專利名稱：用于診斷和治療癌癥的aimp2dx2的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及命名為AIMP2DX2、特異表達于癌細胞中的缺失外顯子2的AIMP2的變異體，及其用于診斷和治療癌癥的用途。
相關技術詳述癌癥的死亡率在全球范圍內持續增加。盡管存在關于癌癥的研究很多，它仍是全球死亡率的主要原因。
人們需要一種能夠簡單快速診斷癌癥的方法以提高治療方法例如手術、放射療法、化學療法或常規療法的效果。
有必要開發針對特定癌癥的標記物以診斷癌癥并對特定癌癥提供一種有效的治療方法。在細胞毒療法首次用作抗癌藥物后其在最近五十年已廣泛用于治療癌癥。這種治療有嚴重的副作用，例如，它非特異作用于與癌細胞相比具有快速細胞分裂率的其它器官的細胞而導致強烈毒性。為了克服副作用和那些已知抗癌藥物的耐藥性，已有許多研究來開發抗癌藥物，這些抗癌藥物中的癌癥特異標記物特異作用于由正常細胞轉化為癌癥中形成的腫瘤細胞。在癌癥靶向療法中發現特異于癌細胞的基因是非常重要的，而癌癥靶向療法被認為是使抗癌藥物毒性降低到最小的方法。
在這種情況下，本發明者已進行了深入研究開發了一種新型癌癥特異性分子并且因此發現了缺失外顯子2的AIMP2的變異體，即AIMP2DX2，它特異表達于癌細胞中且能夠用作診斷癌癥的標記物以提供更可信的結果。此外，本發明者已發現特異于AIMP2DX2蛋白質的抗體，或特異于AIMP2DX2 mRNA的小干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸可被用于癌細胞的特異治療方法。
因此，本發明的目的是提供AIMP2DX2蛋白質，該蛋白質缺失AIMP2蛋白質的外顯子2區域。
本發明的另一目的是提供一種核酸分子，該核酸分子包含編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列。
本發明的另一目的是提供一種重組載體，該重組載體攜帶編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列。
本發明的另一目的是提供一種轉化體，該轉化體由所述的攜帶編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的重組載體進行轉化而來的。
本發明的另一目的是提供制備AIMP2DX2蛋白質的方法，所述方法包含培養上述的轉化體。
本發明的另一目的是提供特異作用于AIMP2DX2蛋白質的抗體。
本發明的另一目的是提供一種癌癥診斷試劑盒，該試劑盒包含特異于AIMP2DX2蛋白質的抗體。
本發明的另一目的是提供一種診斷癌癥的方法。
本發明的另一目的是提供一種篩選AIMP2DX2蛋白質作為癌癥標記物的方法，該方法包含(a)提供分析用樣本和(b)檢測來自于樣本的編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的表達。
本發明的另一目的是提供特異于AIMP2DX2蛋白質mRNA的siRNA核酸分子。
本發明的另一目的是提供一種治療癌癥的藥學組合物，包含特異于AIMP2DX2蛋白質mRNA的siRNA核酸分子。
本發明的另一目的是提供一種治療癌癥的方法，包含施用特異于AIMP2DX2蛋白質mRNA的siRNA核酸分子。
本發明的另一目的是提供與AIMP2DX2蛋白質的mRNA區域互補的反義寡核苷酸。
本發明的另一目的是提供一種治療癌癥的藥學組合物，包含與AIMP2DX2蛋白質的mRNA區域互補的反義寡核苷酸。
本發明的另一目的是提供一種治療癌癥的方法，包含施用與AIMP2DX2蛋白質的mRNA區域互補的反義寡核苷酸。
本發明的另一目的是提供一種篩選AIMP2DX2蛋白質的mRNA作為癌癥標記物的方法，包含使用能夠區分AIMP2蛋白質的mRNA和AIMP2DX2蛋白質的mRNA的引物或探針。
本發明的另一目的是提供一種篩選藥物的方法，所述藥物能抑制AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成，包含以下步驟(a)使測試物質和包含AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質的組合物接觸；和(b)確定該測試物質是否抑制了AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成，其中所述的抑制了AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體形成的測試物質評價為抗癌藥物。
本發明的另一目的是提供一種篩選藥物的方法，所述藥物能抑制AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成，包含以下步驟(a)使測試物質和包含AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質的組合物接觸；和(b)確定該測試物質是否抑制了AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成，其中所述的抑制了AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成的測試物質評價為抗癌藥物。
附圖簡述
圖1a-1e表示AIMP2在TGF-β信號傳導及其與Smad2/3的相互作用中的功能重要性。比較AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs對TGF-β在細胞增殖(圖1a)、菌落形成(圖1b)、細胞周期進行(圖1c)和Smad2和Smad3的核轉運(圖1d)中的作用。在圖1a中，細胞用標明的濃度(0、2和4ng/ml)的TGF-β1培養6小時。未處理細胞中胸苷參入量記為1，并且這些值為四次獨立實驗的平均值。在圖1b中，AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs(14.5天)在TGF-β(2ng/ml)存在下培養4天，用多聚甲醛固定且菌落用吉姆薩染色顯影。在圖1c中，MEFs用TGF-β處理24小時，G0/G1期細胞比例用流式細胞儀檢測。在圖1d中，MEFs用TGF-β(2ng/ml)處理1小時。Smad2和Smad3與它們的特異抗體反應并且用綴合FITC(異硫氰酸熒光素)的抗體(綠色)顯影。細胞核用PI(碘化丙啶)(紅色)染色。在圖1e中，AIMP2與Smad2和Smad3的相互作用通過使用針對Smad2和Smad3的抗體的免疫共沉淀來檢測。
圖2a-2f表示AIMP2在TGF-β信號傳導中的工作機制。在圖2a中，A549細胞在TGF-β(2ng/ml)處理后在標明的時間收集起來且提取的蛋白質用抗Smad2或Smad3抗體免疫沉淀，并且AIMP2的共沉淀用抗AIMP2抗體來確定。WCL代表全細胞裂解物的蛋白質印跡(Western blots)。在圖2b中，通過RT-PCR測定對照和AIMP2轉染的DU145中TGF-β靶基因的表達，p15、p21和PAI-1。圖2c證實了在AIMP2/-MEFs中AIMP2在Smad2的磷酸化中的作用。在圖2d中，Smad2的不同結構域(Mad-同源結構域、MH1、MH2和連接臂)表達為LexA融合蛋白并且通過在酵母X-gal培養基中的藍色菌落形成來檢測其與B42融合AIMP2的相互作用。在圖2e中，Smad2與TGF-β受體的依賴TGF-β的相互作用通過免疫共沉淀來測定。在37℃下用TGF-β處理MEFs并且在免疫沉淀前在8℃的溫度下進行培養。TGF-β受體與Smad2的結合通過使用抗TβRI抗體的免疫印跡法監測。圖2f顯示了總Smad2、磷酸化的Smad2(p-Smad2)的時間過程，和TGF-β處理后在AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs中的AIMP2水平。
圖3a-3f表示AIMP2的差異表達和其缺失外顯子2形式的產生。通過蛋白質印跡分析(圖3a)和流式細胞術(圖3b)在多種癌細胞系中比較AIMP2水平。A549、NCI-H460、-H322和H290是肺癌細胞系而DU145和HCT116分別是前列腺癌和結腸癌細胞系。在圖3b中，“陰性”表明僅用二級抗體處理的DU145。每個細胞系分析2000個細胞。在圖3c中，通過使用不同引物對的RT-PCR來比較AIMP2轉錄水平。跨越外顯子3-4和1-3的轉錄物分別由引物對6/7和1/5產生(參見圖8b)。GAPDH是上樣對照。注意到用于外顯子1-3的轉錄物的引物對產生了較小AIMP2轉錄物。此較小轉錄物是缺失外顯子2的AIMP2(AIMP2DX2)的選擇性拼接形式。此轉錄物僅通過使用引物DX2-F和另一個特異于外顯子1和3間接點序列的引物(DX2-B)的RT-PCR(參見圖8b)自低AIMP2細胞系中生成。在圖3d中，在用TGF-β孵育2小時后通過免疫熒光染色法檢測TGF-β依賴型誘導作用和AIMP2核轉運。在圖3e中，通過[3H]胸苷參入(n＝4)比較TGF-β在標明細胞的增殖中的作用。在圖3f中，在用TGF-β孵育2小時后通過RT-PCR比較靶基因p21和PAI-1的TGF-β依賴型誘導作用。
圖4a-4h證實了AIMP2DX2對AIMP2細胞穩定性的作用。在圖4a中，DX2轉染至未用TGF-β處理或用TGF-β處理2小時的DU145中，并且用蛋白質印跡法檢測AIMP2水平。c-Myc、DX2和GAPDH(對照)的表達通過RT-PCR來監測。在圖4b中，DX2或空載體轉染至DU145中，并且其在TGF-β依賴型的細胞生長抑制中的作用通過胸苷參入(n＝4)來監測。在圖4c中，AIMP2F和-DX2間的相互作用通過先前描述的酵母雙雜交測定法(Rho，S.B.等人，PNAS.USA，964488-93(1999))進行測定。在圖4d中，AIMP2F和-DX2在[35S]蛋氨酸存在下通過體外翻譯合成，與GST-AIMP2F或-CDK2(對照)混合，并且用谷胱苷肽-瓊脂糖(glutathione-Sepharose)沉淀。沉淀的蛋白質用SDS-PAGE分離并且用放射自顯影法檢測。在圖4e中，AIMP2F或-DX2與融合結合蛋白質的相互作用(FBP；Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34330-3362003)和Smad2用酵母雙雜交測定法測定。在圖4f中，在產生DX2的H322細胞中通過使用抗AIMP2抗體的蛋白質印跡法監測蛋白酶體抑制劑ALLN(50μM，4小時)對全長(F)和AIMP2的DX2水平的作用。DX2形式通過與其體外合成的對應物(counterpart)在凝膠上的共遷移來確定。在圖4g中，經ALLN(20μM，2小時)處理的AIMP2的增加還通過在H322細胞中使用抗AIMP2抗體的免疫熒光染色法來顯示。在圖4h中，myc標記的DX2轉染至ALLN處理的DU145中。然后，AIMP2用抗AIMP2抗體免疫沉淀，并且遍在化(ubiquitinated)AIMP2分子通過使用抗遍在蛋白質抗體(Ubi)的免疫印跡法監測。
圖5a-5e表示AIMP2DX2對細胞生長調控和TGF-β傳導中的破壞作用。在圖5a中，DX2(或空載體)轉染至MEFs中并且監測其對細胞生長的作用。細胞和菌落分別通過光學顯微鏡檢查(頂端)和吉姆薩染色(底部)顯影。圖5b顯示編碼特異于DX2的編碼siRNAs的核苷酸序列。在圖5c中，構建了表達siRNAs 3的每個載體，將其轉染至H322和H460細胞系中，并且評價其對AIMP2水平和Smad2磷酸化的作用。在圖5d中，4號或5號siRNA轉染至H322中，并且用TGF-β測定其對細胞死亡(左)和細胞周期停滯(右)的作用。在圖5e中，將靶向AIMP2DX2的siRNA(si-DX2)導入H322中并且其對DX2轉錄物的抑制作用用RT-PCR(頂部)測定。si-DX2不影響全長AIMP2轉錄物如用外顯子3-4的轉錄物的RT-PCR所顯示。si-DX2對Smad2磷酸化和AIMP2表達的作用還由蛋白質印跡法(底部)測定。si-DX2對TGF-β傳導的恢復作用還用使用H322細胞的p-Smad2免疫熒光染色法(圖5f)、3TP啟動子下的TGF-β依賴型報告子分析方法(圖5g)和生長停滯(圖5h)測定。在圖5f中，p-Smad2和細胞核在TGF-β處理30分鐘后分別用綴合FITC的二級抗體(綠色)和PI(紅色)染色。注意到p-Smad2增加和由si-DX2轉染定位的核。
圖6a-6f表示AIMP2與肺癌形成的聯系。在圖6a中，在將苯-(α)-芘腹膜內給藥至AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠后的時間間隔中監測肺腫瘤形成。“N”代表被處死的小鼠的數目。在圖6b中，總的RNAs是從肺癌患者的正常和腫瘤區域分離出來的，并且用DX2-特異的引物進行RT-PCR。同一患者(用代號表示)的正常和腫瘤組織用抗AIMP2抗體進行RT-PCR(圖6c)。
圖7表示與AIMP2相互作用有關的Smad2結構域的測定。我們將編碼AIMP2或CDK2的cDNAs連接至pGEX4T-1的EcoRI和XhoI位點，使它們在E.coli BL21(DE3)中表達為GST融合蛋白并且根據生產商說明書純化它們。在[35S]蛋氨酸存在下使用TNT偶聯的翻譯試劑盒(Promega)通過體外翻譯來合成Smad2的不同缺失片段。結合于谷胱苷肽瓊脂糖凝膠珠上的GST融合蛋白與[35S]蛋氨酸標記的Smad2片段在結合緩沖液中孵育，該緩沖液為含有0.5mM EDTA、0.5mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和1％TritonX-100的PBS緩沖液(pH7.4)。結合混合物在4℃下旋轉孵育過夜并且用含有0.5％TritonX-100的結合緩沖液沖洗四次。加入SDS樣品緩沖液后，結合蛋白質通過煮沸洗脫并且用SDS凝膠電泳法分離。Smad2片段的存在用放射自顯影法檢測。
圖8a和8b顯示了人AIMP2基因的外顯子排列和AIMP2 cDNA上的引物位置。在圖8a中，AIMP2基因由四個編碼標明大小的多肽的外顯子組成。圖8b是用于產生跨越AIMP2不同區域的cDNA的引物位置及其序列的示意圖。
圖9a至9d證實AIMP2的表達減少了，以及在癌細胞系中生成了AIMP2DX2。在圖9a中，為了比較DX2-陽性和陰性細胞中的AIMP2水平，我們在一個平板上培養DU145和H460細胞，并且用抗AIMP2抗體(綠色)進行免疫熒光染色。這兩個細胞系用p53(紅色)免疫熒光染色來區分，因為DU145細胞由于其突變高水平表達p53，而含有野生型p53的H460細胞所表達的p53維持在低水平。用TGF-β處理這些細胞2小時，然后用甲醇固定。在圖9b中，為了確定AIMP2DX2對AIMP2表達的作用，用流式細胞儀監測AIMP2水平。將2μg/ml空載體或DX2轉染至DU145細胞中，培養24小時。然后用70％乙醇固定細胞并且與抗AIMP2抗體反應，隨后與綴合FITC的二級抗體反應。在圖9c中，AIMP2DX2對TGF-β依賴型細胞周期停滯的作用用流式細胞術來比較。盡管G0/G1期細胞比例在用空載體轉染的DU145細胞中增加，但是在DX2轉染的細胞中沒有增加。黑線和藍線分別顯示未用TGF-β處理和用TGF-β處理的細胞。在圖9d中，我們比較未用10μM ALLN處理(對照)或用10μM ALLN處理2小時的H460細胞中的AIMP2水平。“陰性”表示細胞僅用綴合FITC的二級抗體培養。
圖10a和10b顯示了在肺癌組織中AIMP2DX2的生成和AIMP2的抑制。在圖10a中，肺是從注射了苯并芘(benzoypyrene)的AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠中分離出來的，并且RNAs是從每個肺中分離出來進行RT-PCR以檢測AIMP2DX2的生成。所有生成DX2的肺顯示了肺中的腫瘤形成(標記+)。
圖11a和11b表示了AIMP2DX2在多種癌組織和癌細胞系中的表達。在圖11a中，RT-PCR用來檢測肝癌組織中AIMP2DX2的表達。圖11b顯示了多種癌細胞系中AIMP2DX2的表達。
圖12顯示了與正常表達AIMP2的野生型小鼠比較，敲除了(AIMP2+/-)小鼠中癌癥的指征。圖12a，用DNA印跡法(Southern blotting)和PCR分析檢測AIMP2基因處的突變。使用引物f3和r2從小鼠AIMP2基因內含子I區域產生了1223bp的PCR片段，并且將其用作探針與小鼠基因組DNA的Sac I片段雜交。引物f6、r6和pKOf2的混合物用于PCR分析。野生型和突變型等位基因分別生成大約1.2和1.9kb PCR產物。對p AIMP2表達的突變作用由使用AIMP2 cDNA探針的RNA印跡法(Northernblotting)和使用針對純化的人AIMP2的多克隆兔抗體的蛋白質印跡法(Westernblotting)來檢測。在RNA印跡法(數據未顯示)的每個泳道中都檢測到同樣量的肌動蛋白。+/+、+/-和-/-代表野生型、雜合型和純合型突變小鼠。基因捕獲插入的位置由突變等位基因的基因組DNA的序列分析來檢測。圖12b顯示了在AIMP2+/-小鼠和野生型小鼠中的腫瘤形成的比率。圖12c顯示了每個AIMP2+/-小鼠和野生型小鼠的腫瘤的平均數目。圖12d顯示了在AIMP2+/-小鼠和野生型小鼠中生成的乳頭瘤。
圖13顯示了攜帶AIMP2DX2基因的表達載體。在圖1 3中，縮寫pCMV、BGH pA、f1 ori、neomycin、ampicillin、SV40、SV40 pA、ColE1、T7和Sp6分別表示人巨細胞病毒即刻早期啟動子、牛生長激素多聚腺苷酸化信號、f1復制起點、新霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、SV40復制起點、SV40多聚腺苷酸化信號、ColE1復制起點、T7病毒啟動子和Sp6病毒啟動子。
發明詳述命名為AIMP2/JTV-1或AIMP2的AIMP2(ARS-相互作用多功能蛋白質2)是涉及氨酰tRNA合成酶形成的蛋白質之一。
本發明者指出AIMP2的基因斷裂誘導原癌基因(c-myc)過表達從而導致由于肺泡上皮細胞的過度增殖使初生小鼠死亡并且轉化生長因子-β(TGF-β)誘導AIMP2表達并有助于將其轉運到細胞核來下調c-myc(M.J.Kim，等人，Nat.Genet.34330-336(2003))。
根據之前的研究，本發明者已揭示AIMP2是新腫瘤抑制子，通過與Smad2/3的直接相互作用在TGF-β傳導中起到獨特的作用。此外，我們已發現缺失外顯子II的AIMP2的異常變異體(AIMP2DX2)在癌細胞系和組織中特異表達。使用組合的AIMP2特異引物通過RT-PCR可以證實缺乏外顯子II的AIMP2(AIMP2DX2)的存在。當引物用于生成跨越外顯子3和4的AIMP2 cDNA時，在細胞中未觀察到AIMP2轉錄物的減少，在蛋白質印跡分析中顯示AIMP2的水平降低。當我們用引物生成外顯子1至3的轉錄物時，我們不僅得到了預期大小的轉錄物，還得到較小的轉錄物。此小轉錄物的序列分析顯示其缺失編碼AIMP2的69個氨基酸殘基的外顯子2。使用以外顯子1和3的接合點序列為靶的引物的RT-PCR分析顯示表達較低AIMP2水平的細胞系生成較小轉錄物，證實了作為AIMP2變異體的AIMP2DX2的生成。
此外，本發明人觀察到在轉染了AIMP2DX2的細胞中AIMP2水平顯著減少與TGF-β無關，說明AIMP2DX2的生成導致了AIMP2活性的喪失。此外，將AIMP2DX2導入細胞提高了c-myc的表達且再次出現了TGF-β引起的生長停滯。我們發現AIMP2DX2與AIMP2形成無活性的異源二聚體并且通過誘導AIMP2水平的降低與腫瘤發生密切相關。體內研究提供進一步的證據證實AIMP2DX2與肺癌、肝癌、皮膚癌、乳癌、腎癌和骨肉瘤等強烈相關。
AIMP2DX2蛋白質優選包括AIMP2氨基酸序列，其中所述的AIMP2氨基酸序列的外顯子2區域被刪除。
AIMP2DX2蛋白質是缺失外顯子2的AIMP2的缺失變異體。在數個數據庫(312氨基酸版本登記號AAC50391.1或GI1215669；320氨基酸版本登記號AAH13630.1，GI15489023和BC013630.1，來自GenBank)和出版物(312氨基酸版本Nicolaides，N.C.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.Analysis of the 5’region of PMS2 reveals heterogeneoustranscripts and a novel overlapping gene，Genomics 29(2)329-334(1995)；320氨基酸模型Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNAsequences，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)16899-16903(2002))中發現了AIMP2蛋白質的氨基酸序列。AIMP2DX2蛋白質的氨基酸序列優選包含由如前述已知序列的缺失外顯子2區域的AIMP2氨基酸序列。韓國專利申請10-2003-0018424公開了AIMP2蛋白質的癌癥治療作用，其中的教導在此通過參考其全文與本文合并。
AIMP2DX2蛋白質包括AIMP2同等物的外顯子2缺失的變異體，例如，顯示了與野生型AIMP2基本上同樣活性的功能同等物，它們是通過對AIMP2的置換、刪除、插入或其組合得到的，或顯示了與野生型AIMP2基本上同樣活性的功能衍生物，它們經修飾改變了野生型AIMP2的物理和/或生化性質。
如本文描述的AIMP2中外顯子2的缺失是指AIMP2中跨越外顯子2區域的氨基酸序列(對應氨基酸46-114)被部分或整體刪除以生成能夠與AIMP2形成異源二聚體的AIMP2的缺失變異體，從而抑制AIMP2的正常功能和促進AIMP2的降解。相應地，本發明的AIMP2DX2蛋白質可包括全部或部分外顯子2缺失的AIMP2的任意變異體，其中外顯子1、3和/或4是天然的或通過氨基酸置換、刪除或插入被修飾的，只要變異體能夠與AIMP2形成異源二聚體以抑制AIMP2的正常功能。AIMP2DX2蛋白質優選包含外顯子2的全部缺失和完整外顯子1、3和4。AIMP2DX2蛋白質更優選包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
AIMP2DX2蛋白質可包含其天然氨基酸序列和具有修飾序列的變異體，只要變異體保持上述AIMP2DX2蛋白質的活性。AIMP2DX2蛋白質變異體是指蛋白質的序列不同于天然氨基酸序列，它們通過刪除、插入、非保守或保守置換或它們的組合制備得到的。對氨基酸殘基進行沉默改造實質上不會損害蛋白質活性，這是本領域技術人員眾所周知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。這些氨基酸改造包括但是不限于Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
此外，AIMP2DX2蛋白質可包含翻譯后修飾，例如磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化和法尼基化。
AIMP2DX2蛋白質及其變異體可從天然來源中分離得到、通過合成(Merrifleld，J.Amer.Chem.Soc..852149-2156(1963))或重組DNA技術(Joseph Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))獲得。應用重組DNA技術時，宿主細胞用攜帶編碼AIMP2DX2的核酸分子的表達載體轉化，然后培養，隨后收集被表達的AIMP2DX2。
如前所述，本發明的AIMP2DX2蛋白質在包括乳癌、肺癌、肝癌、血癌、皮膚癌、腎癌和骨肉瘤的多種癌細胞中特異表達，說明AIMP2DX2蛋白質能夠用作癌癥診斷標記物。
在本發明的另一方面，提供了一種核酸分子，該核酸分子包含編碼上述AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列。上述編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列包括外顯子2缺失的AIMP2同等物的變異體，例如，顯示與野生型AIMP2基本上相同活性的AIMP2的功能同等物，它們通過對AIMP2置換、刪除、插入或其組合得到。SEQ ID NO2的AIMP2DX2蛋白質優選由包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子編碼。本發明的核酸分子可是單或雙鏈DNA(cDNA和gDNA)或單鏈RNA(mRNA)。
編碼AIMP2DX2蛋白質的核酸分子可從天然來源中分離來制備、通過合成或重組DNA技術制備。AIMP2DX2核酸分子可包含在適當的載體中以提供AIMP2DX2蛋白質。
在本發明的另一方面，提供了一種重組載體，所述重組載體包含核酸分子，所述核酸分子包含能編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列。
如本文所用的術語“重組載體”是指在適當的宿主細胞中能表達目標蛋白質或RNA的基因載體，包含一段相應的外源序列，該序列可操作連接至核酸表達調控序列(例如啟動子、信號序列和轉錄因子結合位點陣列)。
如本文所用的術語“可操作地連接”是指在核酸表達調控序列和第二目標核酸序列之間的功能連接，其中所述表達調控序列影響與所述第二序列相應的核酸的轉錄和/或翻譯。本發明的載體可根據常規重組DNA技術構建，其中使用商業可獲得的酶來進行定點DNA切割和連接。
本發明的載體包括但是不限于質粒、粘粒、噬菌體和病毒載體。載體可包含表達調控元件例如啟動子、操縱子、起始和終止密碼子、多聚腺苷酸化信號和增強子還有膜定位或分泌的信號或前導序列。用在載體中的啟動子可以是組成型的或誘導型的。此外，載體可以攜帶用于選擇包含載體的宿主細胞的選擇標記物和復制起點。
載體中的信號序列包括但是不限于用于埃希氏菌(Escherichia)宿主細胞的PhoA和OmpA信號序列、用于桿菌(Bacillus)宿主細胞的α-淀粉酶和枯草芽孢桿菌素信號序列、用于酵母宿主細胞的MFα和SUC2信號序列和用于動物宿主細胞的胰島素、α-干擾素和抗體分子信號序列。
在本發明的另一方面，提供了一種用本發明上述的重組載體轉化的轉化體。
轉化可根據任何已知將核酸轉化至生物體、細胞、組織或器官的方法來實現，包括但是不限于電穿孔法、原生質融合、CaPO4沉淀、CaCl2沉淀、硅尿素纖維攪拌、農桿菌介導的轉化、PEG、硫酸葡聚糖和脂質體(lipofectamine)。適當的轉化方法可以根據宿主細胞的類型來選擇。
通常根據表達水平和翻譯后修飾來決定適當的宿主細胞。宿主細胞包括但是不限于原核細胞例如大腸埃希桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鏈霉菌(Streptomyces)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、奇異變型桿菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌(Staphylococcus)、真菌(例如曲霉屬真菌(Aspergillus))、酵母(例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)和粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa))、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種通過培養前述轉化細胞來制備AIMP2DX2蛋白質的方法。
所述轉化細胞的培養通過本領域技術人員已知的常規方法在適合表達目標AIMP2DX2蛋白質的條件下進行。
表達的AIMP2DX2蛋白質可通過常規方法純化，例如鹽析(例如硫酸銨和磷酸鈉沉淀)、溶劑沉淀(例如用丙酮或乙醇的蛋白質分級沉淀)、透析、凝膠過濾、離子交換、反相柱層析、超濾或它們的組合(Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)；和Deutscher，M.，Guide to Protein Purification Methods，Enzymology，vol.182.AcademicPress.Inc.，San Diego，CA(1990))。
在本發明的另一方面，提供了一種特異于AIMP2DX2蛋白質的抗體。
如本文所用的術語“抗體”是指特異定向于抗原位點的蛋白質分子。本發明的抗體是指特異識別與AIMP2有差別的AIMP2DX2的抗體，包括多克隆和單克隆抗體。
抗新蛋白質AIMP2DX2的抗體可通過本領域技術人員已知的常規技術來制備。
多克隆抗體可通過已知方法制備，其中將作為免疫原的AIMP2DX2蛋白質注入動物體中然后收集抗血清。被免疫的動物包括但是不限于山羊、兔、綿羊、猴、馬、豬、牛和狗。
單克隆抗體可通過融合方法(Kohler和Milstein，European Journal of Immunology，6511-519(1976))、重組DNA方法(USP 4,816,567)或噬菌體抗體庫(Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991))來制備。
抗AIMP2DX2蛋白質的抗體可以是具有兩個全長輕鏈和兩個全長重鏈的完整免疫球蛋白分子或其含有抗原結合部位例如F(v)、Fab、Fab’和F(ab’)2的片段。
根據本發明的特異于AIMP2DX2的抗體通過抑制AIMP2DX2的活性能用于診斷和治療癌癥。當抗體用作治療藥物時，它們可與常規治療藥物以直接或間接(通過連接臂)方式偶聯。
與本發明的抗體偶聯的治療藥物包括但是不限于放射性核素(例如131I、90Y、105Rh、47Sc、67Cu、212Bi、211At、67Ga、125I、186Re、188Re、177Lu、153Sm、123I和111In)、藥物(例如甲氨蝶呤和阿霉素)、淋巴因子(干擾素)、毒素(蓖麻毒素、相思豆毒素和白喉)和與其它抗體形成復合物的異功能抗體，具有對癌細胞和效應細胞(例如殺傷性T細胞)的雙功能結合能力。
本發明的抗體可以單獨或藥學組合物形式施用。
包含抗體的藥學組合物可用藥學可接受的載體制備。藥學組合物的形式根據給藥方式變化。一般組合物包含一種表面活性劑以促進跨膜轉運。此表面活性劑包括甾體衍生化合物、陽離子脂質體例如N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲基銨(DOTMA)、半琥珀酸膽固醇和磷脂酰甘油。
施用藥學有效量的包含本發明的抗體的藥學組合物治療癌癥或預防癌癥轉移。藥學組合物可以單次或多次給藥方案施用。藥學組合物的給藥方式包括腸胃外、皮下、腹膜內、肺內、鼻內和局部給藥。腸胃外給藥包括皮下、真皮內、肌內、靜脈內、粘液內(intrabursa)、胸骨內、鞘內和腹膜內注射。為使抗體穩定(化學和物理穩定性)和安全，藥學組合物通常配制為pH范圍4-8。此外，藥學組合物可制備為口服劑量形式。使用標準臨床技術優化典型的劑量。。
此外，本發明的抗體可以核酸分子形式施用來誘導抗體的體內生成(WO 96/07321)。
在本發明的另一方面，提供了一種癌癥診斷試劑盒，其包含特異于AIMP2DX2蛋白質的抗體。
本發明的癌癥診斷試劑盒可包含特異于AIMP2DX2的抗體以及用于免疫測定的常用工具和試劑包括載體、檢測信號生成的標記物、溶解試劑、洗滌試劑、緩沖液和穩定劑。當酶用作標記時，可包括其底物和反應淬滅劑。載體的非限制實例包括可溶性載體，例如本領域公知的生理上可接受的緩沖液(例如PBS)、不可溶性載體，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯葡聚糖、多糖、聚合物例如用單金屬、紙、玻璃、多金屬、瓊脂糖及其組合物涂層的橡膠制成的磁微粒。
本發明的癌癥診斷試劑盒中有效的測定體系的非限制實例包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)平板、試條法裝置、免疫層析試紙和擴散分離免疫測定裝置和流動系統裝置。
如本文所用的術語“癌癥標記物”是指通過定性或定量檢測其在組織或細胞中的表達來提供信息評價癌癥可能性、發生或發展的物質。該術語優選為以不同于正常細胞的表達形式在癌細胞中進行表達的有機生物分子(例如蛋白質、DNA和RNA)。本發明的AIMP2DX2基因或蛋白質在癌細胞中特異表達而正常細胞中不表達，從而允許精確診斷癌癥。使用AIMP2DX2表達的癌癥診斷優選在mRNA和/或蛋白質水平進行。本發明的抗體用于診斷癌癥，例如肺癌、肝癌、乳癌、皮膚癌、腎癌和骨肉瘤。
在本發明的另一方面，提供了一種篩選AIMP2DX2蛋白質作為癌癥診斷標記物的方法，其包含以下步驟(a)提供待測樣品；和(b)檢測樣品中編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的表達，其中檢測到編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的表達說明有癌癥。
本發明中所用的術語“待測樣品”包括任何生物樣品例如組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、精液、尿、滑液和脊髓液并且可被預處理以用于檢測。
在本發明中，樣品中編碼AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的表達可在蛋白質或mRNA水平實現。當進行AIMP2DX2蛋白質的檢測時，使用特異識別AIMP2DX2蛋白質的抗體并且檢測是通過使試樣接觸特異于AIMP2DX2蛋白質的抗體并且評價抗原-抗體復合物的形成來進行的。
本發明中所用的術語“抗原-抗體復合物”是指AIMP2DX2蛋白質和生物樣品中特異于AIMP2DX2蛋白質的抗體之間的組合物。對抗原-抗體復合物形成的評價可使用免疫組織化學染色法、放射性免疫測定法(RIA)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、蛋白質印跡法、免疫沉淀測定法、免疫擴散測定法、補體結合測定法、熒光激活細胞分類術(FACS)和蛋白質芯片測定法來進行。對抗原-抗體復合物形成的評價可定性或定量進行，特別是通過測量檢測標記物的信號。
產生抗原-抗體復合物形成的測量信號的標記物包括但是不限于酶、熒光團、配體、發光體、微粒、氧化還原分子和放射性同位素。酶標記物包括但是不限于β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、GDPase、核糖核酸酶(RNase)、熒光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉移酶、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶、β-內酰胺酶。熒光標記物包括但是不限于熒光素、異硫氰酸酯、若丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、allophysocyanin、鄰苯二甲酸鹽和熒光胺。作為標記物的配體包括但是不限于生物素衍生物。發光標記物的非限制實例包括吖啶酯、熒光素和熒光素酶。作為標記物的微粒包括但是不限于膠體金和彩色橡膠。標記用的氧化還原分子包括但是不限于二茂鐵、lutenium復合化合物、紫精、醌、Ti離子、Cs離子、二酰亞胺、1，4-苯醌、對苯二酚、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[Ru(bpy)3]2+和[Mo(CN)8]4-。放射性同位素包括但是不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
當本方法用來檢測AIMP2DX2 mRNA時，檢測步驟可通過本領域公知的擴增反應或雜交反應來進行。
如本文所用的短語“AIMP2DX2 mRNA的檢測”意指通過使用與AIMP2DX2 mRNA特異雜交的引物或探針分析作為細胞中癌癥診斷標記物的AIMP2DX2 mRNA的存在或數量。
如本文所用的術語“引物”意指游離3’羥基的寡核苷酸，它可以是在純化的限制性內切酶酶切消化中自然產生也可以是合成產生的，它能夠與互補模板形成堿基對并且當處于誘導合成與核酸鏈互補的引物延伸產物的條件下時用作合成的起始點。
如本文所用的術語“探針”是指天然或修飾的單體或連接物的線性寡聚物，包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等等，它能夠與不論天然產生或合成生成的靶核苷酸序列特異雜交。本方法中所用的探針可以寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針和RNA探針形式制備。可用生物素、FITC、若丹明、DIG和放射性同位素標記。例如，SEQ ID No.8或16的核苷酸序列可用作探針。
使用引物或探針檢測AIMP2DX2 mRNA的方法包括但是不限于DNA序列分析、RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈反應)、引物延伸方法(Nikiforov，T.T.等人，Nucl Acids Res 22，4167-4175(1994))、寡核苷酸連接分析(OLA)(Nickerson，D.A.等人，Pro Nat Acad Sci USA，87，8923-8927(1990))、等位基因特異性聚合酶鏈反應(Rust，S.等人，Nucl Acids Res，6，3623-3629(1993))、RNA酶錯配裂解(Myers R.M.等人，Science，230，1242-1246(1985))、單鏈構型多態性(SSCP；Orita M.等人，Pro Nat Acad Sci USA，86，2766-2770(1989))、SSCP和異源雙鏈同時分析(Lee等人，Mol Cells，5668-672(1995))、變性梯度凝膠電泳法(DGGE；Cariello NF.等人，Am J Hum Genet，42，726-734(1988))和變性高效液相色譜法(D-HPLC，Underhill PA.等人，Genome Res，7，996-1005(1997))。
擴增反應的方法優選使用能夠區別AIMP2DX2的mRNA和AIMP2的mRNA的引物通過RT-PCR來進行。由P.Seeburg(1986)提出用于RNA研究的RT-PCR方法包含從mRNA逆轉錄獲得的的cDNA的PCR擴增。擴增時，使用特異退火至AIMP2DX2的引物對。引物優選設計為在電泳中生成兩條不同大小的條帶，其中一條特異于AIMP2mRNA，而另一條特異于AIMP2DX2 mRNA。或者，引物設計為僅生成特異于AIMP2DX2mRNA的電泳帶。制備能生成AIMP2 mRNA和AIMP2DX2 mRNA的兩個不同大小條帶的引物對是為了擴增與外顯子2對應的區域。此引物的核苷酸序列不受限制；最優選的一組引物由SEQ ID NOs5和6組成。為了觀察只有一條特異于AIMP2DX2 mRNA的電泳帶，其中一個引物設計為包含外顯子1的C端和外顯子3的N端間的連接序列。下述實施例中，進行RT-PCR時，退火至連接序列的SEQ ID NO8的引物與SEQ ID NO7的引物一起使用或退火至連接序列的SEQ ID NO16的引物與SEQ ID NO6的引物一起使用。因為通過觀察電泳帶帶型來評價AIMP2DX2 mRNA的表達完成癌癥的診斷，從這個意義上來說RT-PCR分析十分方便。
包括肺癌、肝癌、乳癌、皮膚癌、腎癌和骨肉瘤的癌癥癥狀可通過樣品和對照間AIMP2DX2表達的明顯差別來診斷。
根據本發明的優選方面，提供了一種特異于AIMP2DX2的mRNA的siRNA(小干擾RNA)分子。
如本文所用的術語“siRNA”是指通過mRNA裂解誘導RNAi(RNA干擾)現象的短RNA雙鏈。siRNA由與靶mRNA對應的有義RNA鏈和與靶mRNA互補的反義RNA鏈組成。抑制靶基因表達的siRNA提供有效基因敲除方法或基因治療方法。
本發明的siRNA不限制為兩條鏈完全配對的RNA雙鏈且可包含非配對部分例如與非互補堿基的錯配部分和沒有對應堿基的突起。siRNA的全長是10-100個核苷酸，優選15-80個核苷酸，更優選20-70個核苷酸。siRNA還可包含平末端或粘性末端只要它能夠由于RNAi效應沉默AIMP2DX2表達。粘性末端可制成3’末端懸垂結構或5’末端懸垂結構。懸垂堿基的長度不受限制，例如1-8個核苷酸，優選2-6個核苷酸。如本文描述的全長表達為中心雙鏈部分和末端單鏈懸垂部分的全部長度。此外，只要AIMP2DX2 siRNA能夠保持其對靶基因的基因沉默作用，它可含有低分子量RNA(可以是天然RNA分子例如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子)，例如在其任一末端的懸垂部分。AIMP2DX2 siRNA的兩個末端不必都有裂解結構。本發明的AIMP2DX2siRNA可包含與任一末端(頭或尾)通過連接臂相連的莖環結構。只要不損害莖結構的堿基配對，連接臂的長度不受限制。
如本文所用的術語“特異”是指抑制靶基因的表達且不影響其它基因。本發明的siRNA特異于AIMP2DX2基因。
本發明的siRNA優選包含含有外顯子1和3間連接序列的相應序列的有義鏈和含有互補序列的反義鏈。
短語“基因表達的抑制”是指自靶基因生成的mRNA和/或蛋白質水平被結束或減少，它通過發生mRNA裂解的RNA干擾來誘導。
本發明的siRNA可體外合成然后通過轉染導入細胞。此外，它可以siRNA表達載體或PCR衍生siRNA表達盒的形式轉染到細胞中。適合的制備和轉染方法可經考慮實驗目的和靶基因功能來決定。
siRNA的序列和長度不受限制只要它能夠特異抑制AIMP2DX2 mRNA。在下文描述的實施例中使用了3種說明性的沉默AIMP2DX2的siRNA表達載體，它們抑制AIMP2DX2的細胞水平并且恢復AIMP2功能和TGF-β信號轉導。
本發明的優選siRNA包含與AIMP2DX2 mRNA的外顯子1和3間連接序列相應的序列。本發明的siRNA更優選為如下描述的RNA雙鏈(i)由SEQ ID NOs9和10的核苷酸序列表達的兩個RNA分子組成的3號siRNA，(ii)由SEQ ID NOs11和12的核苷酸序列表達的兩個RNA分子組成的4號siRNA，或(iii)由SEQ ID NOs13和14的核苷酸序列表達的兩個RNA分子組成的5號siRNA。最優選的siRNA由SEQ ID NOs11和12的核苷酸序列表達的兩個RNA分子組成。可以使用siRNA分子的單一或混和類型。
在本發明的另一方面，提供了一種與AIMP2DX2蛋白質的mRNA區域互補的反義寡核苷酸。
如本文所用的術語“反義寡核苷酸”是指與靶mRNA的堿基序列互補的核酸，優選DNA、RNA或其衍生物，特征為它們與靶mRNA結合并且干擾其翻譯為蛋白質。本發明的反義寡核苷酸是指結合于AIMP2DX2 mRNA且與其互補的DNA或RNA序列，它們能夠抑制AIMP2DX2 mRNA的翻譯、易位、成熟或其它生物學功能。反義核苷酸長為6-100個，優選8-60，更優選10-40個核苷酸。
反義寡核苷酸可在堿基、糖或主鏈上最少有一個修飾以獲得較高的抑制作用(DeMesmaeker等人，Curr Opin Struct Biol.，5(3)343-55(1995))。修飾的核酸主鏈包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環烷基內糖連接臂或短鏈雜原子或雜環內糖連接臂。反義寡核苷酸還可包含一個或多個取代的糖部分。反義核酸可包括一個或多個修飾堿基，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶(特別是5-甲基胞嘧啶)、5-羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和gentobiosyl HMC、2-氨基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶(thiothymine)、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。本發明的寡核苷酸的另一修飾包括與寡核苷酸進行化學連接的一個或多個部分或綴合物，它們能增強寡核苷酸的活性或細胞攝取。此部分包括但是不限于脂質部分例如膽固醇部分、膽甾醇部分、膽酸、硫醚、硫膽固醇、脂肪鏈、磷脂、多胺、聚乙二醇鏈、乙酸金剛烷胺、棕櫚酰基部分、十八胺、己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。包含親脂部分的寡核苷酸和制備此寡核苷酸的方法在本領域公知，例如美國專利US 5,138,045、5,218,105和5,459,255。上述的修飾能增強抗核酸酶降解的穩定性并且增加反義寡核苷酸對其靶mRNA的親合力。
特異于AIMP2DX2的反義寡核苷酸優選包含與AIMP2DX2 mRNA的外顯子1和3間的連接區域互補的序列。
反義RNA分子在體外常規合成然后轉入細胞。此外，它由外源序列轉錄在細胞內生成。體外合成包括RNA聚合酶I。制備反義RNA的體內轉錄使用的載體的識別區域起點(MCS)在相反方向。反義RNA優選包含抑制翻譯為肽的翻譯終止密碼子。
在本發明的另一方面，提供了一種治療癌癥的藥學組合物，它包含(a)作為活性成分的特異于AIMP2DX2 mRNA的反義寡核苷酸或siRNA，和(b)藥學上可接受的載體。
在本發明的另一方面，提供了一種治療癌癥患者的方法，包含施用于患者的藥學組合物，該藥學組合物包含(a)作為活性成分的特異于AIMP2DX2 mRNA的反義寡核苷酸或siRNA，和(b)藥學上可接受的載體。
包含至少一種AIMP2DX2 siRNAs或反義寡核苷酸的藥學組合物可含有其它藥物來抑制腫瘤細胞增殖和促進siRNA或反義核苷酸的轉導，例如，脂質體(美國專利US4,897,355、4,394,448、4,235,871、4,231,877、4,224,179、4,753,788、4,673,567、4,247,411和4,814,270)，或包括甾醇例如膽固醇、膽酸鹽和脫氧膽酸的親脂載體。此外，siRNA或反義核酸與細胞吸附肽例如肽類激素、抗原和肽毒素綴合(Haralambid等人，WO89/03 849；Lebleu等人，EP 0263740)。
當藥學組合物用藥學上可接受的載體制備用于口服給藥時，它可包含結合劑、潤滑劑、崩解劑、稀釋劑、助溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、色素和甜味劑。當藥學組合物制備用于注射時，它可包含緩沖液、防腐劑、鎮痛藥、助溶劑、張度劑和穩定劑。局部給藥時，藥學組合物可含有基質、稀釋劑、潤滑劑和防腐劑。藥學組合物的制劑可通過與上述藥學上可接受的載體一起配制來制備。口服給藥時，藥學組合物可以是片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿劑和糯米紙囊劑(wafer)的形式。注射組合物可制備為足量的單位劑量或多劑量形式。
本發明包含AIMP2DX2 siRNA或反義寡核苷酸的藥學組合物的正確劑量根據特殊組成、應用形式、患者的年齡、體重和性別、飲食、給藥時間、患者情況、藥物聯合用藥、反應靈敏度和疾病嚴重性而不同。可以理解為普通熟練醫師將能夠很容易決定本藥學組合物的正確劑量并開處方。
藥學組合物的給藥形式包括口服和腸胃外例如皮下、真皮內、肌內、靜脈內、粘液內(intrabursa)、胸骨內、鞘內和腹腔內注射。
在本發明的另一方面，提供了一種篩選抑制權利要求1的AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體形成的藥物的方法，包含以下步驟(a)使試樣和包含AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質的組合物接觸；和(b)測定試樣是否抑制AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間的異源二聚體形成，其中抑制AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間的異源二聚體形成的試樣評價為抗癌藥物。
AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成如下文中描述的實例中表示的與癌癥相關。因此，能夠抑制異源二聚體形成的物質被評價為抗癌藥物的候選物。
篩選異源二聚體形成的方法包括例如酵母雙雜交測定法和體外pull-down測定法。
在由Field&Song(1989)首先發展的酵母雙雜交測定法中，AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質能夠用作“誘餌”或“獵物”(參見例如美國專利US 5,283,317；Zervos等人，Cell 72，223-232(1993)；Maduraetal.，J.Biol.Chem.268，12046-12054(1993)；Bartel等人，BioTechniques 14，920-924(1993)；Iwabuchi等人，Oncogene 8，1693-1696(1993)；和Brent WO 94/10300)來鑒別抑制AIMP2DX2與AIMP2相互作用形成異源二聚體的物質。雙雜交系統是基于大多數轉錄因子的模塊性質，其由可分離的DNA結合和激活區域組成。簡言之，該測定法利用兩個不同的DNA構造。例如，在一個構造中，編碼AIMP2DX2蛋白質的多核苷酸能與編碼已知轉錄因子(例如Lex)的DNA結合區域的多核苷酸融合。在另一個構造中編碼AIMP2蛋白質的DNA序列能與編碼已知轉錄因子(例如B42)的激活區域的多核苷酸融合。
如果經處理進入表達雙雜交系統細胞的試樣能夠抑制AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間的相互作用，轉錄因子的DNA結合和激活區域無法接近。這種接近允許報告基因(例如lac Z)的轉錄，其可操作地連接至響應轉錄因子的轉錄調節位點。報告基因的表達能夠容易地檢測到。
在一個體外pull-down測定法方式中，AIMP2DX2基因和AIMP2基因能夠用作誘餌或獵物。例如，在一個誘餌構造中，AIMP2蛋白質與能使AIMP2蛋白質結合于固體載體的蛋白質融合。例如，谷胱苷肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白能被谷胱苷肽瓊脂糖珠或谷胱苷肽衍生微量滴定板吸附。在另一個獵物構造中，AIMP2DX2蛋白質通過使用35S的體外翻譯系統(例如網織紅細胞裂解物)來合成。放射性AIMP2DX2蛋白質與試樣一起加入結合于谷胱苷肽瓊脂糖珠的GST-AIMP2蛋白中。沖洗反應混合物并且洗脫結合于瓊脂糖珠的蛋白質，隨后電泳。
如果加入反應混合物的試樣能夠抑制AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間的相互作用，電泳結果顯示沒有條帶。
在本發明的另一方面中，提供了一種篩選抑制AIMP2DX2基因表達的藥物的方法，包含以下步驟(a)使試樣和表達AIMP2DX2基因的細胞接觸；和(b)確定試樣是否抑制AIMP2DX2基因的表達或促進AIMP2DX2蛋白質的破壞，其中抑制AIMP2DX2基因的表達或促進AIMP2DX2蛋白質的破壞的試樣評價為抗癌藥物。
在本方法中，在mRNA或蛋白質水平上評價AIMP2DX2基因的表達。當本方法用來檢測AIMP2DX2 mRNA表達時，優選通過使用上文描述的AIMP2DX2特異引物的RT-PCR來進行。當本方法用來檢測AIMP2DX2蛋白質表達時，優選通過多種免疫測定法例如使用如前描述的使用AIMP2DX2特異抗體的蛋白質印跡法來進行。
以下特殊實施例將說明本發明并且不應解釋為限制如附加權利要求所定義的本發明的范圍。
實施例方法細胞培養、化學試劑和細胞周期測量細胞在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640中培養。小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)是從12.5-14.5天的胚胎中分離出來的并且在含有20％FBS的DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium)中培養。為了評價TGF-β在細胞周期中的作用，細胞用2ng/mlTGF-β在無血清或1％含FBS的培養基中培養24小時并且收集用于FACS分析。細胞增殖也由[3H]胸苷參入進行測定。細胞在無血清培養基中用或不用TGF-β培養20小時，然后在1μCi/ml[3H]胸苷存在下培養4小時。參入的胸苷用如前描述的液滴閃爍計數法(Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34，330-336(2003))進行定量。TGF-β購買自R&D system，抗Smad2和抗Smad4抗體購買自Santa Cruz。抗AIMP2抗體如下制備將分離的500ugAIMP2蛋白質與500ul完全佐劑(Sigma，1mg/ml)混合皮下注射到兔(雄性，新西蘭)中。7天后，將分離的500ug AIMP2蛋白質與500ul完全佐劑(1mg/ml)混合注射到兔中，然后每間隔7天注射測試物，進行2次。3天后，從兔血中分離抗AIMP2 Ab。
免疫印跡和免疫沉淀細胞用TGF-β處理所標明的次數并且蛋白質用含有蛋白水解酶的RIPA緩沖液提取，經10-12％SDS-PAGE分離，并且用使用ECL系統的特異性抗體進行免疫印跡。進行免疫沉淀時，細胞裂解物用IgG和綴合瓊脂糖的蛋白質A預處理來清除。離心后，上清液用特異性抗體和綴合瓊脂糖的蛋白質A培養2小時。用冰預冷的PBS洗滌兩次和RIPA洗滌一次后，用特異性抗體沉淀結合的蛋白質，洗脫并進行蛋白質印跡分析。
RT-PCR總RNAs根據生產商(Qiagen)的使用說明進行分離。簡言之，將新鮮制備的組織(3×3×3mm)剁碎為小片，與350μl裂解緩沖液混合并且使用勻漿器或注射器勻漿化。加入350μl 70％乙醇后，裂解物倒置數次，上樣至柱子，在13,000RPM離心15秒。用洗滌緩沖液洗滌柱子兩次后，RNAs用40μl無RNase DW洗脫。進行逆轉錄時，將分離的1μgRNA用作AIMP2特異引物的模板(圖8b)。反應后，混合物用DW稀釋3倍并且其1μl等分試樣用于30μl PCR反應，其中含有0.5μl dNTP(每種2.5mM)、0.5μl所標明的引物(每種10pM)、1.5μlDMSO和0.1μlTaq聚合酶(5U/μl)。
用si-RNA抑制AIMP2DX2為了抑制AIMP2DX2的表達，制備抗AIMP2DX2的siRNAs。設計編碼抗AIMP2DX2的siRNA的序列并且將其克隆至16 IMG-700載體系統(Imgenex)的SalI和XbaI位點，隨后經DNA序列分析以確證被克隆的序列。將2μg的si-DX2表達載體轉染至H322細胞中。用DNA-脂質體復合物在1ml無血清培養基中培養3小時后，用1ml含有20％FBS的RPMI-1640處理H322細胞。然后，細胞在有或沒有TGF-β的無血清培養基中培養20小時。
酵母雙雜交分析使用特異引物通過PCR獲得編碼人AIMP2和Smad2的cDNAs(及其缺失片段)。Smad2和AIMP2的PCR產物用EcoRI和XhoI消化，并且分別連接至pEG202(LexA)和pJG4-5(B42)的相同位點(Gyuris，J等人，a human G1 and S phase protein phosphatasethat associates with Cdk2.Cell 75，791-803(1993))。Lex-Smad2片段和B42-AIMP2間的相互作用通過如前所述的它們在含有X-gal的酵母培養基中生長的能力來進行分析(Rho，S.B.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 96，4488-93.(1999))。
穩定生成AIMP2DX2的細胞的構建野生型MEFs用pcDNA-AIMP2DX2或pcDNA本身進行轉染并且在含有400μg/mlG418的DMEM培養基中選擇轉染細胞。棄去未轉染的細胞后，將轉染細胞在無G418的正常培養基中培養3天，用2％PFA固定并且吉姆薩染色。
免疫染色和組織學分析將冷凍的組織載片用2％多聚甲醛固定并且用冰預冷的PBS沖洗。在封閉和用含有0.2％Triton X-100(PBST)和1％BSA的PBS滲透后，載片用抗AIMP2抗體培養2小時。用PBS沖洗后，再用抗兔羊IgG-FITC和碘化丙啶(50μg/ml)孵育1小時，用PBS沖洗，裝好，在共聚焦顯微鏡下觀察。
AIMP2DX2表達載體的構建為了構建AIMP2DX2表達載體，將AIMP2DX2的cDNA克隆到pcDNA3.1-myc中。首先，使用引物和EcoRI和XhoI的連接臂擴增H322 cDNA中的AIMP2DX2并且使用EcoRI和XhoI將其克隆到pcDNA3.1-myc(Invitrogen)中。將表達AIMP2DX的pcDNA3.1-myc/AIMP2D X2載體(圖12)導入E.coli DH5α中，該E.coli DH5α于2004年10月25日保藏于國際保藏機構(International Depository Authority)，韓國典型菌種保藏中心(KCTC)并且給予的保藏編號為KCTC 10710BP。
敲除小鼠的產生和特征小鼠基因組DNA的突變通過基因捕獲方法產生(Zambrowicz等人，Nature，9，608-611，1998)。基因捕獲載體用于產生來自129/SvEvBrd小鼠的胚胎干細胞的隨機突變體庫(OmniBank library，Lexicon Genetics，USA)。在該庫中，證實OST7994克隆中AIMP2DX2基因被破壞。使用以上克隆，根據Lexicon Genetics的標準方法得到C57/BL6雜合小鼠。然后將所述雜合小鼠交配以獲得純合突變小鼠。將13.5天的小鼠胚胎分離出來用刀片切碎，胰蛋白酶消化且放置于培養皿中培養。
突變體通過使用從小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)分離出來的基因組DNAs的DNA印跡法和PCR分析法確證。AIMP2表達通過RNA印跡和蛋白質印跡分析來測定。基因捕獲插入的位置通過基因組DNA的序列分析來測定。進行DNA印跡分析時，從小鼠尾巴中分離基因組DNA并且將其用SacI消化。切割的DNA片段通過變性凝膠電泳分離并且將其與AIMP2基因與SEQ NOs17和18的引物的放射性標記的1.2kb PCR產物雜交。雜交帶用磷光計分析器檢測。使用SEQ NOs 19和20，SEQ NOs 20和21的特異引物對，還可將被分離的基因組DNA用于PCR分析。
進行RNA印跡分析時，使用RNeasy Midi kit(QIAGEN)根據生產商說明從小鼠胚胎成纖維細胞中制備總的細胞RNA。獨立的RNAs(30ug)通過1.2％瓊脂糖/2.2M甲醛凝膠的電泳分離，轉移至Hybond N膜上(Amersham)，然后通過紫外線照射固定在膜上。使用ExpressHyb雜交溶液(CLONTECH)使膜上的RNAs與通過AIMP2 cDNA的PCR生成的特殊探針雜交。從小鼠胚胎成纖維(MEF)細胞中提取蛋白質，經SDS-PAGE分離并且用抗AIMP2多克隆抗體進行蛋白質印跡分析，所用方法描述在(Park等人，274，16673-16676，1999；Kim等人，J Biol Chem，275，21768-21772，2000)中。
肺癌形成32只AIMP2+/-小鼠(19只雄性和13只雌性小鼠)和25只AIMP2+/+小鼠(14只雄性和11只雌性小鼠)用于實驗。我們通過將化學致癌物苯-(α)-芘(BP，100mg/kg)注射到AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠腹腔內誘導肺腫瘤，并且監測肺中腫瘤的形成。作為對照組，3只AIMP2+/+(2只雄性和1只雌性)和5只AIMP2+/-小鼠(4雄性和1雌性)用bical溶液(10％DMSO和35％PEG40鹽溶液)注射。
使用敲除小鼠的皮膚癌模型33只兩種性別的野生型(WT)和AIMP2敲除(KO)小鼠分成以下組別WT雄性對照(3)、WT雄性處理(6)、WT雌性對照(2)、WT雌性處理(6)、KO雄性對照(2)、KO雄性處理(6)、KO雌性對照(3)和KO雌性處理組(5)。
單一劑量(0.2μmol/0.2ml丙酮)的7，12-二甲苯[a]蒽(7，12-dimethybenz[a]anthracene))(DMBA)局部施用給處理組小鼠去毛的背部，而對照組小鼠僅用丙酮處理。一周后，施用了DMBA的小鼠(DMBA-initiated mice)用12-O-十四酰-佛波醇-13-醋酸鹽(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)(TPA，10nmol/0.2ml丙酮)每周處理兩次共處理21周。對照動物在整個研究中僅用丙酮處理。從經促進劑處理的1周開始，對最少1mm直徑的腫瘤每周進行計數。21周后，處死小鼠并且對腫瘤樣品進行校正用于隨后的生物化學分析。
實施例1AIMP2在TGF-β傳導中的功能重要性和工作模式為了觀察AIMP2在TGF-β傳導中的重要性，我們比較了AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs對TGF-β誘導的生長停滯、Smad2/3的核易位和AIMP2與Smad2/3的相互作用的反應。當野生型細胞的生長被TGF-β抑制時，AIMP2缺乏的細胞對通過胸苷參入、菌落形成和流式細胞術(圖1a、1b和1c，分別地)確定的信號無應答。當MEFs用TGF-β處理時，Smad2和Smad3在正常細胞中易位至細胞核，但在AIMP2/細胞中不易位(圖1d)。所有這些結果提示了AIMP2在通過Smad2和Smad3的TGF-β傳導中的功能重要性。
AMIP2與Smad2和Smad3的可能相互作用通過免疫共沉淀來檢查。AIMP2顯示了被TGF-β增強的與Smad2/3的相互作用(圖1e)。AIMP2與兩個R-Smads的直接相互作用還被酵母雙雜交和體外pull-down測定法所證實(圖2和7)。與Smad2/3結合的AIMP2的量根據被TGF-β誘導的AIMP2而增加(圖2a)。當AIMP2水平通過轉染增加時，TGF-β靶基因的表達被增強，暗示了其在TGF-β傳導中的刺激作用(圖2b)。由于AIMP2與Smad2和3都結合，我們預期它對這兩個R-Smads以類似方式起作用并且因此將關注點集中在其與Smad2的具體關系上。Smad2的TGF-β依賴的磷酸化作用在AIMP2缺乏的MEFs中被抑制，但是當將AIMP2導入AIMP2/-細胞時恢復(圖2c)。Smad2中涉及與AIMP2的相互作用的結構域通過酵母雙雜交(圖2d)和體外pull-down測定法(圖7)來確定。這兩個實驗顯示相互作用涉及Smad2的MH2結構域。
為了確定AIMP2在TGF-β傳導中的工作模式，在正常細胞和AIMP2缺乏細胞中比較Smad2與TGF-β受體的TGF-β誘導的聯系。用TGF-β處理細胞并且Smad2和受體的聯系通過I類受體與Smad2在時間間隔的免疫共沉淀來監測。在早期時間點觀察與TGF-β受體結合的TGF-β誘導的Smad2并且它在野生型細胞中降低，而在AIMP2缺乏細胞中經TGF-β處理后結合于Smad2的受體在晚期累積(圖2e)。在TGF-β誘導的Smad2的磷酸化作用中，磷酸化的Smad2在野生型細胞中逐漸增加，但是在AIMP2/-細胞中被嚴重抑制(圖2f)。這些結果說明AIMP2通過其與R-Smad2的直接相互作用在R-Smad2的TGF-β誘導的磷酸化作用中起到關鍵的作用。
實施例2AIMP2的抑制和癌細胞中其缺失變異體的產生為了探索AIMP2與癌癥形成的可能聯系，在不同癌細胞系中觀察AIMP2水平的差異[可自美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的A549(肺上皮癌)、DU145(前列腺癌)、HCT116(人結腸直腸癌)、H460(大細胞肺癌)、H322(肺細支氣管肺泡癌)和H290(間皮瘤癌細胞系)]。這六種檢測細胞系中的三種在蛋白質印跡法(圖3a)和FACS分析(圖3b)中顯示了較低AIMP2水平。所有低AIMP2水平的細胞系表達了正常水平的TGF-βII型受體并且保持其激酶活性，暗示低AIMP2水平不是由于受體的功能出現障礙(mal-functionality)導致的。為了測定AIMP2水平的差異是否是由于轉錄的差異造成的，使用不同組合的AIMP2特異引物進行RT-PCR。AIMP2基因由四個外顯子組成(圖8a)。當SEQ ID Nos.3和4的引物用于產生跨越外顯子3和4的AIMP2 cDNA時，在顯示AIMP2水平降低的細胞中未發現AIMP2轉錄物的減少(圖3c，第一行)，暗示其不是由于較低轉錄造成的結果。當使用SEQ ID Nos.5和6的引物產生外顯子1至3的轉錄物時，不僅獲得了預期大小的轉錄物還有一個較小的轉錄物(圖3c，第二行)。此小轉錄物的序列分析顯示其缺乏編碼AIMP2的69個氨基酸的外顯子2(圖8b)。為了證實生成了這種較小轉錄物，設計了靶向外顯子1和3的連接序列的SEQ ID No.8的引物(圖8b，引物DX-B)，，其中所述的連接序列是由于外顯子2的缺失生成的，并且用SEQ ID No.7的引物進行RT-PCR。表達較低AIMP2水平的細胞系生成了該較小轉錄物(命名為DX2，圖3c，第二及第三行)。
使用抗AIMP2抗體的蛋白質印跡分析只檢測到全長AIMP2，而沒有檢測到DX2(圖2a)，這暗示DX2可能在蛋白質水平是非常不穩定的。免疫熒光染色法也證明了在H460、H322和H290中的較低的AIMP2水平(圖3d)。為了排除染色偽差的可能性，將H460和DU145細胞在同一平板上共培養且染色AIMP2。AIMP2在H460中的染色強度再次比在DU145中弱很多(圖9a)。此外，在低AIMP2表達的細胞中未觀察到AIMP2的TGF-β依賴的核定位(圖3d，底部行)。為了找到AIMP2水平和TGF-β功能性間的關系，我們檢測了TGF-β對這些細胞系的生長抑制。當A549和DU145細胞的生長被TGF-β抑制時，低AIMP2水平的細胞對TGF-β無應答(圖3e)。這個結果與前面報道的A549是敏感的而H460對TGF-β信號是抵抗的(Osada，H.等人，Cancer Res.61，8331-8339(2001)；Kim，T.K.等人，Lung Cancer 31，181-191(2001))一致。此外，靶基因在A549和DU145中被TGF-β誘導，但在H322和另外兩個低AIMP2的細胞系中未被誘導(圖3f)。
實施例3無活性的缺失變異體與功能AIMP2形成復合物為了了解DX2生成和AIMP2抑制的因果關系，在將DX2轉染至DU145后檢查AIMP2水平的變化。AIMP2在DX2轉染細胞中減少，如蛋白質印跡(圖4a，第一行)和FACS分析(圖9b)所顯示。此外，AIMP2的靶c-myc的表達由于導入DX2而提高(圖4a，第三行)。DX2還減輕了由于TGF-β造成的生長抑制(圖4b和9c)。然后我們研究DX2如何影響功能性的AIMP2(AIMP2F)。由于AIMP2具有形成同源二聚體的可能性(Quevillon，S.等人，J.Mol.Biol.285，183-195(1999)；和Kim，J.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，7912-7916(2002))，我們通過酵母雙雜交測定法檢查AIMP2DX2是否與AIMP2F相互作用。AIMP2DX2顯示它與AIMP2F有相互作用，但是與它自己沒有相互作用(圖4c)。在體外pull-down測定中，放射性合成的AIMP2F和-DX2都與GST-AIMP2F共純化(圖4d)，而DX2卻不能，這證明了AIMP2F和-DX2間的直接相互作用。為了觀察DX2在TGF-β傳導中是否有活性，我們用酵母雙雜交測定法檢測其與Smad2的相互作用。當AIMP2與Smad2和AIMP2的已知靶點FBP相互作用時(Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34，330-336(2003))，DX2不與任何這些蛋白質結合，這暗示其是沒有功能活性的(圖4e)。
為了了解異源二聚體的形成是如何抑制AIMP2的，我們檢查AIMP2水平是否被蛋白酶體依賴的降解過程調控。產生DX2的H322細胞用蛋白酶體抑制劑ALLN處理(Zhou，M.，等人，J.Biol.Chem.271，24769-24775(1996))并且檢測AIMP2水平是否通過阻斷蛋白酶體而增加。AIMP2水平通過ALLN處理顯著增加，如蛋白質印跡(圖4f)、免疫熒光染色(圖4g)和流式細胞術(圖9d)所示，這暗示其細胞水平可能由蛋白酶體介導的降解所調控。此外，AIMP2DX2形式還可通過抑制蛋白酶體來檢測(圖4f)，這就證實了DX2由于蛋白酶體依賴的快速降解而不穩定的觀點。與正常AIMP2比較，AIMP2DX2的強度低看起來是由于較低轉錄造成的，這通過RT-PCR分析(圖3c)得到證實，和/或由于抗AIMP2抗體的識別效率差造成的。由于AIMP2降解是蛋白酶體介導的，我們檢測其遍在蛋白化是否被DX2促進。當AIMP2從經ALLN處理及用抗遍在蛋白質抗體標記的對照和DX2轉染細胞中免疫沉淀時，與對照細胞中的遍在蛋白質化的AIMP2比較，在DX2轉染細胞中觀察到較高量的遍在蛋白質化的AIMP2(圖4h)。總之，DX2作為顯性負性突變體與AIMP2形成無活性復合物，該復合物快速進入降解過程。
實施例4AIMP2DX2使TGF-β的傳導失活和促進細胞生長將DX2轉染至MEFs并且通過顯微鏡分析和菌落形成檢測其在細胞生長中的作用。通過導入DX2顯著增強細胞的生長(圖5a)。然后我們導入特異抑制DX2轉錄的siRNA(si-DX2)并且檢查它是否能夠在表達DX2的H322細胞中恢復AIMP2的正常水平和TGF-β傳導。當用表達4號或5號siRNA的載體轉染H322細胞時，用FACS測定TGF-β導致的細胞死亡的提高(左)和細胞周期停滯的產生(右)(圖5d)。為了檢測siRNA是否能恢復AIMP2的正常水平和TGF-β傳導，將特異抑制DX2特異表達的生成4號siRNA(si-DX2)的載體轉染入表達DX2的H322細胞中。si-DX2消融了DX2轉錄物(圖5e頂部)并且使AIMP2恢復正常水平和恢復了Smad2的TGF-β誘導的磷酸化作用(圖5e底部和圖5f)、p-Smad2的核定位(圖5f)、TGF-β依賴的報告表達(圖5g)和生長抑制(圖5h)。所有這些結果說明DX2對TGF-β傳導和細胞生長調控具有破壞作用。
實施例5AIMP2缺失變異體與人肺癌的聯系由于AIMP2的減少時常在不同癌細胞系中(圖3a、3b和3d)檢測到，并且AIMP2的喪失導致肺細胞的過增殖(Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34，330-336(2003))，我們檢測了AIMP2的異常與肺癌形成的聯系。我們通過在AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠中腹腔內注射化學致癌物苯-(α)-芘(BP，Wang，Y等人，Cancer Res.63，4389-4395(2003))誘導肺腫瘤，并且監測肺中的腫瘤形成。從BP給藥后6周，觀察到AIMP2+/-小鼠中肺腫瘤的發生率為50-70％，而在野生型同窩出生仔中大約30％(圖6a)，這暗示雜合小鼠對BP誘導的腫瘤生成更敏感。從AIMP2+/-小鼠中分離的四個肺中的三個顯示了腫瘤，而三個AIMP2+/+小鼠中僅有一個產生腫瘤并且所有這些腫瘤都產生DX2(圖10)，進一步支持了DX2與腫瘤形成的關聯性。然后我們比較人肺中炎癥但是無腫瘤和腫瘤組織的AIMP2水平。DX2只在腫瘤組織中產生(圖6b)。為了排除AIMP2水平和DX2形成可能依賴于不同個體的可能性，我們對從同一患者中分離的一對正常和腫瘤組織進行RT-PCR和免疫熒光分析。在癌區域中顯示正常AIMP2水平的一例中未檢測到DX2(圖6e和6f，患者22872)。
實施例6AIMP2、AIMP2DX2及其缺失變異體的聯系在人組織和癌細胞系中檢測AIMP2、AIMP2DX2及其缺失變異體與癌癥的關系。
通過RT-PCR評價在來自肝細胞癌的正常和癌組織中的AIMP2DX2形成。另外，檢測不同癌細胞系中的AIMP2DX2形成(圖11a)。將細胞在6孔板中以1×105的密度培養并且于24小時后收集。收集的細胞用GSS緩沖液裂解，與含有酸性苯酚(pH4.3)和氯仿的4％異戊醇混合，然后離心。離心獲得的上清液用異丙醇沉淀并且再次離心，隨后得到沉淀。沉淀用乙醇沖洗并且溶解于DW中。RNA用M-MLV逆轉錄酶(invitrogen)在42℃逆轉錄1小時然后使用引物SEQNos.16和17進行PCR，95℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘循環38個周期。AIMP2DX2在肺癌細胞系(H226、H460、H322和H290)、胚胎腎細胞系(293)、骨肉瘤細胞系(SaOS2)、皮膚癌細胞株系(HaCAT)和乳癌細胞系(MCF7)中表達(圖11b)。
實施例7使用AIMP2敲除小鼠對腫瘤發生的研究在AIMP2DX2敲除小鼠和野生小鼠中觀察腫瘤的敏感性。
作為結果，AIMP2DX2敲除小鼠中在皮膚上具有腫瘤的小鼠數目和小鼠的腫瘤數目都顯著增加。具體地說，當小鼠的腫瘤發生被DMBA誘導和被TPA促進時，AIMP2敲除雌性小鼠中腫瘤形成的比例比野生型雌性對照小鼠增加大約1.3倍。此外，AIMP2敲除雄性小鼠中腫瘤形成的比例比野生型雄性對照小鼠增加大約2倍(圖12b)。在AIMP2敲除雌性小鼠中形成的腫瘤的數目比野生型雌性對照小鼠增加了大約4倍。在AIMP2敲除雄性小鼠中形成的腫瘤的數目比野生型雄性對照小鼠增加了大約2倍(圖12c和圖12d)。
已描述了本發明的一個優選實施例，應當理解其落入本發明精神的變異體和修飾體對于本領域技術人員是顯而易見的，并且本發明的范圍通過附加權利要求和其同等物來確定。
關于國際承認的用于專利目的的微生物保藏的布達佩斯條約國際表格原始保藏的受理根據7.1條頒布的致金松宏韓國首爾151-742廣津區新林洞#56-1首爾大學藥學院ARS網絡中心
序列表<110>Seoul National University Industry Foundation<120>Use of AIMP2DX2 for the diagnosis and treatment of cancer<150>KR20040097164<151>2004-11-24<150>KR20050039073<151>2005-05-10<160>21<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>756<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(753)<223>p38DX2 amino acid sequence<400>1atg ccg atg tac cag gta aag ccc tat cac ggg ggc ggc gcg cct ctc48Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu1 5 10 15cgt gtg gag ctt ccc acc tgc atg tac cgg ctc ccc aac gtg cac ggc96Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly20 25 30agg agc tac ggc cca gcg ccg ggc gct ggc cac gtg cag gat tac ggg 144Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly35 40 45gcg ctg aaa gac atc gtg atc aac gca aac ccg gcc tcc cct ccc ctc 192Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu
50 55 60tcc ctg ctt gtg ctg cac agg ctg ctc tgt gag cac ttc agg gtc ctg240Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu65 70 75 80tcc acg gtg cac acg cac tcc tcg gtc aag agc gtg cct gaa aac ctt288Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu85 90 95ctc aag tgc ttt gga gaa cag aat aaa aaa cag ccc cgc caa gac tat336Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr100 105 110cag ctg gga ttc act tta att tgg aag aat gtg ccg aag acg cag atg384Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met115 120 125aaa ttc agc atc cag acg atg tgc ccc atc gaa ggc gaa ggg aac att432Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile130 135 140gca cgt ttc ttg ttc tct ctg ttt ggc cag aag cat aat gct gtc aac480Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn145 150 155 160gca acc ctt ata gat agc tgg gta gat att gcg att ttt cag tta aaa528Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys165 170 175gag gga agc agt aaa gaa aaa gcc gct gtt ttc cgc tcc atg aac tct576Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser180 185 190gct ctt ggg aag agc cct tgg ctc gct ggg aat gaa ctc acc gta gca624Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala195 200 205gac gtg gtg ctg tgg tct gta ctc cag cag atc gga ggc tgc agt gtg672
Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val210 215 220aca gtg cca gcc aat gtg cag agg tgg atg agg tct tgt gaa aac ctg720Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu225 230 235 240gct cct ttt aac acg gcc ctc aag ctc ctt aag tga756Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys245 250<210>2<211>251<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu1 5 10 15Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly20 25 30Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly35 40 45Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu50 55 60Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu65 70 75 80Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu85 90 95Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr100 105 110Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met115 120 125
Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile130 135 140Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn145 150 155 160Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys165 170 175Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser180 185 190Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala195 200 205Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val210 215 220Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu225 230 235 240Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys245250<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<220>
<223>primer DX2-F<400>7tgctttggtt ctgccatgcc g 21<210>8<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer DX2-B<400>8cgtaatcctg cacgtggcca g 21<210>9<211>54<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>si-DX2#3 coding nucleic acid sequence<400>9tcgaggccac gtgcaggtta cgggagtagg ccgtaatcct gcacgtggcc tttt 54<210>10<211>55<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>si-DX2#3 coding nucleic acid sequence<400>10ctagaaaagg ccacgtgcag gattacggca gactcccgta atcctgcacg tggcc55<210>11<211>58<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>si-DX2#4 coding nucleic acid sequence<400>11tcgagctggc cacgtgcagg attacgagta ctggtaatcc tgcacgtggc cagctttt 58<210>12<211>58<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>si-DX2#4 coding nucleic acid sequence<400>12ctagaaaagc tggccacgtg caggattacc agtactcgta atcctgcacg tggccagc 58<210>13<211>56<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>si-DX2#5 coding nucleic acid sequence
<400>13tcgacacgtg caggat tacg gggcgagtac tggccccgta atcctgcacg tgtttt 56<210>14<211>56<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>si-DX2#5 coding nucleic acid sequence<400>14ctagaaaaca cgtgcaggat tacggggcca gtactcgccc cgtaatcctg cacgtg 56<210>15<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>RT primer<400>15cagcaccacg tctgc 15<210>16<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer DX2-S2<400>16
ctggccacgt gcaggat tac gggg 24<210>17<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer f3<400>17gagcatctga gtttgacccc tggaatctac30<210>18<211>35<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>priemr r2<400>18ttgcaggatg ttggttacgt ccaagtctgc atctg 35<210>19<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>priemr f6<400>19gtcaccgaat gtaactgtgc tggcttcgaa g 31
<210>20<211>30<212>DNA<213>primer pK0f2<400>20ggtaggtcca gagtcttcag agatcaagtc 30<210>21<211>30<212>DNA<213>primer r6<400>21ccataaccca ggt tgacggg tttagtgccc30
權利要求
1.包含AIMP2氨基酸序列的AIMP2DX2蛋白質，其中所述AIMP2氨基酸序列的外顯子2區域被刪除。
2.根據權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質，其中所述AIMP2DX2蛋白質包含SEQID NO2的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質，其中所述AIMP2DX2蛋白質被用作癌癥標記物。
4.包含編碼權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的核酸分子。
5.根據權利要求4所述的核酸分子，其中所述的核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸序列。
6.一種重組載體，該重組載體中的核酸分子包含編碼權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列。
7.一種轉化體，該轉化體用權利要求6所述的重組載體進行轉化。
8.一種制備權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的方法，包含培養權利要求7所述的轉化體。
9.一種特異于權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的抗體。
10.一種癌癥診斷試劑盒，該試劑盒包含特異于權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的抗體。
11.一種篩選作為癌癥標記物的AIMP2DX2蛋白質的方法，其中包含以下步驟(a)提供待測樣品；和(b)檢測所述樣品中編碼權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的核苷酸序列的表達，其中編碼所述AIMP2DX2蛋白質的所述核苷酸序列的表達的檢測指示有癌癥。
12.根據權利要求11的方法，其中步驟(b)中所述檢測通過使所述樣品和特異于權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的抗體接觸來進行。
13.根據權利要求11的方法，其中步驟(b)中所述檢測通過擴增反應或雜交反應來進行。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述擴增反應通過使用能夠區別AIMP2DX2的mRNA和AIMP2的mRNA的引物的RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈反應)來進行或所述雜交反應通過使用能夠區別AIMP2DX2的mRNA和AIMP2的mRNA的探針來進行。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述引物的序列包含SEQ ID No.5和6、SEQID No.7和8或SEQ ID No.16和6；或所述探針的序列包含SEQ ID No.8或16。
16.一種包含SEQ ID No.3、4、5、6、7、8或16的核苷酸序列的核酸分子。
17.特異于權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的mRNA的siRNA核酸分子。
18.根據權利要求17所述的siRNA核酸分子，其中所述siRNA核酸分子包含編碼SEQID Nos.9和10、SEQ ID Nos.11和12或SEQ ID Nos.13和14的核苷酸序列的有義和反義RNA。
19.一種治療癌癥的藥學組合物，其中包含權利要求17所述的siRNA核酸分子。
20.一種治療癌癥的方法，其中包含施用權利要求17所述的siRNA核酸分子。
21.一種反義寡核苷酸，該寡核苷酸與權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質的mRNA區域是互補的。
22.一種治療癌癥的藥學組合物，其中包含權利要求21所述的反義寡核苷酸。
23.一種治療癌癥的方法，其中包含施用權利要求21所述的反義寡核苷酸。
24.一種篩選抗癌藥物的方法，所述的抗癌藥物抑制權利要求1所述的AIMP2DX2蛋白質和AIMP2蛋白質間異源二聚體的形成，包含以下步驟(a)使測試物質和包含所述AIMP2DX2蛋白質和所述AIMP2蛋白質的組合物接觸；和(b)確定所述測試物質是否抑制所述AIMP2DX2蛋白質和所述AIMP2蛋白質間的所述異源二聚體的形成，其中抑制所述AIMP2DX2蛋白質和所述AIMP2蛋白質間的所述異源二聚體形成的所述測試物質被評價為抗癌藥物。
25.根據權利要求24的方法，其中該方法通過酵母雙雜交測定法或體外pull-down測度法進行。
26.一種篩選抗癌藥物的方法，所述抗癌藥物抑制權利要求1所述的AIMP2DX2基因的表達或促進所述AIMP2DX2蛋白質的破壞，包含以下步驟(a)使測試物質和表達所述AIMP2DX2基因的細胞接觸；和(b)確定所述測試物質是否抑制所述AIMP2DX2基因的表達或促進所述AIMP2DX2蛋白質的破壞，其中所述抑制所述AIMP2DX2基因表達的所述測試物質被評價為抗癌藥物。
27.根據權利要求26的方法，其中此方法通過RT-PCR或蛋白質印跡法進行。
全文摘要
本發明涉及命名為AIMP2DX2、特異表達于癌細胞中的缺失外顯子2的AIMP2的變異體。該AIMP2DX2蛋白質和基因能夠成功用于癌癥診斷和治療的發展中。
文檔編號C07K14/47GK101087804SQ200580037802
公開日2007年12月12日 申請日期2005年11月18日 優先權日2004年11月24日
發明者金松宏 申請人:首爾大學工業基地