(圖7)。第二組組織包括組織切片中染色為陽性的組織，但限于血管平滑肌纖維和/或上皮組織(圖8)。這些結果說明11BD-2E11-2特異性抗原并未在正常組織上廣泛表達，而且該抗體也僅與人的有限幾個組織結合。11BD-2E11-2對正常人組織的染色結果與先前報道的抗MCSP抗體B5的情況類似；先前的研究顯示B5與皮膚角化細胞、肺泡上皮和毛細管內皮結表6:冰凍人正常組織上11BD-2E11-2的IHC結果<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>縮寫SMF:平滑肌纖維，Bg:背景染色，PD:部分分離，F:folded,CD:完全分離。實施例7:人乳腺癌組織染色本實施例通過工HC研究來確定11BD-2E11-2抗原與人乳腺癌之間的關系(據專利申請No.10/810，744所述)。對肌動蛋白(陽性對照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶(一種哺乳動物組織中不存在也不能誘導產生的酶)抗體(陰性對照)進行比較。本研究中使用源自15例乳腺癌患者和5份未長腫瘤的乳腺組織樣本的乳腺癌組織陣列(紐約Watervliet市Clinomics公司)。各患者信息包括年齡、性別和診斷結果。IHC步驟同實施例6。表7概括了乳腺癌組織陣列經11BD-2E1卜2抗體結合后的染色情況。各陣列包含了15例患者個體的腫瘤樣本。總體上，進行試驗的8例(其中7份組織樣本或者完全分離，或者不具有代表性)患者中62%顯示為11BD-2E11-2抗原陽性。而3份(又有2份組織樣本完全分離)正常乳腺組織樣本均未呈現11BD-2E11-2陽性(圖9)。從結果中看不出11BD-2E1卜2陽性表達量隨腫瘤期別增加而增加的趨勢。但由于樣本規模小，所以研究結果有一定局限性。11BD-2E11-2染色具有癌細胞特異性(圖9)。從11BD-2Ell-2的染色圖譜來看，抗體對患者樣本中的惡性細胞具有高度特異性，因而成為備受矚目的藥物靶點。11BD-2E11-2對乳腺癌組織的染色結果與先前報道的抗MCSP抗體B5類似。先前的研究顯示B5與60%乳腺癌腫瘤組織結合。表7:冰凍人正常組織和乳腺癌組織上11BD-2E11-2的IHC結果<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>本實施例通過IHC研究來確定11BD-2E11-2抗原與人黑色素瘤癌之間的癌癥關系。比較抗CD63抗體(NIK-C3;MEDIC0RP，MontrealQC);陽性對照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶(一種哺乳動物組織中不存在也不能誘導產生的酶)抗體(陰性對照)。所使用的惡性黑色素瘤組織陣列源自35例惡性黑色素瘤患者，IO份樣本源自惡性黑色素瘤患者的正常皮膚組織(馬里蘭州Bethesda市TriStarTechnologyGroup有限責任公司)。IHC操作步驟除以下改動外基本同實施例6:加入用于免疫過氧化物酶染色的AEC(安大略省多倫多Dako公司)色原底物溶液室溫下顯色10分鐘。用自來水清洗玻片，使顯色反應終止。用Meyer蘇木精(安大略省0akville市SigmaDiagnostics公司)復染色后，玻片用蒸餾水清除。表8概括了黑色素瘤癌組織陣列經11BD-2EU-2抗體結合后的染色情況。各陣列包含采自35例患者個體的腫瘤樣本和10例患者的正常皮膚。總體上，進行試驗的33例(其中2份組織樣本完全著色)患者中67%表現為11BD-2Ell-2抗原陽性(圖IO)。另外，取自惡性黑色素瘤患者的6份(4份組織樣本不具有代表性或不能用)正常皮膚組織樣本均未呈現陽性(圖ll)。11BD-2E11-2染色具有癌細胞特異性(圖11)。HBD-2E11-2的染色圖譜顯示，抗體對患者樣本中的惡性細胞有高度特異性，因而稱為備受矚目的藥物耙點，并且證實11BD-2E11-2可用作潛在藥物。表8:冰凍人正常皮膚和黑色素瘤組織上11BD-2E11-2的IHC結果<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>縮寫meta:轉移性，NR:沒有代表性，CD:完全分離，NA:不能用。實施例9:建立體內MDA-MB-468腫瘤實驗根據專利申請No.10/810，744所述并參照圖12，向6-8周的老年雌性SCID小鼠后頸部皮下注射含200萬個MDA-MB-468人乳腺癌細胞的生理鹽水lOOul。每周用卡尺測量腫瘤生長體積。當群體中大多數腫瘤體積達到lOOmm3，小鼠隨機分成2個治療組，每組5_6只。11BD-2E1卜2或緩沖液對照的母液在用含2.7mMKC1、ImMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后，按10mg/kg/劑腹腔注入300"1。然后按同樣方式一周注入3次、共10齊U，直到注入后第66天。大約每七天用卡尺測一次腫瘤體積，直到研究結束或動物個體達到加拿大動物保護協會(CCAC)終點。研究期間記錄動物體重。研究結束時，根據CCAC指南對所有動物實施安樂死。隨機化時各組的腫瘤平均體積和標準偏差大致相同。各組間體重無統計學差異，說明是真正的隨機化。如圖12所示，在為期3周的療程結束時，與緩沖液對照相比，抗體11BD-2E11-2抑制腫瘤生長達25%(p=0.52)。盡管非顯著性差異，但與緩沖液對照相比，研究期間可以觀察到腫瘤體積減小的趨勢。所以，研究顯示11BD-2E11-2在乳腺癌模型中有療效。實施例10:建立體內ES-2+SEAP腫瘤實驗據專利申請No.10/810，744所述并參照圖13和14，將1000萬經轉染后穩定表達人胎盤分泌堿性磷酸酶(SEAP)的ES-2+SEAP人卵巢癌細胞腹腔注入6-8周老年雌性athymic裸鼠體內。將1000萬卵巢癌細胞重懸在500pl無血清的a-MEM中。第7天，3只小鼠死亡，說明腫瘤生長。然后小鼠隨機分成2個治療組，每組8只。11BD-2E11-2或緩沖液對照的母液在用含2.7mMKC1、lmMKH2P04、137rnMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后，按10mg/kg/劑腹腔注入250ul。然后每天施用一次，施用5劑后，再每隔一天施用一次，施用5齊lj，前后總共施用10齊ij。研究期間或者動物個體達到CCAC終點前，通過所測定的SEAP循環水平來推測腫瘤負荷，并在尸檢后對腫瘤負荷進行目測評估。研究期間記錄動物體重。研究結束時，根據CCAC指南對所有動物實施安樂死。隨機化時分析血漿SEAP循環水平(用來表示腫瘤負荷)。11BD-2E11-2治療組和緩沖液對照治療組之間，SEAP平均水平沒有顯著性差異。但各組內腫瘤攝取率發生變化。如圖13所示，抗體11BD-2E11-2使治療組群體生存期有延長的趨勢。如圖14所示，一只接受11BD-2E11-2治療的動物的SEAP循環量已減小到可幾乎忽略不計的水平。自注入后60天左右SEAP循環一直維持在低水平。實施例11:體內A2058人黑色素瘤的預防腫瘤實驗參照圖15中數據，向4-8周老年雌性SCID小鼠后頸部皮下注射IOOpI含75萬A2058人黑色素瘤癌細胞的生理鹽水。小鼠隨機分成2個治療組，每組5只。注射后當天，11BD-2E11-2試驗抗體或緩沖液對照的母液在用含2.7mMKC1、lmMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后，按20mg/kg/劑腹腔注入300u1。然后按同樣方式每周施用抗體或緩沖液對照一次，持續施用7周。用卡尺每7天測一次腫瘤體積，直到第10周，或者動物個體達到加拿大動物保護協會(CCAC)規定的終點為止。研究期間記錄動物體重。研究結束時，根據CCAC指南對所有動物實施安樂死。如圖15所示，與緩沖液對照相比，11BD-2E11-2治療使腫瘤生長減慢。第55天(治療結束后第5天)，11BD-2E11-2治療組的腫瘤平均體積占緩沖液對照組的58%(=.046，非配對t檢驗法)。所以，與對照相比，11BD-2E11-2在乳腺、卵巢和黑色素瘤的人體內癌癥模型中對癌癥有療效，并且能減小腫瘤負荷。實施例12:建立體內A2058人黑色素瘤的腫瘤實驗參照圖16，向老年雌性SCID小鼠的后頸部注入100iU含50萬A2058人黑色素瘤癌細胞的生理鹽水。每周用卡尺測一次腫瘤體積。當群體中大多數腫瘤體積達到100mm3，小鼠隨機分成2個治療組每組5-6只。11BD-2E11-2或緩沖液對照的母液用含2.7mMKC1、lmMKH2P04>137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后按20mg/kg/劑腹腔注射300ul。然后按同樣方式每周施用抗體或緩沖液對照3次，共施用10齊l」，直至注入后第44天。用卡尺大約每七天測一次腫瘤體積，直到研究結束或動物個體達到CCAC終點。研究期間記錄動物體重。研究結束時，根據CCAC指南對所有動物實施安樂死。隨機化時各組的腫瘤平均體積和標準偏差大致相同。各組間體重無統計學差異，說明是真正的隨機化。如圖13所示，在治療期結束后，與緩沖液對照相比，抗體11BD-2E11-2抑制腫瘤生長達49%(p=0.1272;非配對t檢驗法)。盡管結果屬于非顯著性差異，但與緩沖液對照相比，研究期間可以觀察到腫瘤體積減小的趨勢。所以，11BD-2E11-2在乳腺、卵巢和惡性黑色素瘤模型中顯示出療效。總之，11BD-2E11-2在多個人癌癥模型中產生的益處(與對照治療相比，延長生存期和/或減小腫瘤負荷)暗示該抗體對包括人在內的哺乳動物的癌癥治療具有藥理和制藥方面的益處。確鑿證據顯示11BD-2E11-2是通過與MSCP上表位配接來介導抗癌作用。本發明中，所述表位稱為"MSCP抗原性部分(antigenicmoiety)"，其特征為能與雜交瘤細胞系11BD-2E11-2編碼的單克隆抗體、其抗原結合片段或抗體結合物結合。實施例3中顯示，11BD-2E1卜2抗體可用于免疫沉淀MDA-MB-231細胞等表達的相關抗原。另外，還可能借助FACS、細胞酶聯免疫吸附或IHC等技術將11BD-2E11-2抗體用于檢測是否存在表達與該抗體特異性結合的MSCP抗原性部分的細胞和/或組織。因此，通過FACS、細胞酶聯免疫吸附或IHC檢測技術，免疫沉淀的11BD-2E11-2抗原可以抑制11BD-2E11-2與這些細胞或組織結合。另外，與11BD-2Ell-2抗體一樣，其他抗MSCP抗體也可用于免疫沉淀和分離其他形式的MSCP抗原，而且同樣利用上述檢測法，該抗原也可用于抑制這些抗體與表達該抗原的細胞或組織的結合。本文中提到的所有專利和出版物代表本發明所屬
技術領域：
的技術人員的技術水平，并視同以一一具體指明的引用方式全部并入文本。應當理解，雖然本發明按一定形式予以闡述，但并不限于本文所述和所顯示的特定形式或布局。本發明可在其范圍內做出各種變更，而且并不限于本說明書所言和所顯示的內容，這對本領域技術人員來說是不言而喻的。本領域的技術人員很容易理解，本發明能夠實現和取得已述及和雖未述及卻切實存在的目的、預期結果和有益效果。本文所述的寡聚核苷酸、肽、多肽、生物相關化合物、方法、步驟和技術均代表優選實施例，它們只是作為典型實例而非對發明范圍作出限制。本領域技術人員會想到屬于本發明精神涵蓋范圍和所附權利要求范圍所限定的變更及其他應用。雖然已對本發明作出說明并給出具體的優選實施例，但是本發明要求保護的范圍并不局限于這些具體的實施例。實際上，對本發明上述實施方式做出的各種本領域技術人員顯而易見的改動都包含在所附權利要求的范圍內。權利要求1.一種治療癌癥患者的方法，其包括向所述患者施用抗癌抗體或其片段，該抗體是根據癌癥治療所使用的抗癌抗體的制備方法制備所得，所述抗體或其片段的特征在于對癌組織細胞有細胞毒性，而對非癌細胞基本上為良性；其中，將所述抗體或其片段與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導所述癌癥的治療；所述抗體是分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段，它能與所述癌組織表達的抗原性部分結合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結合。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段是人源化抗體或嵌合抗體。3.根據權利要求1所述的方法，其包括將所述抗體或其抗原結合片段與選自毒素、酶、放射性化合物和血細胞的成分結合，形成抗體結合物；向所述患者施用所述抗體結合物或結合片段；其中，將所述抗體結合物或結合片段與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導所述癌癥的治療。4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述抗體或其片段是人源化抗體或嵌合抗體。5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過抗體依賴性細胞的細胞毒性來介導。6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過補體依賴性細胞毒性來介導。7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過催化細胞化學鍵水解來介導。8.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過針對腫瘤細胞上癌癥抗原產生免疫應答來介導。9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過靶向細胞膜蛋白以干擾其功能來介導。10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過使細胞蛋白構象變化從而產生細胞殺傷作用啟動信號來介導。11.根據權利要求1所述的方法，其中，所述制備方法利用含有取自特定個體的癌細胞和非癌細胞的組織樣本進行制備。12.—種治療癌癥患者的方法，其包括向所述患者施用抗癌抗體或其片段，該抗體是根據癌癥治療所使用的抗癌抗體的制備方法制備所得，所述抗體對癌組織細胞有細胞毒性，而對非癌細胞基本上為良性；其中，所述抗體是分離出的、由保藏于ATC(;保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體或其抗原結合片段，將它與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導所述癌癥的治療。13.根據權利要求12所述的方法，所述抗體或其片段是人源化抗體或嵌合抗體。14.根據權利要求12所述的方法，其包括將所述抗體或其片段與選自毒素、酶、放射性化合物和血細胞的成分結合，形成抗體結合物；向所述患者施用所述抗體結合物或其片段；其中，將所述抗體結合物與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導所述癌癥的治療。15.根據權利要求14所述的方法，所述抗體或其片段是人源化抗體或嵌合抗體。16.根據權利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過抗體依賴性細胞的細胞毒性來介導。17.根據權利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過補體依賴性細胞毒性來介導。18.根據權利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過催化細胞化學鍵水解來介導。19.根據權利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過針對腫瘤細胞上癌癥抗原產生免疫應答來介導。20.根據權利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過靶向細胞膜蛋白以干擾其功能來介導。21.根據權利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細胞毒性是通過使細胞蛋白構象變化從而產生細胞殺傷作用啟動信號來介導。22.根據權利要求12所述的方法，其中，所述制備方法利用含有取自特定個體的癌細胞和非癌細胞的組織樣本進行制備。23.—種介導對細胞表面上表達有MCSP抗原性部分的人腫瘤細胞的細胞毒性的方法，其包括使所述腫瘤細胞與分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段接觸，所述抗體或抗原結合片段是分離出的、能與所述表達的MCSP抗原性部分結合的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATC(;保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結合，所述結合后即產生對細胞的細胞毒性作用。24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述分離出的抗體或其抗原結合片段是人源化抗體或嵌合抗體。25.根據權利要求23所述的方法，其中，將所述分離出的抗體或其抗原結合片段與選自細胞毒性組分、酶、放射性化合物和血細胞的成分結合，形成抗體結合物。26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述分離出的抗體或其抗原結合片段是人源化抗體或嵌合抗體。27.根據權利要求23所述的方法，其中，所述分離出的抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體。28.根據權利要求23所述的方法，其中，人腫瘤組織樣本從選自乳腺、卵巢或黑色素瘤組織的組織中的瘤獲得。29.—種確定存在表達MCSP抗原性部分的細胞的結合分析法，該MCSP抗原性部分能與分離出的、由保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體或其抗原結合片段特異性結合，該結合分析法包括提供細胞樣本；提供分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段能與所述表達的MCSP抗原性部分結合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCG保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結合；將所述分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣本接觸；以及確定所述分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣本結合；從而確定存在表達能與所述分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段特異性結合的MCSP抗原性部分的細胞。30.根據權利要求29所述的結合分析法，其中，人腫瘤組織樣本從選自乳腺、卵巢或黑色素瘤組織的組織中的瘤獲得。31.—種從樣本中分離或篩選表達能與分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段特異性結合的MCSP抗原性部分的細胞的方法，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結合，該方法包括提供細胞樣本；提供分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段能與所述表達的MCSP抗原性部分結合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCG保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結合；將所述分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣本接觸；以及確定所述分離出的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣本結合；從而確認存在表達能與所述分離出的、由保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體或其抗原結合片段特異性結合的MCSP抗原性部分的細胞。32.根據權利要求31所述的方法，其中，細胞樣本從選自乳腺、卵巢或黑色素瘤組織的組織中的瘤獲得。33.—種通過對哺乳動物中的人腫瘤予以治療來延長生存期和/或延緩疾病進展的方法，其中，所述腫瘤表達能與具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的單克隆抗體或抗原結合片段特異性結合的抗原，該方法包括向所述哺乳動物按有效量施用所述單克隆抗體以減小所述哺乳動物的腫瘤負荷，從而延緩疾病進展和/或延長生存期。34.根據權利要求33所述的方法，其中，所述抗體與細胞毒性組分結合。35.根據權利要求33所述的方法，其中，所述細胞毒性組分是放射性同位素。36.根據權利要求33所述的方法，其中，所述抗體將補體激活。37.根據權利要求33所述的方法，其中，所述抗體介導抗體依賴性細胞的細胞毒性作用。38.根據權利要求33所述的方法，其中，所述抗體是鼠源抗體。39.根據權利要求33所述的方法，其中，所述抗體是人源化抗體。40.根據權利要求33所述的方法，其中，所述抗體是嵌合抗體。41.一種MCSP的表位，其包括表達出的MCSP抗原性部分，該MCSP抗原性部分能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的單克隆抗體或它的能與所述表達出的MCSP抗原性部分特異性結合的抗原結合片段特異性結合。42.—種抗體-抗原復合物，其包括權利要求41所述MCSP的表位，該表位能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的單克隆抗體或它的能與所述MCSP表位特異性結合的抗原結合片段結合。43.根據權利要求42所述的抗體-抗原復合物，其中，該抗體是嵌合抗體。44.根據權利要求42所述的抗體-抗原復合物，其中，該抗體是人源化抗體。45.根據權利要求42所述的抗體-抗原復合物，其中，所述抗體或其抗原結合片段與選自細胞毒性組分、酶、放射性化合物和血細胞的成分結合，形成抗體結合物。46.根據權利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.1所示肽序列LEFTLTTQSRQAPLAFQA被特異性結合。47.根據權利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.2所示肽序列CGGPAQDLTFRVSDGLQA被特異性結合。48.根據權利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.1所示肽序列LEFTLTTQSRQAPLAFQA和SEQIDNO.2所示肽序列CGGPAQDLTFRVSDGLQA被特異性結合。49.豐^fe禾J^求48戶;M的表位，其^i^與至^^^條選自SEQIDNO.3所示肽序列TL1MARLASAASFFGEN、SEQIDNO.4所示肽序列ACEGLTFQVLGTSSGLPV、SEQIDNO.5戶標月W^JVLRGAPGTEVRSFTQAQL、SEQIDNO.6所示肽序列KTGKHDVQVLTAKPRNGL、SEQIDNO.7所示肽序列LTAKP艦LAGDTETFRK、SEQIDNO.8戶際月游列PGGQPDPELLQFCRTPNP的月游列J口口°全文摘要本發明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及對腫瘤細胞的細胞毒性介導；更特別涉及使用癌癥緩解性抗體(CDMAB)來啟動細胞毒性反應，可根據情況選擇與一種或多種化療劑聯合使用。本發明進一步涉及使用本發明CDMAB進行結合分析。文檔編號C07K16/00GK101107267SQ200580040303公開日2008年1月16日申請日期2005年3月24日優先權日2004年9月24日發明者大衛·S·F·楊,海倫·P·芬得利,艾莉森·L·費里,蘇姍·E·哈恩申請人:阿里烏斯研究公司