多肽的生產的制作方法

專利名稱：多肽的生產的制作方法
相關申請本申請要求于2004年8月27日遞交的臨時專利申請號60/605,097、60/604,941和60/605,074的優先權，均在此處整體引用作為參考。
背景技術：
蛋白質和多肽作為治療物質已日益重要。大多數情況下，治療性蛋白質和多肽產生于細胞培養物中，所述細胞經過基因工程操作和/或選擇以產生非比尋常的高水平特定目的蛋白質或多肽。細胞培養條件的調控和優化對于蛋白質和多肽的成功商業化生產至關重要。
許多在細胞培養物中生產的蛋白質和多肽均系分批或補料分批方法產生，其中將細胞培養一段時間，然后終止培養并分離產生的蛋白質或多肽。細胞培養條件能顯著影響所產生蛋白質或多肽的最終數量和質量。例如，常規分批或補料分批培養方法常常導致產生對細胞增殖、存活力以及目的蛋白質和多肽的產生或穩定性有不良影響的代謝廢物。盡管已經努力改善分批或補料分批培養方法中蛋白質和多肽的生產，仍然有進一步改進的需要。
此外，也投入了大量的精力以發展用于培養細胞(特別是哺乳動物細胞)的限定培養基(即由已知單個成分組合的、缺乏血清或其他動物性副產物的培養基)。細胞在限定培養基中的生長特性相對于血清來源培養基中可能有很大差別。尤其需要發展出在限定培養基的細胞培養物中產生蛋白質和多肽的改良系統。
發明概述本發明提供了在細胞培養物中大規模生產蛋白質和/或多肽的改良系統。例如，本發明提供了利用培養基進行商業規模(如500L或更多)培養的方法，所述培養基具有下列一項或多項的特征i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機離子與累積總氨基酸的比率為約0.4至1；或v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺濃度的組合累積量大于約16mM。本領域普通技術人員理應知道上文所用的“累積”是指，在細胞培養過程中加入的特定成分的總量，包括在培養起始時加入的成分以及其后加入的成分。在本發明的某些優選實施方案中，期待將培養期間的“補料”減少到最小，因此需要最大化培養起始時的量。當然培養基成分在培養期間被代謝，因此如果在不同時間加入某些成分(例如全部于起始時加入和一些通過補料加入)，則特定成分累積量相同的培養基的絕對水平會有所差異。
根據本發明，此類培養基的應用能提高蛋白質產生的水平，并減少某些不良因子如銨鹽和/或乳酸鹽的蓄積。
本領域的普通技術人員知道，本發明的培養基配方包括限定和非限定培養基。在本發明的某些優選實施方案中，培養基為成分已知并受控的限定培養基。
在本發明的某些優選實施方案中，培養方法包括將第一組培養條件變為第二組培養條件，從而改變細胞的代謝。在某些實施方案中，當培養物達到其最大細胞密度約20-80％時實施這一改變。在某些實施方案中，所述改變包括改變培養物的維持溫度(或溫度范圍)。備選地或額外地，本發明提供了調整的方法，以使培養物中乳酸鹽和/或銨鹽水平在達到峰值后隨時間而下降。在其他實施方案中，所述改變包括改變pH值、摩爾滲透壓濃度或化學物誘導物如鏈烷酸或其鹽的水平。
本發明的細胞培養物可任選添加營養素和/或其他培養基成分，包括激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(終濃度通常極低的無機化合物)、氨基酸、脂質或葡萄糖或其他能源。在本發明的某些實施方案中，向培養基中添加化學誘導物如六亞甲基二乙酰胺(“HMBA”)和丁酸鈉(“NaB”)是有利的。這些任選增補劑可在培養起始時加入，或者稍后加入以補充消耗的營養素或以備他用。一般而言，期望根據本發明需要選擇初始培養基成分以使添加降至最低。
可監測本發明的多種培養條件，包括pH、細胞密度、細胞存活力、乳酸鹽水平、銨鹽水平、摩爾滲透壓濃度或表達的多肽或蛋白質的滴度。
附圖簡述

圖1顯示了利用抗GDF-8細胞對搖瓶中培養基1和培養基2的比較。
圖2顯示了培養基1中抗GDF-8細胞的細胞生長和存活力。
圖3顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和無谷氨酰胺補料培養條件下的細胞生長。
圖4顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和無谷氨酰胺補料培養條件下的細胞存活力。
圖5顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和無谷氨酰胺補料培養條件下的銨鹽水平。
圖6顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和無谷氨酰胺補料培養條件下的乳酸鹽水平。
圖7顯示了在對照和無谷氨酰胺補料培養條件下的抗GDF-8滴度。
圖8顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和谷氨酰胺饑餓的補料培養條件下的細胞密度。
圖9顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和谷氨酰胺饑餓的補料培養條件下的細胞存活力。
圖10顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和谷氨酰胺饑餓的培養條件下的銨鹽水平。
圖11顯示了抗GDF-8細胞培養物在對照和谷氨酰胺饑餓的培養條件下的乳酸鹽水平。
圖12顯示了在對照和谷氨酰胺饑餓的培養條件下的抗GDF-8滴度。
圖13顯示了培養基1和培養基2中抗GDF-8細胞的鐵劑量應答。
圖14顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養物中的細胞密度。
圖15顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養物中的細胞存活力。
圖16顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養物中的抗Lewis Y滴度。
圖17顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養物中的乳酸鹽水平。
圖18顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養物中的銨鹽水平。
圖19顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養物的摩爾滲透壓濃度。
圖20顯示了抗Lewis Y細胞的細胞密度。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖21顯示了抗Lewis Y細胞的細胞存活力。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖22顯示了抗Lewis Y培養物的平均滴度。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖23顯示了抗Lewis Y細胞的銨鹽水平。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖24顯示了補料分批培養中所用的葉輪竄動。
圖25顯示了多種試驗條件下抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖26顯示了多種試驗條件下抗GDF-8細胞的存活力。
圖27顯示了多種試驗條件下的抗GDF-8滴度。
圖28顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養物的乳酸鹽水平。
圖29顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養物的銨鹽水平。
圖30顯示了多種試驗條件下抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖31顯示了多種試驗條件下的抗GDF-8滴度。
圖32顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養物的乳酸鹽水平。
圖33顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養物的銨鹽水平。
圖34顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖35顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中抗GDF-8細胞的細胞存活力。
圖36顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中抗GDF-8培養物的乳酸鹽水平。
圖37顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中抗GDF-8培養物的銨鹽水平。
圖38顯示了在不同水平含谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中抗GDF-8培養物的谷氨酰胺水平。
圖39顯示了含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中的抗GDF-8滴度。
圖40顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養基9中抗GDF-8培養物的摩爾滲透壓濃度。
圖41顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖42顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中抗GDF-8培養物的乳酸鹽水平。
圖43顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中抗GDF-8培養物的銨鹽水平。
圖44顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中抗GDF-8培養物的谷氨酰胺水平。
圖45顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中抗GDF-8培養物的谷氨酸水平。
圖46顯示了含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中的抗GDF-8滴度。
圖47顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養基中抗GDF-8培養物的摩爾滲透壓濃度。
圖48顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養基中抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖49顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養基中抗GDF-8培養物的乳酸鹽水平。
圖50顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養基中抗GDF-8培養物的銨鹽水平。
圖51顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養基中抗GDF-8培養物的谷氨酰胺水平。
圖52顯示了含不同水平氨基酸和維生素的培養基中的抗GDF-8滴度。
圖53顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養基中抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖54顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養基中抗GDF-8培養物的乳酸鹽水平。
圖55顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養基中抗GDF-8培養物的銨鹽水平。
圖56顯示了含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養基中的抗GDF-8滴度。
圖57顯示了在培養基1、3和9中抗GDF-8細胞的細胞生長。
圖58顯示了培養基1、3和9中的抗GDF-8滴度。
圖59顯示了含不同水平谷氨酰胺以及含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺組合總量時的外推抗GDF-8滴度。
圖60顯示了在多種測試培養基條件下抗Aβ細胞的細胞生長。
圖61顯示了在多種測試培養基條件下抗Aβ細胞的存活力。
圖62顯示了在多種測試培養基條件下抗Aβ培養物的乳酸鹽水平。
圖63顯示了在多種測試培養基條件下抗Aβ培養物的銨鹽水平。
圖64顯示了多種測試培養基條件下的抗Aβ滴度。
圖65顯示了在多種測試培養基條件下抗Aβ培養物的摩爾滲透壓濃度。
圖66顯示了在多種試驗條件下表達TNFR-Ig的細胞的細胞生長。
圖67顯示了在多種試驗條件下表達TNFR-Ig的細胞的存活力。
圖68顯示了在多種試驗條件下表達TNFR-Ig的細胞培養物中的殘留葡萄糖。
圖69顯示了在多種試驗條件下表達TNFR-Ig的細胞培養物中的谷氨酰胺水平。
圖70顯示了在多種試驗條件下表達TNFR-Ig的細胞培養物中的乳酸鹽濃度。
圖71顯示了在多種試驗條件下表達TNFR-Ig的細胞培養物中的銨鹽水平。
圖72顯示了多種試驗條件下的TNFR-Ig相對滴度。
圖73顯示了生長于6000L和1L生物反應器內的抗GDF-8細胞的細胞密度。
圖74顯示了生長于6000L和1L生物反應器內的抗GDF-8細胞的滴度。
圖75顯示了生長于6000L和1L生物反應器內的抗GDF-8細胞的乳酸鹽水平。
圖76顯示了生長于6000L和1L生物反應器內的抗GDF-8細胞的銨鹽水平。
定義“約”、“大約”當此處所用的術語“約”和“大約”用于一種或多種具體細胞培養條件時，是指與所述培養條件下指定的參考值相似的一系列值。在某些實施方案中，術語“約”是指處在所述培養條件下指定參考值的百分之25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更小范圍的系列值。
“氨基酸”此處所用的術語“氨基酸”，指用于常規制備多肽的20種天然氨基酸中的任意一種，或所述氨基酸的類似物或衍生物。本發明中于培養基內向細胞培養物提供氨基酸。培養基中所含的氨基酸可為鹽或水合物形式。
“抗體”此處所用的術語“抗體”，是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，如Fab或F(ab′)2片段，其含有一個或多個能與抗原特異性結合(免疫反應)的抗原結合位點。此處所用的術語“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”，是指僅含有一種能與特定抗原表位發生免疫反應的抗原結合位點的抗體分子克隆群，而術語“多克隆抗體”和“多克隆抗體組合物”是指含有多種能與某一特定抗原相互作用的抗原結合位點的抗體分子群。單克隆抗體的定義既包括了常規技術得到的克隆分子，也包括了通過操作或變異特定殘基得到的指定序列分子，如人源化抗體。
“分批培養”此處所用的術語“分批培養”是一種細胞培養方法，其中所有最終將用于培養細胞的成分均于培養過程起始時加入，包括培養基(見下文“培養基”定義)和細胞本身。一般在某一點終止分批培養，收集培養基中的細胞和/或成分，并任選純化之。
“生物反應器”此處所用的術語“生物反應器”是指用于哺乳動物細胞培養物生長的任何容器。只要能用于培養哺乳動物細胞，生物反應器可為任意大小。一般而言，生物反應器為至少1升，也可為10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更大，或其間任意容積。一般在培養期間調控生物反應器的內部條件，包括但不僅限于pH和溫度。生物反應器可以由適于容納在本發明培養條件下懸浮于培養基內的哺乳動物細胞培養物的任何材料構成，包括玻璃、塑料或金屬。此處所用的術語“生產生物反應器”是指用于生產目的多肽或蛋白質的終末生物反應器。大規模細胞培養物生產生物反應器的容積一般至少為500升，也可為1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更大，或其間任意容積。本領域普通技術人員應當了解并能夠選擇合適的生物反應器用于實施本發明。
“細胞密度”此處所用的術語“細胞密度”是指在指定體積培養基中存在的細胞數目。
“細胞存活力”此處所用的術語“細胞存活力”是指培養物中的細胞在一組指定培養條件或試驗變量下存活的能力。此處所用的術語也指在某一特定時間內存活的那部分細胞與該時間培養物中活細胞和死細胞總數之間的關系。
“培養物”、“細胞培養物”和“哺乳動物細胞培養物”此處所用的這些術語是指在適于細胞群存活和/或生長的條件下，懸浮于培養基(見下文“培養基”定義)內的哺乳動物細胞群。對本領域普通技術人員顯而易見的是，此處所用的這些術語也指包含哺乳動物細胞群和細胞群懸浮于其中的培養基的組合。
“補料分批培養”此處所用的術語“補料分批培養”是在培養過程起始后的某一時間向培養物內加入額外成分的細胞培養方法。所提供的成分一般包括在培養過程中已消耗的細胞營養添加劑。一般在某一點終止補料分批培養，收集培養基中的細胞和/或成分，并任選純化之。
“片段”此處所用的術語“片段”指多肽并且被定義為給定多肽中特有的或特征性的任意分離部分。此處所用的該術語也指給定多肽中保留至少部分全長多肽活性的任意分離部分。優選保留的活性部分至少為全長多肽活性的10％。更優選保留的活性部分至少為全長多肽活性的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。更優選保留的活性部分至少為全長多肽活性的95％、96％、97％、98％或99％。最優選保留的活性部分為全長多肽活性的100％。此處所用的該術語也指包括全長多肽中至少一個確定序列元件的指定多肽的任意部分。優選該序列元件跨越全長多肽的至少4-5個，更優選至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多氨基酸。
“基因”此處所用的術語“基因”指DNA或RNA的任意核苷酸序列，其中至少某些部分編碼分離的在細胞代謝或發育的某些方面發揮作用的終產物，一般為(但不僅限于)多肽。該術語并非僅指編碼多肽或其他分離終產物的編碼序列，還包括位于編碼序列之前或之后、調節基礎表達水平的區域(見下文“遺傳控制元件”定義)，以及單個編碼區段(“外顯子”)之間的插入序列(“內含子”)。
“遺傳控制元件”此處所用的術語“遺傳控制元件”，是指調節與其有效連接的基因表達的任意序列元件。遺傳控制元件通過提高或降低表達水平而發揮功能，可位于編碼序列之前、之中或之后。通過調節如轉錄起始、延伸或終止；mRNA剪接、mRNA編輯、mRNA穩定性、mRNA細胞內定位；翻譯起始、延伸或終止；或基因表達的任何其他階段，遺傳控制元件可以作用于基因表達的任意階段。遺傳控制元件可以單獨作用或彼此聯合作用。
“雜交瘤”此處所用的術語“雜交瘤”，是指將免疫來源的永生細胞與抗體產生細胞融合而得到的細胞。所產生的雜交瘤為能產生抗體的永生細胞。用于產生雜交瘤的單個細胞可來自任何哺乳動物，包括但不僅限于大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊和人。該術語也包括三體瘤細胞系，后者為人細胞和鼠骨髓瘤細胞系融合產生的異雜交骨髓瘤融合體的子代，再與漿細胞融合的產物。此外，該術語還包括任何產生抗體的永生雜交細胞系，例如四體瘤(見如Milstein等人.，Nature，5373053(1983))。
“綜合活細胞密度”此處所用的術語“綜合活細胞密度”，是指在培養過程中活細胞的平均密度乘以培養持續的時間量。假設產生多肽和/或蛋白質的量與培養過程中存在的活細胞數目成正比，則綜合活細胞密度是估計培養過程中產生多肽和/或蛋白質量的有力工具。
“培養基”、“細胞培養基”此處所用的這些術語是指含有滋養哺乳動物細胞生長的營養素的溶液。一般而言，這些溶液提供細胞基本生長和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、維生素、能源、脂質和微量元素。溶液中也可含有促進最低速率以上生長和/或存活的成分，包括激素和生長因子。所述溶液優選配制為適于細胞存活和增殖的pH和鹽濃度。培養基也可為“限定培養基”——不含蛋白質、水解產物或未知組合物成分的無血清培養基。限定培養基中不含有動物來源的成分，并且其所有成分均具有已知的化學結構。
“代謝廢物”此處所用的術語“代謝廢物”是指細胞培養物在正常或非正常代謝過程中產生的、對細胞培養物的某些方面(特別是對所需重組多肽或蛋白質的表達或活性)具有不良作用的化合物。例如，代謝廢物可能對細胞培養物的生長或存活力有不良作用，可能減少重組多肽或蛋白質的產量，可能改變表達多肽或蛋白質的折疊、穩定性、糖基化或其他翻譯后修飾，可能對細胞和/或重組多肽或蛋白質的表達或活性的任意其他方面具有不良作用。代謝廢物的實例包括糖代謝產生的乳酸鹽，以及谷氨酰胺代謝產生的銨鹽。本發明的目的之一在于減慢哺乳動物細胞培養物中代謝廢物的生成，減少或甚至杜絕哺乳動物細胞培養中的代謝廢物。
“摩爾滲透壓濃度”和“重量摩爾滲透壓濃度”“重量摩爾滲透壓濃度”是對水溶液中溶解的溶質顆粒滲透壓的測量。溶質顆粒包括離子和非離子分子。重量摩爾滲透壓濃度表示為溶于1kg溶液中滲透活性顆粒的濃度(即滲透壓摩爾)(38℃的1mOsm/kg H2O相當于19mmHg滲透壓)。與之相反，“摩爾滲透壓濃度”是指溶于1升溶液中溶質顆粒的數目。此處所用的簡寫“mOsm”指“毫滲透壓摩爾/kg溶液”。
“灌流式培養”此處所用的術語“灌流式培養”為一種在培養過程起始后，持續或半持續地向培養物中供以額外成分的細胞培養方法。所提供的成分一般包括在培養過程中消耗的細胞營養添加劑。一般在持續或半持續的基礎上收集培養基中的細胞和/或成分部分，并任選純化之。
“多肽”此處所用的術語“多肽”是指通過肽鍵相連的順序氨基酸鏈。該術語用以指任意長度的氨基酸鏈，然而本領域普通技術人員知道該術語不僅指代長鏈，也可用于指含有通過肽鍵相連的2個氨基酸的最短鏈。
“蛋白質”此處所用的術語“蛋白質”是指作用如離散單位的一個或多個多肽。如果單個多肽即為離散的功能單位，且不需要與其他多肽的持久物理締合以形成該獨立的功能單位，則此處術語“多肽”和“蛋白質”可互換使用。如果該離散功能單位由多于一個彼此物理締合的多肽組成，則此處所用的術語“蛋白質”指物理偶聯的并且共同作為離散單位起作用的多個多肽。
“重組表達多肽”和“重組多肽”此處所用的這些術語是指從經遺傳工程修飾以表達該多肽的哺乳動物宿主細胞中表達的多肽。重組表達多肽可以與哺乳動物宿主細胞內正常表達的多肽相同或相似。重組表達多肽也可為宿主細胞的外源物，即異源于哺乳動物宿主細胞正常表達的多肽。或者重組表達多肽為嵌合多肽，即部分多肽含有與哺乳動物宿主細胞內正常表達的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其他部分為宿主細胞外源物。
“接種”此處所用的術語“接種”是指將細胞培養物供予生物反應器或另一容器的方法。之前細胞可在另一生物反應器或容器中增殖。或者細胞為冰凍并于供予生物反應器或容器之前解凍。該術語用于指任意數目細胞，包括單個細胞。
“滴度”此處所用的術語“滴度”是指由哺乳動物細胞培養物產生的重組表達多肽或蛋白質的總量除以給定量的培養基體積。滴度一般用每毫升培養基毫克多肽或蛋白質的單位表示。
某些優選實施方案的詳述本發明提供了通過細胞培養物生成蛋白質和/或多肽的改良系統。具體而言，本發明提供了使一種或多種對細胞生長、存活力和/或蛋白質產生或質量有害的代謝產物的產生最小化的系統。在本發明的優選實施方案中，細胞培養物為分批或補料分批培養。其他某些本發明的優選實施方案將詳述于下文。然而，本領域普通技術人員知道多種對這些優選實施方案的修改均處于所附權利要求書的范圍內。權利要求書及其等同物定義了本發明的范圍，并不限于也不應當限于此處對某些優選實施方案的說明。
多肽根據本發明，可以生成任何能在宿主細胞內表達的多肽。該多肽表達自宿主細胞內源性基因，或表達自通過基因工程引入宿主細胞中的基因。該多肽可為天然存在的多肽，也可以具有人工操作或選擇的序列。經加工的多肽可為天然存在的其他單個多肽片段組裝而成，也可包括一個或多個并非天然存在的片段。
能夠根據本發明表達的多肽的選擇，是基于其目的生物或化學活性。例如，本發明可用于表達任意藥物或商業相關的酶、受體、抗體、激素、調節因子、抗原、結合劑等。
抗體考慮到目前應用或研究中的用作藥物或其他商業物質的抗體數目之巨，本發明的抗體生產具有特別意義。抗體為能特異性結合特定抗原的蛋白質。任何表達于宿主細胞的抗體都可以用于本發明。在優選實施方案中，表達的抗體為單克隆抗體。
在另一優選實施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體。嵌合抗體含有來源于多于一種生物的氨基酸片段。嵌合抗體分子可包括，例如來自小鼠、大鼠或其他物種抗體的抗原結合結構域和人恒定區。制備嵌合抗體的多種方法已被描述。見如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等人，Nature 314，452(1985)，Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Boss等人，美國專利號4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專利出版號EP171496；歐洲專利出版號0173494，英國專利GB 2177096B。
在另一優選實施方案中，單克隆抗體為人抗體，如通過應用核糖體展示或噬菌體展示文庫得到(見如Winter等人，美國專利號6,291,159和Kawasaki，美國專利號5,658,754)，或利用天然抗體基因失活并被人抗體基因功能性替代、而天然免疫系統的其他成分完好的異種移植物種得到(見如Kucherlapati等人，美國專利號6,657,103)。
在另一優選實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。人源化抗體為嵌合抗體，其中大部分氨基酸殘基來自人抗體，因此將施用于人受試者時的潛在免疫反應降至最低。人源化抗體中互補性決定區域的氨基酸至少部分被非人物種的殘基所取代，后者可賦予所需的抗原特異性或親和力。可以通過本領域已知的若干技術中的任意一種制備此類改變的免疫球蛋白分子(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，7308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982))，并優選根據PCT出版號WO92/06193或EP0239400的教導制備，均在此處引用作為參考)。人源化抗體可以由如Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain商業化制備。更多參考見Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)，均在此處引用作為參考。
在另一優選實施方案中，上述單克隆、嵌合或人源化抗體中可能含有自然界任何物種的任何抗體中都不天然存在的氨基酸殘基。這些外源性殘基可用于，如為單克隆、嵌合或人源化抗體帶來新的或改良的特異性、親和力或效應物功能。在另一優選實施方案中，上述抗體可綴合于藥物用于全身性藥物治療，例如毒素、低分子量細胞毒藥物、生物應答調節物和放射性核素(見如Kunz等人，Calicheamicin derivative-carrier conjugates，US20040082764 A1)。
在一個實施方案中，該抗體特異性結合淀粉樣前體蛋白的Aβ片段或淀粉樣斑塊的其他成分，且可用于對抗Alzheimer’s病特征性大腦中淀粉樣斑塊的聚集(見如美國臨時申請60/636,684)。
在另一實施方案中，本發明的抗體針對增殖性疾病如癌癥的靶細胞和/或組織中表達的細胞表面抗原。在某一實施方案中，該抗體為IgG1抗Lewis Y抗體。Lewis Y為糖抗原，其結構為Fuca1→2Galβ1→4[Fuca1→3]GlcNacβ1→3R(Abe等人(1983)J.Biol.Chem.，258 11793-11797)。LewisY抗原表達于60％至90％的人上皮腫瘤(包括乳腺、結腸、肺和前列腺上皮腫瘤)的表面，其中至少40％過量表達該抗原，而在正常組織中限量表達。
為靶定Ley并有效靶定腫瘤，最好需要對該抗原有專一特異性的抗體。因此，優選本發明的抗Lewis Y抗體不與1型結構(即乳糖系列血型(Lea和Leb))發生交叉反應，且優選不結合其他2型表位(即新乳糖結構)如Lex和H-型2型結構。優選的抗Lewis Y抗體的實例命名為hu3S193(見美國專利號6,310,185；6,518,415；5,874,060，在此處整體引用作為參考)。人源化抗體hu3S193(Attia，M.A.等人.1787-1800)經CDR移植從3S193(Kitamura，K.，12957-12961)產生，3S193為針對腺癌細胞產生的對Ley具有高度特異性的鼠單克隆抗體。Hu3S193不僅保留了3S193對Ley的特異性，而且獲得了介導補體依賴性細胞毒作用(以下稱為CDC)以及抗體依賴性細胞毒作用(以下稱為ADCC)的能力(Attia，M.A.等人1787-1800)。該抗體靶定裸鼠中表達Ley的異種移植物，如利用125I、111In或18F，以及需要螯合劑的其他放射性標記如111In、99mTc或90Y標記的hu3S193進行生物分布研究所示(Clark等人4804-4811)。
在另一實施方案中，抗體為稱為Myo29、Myo28及Myo22的人抗GDF-8抗體以及由其衍生的抗體和抗原結合片段之一。這些抗體能高親和力結合成熟GDF-8，抑制GDF-8的體外和體內活性(如抑制ActRIIB結合和報告基因檢測所示)，還可抑制與骨骼肌重量和骨密度負調節相關的GDF-8活性。見如Veldman等人，美國專利申請號20040142382。
受體可有效作為藥物和/或商業物質的另一類多肽包括受體。受體一般為通過識別細胞外信號配體而發揮作用的跨膜糖蛋白。除配體識別結構域外，受體一般還具有蛋白質激酶結構域，后者在結合受體后通過磷酸化細胞內靶分子而起始信號途徑，從而導致細胞內發育或代謝改變。在一個實施方案中，修飾目的受體以移除其跨膜和/或細胞內結構域，而可任選以IgG結構域取代之。在優選實施方案中，根據本發明生產的受體為受體酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括對眾多細胞類型中多種功能具有關鍵作用的受體(見如Yarden和Ullrich，Ann.Rev.Biochem.57433-478，1988；Ullrich和Schlessinger，Cell 61243-254，1990，此處引用作為參考)。RTK的非限制性實例包括成纖維細胞生長因子(FGF)受體家族成員、表皮生長因子(EGF)受體家族成員、血小板衍生生長因子(PDGF)受體、攜帶免疫球蛋白和EGF同源結構域-1(TIE-1)及TIE-2受體的酪氨酸激酶(Sato等人，Nature376(6535)70-74(1995)，此處引用作為參考)以及c-Met受體，其中一些似乎能直接或間接促進血管形成(Mustonen和Alitalo，J.Cell Biol.129895-898，1995)。其他RTK的非限制性實例包括胎肝激酶1(FLK-1)(有時稱為含激酶插入結構域的受體(KDR)(Terman等人，Oncogene61677-83，1991)或血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2))、fms樣酪氨酸激酶-1(Flt-1)(DeVries等人Science 255；989-991，1992；Shibuya等人，Oncogene 5519-524，1990)，有時稱為血管內皮細胞生長因子受體1(VEGFR-1)、神經氈蛋白-1、內皮糖蛋白、內皮唾液酸蛋白和Axl。本領域普通技術人員知道根據本發明優選表達的其他受體。
在特別優選的實施方案中，根據本發明表達的腫瘤壞死因子抑配方如腫瘤壞死因子α和β受體形式(TNFR-1，發表于1991年3月20日的EP417,563；以及TNFR-2，發表于1991年3月20日的EP 417,014)(綜述見Naismith和Sprang，J Inflamm.47(1-2)1-7(1995-96)，此處引用作為參考)。根據一個實施方案，腫瘤壞死因子抑配方包括可溶性TNF受體及優選TNFR-Ig。在一個實施方案中，本發明優選的TNF抑配方為TNFRI和TNFRII的可溶形式，以及可溶性TNF結合蛋白質。在另一實施方案中，該TNFR-Ig融合物為TNFR:Fc，此處所用的該術語指“依那西普(etanercept)”，其為兩分子p75 TNF-α受體胞外部分的二聚體，每一分子由人IgG亞型1的Fc部分的235個氨基酸組成。
生長因子和其他信號分子可有效作為藥物和/或商業物質的另一類多肽包括生長因子和其他信號分子。生長因子一般為糖蛋白，其由細胞分泌并結合和活化其他細胞上的受體，起始受體細胞中的代謝或發育改變。在一個實施方案中，目的蛋白質為包括ActRIIB受體胞外結構域和抗體Fc部分的ActRIIB融合多肽(見如Wolfman等人，ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor，US2004/0223966 A1)。在另一實施方案中，生長因子為修飾的GDF-8前肽(見如Wolfman等人.，Modifed and stabilized GDF propeptides and usesthereof，US2003/0104406 A1)。或者目的蛋白為含濾泡素抑制素結構域的蛋白質(見如Hill等人，GASP1a follistatin domain containing protein，US2003/0162714 A1，Hill等人，GASP1a follistatin domain containing protein，US 2005/0106154 A1，Hill等人，Follistatin domain containing proteins，US2003/0180306 A1)。
哺乳動物生長因子和其他信號分子的非限制性實例包括細胞因子；表皮生長因子(EGF)；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子(FGF)如aFGF和bFGF；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白質如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；紅細胞生成素；骨生成誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白質(BMP)；干擾素如干擾素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(TL)如IL-1至IL-10；腫瘤壞死因子(TNF)α和β；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和馮維勒布蘭德因子；抗凝因子如蛋白C；心鈉素；肺表面活性物質；纖溶酶原激活物如尿激酶或人尿或組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)；蛙皮素；凝血酶、造血生長因子；腦啡肽酶；RANTES(調節激活正常T細胞表達和分泌因子)；人巨噬細胞炎癥蛋白質(MIP-1-α)；米勒抑制物質；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；神經營養因子如骨源神經營養因子(BDNF)、神經營養因子3、4、5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經生長因子如NGF-β。一名本領域普通技術人員應了解可根據本發明表達的其他生長因子或信號分子。
G-蛋白偶聯受體可有效作為藥物和/或商業物質的另一類多肽包括生長因子和/或其他信號分子。G-蛋白偶聯受體(GPCR)為具有7個跨膜結構域的蛋白質。一旦配體與GPCR結合，將在細胞內轉導信號，從而使細胞的生物或生理性質發生改變。
GPCR以及G蛋白和效應物(受G蛋白調控的胞內酶和通道)，是將細胞內第二信使狀態和細胞外輸入相聯系的調節信號系統的組分。這些基因和基因產物是疾病的潛在誘因。
視紫紅質基因和V2血管加壓素受體基因的特定缺陷會導致多種形式的常染色體顯性和常染色體隱性視網膜色素變性、腎性尿崩癥。這些受體對于中樞神經系統和外周生理過程都至關重要。GPCR蛋白質超家族目前包括250種以上的旁系同源物(基因復制(或其他過程)產生的變體受體)，與之對應的直系同源物為不同物種的相同受體。該超家族可分為5個家族家族I，以視紫紅質和β2腎上腺素受體為代表的受體，目前具有200以上的獨特成員；家族II，最近表征的甲狀旁腺激素/降鈣素/胰泌素受體家族；家族III，哺乳動物代謝型谷氨酸受體家族；家族IV，cAMP受體家族，在化學趨化作用和盤基網柄菌(D.discoideum)的發育中具有重要作用；以及家族V，真菌交配信息素受體如STE2。
GPCR包括生物胺、炎癥脂質介質、肽激素和感覺信號介質的受體。當受體結合其細胞外配體時GPCR被活化。配體-受體相互作用引發的GPCR構象改變，會影響G蛋白對GPCR胞內結構域的結合親和力。這使得GTP以增強的親和力結合于G蛋白。
由GTP活化G蛋白，引發了G蛋白α亞基與腺苷酸環化酶或其他第二信使分子產生物間的相互作用。這一相互作用調節腺苷酸環化酶的活性，繼而調節了第二信使分子cAMP的產生。cAMP調節其他細胞內蛋白質的磷酸化和活化。備選地，GPCR的活性也可上調或下調其他第二信使分子如cGMP或eicosinoid的細胞水平。GTPase水解GTP失活G蛋白α亞基，隨后α、β和γ亞基重新組合。然后異三聚體G蛋白從腺苷酸環化酶或其他第二信使分子產生物上脫落下來。也可通過細胞內和細胞外結構域或環的磷酸化調節GPCR的活性。
谷氨酸受體構成了一組在神經傳導中很重要的GPCR。谷氨酸為中樞神經系統中的主要神經遞質，在神經元可塑性、認知、記憶、學習和某些神經系統疾病如癲癇、中風和神經變性中起重要作用(Watson，S.和S.Arkinstall(1994)The G-Protein Linked Receptor Facts Book，AcademicPress，San Diego CA，130-132頁)。谷氨酸的這些作用主要通過兩類不同的受體介導，即離子型和代謝型。離子型受體含有內源性陽離子通道并介導谷氨酸的快速激動性作用。代謝型受體為調節性受體，通過抑制鈣依賴性鉀電導并同時抑制和加強離子型受體的興奮性傳導，提高神經元的膜興奮性。代謝型受體基于激動劑藥理學和信號轉導途徑可分為5個亞類，并廣泛分布于腦組織中。
血管活性腸肽(VIP)家族為一組也通過GPCR介導作用的相關多肽。該家族的核心成員為VIP本身、胰泌素和生長激素釋放因子(GRF)。VIP具有廣泛的生理作用，包括松弛平滑肌、刺激或抑制多種組織中的分泌、調節中樞神經系統中多種免疫細胞活性以及多種興奮性或抑制性活性。胰泌素刺激胰腺和腸中酶和離子的分泌，在腦中也少量存在。GRF為重要的神經內分泌物質，調節腺垂體中生長激素的合成和釋放(Watson，S.和S.Arkinstall同上，278-283頁)。
配體結合GPCR后，構象變化傳遞到G蛋白，導致α亞基將結合的GDP分子更換為GTP分子，并從β、γ亞基上解離下來。α亞基的GTP結合形式一般作用如效應物調節部分，導致第二信使的產生，如環化AMP(如通過腺苷酸環化酶的活化)、甘油二酯或肌醇磷酸。已知人有多于20種不同類型的α亞基，與較少類型的β和γ亞基相連。哺乳動物G蛋白的實例包括Gi、Go、Gq、Gs和Gt。G蛋白詳述于Lodish H.等人Molecular CellBiology中(Scientific American Books Inc.，New York，N.Y.，1995)，其內容在此處引用作為參考。
GPCR為藥物作用和研發的主要靶位。實際上，目前已知藥物的一半以上均為受體所致(Drews，Nature Biotechnology，1996，141516)，而GPCR為治療干預最重要的靶位，臨床用藥的30％為GPCR的拮抗劑或激動劑(Milligan，G.和Rees，S.，(1999)TIPS，20118-124)。這表明，這些受體作為治療物質已有確定的且經證實的歷史。
一般而言，本發明的實施者會選擇其目的多肽，并已知其準確的氨基酸序列。本發明的技術已經成功應用于生產多樣化多肽，其包括如針對生長和分化因子8的人單克隆抗體(實施例1、3、4、7-14)、人源化抗Lewis Y抗體(實施例5和6)、抗Aβ(實施例15)以及腫瘤壞死因子受體的二聚Fc-融合蛋白(實施例16)，提示本發明可用于表達多種不同的多肽和蛋白質。將根據本發明表達的任何給定蛋白質都具有自身的特異反應性特征，并可能影響培養細胞的細胞密度或存活力，其表達水平可能低于相同培養條件下生長的另一種多肽或蛋白質。本領域的普通技術人員能適當修飾本發明的步驟和組合物，從而優化細胞生長和/或任意給定表達的多肽或蛋白質的產生。
遺傳控制元件對于本領域普通技術人員顯而易見的是，遺傳控制元件可用于調控多肽或蛋白質的基因表達。選擇此類遺傳控制元件使其在相關宿主細胞中具有活性。控制元件可具有組成型活性或為指定條件下可誘導。可誘導型控制元件在表達蛋白質具毒性或對細胞生長和/或存活力具其他不良影響時特別有用。在這種情況下，通過可誘導型控制元件調控多肽或蛋白質的表達，可以改善細胞存活力、細胞密度和/或表達多肽或蛋白質的總產率。可用于實施本發明的大量控制元件為本領域公知且可獲取。
可用于本發明的代表性組成型哺乳動物啟動子包括但不僅限于，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPTR)啟動子、腺苷脫氨酶啟動子、丙酮酸激酶啟動子、β肌動蛋白啟動予以及其他本領域普通技術人員已知的組成型啟動子。此外，能驅動真核細胞中編碼序列的組成型表達的病毒啟動子包括，如猿猴病毒啟動子、單純皰疹病毒啟動子、乳頭瘤病毒啟動子、腺病毒啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、莫洛尼鼠白血病病毒及其他逆轉錄病毒的長末端重復序列(LTR)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子，以及其他本領域普通技術人員已知的病毒啟動子。
誘導型啟動子可在存在誘導劑時驅動有效連接的編碼序列的表達，也可根據本發明使用。例如在哺乳動物細胞內，金屬硫蛋白啟動子在某些金屬離子存在時能誘導下游編碼序列的轉錄。其他誘導型啟動子為本領域普通技術人員所識別和/或公知。
一般而言，基因表達序列也包括分別涉及轉錄和翻譯起始的5’非轉錄和5’非翻譯序列，如TATA盒、帽子序列、CAAT序列等。增強子元件可任選用于增強欲表達多肽或蛋白質的表達水平。可在哺乳動物細胞中作用的增強子元件的實例包括SV40早期基因增強子(如Dijkema等人，EMBOJ.(1985)4761所述)、以及來自勞斯肉瘤病毒(RSV)(如Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)796777所述)和人巨細胞病毒(如Boshart等人，Cell(1985)41521所述)長末端重復序列的增強子/啟動子。
將控制元件連接到編碼序列的系統為本領域公知(普通分子生物學和重組DNA技術，如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989，此處引用作為參考)。適用于插入優選編碼序列以在多種生長和誘導條件下的多種哺乳動物細胞中表達的商業載體也為本領域所公知。
將編碼序列和相關控制元件引入宿主細胞適于將表達目的多肽或蛋白質所需的足量核酸引入哺乳動物宿主細胞內的方法為本領域所公知。見如Gething等人，Nature，293620-625(1981)；Mantei等人，Nature，28140-46(1979)；Levinson等人；EP 117,060；以及EP 117,058，均在此處引用作為參考。
對于哺乳動物細胞而言，優選轉化方法包括，Graham和van der Erb，Virology，52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法，或Hawley-Nelson，Focus1573(1193)的lipofectamineTM.(Gibco BRL)法。哺乳動物細胞宿主系統轉化的一般方面已由Axel述于1983年8月16日遞交的美國專利號4,399,216。轉化哺乳動物細胞的多種技術可見Keown等人，Methods inEnzymology(1989)、Keown等人，Methods in Enzymology，185527-537(1990)，以及Mansour等人，Nature，336348-352(1988)。在哺乳動物細胞中表達多肽或蛋白質的合適載體的非限制性代表實例包括pCDNA1；pCD，見Okayama等人.(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneoPoly-A，見Thomas等人.(1987)Cell 51503-512；以及桿狀病毒載體如pAC373或pAC610。
在優選的實施方案中，多肽或蛋白質穩定轉染入宿主細胞中。然而，本領域普通技術人員應當認識到，本發明可用于瞬時或穩定轉染哺乳動物細胞。
細胞本發明中可應用任何易于細胞培養及表達多肽的哺乳動物細胞或細胞類型。可用于本發明的哺乳動物細胞的非限制性實例，包括BALB/c小鼠骨髓瘤細胞系(NSO/l，ECACC No85110503)；人成視網膜細胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胎腎細胞系(亞克隆的293或293細胞用于在懸浮培養基中生長，Graham等人，J.Gen Virol.，3659(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠支持細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL 2)；狗腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞和人肝癌細胞系(Hep G2)。在特別優選的實施方案中，本發明用于培養和表達來自CHO細胞系的多肽及蛋白質。
此外，任意數目的商業和非商業可得的能表達多肽或蛋白質的雜交瘤細胞系可用于本發明。本領域技術人員應當知道，雜交瘤細胞系可能具有不同的營養要求，和/或可能需要不同的培養條件以達到最佳的生長和多肽或蛋白質的表達，并能按需改變條件。
如上所述，在許多情況下需要選擇或設計細胞以產生高水平的蛋白質或多肽。通常對細胞進行遺傳工程操作以產生高水平蛋白質，例如通過引入編碼目的蛋白質或多肽的基因，和/或通過引入調控編碼目的多肽的基因(內源性或引入的)表達的控制元件。
某些多肽可能對細胞生長、細胞存活力或某些其他細胞特征具有不良影響，從而最終在某些方面限制了目的多肽或蛋白質的產生。即使在經過遺傳工程改造以表達某一特定多肽的特定類型細胞群中，細胞群內部也存在差異，某些細胞個體生長更好和/或產生更多目的多肽。在本發明某些優選實施方案中，實施者經驗性選擇在選定的特定細胞培養條件下生長良好的細胞系。在特別優選的實施方案中，基于細胞生長、最終細胞密度、細胞存活力百分比、表達多肽的滴度或由這些或由實施者重視的其他條件的任意組合，選擇經改造表達特定多肽的個體細胞進行大規模生產。
細胞培養階段生產目的多肽的一般方法包括分批培養和補料分批培養。分批培養方法一般包括用特定細胞密度的種子培養物接種大規模生產培養物，使細胞在有利于細胞生長和存活力的條件下生長、當細胞達到特定細胞密度時收集培養物，并純化表達多肽。補料分批培養方法包括額外的步驟，即向分批培養物中補充營養素或其他細胞生長中消耗的成分。常規分批和補料分批培養中長期未決的問題，在于對細胞生長、存活力以及表達多肽產生有害的代謝廢物的產生。兩類特別有害的代謝廢物為乳酸鹽和銨鹽，分別為葡萄糖和谷氨酰胺代謝所產生。除谷氨酰胺代謝中酶促產生銨鹽外，細胞培養物中也會因為隨時間的非代謝降解蓄積銨鹽。本發明提供了大規模生產多肽的改良方法，能通過減緩甚至逆轉細胞培養物中這些廢物的蓄積，使銨鹽和乳酸鹽的不良影響最低化。本領域普通技術人員應當認識到本發明可用于任何細胞培養系統，包括但不僅限于分批、補料分批和灌流系統。在本發明的某些優選實施方案中，細胞生長于分批或補料分批系統。
培養基常規培養基配方，包括可購買培養基如Ham′s F10(Sigma)、極限必需培養基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s改良Eagle′s培養基([DMEM]，Sigma)，含有相對高水平的葡萄糖和與其他氨基酸相比而言相對高水平的谷氨酰胺。通常認為需要大量這些成分，因為它們是細胞的主要代謝能量來源。然而，這些營養物質的快速消耗導致了上述乳酸鹽和銨鹽的蓄積。此外，高初始水平的葡萄糖和谷氨酰胺以及隨后乳酸鹽和銨鹽的蓄積會導致高摩爾滲透壓濃度，后者本身往往就對細胞生長、細胞存活力和多肽的產生有害。
本發明提供了多種培養基配方，當與此處所述的其他培養步驟一同使用時，能最小化甚至逆轉乳酸鹽和銨鹽的蓄積。對細胞生長和/或存活力以及對多肽或蛋白質的表達有利的本發明培養基配方，包括以下一項或多項i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機離子與累積總氨基酸的比率為約0.4至1；或v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺濃度的組合累積量大于約16mM。本領域普通技術人員應當理解上文所用的“累積”，是指細胞培養過程中加入的特定成分或成分的總量，包括在培養起始時加入的成分和其后加入的成分。本領域的普通技術人員應當理解本發明的培養基配方包括限定和非限定培養基。
相對于本發明培養基配方，常規培養基配方起始時具有相對低水平的總氨基酸。例如，常規細胞培養基DME-F12(Dulbecco′s改良Eagle′s培養基與Ham′s F培養基12的50∶50混合物)中總氨基酸含量為7.29mM，而常規細胞培養基RPMI-1640的總氨基酸含量為6.44mM(見如H.J.Morton，In Vitro，689-108(1970)，R.G.Ham，Proc.Nat.Assoc.Sci.(USA)，53288-293(1965)，G.E.Moore等人，J.Am.Medical Assn.，199519-24(1967)，均在此處引用作為參考)。在某些本發明某些實施方案中，培養基中的氨基酸濃度優選大于約70mM。更優選本發明培養基配方中初始培養基含有氨基酸濃度大于約70mM。已經證實當初始培養基的氨基酸濃度在此范圍內時，培養物生長期間的細胞密度和滴度得以提高(見實施例13)。
此外，在本發明的某些實施方案中，培養基中的谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比比其他可購買或不可購買的培養基降低。優選培養基中的谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比小于約2。
此外，在本發明的某些實施方案中，培養基中的谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比比其他可購買或不可購買的培養基降低。優選培養基中的谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比小于約0.2。
如本發明中降低初始培養基中的谷氨酰胺與天冬酰胺或與總氨基酸濃度的摩爾比，得到的有趣而出人預料的結果是，除了觀察到銨鹽蓄積減少外，乳酸鹽蓄積也減少了。在某些實施方案中，銨鹽和乳酸鹽的蓄積水平不僅低于對照培養物的水平，實際上在初始蓄積后也降低了(例如，見實施例3和7)。
Boraston(美國專利號5,871,999)已公開了總無機離子與總氨基酸摩爾比為1至10的培養基。Boraston顯示，使用總無機離子與總氨基酸摩爾比位于此范圍內的培養基，該培養基中生長的CHO細胞聚集有所減少。在本發明的另一優選實施方案中，培養基中總無機離子與總氨基酸摩爾比進一步降低至約0.4至1。如實施例13所示，將該比例從1.75降至約0.7，使得培養物生長期間的細胞密度和表達的多肽或蛋白質的產生顯著增加。
在本發明的另一優選實施方案中，培養基含有谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度為約16至36mM。如實施例14、表22所示，含谷氨酰胺與天冬酰胺的組合總濃度位于此范圍內的培養基，相對于谷氨酰胺與天冬酰胺的組合總濃度在此范圍外的培養基，其表達多肽的滴度更高。本領域普通技術人員能夠選擇該范圍內恰當的谷氨酰胺與天冬酰胺組合濃度，從而優化細胞生長和/或存活力，并最大化表達多肽的產生。
此外，本領域普通技術人員應當認識到以上所列的任一種條件都可單獨使用或彼此多種組合使用。利用具有上述一種、幾種或所有特征的培養基配方，本領域普通技術人員能夠優化細胞生長和/或存活力，并最大化表達多肽的產生。
本發明中公開的任何培養基配方可任選于必要時添加激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質、蛋白質水解物或葡萄糖或其他能量來源。在本發明的某些實施方案中，向培養基中添加化學誘導劑如六亞甲基二乙酰胺(“HMBA”)和丁酸鈉(“NaB”)是有利的。可于培養起始加入這些任選添加劑，也可在稍后加入以補充消耗的營養或另作他用。本領域普通技術人員知道可加入公開培養基配方中的任何有利或必需的添加劑。
提供哺乳動物細胞培養物制備用于通過分批或補料分批培養生產蛋白質或多肽的哺乳動物細胞的多種方法為本領域公知。如上所述，可通過任意數目的公知技術將足以進行表達的核酸(一般為含有編碼目的多肽或蛋白質基因及任何有效連接的遺傳控制元件的載體)引入宿主細胞系內。一般而言，篩查細胞以確定哪些宿主細胞實際獲得了載體并表達目的多肽或蛋白質。檢測哺乳動物細胞表達的某一特定目的多肽或蛋白質的常規方法，包括但不僅限于免疫組化、免疫沉淀、流式細胞術、免疫熒光顯微術、SDS-PAGE、Western印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)技術、生物活性測定和親和層析。本領域普通技術人員將會知道檢測表達多肽或蛋白質的其他合適技術。如果多個宿主細胞表達目的多肽或蛋白質，可以使用某些或所有上述技術確定哪些細胞表達多肽或蛋白質的水平最高。
一旦表達目的多肽或蛋白質的細胞得以鑒定，通過任意的本領域普通技術人員公知的多種方法于培養物中增殖細胞。一般使細胞在有利于細胞存活、生長和存活力的溫度和培養基中生長，來增殖表達目的多肽和蛋白質的細胞。初始培養基體積可為任意大小，但通常小于最終生成目的多肽或蛋白質的生產生物反應器的培養基體積，且通常在將細胞接種于生產生物反應器前，使細胞在容積遞增的生物反應器傳代數次。攪拌或搖動細胞培養物以提高培養基的充氧程度和營養物質在細胞中的散布。備選地或額外地，可使用本領域公知的特殊噴射裝置提高和控制培養物的充氧程度。根據本發明，本領域的普通技術人員知道控制或調控某些生物反應器的內部條件是有利的，包括但不僅限于pH、溫度、充氧等。
生產生物反應器中的起始細胞密度可由本領域普通技術人員選定。根據本發明，生產生物反應器中的起始細胞密度可低至每單位培養物體積含一個細胞。在本發明優選實施方案中，生產生物反應器中的起始細胞密度可為約每毫升2×102個活細胞，至約每毫升2×103、2×104、2×105、2×106、5×106或10×106個活細胞及更高。
可使起始和中間細胞培養物生長至任何所需的密度，再接種下一中間或最終生產生物反應器。優選在接種前大部分細胞都存活，盡管具有完全存活力或近于完全的存活力并非必需。在本發明的某一實施方案中，可通過如低速離心將細胞從上清液中分離出來。也可以在接種下一生物反應器前用培養基洗滌取出的細胞，以除去任何不需要的代謝廢物或培養基成分。該培養基可為細胞之前生長的培養基，也可為由本發明實施者選擇的不同的培養基或洗滌溶液。
可將細胞稀釋至合適的密度以接種生產生物反應器。在本發明優選實施方案中，將細胞稀釋于生產生物反應器所用的相同培養基中。或者也可根據本發明實施者的需要或愿望，或為適應細胞本身的特定需求(例如在接種生產生物反應器前它們需短期貯存)，將細胞稀釋至另一培養基或溶液中。
起始生長階段一旦如上所述接種生產生物反應器，在有利于細胞培養物存活、生長和存活力的條件下將細胞培養物維持在起始生長階段。準確的條件將取決于細胞類型、獲取細胞的生物以及表達多肽或蛋白質的性質和特征而改變。
根據本發明，生產生物反應器可以為適合多肽或蛋白質大規模生產的任意容積。在優選實施方案中，生產生物反應器的容積為至少500升。在另一優選實施方案中，生產生物反應器的容積為1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更大，或其間的任意容積。本領域普通技術人員知道也能夠選擇合適的生物反應器用于實施本發明。該生產生物反應器可由有利于細胞生長和存活力、且不干擾產生的多肽或蛋白質的表達或穩定性的任意材料構成。
起始生長階段細胞培養物溫度的選擇主要是基于細胞培養物可保持存活力的溫度范圍。例如，在起始生長階段，CHO細胞在37℃生長良好。一般而言，大部分哺乳動物細胞在約25℃至42℃的范圍內生長良好。優選哺乳動物細胞在約35℃至40℃的范圍內生長良好。本領域普通技術人員能根據細胞的需求和實施者的生產要求，選擇細胞生長的合適溫度。
在本發明的某一實施方案中，將起始生長階段的溫度維持在單一、恒定的溫度。在另一實施方案中，將起始生長階段的溫度維持在一系列溫度范圍內。例如可在起始生長階段穩步提高或降低溫度。或者也可在起始生長階段的多個時間點不連續地提高或降低溫度。本領域普通技術人員能夠確定是否應當使用單一或多個溫度，以及該溫度是否應當穩步改變還是不連續地改變。
根據實施者的需要和細胞本身的需求，細胞在起始生長階段生長的時間可長可短。在一個實施方案中，使細胞生長足以達到活細胞密度的時間，所述活細胞密度為細胞在不受干擾時生長最終可達到的最大活細胞的給定百分比。例如，可使細胞生長一段時間，該時間內足以達到所需的活細胞密度，其為最大活細胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99。
在另一實施方案中使細胞生長指定的時間。例如，根據細胞培養物的起始濃度、細胞生長的溫度以及細胞的內在生長速率，可使細胞生長0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天時間。在某些情況下，可使細胞生長一個月或更長時間。如果細胞在起始生長階段的溫度下、接種生物反應器中的生長足以使接種時生產生物反應器中活細胞密度已經達到所需的最大活細胞密度百分比，則細胞可在生產生物反應器中生長0天。本發明實施者能夠根據多肽或蛋白質生產需求和細胞本身需求選擇起始生長階段的長度。
在起始培養期間可攪拌或搖動細胞培養物，以提高充氧和細胞中營養物質的分布。根據本發明，本領域普通技術人員應當知道，在起始生長階段控制或調控生物反應器的某些內部條件(包括但不僅限于pH、溫度、充氧等)是有利的。例如，可以通過供以適量的酸或堿控制pH，而可通過本領域公知的噴射裝置控制充氧。
改變培養條件根據本發明的教導，在起始生長階段終末期至少可以改變一種培養條件，以應用第二組培養條件并使培養物中發生代謝轉變。抑制性代謝物(最主要為乳酸鹽和氨)的蓄積會抑制生長。通過如改變細胞培養物的溫度、pH、重量摩爾滲透壓濃度或化學誘導物水平而完成的代謝轉變，其特征在于降低了特定乳酸鹽產生速率與特定葡萄糖消耗速率的比率。在非限制性實施方案中，通過轉變培養物的溫度轉變培養條件。然而，如本領域所公知，改變溫度不是完成合適代謝改變的唯一機制。例如，此類代謝轉變也可通過改變其他培養條件而完成，包括但不僅限于pH、重量摩爾滲透壓濃度或丁酸鈉水平。如上所述，培養物轉變的時間由本發明實施者根據多肽或蛋白質生產需要或細胞本身需求所確定。
當改變培養物溫度時，溫度的轉變可能相對漸變。例如，溫度改變的完成可能需要數小時至數天。或者溫度轉變可以相對突然。例如，溫度轉變可能在少于數小時內完成。利用適當的生產和控制設施(如商業大規模多肽或蛋白質生產中的標準設施)，溫度改變甚至可以在1小時以內完成。
隨后生長階段中細胞培養物的溫度的選擇，主要是基于細胞培養物保持存活力且能在商業滿足量水平上表達重組多肽或蛋白質的溫度范圍。一般而言，大多數哺乳動物細胞在約25℃至42℃的溫度范圍能保持存活力并且在商業滿足量水平上表達重組多肽或蛋白質。優選哺乳動物細胞在約25℃至35℃的溫度范圍保持存活力且能在商業滿足量水平上表達重組多肽或蛋白質。本領域普通技術人員能根據細胞需求和實施者的生產需要，選擇生長細胞的合適溫度。
在本發明的一個實施方案中，維持隨后生長階段的溫度為單一、恒定的溫度。在另一實施方案中，維持隨后生長階段的溫度在一系列溫度范圍內。例如可在隨后生長階段穩步提高或降低溫度。或者也可在隨后生長階段的多個時間點不連續地提高或降低溫度。本領域普通技術人員應當理解該實施方案中包括多個不連續的溫度轉換。例如，溫度可能轉變一次，細胞在該溫度或溫度范圍內維持一段時間，隨后可再次轉變溫度——至更高或更低溫度。每次不連續地轉變后，培養物溫度可為恒定，也可維持于某—溫度范圍內。
在實施例16中，顯示的數據證實應用兩次連續溫度改變的有效性，然而本領域普通技術人員應當理解，在本發明中可以使用3次或更多次連續的溫度改變提高細胞的存活力或密度和/或提高重組多肽或蛋白質的表達。每次連續溫度轉變后細胞培養物的溫度或溫度范圍可能高于或低于轉變前的溫度或溫度范圍。在本發明的優選實施方案中，每一連續的溫度或溫度范圍都低于前一溫度或溫度范圍。
后續生產階段根據本發明，一旦如上述轉變了細胞培養物條件，將細胞培養物維持于第二組培養條件的后續生產階段，所述培養條件有利于細胞培養物的存活和存活力，且適于所需多肽或蛋白質以商業滿足水平表達。
如上所述，可以通過改變數種培養條件中的一種或多種來轉變培養物，包括但不僅限于溫度、pH、重量摩爾滲透壓濃度和丁酸鈉水平。在一個實施方案中，轉變培養物的溫度。根據該實施方案，在后續生產階段，將培養物維持于低于起始生長階段溫度或溫度范圍的溫度或溫度范圍內。例如，在后續生產階段中，CHO細胞在25℃至35℃范圍內良好表達重組多肽或蛋白質。如上所述，可利用多重不連續的溫度轉變提高細胞密度或存活力，或提高重組多肽或蛋白質的表達。
根據本發明，可維持細胞于后續生產階段直至達到所需的細胞密度或生產滴度。在一個實施方案中，維持細胞于后續生產階段直至重組多肽或蛋白質的滴度達到最大。在其他實施方案中，可根據實施者的生產要求或細胞本身的需求，在此時間點前收集培養物。例如，可維持細胞一段時間，以足以達到活細胞密度為最大活細胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99。在某些情況下，使活細胞密度達到最大后再于收集培養物前使活細胞密度下降至某一水平可能是有利的。在極端實例中，在收集培養物前使活細胞密度接近或達到0可能有利。
在本發明的另一實施方案中，使細胞于后續生產階段中生長指定的時間。例如，根據細胞培養物在后續生產階段的起始濃度、細胞生長的溫度以及細胞的內在生長速率，可使細胞生長0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天時間。在某些情況下，可使細胞生長一個月或更長時間。本發明實施者能夠根據多肽或蛋白質生產需求和細胞本身需求選擇后續生長階段的長度。
在某些情況下，于后續生產階段中向細胞培養物中添加細胞消耗或代謝的營養物質或其他培養基成分，可能為有利或必要的。例如，向細胞培養物中添加在細胞培養物監測(見下文“監測培養條件”章節)中發現消耗的營養物質或其他培養基成分是有利的。備選地或額外地，在后續生產階段前補充細胞培養物也是有利或必要的。在非限制性實例中，向細胞培養物中添加激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質或葡萄糖或其他能量來源，是有利或必要的。
可將這些增補成分全部一次加入細胞培養物中，或可以系列添加提供給細胞培養物。在本發明的某一實施方案中，在多個時間點按比例量向細胞培養物中提供增補成分。在另一實施方案中，可于起始時僅提供某些增補成分，并于稍后提供其余成分。在本發明的另一實施方案中，以這些增補成分持續向細胞培養物補料。
根據本發明，最好應將向細胞培養物中添加的總量保持為最小。例如，向細胞培養物中添加的含有增補成分的培養基或溶液的總量可為提供增補成分之前細胞培養物體積的百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50。
在后續生產階段期間可攪拌或搖動細胞培養物，以提高充氧和細胞中營養物質的分散。根據本發明，本領域普通技術人員應當知道，在后續生長階段控制或調控生物反應器的某些內部條件(包括但不僅限于pH、溫度、充氧等)是有利的。例如，可以通過供以適量的酸或堿控制pH，而可通過本領域公知的噴射裝置控制充氧。
監測培養條件在本發明的某些實施方案中，實施者會發現周期性監測生長的細胞培養的具體條件是有利或必要的。監測細胞培養條件使得實施者能確定細胞培養物是否在次佳水平上生產重組多肽或蛋白質，或培養物將進入次佳生產階段。為監測某些細胞培養條件，有必要取出少量等份的培養物進行分析。本領域普通技術人員應當理解此類取出有可能會向細胞培養物中引入污染，并會適度注意以最小化此類污染的風險。
作為非限制性實例，監測溫度、pH、細胞密度、細胞存活力、綜合活細胞密度、乳酸鹽水平、銨鹽水平、摩爾滲透壓濃度或表達多肽或蛋白質的滴度，是有利或必要的。本領域公知有多種技術可使本領域普通技術人員測量這些條件。例如，可以利用血細胞計數儀、Coulter計數器或細胞密度檢查(CEDEX)測量細胞密度。可以通過臺盼藍染色培養物樣本確定活細胞密度。由于只有死細胞才攝取臺盼藍，通過計量細胞總數、用攝取染料的細胞數目除以細胞總數，取剩余值即可確定活細胞密度。可以利用HPLC確定乳酸鹽、銨鹽或表達多肽或蛋白質的水平。或者，也可利用標準分子生物學技術例如SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色、Western印跡、Bradford測定、勞里測定、雙縮脲測定和UV吸收確定表達多肽或蛋白質的水平。監測表達多肽或蛋白質的翻譯后修飾(包括磷酸化和糖基化)也是有利或必要的。
表達多肽的分離一般而言，一般優選分離和/或純化本發明中表達的蛋白質或多肽。在優選實施方案中，表達多肽或蛋白質分泌于培養基中，因此通過如離心或過濾去除細胞和其他固體是純化過程的第一步。該實施方案在用于本發明時特別有用，因為此處描述的方法和組合物使細胞存活力增加。結果在培養過程中死亡的細胞減少，且釋放入培養基中能潛在降低表達多肽或蛋白質產量的蛋白水解酶減少。
或者可將表達的多肽或蛋白質結合于宿主細胞的表面。在該實施方案中，去除培養基，并裂解表達多肽或蛋白質的宿主細胞作為純化過程中的第一步。可以通過本領域普通技術人員已知的任意方法裂解哺乳動物宿主細胞，包括利用玻璃珠物理破壞，以及暴露于高pH值條件。
可以通過標準方法分離和純化多肽或蛋白質，包括但不限于色譜法(例如離子交換、親和力、尺寸排阻和羥基磷灰石層析)、凝膠過濾、離心或差異溶解度、乙醇沉淀或任何其他可用的純化蛋白質技術(見如Scopes，Protein Purification Principles and Practice第二版，Springer-Verlag，NewYork，1987；Higgins，S.J.和Hames，B.D.(編輯)，Protein ExpressionAPractical Approach，Oxford Univ Press，1999；以及Deutscher，M.P.，Simon，M.I.，Abelson，J.N.(編輯)，Guide to Protein PurificationMethods inEnzymology(Methods in Enzymology Series，Vol 182)，Academic Press，1997，均在此處引用作為參考)。具體對于免疫親和層析而言，通過將蛋白質結合于含有抗體的親和柱可以分離蛋白質，所述抗體為針對該蛋白質所產生并固定于固態支持物上。或者可利用標準重組技術將親和標記如流感外殼序列、多聚組氨酸、谷胱甘肽-S-轉移酶連接于蛋白質，以使得可通過合適的親和柱進行簡單純化。可在任意或所有階段加入蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑或抑酶肽，以減少或消除純化過程中多肽或蛋白質的降解。當必須裂解細胞以分離和純化表達多肽或蛋白質時，尤其需要蛋白酶抑制劑。本領域普通技術人員應當認識到根據待純化多肽或蛋白質的特性、表達多肽或蛋白質的細胞特性，以及細胞生長的培養基組成，具體純化技術有所不同。
藥物配方在本發明的某些優選實施方案中，生產的多肽或蛋白質具有藥理學活性并可用于藥物制備。上述的發明組合物可施用于受試者或可先配制以通過任何可用的途徑遞送，所述途徑包括但不限于胃腸道外(如靜脈內)、皮內、皮下、口服、經鼻、經氣管、經眼(opthalmic)、經皮(局部)、經粘膜、經直腸以及經陰道途徑。發明性藥物組合物一般包括表達自哺乳動物細胞系的純化的多肽或蛋白質、遞送物質(即陽離子聚合物、肽分子轉運蛋白、表面活性物質等，如上文所述)，與可藥用載體的組合。此處所用的詞語“可藥用載體”包括溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等與藥物施用相容的物質。組合物中也可含有增補的活性化合物。
配制藥物組合物以使之與其預期的施用途徑相容。應用于胃腸道外、皮內或皮下的溶液或懸浮液包括以下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及調節張力物質如氯化鈉或右旋糖。可用酸或堿(如鹽酸或氫氧化鈉)調節pH。可包裝胃腸道外制品于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多劑小瓶。
適于注射用的藥物組合物一般包括無菌水溶液(其中可溶于水)或分散體，以及無菌散劑，用以制備無菌注射溶液或分散系的臨時制品。可用于經靜脈施用的合適載體包括生理鹽水、制菌水、聚氧乙烯醚(CremophorELTM)(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物都必須無菌且為可易于注射的液態。優選的藥物制劑在生產和貯存條件下穩定，且必須貯存以避免微生物如細菌和真菌的污染作用。一般而言，相關載體可為溶劑或分散介質，其中含有如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液態聚乙二醇等)及其合適混合物。通過如利用如卵磷脂包衣、維持分散系中所需顆粒的尺寸以及通過利用表面活性劑，能夠維持適當的流動性。可利用多種抗細菌和抗真菌劑來防止微生物作用，例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，優選向組合物中加入等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。可以通過向組合物中加入延遲吸收的物質如單硬脂酸鋁和明膠，延長注射組合物的吸收。
根據需求，向含有上述成分的一種或數種組合的合適溶劑中摻入所需量的純化多肽或蛋白質，然后過濾滅菌，可制備無菌注射用溶液。一般而言，向含有基礎分散介質以及所需上述列舉中的其他成分的無菌載體中摻入純化的哺乳動物細胞系表達的多肽或蛋白質，可制備分散系。對于用于制備無菌注射溶液的無菌散劑而言，優選制備方法為真空干燥以及冷凍干燥，可產生具有活性成分以及來自以前無菌過濾溶液的任意其他所需成分的散劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。為進行口服治療施用，可將純化多肽或蛋白質混合于賦形劑，并以片劑、錠劑或膠囊如明膠膠囊的形式使用。也可利用液態載體制備口服組合物，用如漱口液。藥物相容性粘合劑和/或佐劑材料可作為組合物的組成部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有任意以下成分，或具有相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或增味劑如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或桔子香精。口服遞送制劑可以有利地摻入能提高胃腸道內穩定性和/或增強吸收的物質。
為吸入施用，優選從含有合適推進劑(如氣體如二氧化碳)或霧化器的加壓容器或分散器以氣溶膠噴霧的形式遞送含有表達自哺乳動物細胞系的純化的多肽或蛋白質和遞送劑的本發明組合物。本發明特別涉及利用鼻噴霧、吸入或其他直接遞送方式將組合物遞送至上和/或下呼吸道。經鼻施用針對流感病毒的DNA疫苗已經顯示能夠引發CD8 T細胞應答，提示至少呼吸道內的某些細胞能攝取經此途徑遞送的DNA，且本發明的遞送劑會增強細胞攝取。根據本發明某些實施方案，含有表達自哺乳動物細胞系的純化多肽和遞送劑的組合物，被配制為大的多孔顆粒用于氣溶膠施用。
也可通過經粘膜或經皮方法全身施用。為進行經粘膜或經皮施用，制劑中使用適合于待穿透屏障的滲透劑。此類滲透劑一般為本領域公知，包括如用于經粘膜施用的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜施用可通過使用鼻噴霧或栓劑而實現。對于經皮施用而言，將純化的多肽或蛋白質以及遞送劑配制為本領域公知的軟膏、油膏、凝膠或霜劑中。
組合物也可制備為栓劑(例如使用如可可油或其他甘油酯的常規栓劑基質)或用于直腸遞送的留置灌腸劑形式。
在一個實施方案中，制備的組合物中含有可保護多肽或蛋白質以避免體內迅速消除的載體，例如控釋制劑(包括埋植和微囊遞送系統)。可使用生物可降解的和生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的方法對于本領域技術人員而言顯而易見。這些材料也可購自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂質體懸浮液(包括含有針對病毒抗原單克隆抗體的靶定感染細胞的脂質體)也可用作可藥用載體。這些均可根據本領域技術人員已知的方法制備，例如美國專利號4,522,811中所述。
最好可將口服或胃腸道外組合物配制為單劑形式以便于劑量的使用和均一性。此處所用的單劑形式是指適合待治療受試者的單位劑量的物理分離單位；其中每一單位含有經計算能與所需藥物載體一同產生所需治療效果的預定量的活性多肽或蛋白質。
根據本發明表達的多肽或蛋白質可按需以多個間隔、持續不同時期施用，例如每周一次，持續約1至10周、2至8周、約3至7周、約4、5或6周等。技術人員認識到某些因素會影響有效治療受試者所需的劑量和時間選擇，包括但不僅限于疾病或紊亂的嚴重性、既往治療、受試者的一般健康狀況和/或年齡，以及存在的其他疾病。一般而言，用此處所述的多肽或蛋白質治療受試者可包括單次治療，或在多種情況下可包括一系列治療。進一步認識到合適的劑量將取決于多肽或蛋白質的效力，且可任選根據具體受者調整，例如通過施用遞增的劑量直至出現預選的期望反應。對于任何具體動物受試者的特定劑量水平可能取決于多種因素，包括所用特定多肽或蛋白質的活性、受試者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食、施用時間、施用途徑、排泄速率、任何藥物組合以及被調節的表達水平或活性。
本發明包括利用發明組合物治療非人類動物。因此，可根據已知的獸醫藥理學和醫學原則選擇施用的劑量和方法。指南可見于如Adams，R.(編輯)，Veterinary Pharmacology and Therapeutics，第8版，Iowa StateUniversity Press；ISBN0813817439；2001。
發明藥物組合物可與施用說明一起含于容器、包裹或分散器中。
應該理解，前述說明僅為代表而非限制。實施本發明的其他方法和材料以及額外的應用對于本領域技術人員而言顯而易見，并包括于所附權利要求中。
實施例實施例1用于抗GDF-8補料分批方法的增強型培養基1常規用于細胞系培養的補料分批方法有一些缺點，包括補料所必需的時間及精力，以及大規模生物反應器所需要的特別設施。本實施例的目的是開發一種需要最小補料的在大規模生物反應器中生產目的蛋白質的分批培養基。
材料與方法株系和培養基設計中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表達針對生長分化因子8的單克隆抗體(抗GDF-8細胞)(見Veldman等人，Neutralizing AntibodiesAgainst GDF-8 and Uses Therefor，US20040142382 A1)。抗GDF-8細胞用于測試新的分批培養基。比較培養基1和培養基2支持高細胞密度和存活力的能力。表1中列出了這些培養基和培養基3的成分。加入除FeSO4·7H2O以外的所有成分配制培養基。然后將培養基調節至pH 7.25，記錄摩爾滲透壓濃度，然后加入FeSO4·7H2O。
培養條件對于燒瓶實驗，使抗GDF-8細胞在振蕩的燒瓶中生長并傳代三次。對于生物反應器實驗，抗GDF-8細胞在培養基中生長12天，第5天后每日補充2％體積的20×培養基4的補料培養基(表3)或3％體積的16×培養基4(表4)。對于頭4天而言，于37℃培養細胞。在第5天時將細胞移至31℃。
樣品分析每天從培養物中取出樣品，分析氨基酸、維生素、鐵、磷酸鹽、葡萄糖和谷氨酰胺的水平。
表1.培養基1、培養基2和培養基3的成分
結果與結論圖1顯示，在燒瓶實驗中，抗GDF-8細胞在培養基1和培養基2中的生長速率相似。
圖2顯示生物反應器中，培養基1的最終細胞密度和存活度相對于培養基3顯著增加。最終滴度也顯著增加，從平臺過程的551mg/L到培養基1的976mg/L(數據未示)。第5天時將溫度由37℃變為31℃。由于未預料的高速細胞生長，在第5天后每日向培養物加入2％體積的20×培養基4或3％體積的16×培養基4。因此，這并非初始計劃的真正分批實驗。從第10天開始向補料培養基中補充天冬酰胺和硫胺素。
開發濃縮分批培養基時需要考慮幾個可能的問題。第一，濃縮的營養物可能對細胞有毒。本實施例開發的培養基中，已確認所有營養物和成分都在毒性限度下(數據未示)。
第二，濃縮的分批培養基的摩爾滲透壓濃度必定高于非濃縮培養基，會對細胞生長和存活力產生有害影響。可以通過降低起始培養基中的NaCl含量來解決這一問題。此外，濃縮分批培養基含有的葡萄糖水平不足以維持整個培養時期的生長。因此在第5天后，每天向培養物中補充葡萄糖補料。
第三，胰島素和谷氨酰胺容易在12天培養期間降解。因此，除葡萄糖之外還要向培養物補充這些成分。
最后，鐵在高pH值會從含高濃度磷酸鹽的溶液中沉淀出來。在培養基制備過程的最后，即pH值已調節至合適水平后，再加入鐵，可以解決這一問題。
實施例2補料分批方法中抗GDF-8細胞的濃縮補料培養基(培養基5)的開發實施例1開發了用培養基1培養抗GDF-8細胞的分批方法。由于此過程中產生了較高細胞密度，認為補充除葡萄糖和谷氨酰胺以外的營養物仍然是有利的。然而，向分批培養基中添加8×補料培養基4會導致培養物的過度稀釋。為克服這一問題，開發了一種更為濃縮的補料培養基。
材料、方法與結果表2列出了用于表3-7的配方的培養基4A-1、培養基4B、微量元素B和微量元素D的成分。
表2.用于表3-7配方的培養基4A-1、培養基4B、微量元素B和微量元素D成分。
1.20×培養基4第一種開發的濃縮培養基是20×培養基4。表3中提供了20×培養基4的配方。
表3.20×補料培養基4的工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
該培養基配方由3個部分組成I、II、III。部分I為含有除葉酸以外培養基4B各個成分(考慮到該維生素的溶解性)的濃縮形式的8×培養基4。部分II為鐵貯存液、微量元素D和酸性半胱氨酸，以避免加入部分I中可能出現的鐵沉淀。部分III是葉酸貯存液。從第5天開始，每日添加2％體積的部分I，而部分II和部分III則在第5天時與部分I一同添加一次。
調節補料培養基的最終pH值為7.0，摩爾滲透壓濃度約為1064mOsm。2％的補料將導致培養物的葡萄糖升高2g/L，谷胺酰胺升高2mM以及摩爾滲透壓濃度升高14mOsm。
2.16×培養基4為減少摩爾滲透壓濃度的升高，補料培養基從20×培養基4(每日加入2％體積)變為16×培養基4(每日加入3％體積)。16×培養基4的配方見表4。
表4.16×培養基4補料培養基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
在此改良的16×培養基4中，也除去葡萄糖以進一步降低摩爾滲透壓濃度并賦予葡萄糖補料的機動性。補料培養基的總摩爾滲透壓濃度現在為295mOsm。
3.16×培養基4對16×培養基4的配方進行改變。向補料培養基中加入鐵貯存液使每次補料增加0.45μM。此外，又加回葡萄糖使每次補料增加1.5g/L。改良的16×培養基4的培養基配方見表5。
表5.16×培養基4補料培養基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
4.16×培養基4此處，制備補料培養基(16×培養基4)為混合培養基，代替最近幾批中3種獨立的補料。測試以確保葉酸可以以所需濃度溶解，且在4℃或室溫存貯6天后，無論鐵還是葉酸都不會從溶液中沉淀。組合16×培養基4的培養基配方見表6。
表6.16×培養基4的補料培養基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松，1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
該培養基的最終摩爾滲透壓濃度為724mOsm，每日加入2g/L葡萄糖和1.5mM的谷氨酰胺。
5.12X培養基4此處，對補料培養基進行幾處改進。采用培養基4B粉末代替加入培養基4B中的各單獨成分。將培養基4B粉末與葡萄糖混合，并通過滴定調節溶液pH為10.25，在堿性條件下分別溶解之。由于氨基酸和維生素分析結果顯示，天冬酰胺和硫胺素在補料分批方法的最后已經耗盡，因此還要加入額外的這兩種成分。使用12X培養基4進一步降低了向培養物補料時摩爾滲透壓濃度的升高。12X培養基4的培養基配方見表7。
表7.12X培養基4的補料培養基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松，1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
最終的摩爾滲透壓濃度為566mOsm。每日加入4％體積補料使摩爾滲透壓濃度提高約8.6，葡萄糖提高2g/L，谷氨酰胺提高1.5mM。12X培養基4配方即為培養基5。培養基5相對于20X培養基4或16X培養基4更易配制，且在室溫或4℃貯存10天以上保持穩定(數據未示)。
實施例3培養抗GDF-8細胞的谷氨酰胺饑餓的補料分批方法在起始培養基中CHO細胞需要谷氨酰胺才能存活。初始谷氨酰胺水平通常較高，且在第5天后每日都補料直至補料分批法結束。常規補料分批方法通常會造成細胞培養物中高水平的乳酸鹽和銨鹽，已知這會抑制細胞生長、細胞密度和重組蛋白質的表達。緩慢將葡萄糖加入培養物的補料分批方法，能夠減少乳酸鹽產生，并提高細胞生長、細胞密度和重組蛋白質的表達。然而，操作葡萄糖加入的該領域現有方法并不適用于大規模生產。此處，通過采用含有較低起始水平谷氨酰胺的培養基并從補料中除去谷氨酰胺，顯示出能產生較低水平的銨鹽和乳酸鹽，從而增強細胞存活力。此外，谷氨酰胺饑餓的培養物中重組蛋白質的表達提高，且最終的摩爾滲透壓濃度降低。
材料與方法株系和培養基以補料分批方式，于1L生物反應器中的培養基1中培養抗GDF-8細胞。
培養條件在1L生物反應器中使細胞生長12天。根據細胞生長狀況，在第4或第5天將溫度從37℃調為31℃。測試了三種補料分批方法正常(對照)方法、無谷氨酰胺補料方法和谷氨酰胺饑餓方法。這些方法的相關細節如表8和表9所列。
表8.在1L生物反應器中無谷氨酰胺補料方法的補料分批方法
表9.在1L生物反應器中谷氨酰胺饑餓方法的補料分批方法
樣品分析每日從培養物中取出樣品，并分析細胞密度、細胞存活力、乳酸鹽、谷氨酰胺和銨鹽水平。每日也測定表達的抗GDF-8抗體滴度。
結果與結論圖3顯示了在無谷氨酰胺補料或對照補料分批條件下生長的培養物的細胞密度。這兩種情況下，實驗過程中的細胞密度相近。
圖4顯示了在無谷氨酰胺補料或對照補料分批條件下生長的培養物的細胞存活力百分數。從第6天起到實驗結束，無谷氨酰胺補料的培養物的細胞存活度明顯增加。
圖5顯示了在無谷氨酰胺補料或對照補料分批條件下生長的培養物的銨鹽水平。從第4天起到實驗結束，無谷氨酰胺補料的培養物的銨鹽水平明顯降低。
圖6顯示了在無谷氨酰胺補料或對照補料分批條件下生長的培養物的乳酸鹽水平。整個實驗過程中，無谷氨酰胺補料的培養物中乳酸鹽水平較低。
圖7顯示了在無谷氨酰胺補料或對照補料分批條件下生長的培養物中的抗GDF-8抗體滴度。無谷氨酰胺補料的培養物中最終的抗GDF-8抗體滴度較高。
圖8顯示了在谷氨酰胺饑餓或對照補料分批條件下生長的培養物的細胞密度。在這兩種情況下，實驗過程中的細胞密度相似。
圖9顯示了在谷氨酰胺饑餓或對照補料分批條件下生長的培養物的細胞存活力。在這兩種情況下，實驗過程中細胞的存活力相似。
圖10顯示了在谷氨酰胺饑餓或對照補料分批條件下生長的培養物的銨鹽水平。在實驗過程中谷氨酰胺饑餓培養物的銨鹽水平明顯降低。
圖11顯示了在谷氨酰胺饑餓或對照補料分批條件下生長的培養物的乳酸鹽水平。從第4天起到實驗結束，谷氨酰胺饑餓培養物的乳酸鹽水平明顯降低。
圖12顯示了在谷氨酰胺饑餓或對照補料分批條件下生長的培養物的抗GDF-8抗體滴度。谷氨酰胺饑餓的培養物中的最終抗-GDF-8抗體滴度較高。
綜合這些結果提示，谷氨酰胺水平的降低通過減少銨鹽產生量、提高細胞存活力、并增加表達的抗GDF-8抗體滴度，而對細胞培養物有利。此外，谷氨酰胺饑餓培養物中觀測到低乳酸鹽水平，可能是葡萄糖的消耗速率降低所致。降低的銨鹽和乳酸鹽水平也對減少總摩爾滲透壓濃度有效。已知摩爾滲透壓濃度的升高對細胞生長和存活有抑制作用。低起始水平谷氨酰胺加上除去谷氨酰胺的補料，對減少在貯存培養基中非酶解的谷氨酰胺降解導致的銨鹽產生，也具有正面效果。在補料中除去谷氨酰胺也簡化了抗GDF-8細胞的培養流程。
實施例4.培養基1和培養基2中抗GDF-8細胞的鐵劑量應答培養基1的營養成分比培養基2濃很多。為避免在細胞培養過程中的缺鐵問題，確定培養基1中細胞生長最佳的鐵水平。
材料與方法將抗GDF-8細胞在含有培養基1或培養基2的平皿上培養一代。通過加入不同量的鐵貯存溶液，操控這些培養基中的鐵濃度。用CEDEX測定最終細胞密度。
結果與結論圖13顯示了在含有不同鐵濃度的培養基1和培養基2中，抗GDF-8細胞的鐵劑量應答。在培養基2中，鐵濃度在3μM至15μM間時細胞密度相對恒定。在培養基1中，細胞密度隨著鐵濃度增加，但在約5μM時達到最大。這種差異可能是由于培養基1中高濃度的營養物含量可能降低了細胞對鐵的利用度(鐵在培養基中被鰲合所致)。這些結果提示應保持鐵水平大于5μM，以避免在培養基1中鐵缺乏的問題。
實施例5.在生物反應器方法中用谷氨酸替代谷氨酰胺進行三個實驗，測試在抗Lewis Y細胞培養過程中，用谷氨酸替代谷氨酰胺的效果。
材料與方法于10L生物反應器中進行這些實驗，pH 7.1、30％溶解氧、起始溫度為37℃，且在第5天變為31℃。噴射和頂部氣體為88％的混合氣體(93％空氣/7％CO2)和12％氧氣。所有實驗中起始培養基均為含谷氨酰胺的培養基1。補料培養基和補料方案，包括補充的葡萄糖和谷氨酰胺補料見表10。標記“谷氨酸”的欄以改良的培養基5補料，所述改良的培養基5不含谷氨酰胺，但含有與標準培養基5中等摩爾濃度的谷氨酸。標記谷氨酰胺的欄以標準培養基5補料。
表10.補料方案
結果與結論如圖14所示，每一實驗中的細胞密度相似。由于實驗第3天的pH值偏離至約6.7，谷氨酰胺2和谷氨酸2實驗中的細胞密度較低。由于在第6天補入29％的培養基，導致谷氨酰胺3和谷氨酸3實驗在第6天和第7天之間細胞密度下降。
圖15顯示了在谷氨酸和谷氨酰胺補料培養物中的細胞存活力。在含有谷氨酸補料培養物的生物反應器中細胞的存活力在后半程中維持較高。
在實驗1中，谷氨酸和谷氨酰胺補料培養物中的抗Lewis Y滴度相似。圖16顯示了在實驗2和3中，谷氨酰胺補料反應器中的抗Lewis Y滴度較低。觀察到的這些反應器中較低的抗Lewis Y滴度，可能是由于產生了高水平的乳酸鹽，如圖17所示。
含有谷氨酸的補料培養基的生物反應器中銨鹽濃度(圖18)和摩爾滲透壓濃度(圖19)較低。
利用結合ELISA測定檢測谷氨酰胺1和谷氨酸1實驗中樣品的活性。其活性相似谷氨酰胺1樣品為參照的110％，而谷氨酸1樣品為參照的122％(數據未示)。
在這些實驗中用谷氨酸代替谷氨酰胺，對于細胞密度沒有明顯影響。但是，細胞存活力在以谷氨酰胺補料的生物反應器中較低。以谷氨酸補料的生物反應器相對于以谷氨酰胺補料者，其中銨鹽、乳酸鹽和摩爾滲透壓濃度較低。平均而言，以谷氨酸補料的生物反應器中抗Lewis Y滴度較高，而在兩種條件下活性基本相同。
實施例6.抗Lewis Y細胞培養過程中葡萄糖和谷氨酰胺的替換本實驗的目的在于，測試在培養抗Lewis Y細胞時以下表11列出的補料培養基的葡萄糖和谷氨酰胺進行替換的效果(見Bogheart等人，Antibody-targeted chemotherapy with the calicheamicin conjugatehu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisyand eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografts，Clin.Can.Res.104538-49(2004))。測定細胞密度、細胞存活力、抗Lewis Y滴度和銨鹽水平。
材料與方法于250ml搖瓶中進行本實驗，起始體積75ml。所有搖瓶中都以0.25×106細胞/ml接種培養基2。于37℃含7％CO2的溫箱里溫育這些搖瓶14天。在第3天和第4天，向搖瓶中補入5％體積的補料培養基6。表11中列出了培養基6的成分。在第5-13天，向搖瓶中補入5％體積的表12中列出的補料溶液之一。每個條件進行一式兩份重復。每日取樣品用CEDEX進行細胞計數，并檢測銨鹽、葡萄糖和乳酸鹽。
表11.培養基6的組成
表12.第5-13天的補料。不含葡萄糖和谷氨酰胺的改良培養基6。
結果與結論補料培養基中存在葡萄糖或半乳糖時，用谷氨酸或甘氨酰谷氨酰胺替代谷氨酰胺，細胞密度最高。一般在以葡萄糖/谷氨酰胺、半乳糖/谷氨酰胺、或僅葡萄糖為補料的培養物中細胞密度較低(圖20)。最終存活力在僅補料葡萄糖的培養物中最高，其次是以葡萄糖/谷氨酸補料的培養物。在補入與葡萄糖或半乳糖組合的谷氨酰胺或天冬酰胺的培養物中存活力最低(圖21)。
葡萄糖/甘氨酰谷氨酰胺和葡萄糖/谷氨酸補料培養物中，第14天的滴度最高，約為700μg/ml。在半乳糖/甘氨酰谷氨酰胺和半乳糖/天冬酰胺補料的培養物中滴度最低，約為500μg/ml。在葡萄糖/谷氨酰胺對照中滴度約為570μg/ml(圖22)。
在以葡萄糖/谷氨酸補料或僅以葡萄糖補料的搖瓶中銨鹽水平最低。半乳糖/谷氨酸、葡萄糖/谷氨酰胺、葡萄糖/甘氨酰谷氨酰胺和葡萄糖/天冬酰胺補料的搖瓶中銨鹽水平居中。以半乳糖/天冬酰胺、半乳糖/甘氨酰谷氨酰胺、和半乳糖/谷氨酰胺補料的搖瓶中銨鹽水平最高(圖23)。
直至第11天，所有補入半乳糖的搖瓶中葡萄糖水平均高于1g/L。從第11天到第14天，這些培養物中的葡萄糖從未被完全耗盡，保持在0.6-1g/L之間，在不同培養物之間無明顯差異。
直至第10天，以葡萄糖補料或與另一底物組合的葡萄糖補料的所有搖瓶中的葡萄糖水平均在增加。從第10天到第14天，這些培養物中的葡萄糖水平相當恒定，且彼此類似。第14天時，在葡萄糖/谷氨酰胺補料培養物中還剩約8.4g/L葡萄糖，而在僅葡萄糖補料的培養物中，葡萄糖約為10.8g/L。
所有細胞的條件都相同時，乳酸鹽水平在第5天達到最高約2.4g/L，至第14天時所有培養物中均下降至接近零。葡萄糖/谷氨酰胺對照中的乳酸鹽水平從第10天至第14天最高，但在此期間低于1g/L(數據未示)。
該實驗中測試的所有條件都導致細胞密度高于葡萄糖/谷氨酰胺對照條件。除半乳糖/天冬酰胺條件外，所有測試條件都導致最終存活力高于葡萄糖/谷氨酰胺對照條件或半乳糖/谷氨酰胺補料條件。葡萄糖/谷氨酰胺對照中的滴度約為570μg/ml，相比而言，葡萄糖/甘氨酰谷氨酰胺補料條件和葡萄糖/谷氨酸補料條件的滴度較高，約為700μg/ml。
實施例7.對用谷氨酰胺饑餓的分批方法生產抗GDF-8的評估一般的補料分批生產方法需要在培養期間多步補料。這些補料旨在取代培養基中可能被細胞消耗或可能在分批(培養)過程中降解的營養物質。當此方法擴大用于較大反應器時，這些補料可能會使情況復雜化，如需要葉輪竄動(見圖24)。此外，這些補料稀釋了已分泌到培養物中的抗GDF-8的量，從而影響收集滴度。使用分批方法，可以用全部體積而非部分體積的生物反應器來接種以容納補料，從而不必使用葉輪竄動，并大幅減少對生產率的任何稀釋作用。
谷氨酰胺是采用補料分批方法的最重要的原因之一，因為它在37℃不穩定，且被認為需要在分批培養過程中進行補充。然而測試谷氨酰胺饑餓策略的實施例2、5和6的結果顯示，相對于與谷氨酰胺補料的對照反應器，生產率明顯提高。將本結果與分批方法組合，產生了本實施例測試的谷氨酰胺饑餓的分批方法。
材料與方法根據以下四個生長條件，使抗GDF-8細胞在1L生物反應器中生長12天。設置所有條件下的生物反應器參數都相同。利用空氣噴射維持溶解氧不低于23％的空氣飽和度，通過加入含有0.58M碳酸氫鈉和0.71M碳酸鈉的溶液，維持pH值為7.00。在前4天分批培養時所有培養物的溫度都維持在37℃。分批培養的第4天，將所有生物反應器的溫度降為31℃，且整個分批培養期間維持此溫度。分別在第5、7和10天向對照培養物和補料分批培養物加入占總反應器體積8％、12％和8％的相應補料培養基。
1)對照.
-在培養基7上接種(見表13)。
-第5、7、10天時加入培養基8(見表13)。
-第4天時加入5mM谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
2)谷氨酰胺饑餓的分批補料-在僅含4mM谷氨酰胺的培養基7上接種(見表13)。
-第5、7、10天時加入不含谷氨酰胺的培養基8(見表13)。
-第4天不添加谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
3)分批谷氨酰胺饑餓-在僅含4mM谷氨酰胺的新分批培養基上接種(見表13)。
-無補料培養基。
-不添加谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
-第8天時加入5g/L葡萄糖。
4)在第8天補充的分批谷氨酰胺饑餓-在僅含4mM谷氨酰胺的新分批培養基上接種(見表13)。
-無補料培養基。
-不添加谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
-第8天時加入4g葡萄糖、375mg天冬酰胺、1mM FeSO4貯存溶液3mL、5g/L NucellinTM溶液3.33mL、36mg/L氫化可的松2.57mL和1.0g/L腐胺貯存溶液、50mg/L亞硒酸鈉貯存溶液0.23mL，以及13.1mg的硫胺素。
表13.所用培養基的成分
結果與結論對照和分批方法中前4天的細胞生長相似，而谷氨酰胺饑餓的分批補料方法中細胞密度稍低，并且在其后的分批過程中保持稍低。兩種分批方法在分批期間都維持了較高的細胞密度，可能是由于不存在任何明顯的稀釋作用(見圖25)。直到第8天，所有培養物的存活力相同。然而有意思的是，未補充的分批方法在第11天時的存活力低于其它三個生物反應器，且至最后一天時顯著偏低。這提示還能最優化分批培養基，因為補充的分批方法具有和補料分批的生物反應器相同的存活力(見圖26)。
谷氨酰胺饑餓的分批方法或谷氨酰胺饑餓的補料分批方法中培養的細胞，生產率都比在對照補料分批方法培養的相同細胞要高。對照補料分批方法的日收集滴度如預期為685μg/mL，而谷氨酰胺饑餓的補料分批方法的日收集滴度為1080μg/mL，比對照高出約58％。這與前面所見到的結果類似。谷氨酰胺饑餓的非補充分批方法的日收集滴度為960μg/mL，比對照高40％，與谷氨酰胺饑餓的補料分批方法相似，而補充的谷氨酰胺饑餓的分批方法具有最高滴度1296μg/mL。比對照高出89％(見圖27)。
分析四種條件下抑制劑的水平，結果顯示所有三種谷氨酰胺饑餓的方法中，乳酸鹽和銨鹽水平都明顯低于對照。事實上，這三個條件在第4天后都不再產生或者開始消耗乳酸鹽，而對照還在分批過程中繼續產生乳酸(見圖28)。如預期的那樣，谷氨酰胺饑餓方法中的銨鹽水平低得多并在4天后下降，而對照則持續產生銨鹽(見圖29)。
本實施例中，將谷氨酰胺饑餓的策略與分批方法相結合，可使抗GDF-8細胞生產率比對照的補料分批方法提高40％。數據也提示，對分批培養基做一些優化，可以獲得幾乎2倍提高的生產率。生產率的提高可以歸于兩個因素。第一，谷氨酰胺饑餓可直接或通過控制銨鹽和乳酸鹽于低水平而提高生產率。第二，由于缺乏補料，分批過程中的滴度沒有被稀釋。生產率的提高以及分批過程本身的易于操作，使其成為生產重組多肽的有利選擇。
實施例8.抗GDF-8細胞培養過程中，分批培養基中谷氨酰胺和天冬酰胺濃度的效果在實施例2、5和6中，已經證實谷氨酰胺的饑餓對于兩種細胞系的補料分批培養有益，包括促進細胞生長、細胞存活力和滴度，以及降低乳酸鹽和銨鹽的產生。天冬酰胺似乎也在分批培養基中發揮作用。
材料與方法在1L生物反應器中含不同濃度谷氨酰胺和天冬酰胺的改良培養基9內培養抗GDF-8細胞。表14列出了培養基9的基本成分。表15列出了這些基本成分的實驗變量。除了4號反應器的溫度在第一天因溫度控制問題為30℃外，前5天在37℃溫育培養物。第6天時將培養物變至31℃。第7天時，向培養物中一次補加5％體積的不含谷氨酰胺的培養基5。每日測定培養物的細胞密度、抗GDF-8滴度、乳酸鹽和銨鹽水平。
表14.培養基9的成分
表15.測試的谷氨酰胺和天冬酰胺條件
結果與結論圖30、31、32和33分別顯示了在多種實驗條件下，整個實驗過程中抗GDF-8細胞的細胞生長、抗GDF-8滴度、乳酸鹽水平和銨鹽水平。
在所有實驗條件中，所有測試的天冬酰胺水平下，4mM谷氨酰胺都優于1mM谷氨酰胺。谷氨酰胺水平相當時，12mM和20mM天冬酰胺條件優于8mM的天冬酰胺條件。在培養終末期，可見所有測試條件下乳酸鹽和NH4水平都降低。
實施例9.分批培養基中谷氨酰胺和天冬酰胺的濃度對抗GDF-8細胞培養方法的作用實施例8證實了無論天冬酰胺的水平如何，谷氨酰胺初始濃度為4mM的培養基9優于含谷氨酰胺1mM的培養基。本實施例說明了含13mM谷氨酰胺和不同水平天冬酰胺的培養基的效果。
材料與方法如表16中所列，于1L生物反應器含不同濃度的谷氨酰胺和天冬酰胺的改良培養基9中，培養抗GDF-8細胞12天。最初3天在37℃溫育培養物。然后第4天將培養物變為31℃。第7天時向培養物中一次補加5％體積的不含谷氨酰胺的培養基5。定期測量培養物的細胞密度、細胞存活力、乳酸鹽、銨鹽水平和谷氨酰胺水平、抗GDF-8滴度和摩爾滲透壓濃度。
表16.測試的谷氨酰胺和天冬酰胺條件
結果與結論圖34、35、36、37、38、39和40分別顯示了在多種實驗條件下，整個實驗期間抗GDF-8細胞的細胞生長、抗GDF-8細胞的存活力百分比、乳酸鹽水平、銨鹽水平、谷氨酰胺水平、抗GDF-8滴度和摩爾滲透壓濃度。
在所有測試的條件下，只有含13mM谷氨酰胺和20mM天冬酰胺的培養基9，對細胞生長和滴度具有顯著的負作用。無論培養物起始谷氨酰胺是4mM還是13mM，所有培養物中的谷氨酰胺都約同時耗盡。含13mM谷氨酰胺和12mM天冬酰胺的培養物中抗GDF-8的滴度最高。所有培養條件下，培養末期的乳酸鹽和銨鹽水平都降低。含有13mM谷氨酰胺和20mM天冬酰胺的培養物中的銨鹽水平最高。
實施例10.天冬酰胺和半胱氨酸的水平對在培養基9中培養的抗GDF-8細胞中觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平降低的影響實施例2、5和6中，發現在谷氨酰胺饑餓條件下生長的培養物，培養末期乳酸鹽和銨鹽的水平降低。但在非谷氨酰胺饑餓條件生長于培養基9的培養物，在培養過程末期仍然有乳酸鹽和銨鹽水平的降低。在其他培養基如培養基1中沒有觀察到這一效應，似乎谷氨酰胺饑餓對于乳酸和銨鹽水平的降低是必需的。培養基9和培養基1的天冬酰胺(培養基9為20mM，而培養基1含補料共計為11mM)和酸性胱氨酸(培養基9為1.5mM，而培養基1為0.95mM)的水平不同。本實施例測試了這兩種成分是否與在培養末期觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平的降低有關。
材料與方法將抗GDF-8細胞在1L生物反應器中培養12天。最初在37℃培養細胞，第4天或第5天在8-10×106/ml時變為31℃。表17列出了測試的多種實驗條件。每日取出樣本，留作蛋白質A HPLC滴度分析。
表17.測試的天冬酰胺和半胱氨酸條件
注培養基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養基5.
結果與結論無論培養物中的起始谷氨酰胺濃度是4mM或13mM，培養基9中生長的抗GDF-8細胞在培養過程末期的乳酸鹽和銨鹽的水平都有降低(見圖42和圖43)。與之相反，僅當培養物中起始谷氨酰胺為4mM時，培養基1才在培養過程末期出現乳酸鹽和銨鹽水平的降低(見圖42和圖43)。向培養基1中添加額外的天冬酰胺和半胱氨酸，不會造成培養末期乳酸鹽和銨鹽水平的降低(見圖42和圖43)。
在培養過程末期出現乳酸鹽和銨鹽水平降低的培養物(含4mM谷氨酰胺的培養基1，含4mM谷氨酰胺的培養基9和含13mM谷氨酰胺的培養基9)，在培養過程末期也具有較低的總摩爾滲透壓濃度(見圖47)。
含4mM谷氨酰胺的培養基9抗GDF-8滴度最高，其次為在第4天加入13mM谷氨酰胺的培養基9(見圖46)。考慮到補料的稀釋效應，含4mM谷氨酰胺的培養基9與含有13mM谷氨酰胺的培養基9具有相同的抗GDF-8滴度。
實施例11.氨基酸和維生素水平對培養基9培養的抗GDF-8細胞中觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平下降的影響實施例10測試了培養基1和培養基9間天冬酰胺和半胱氨酸水平的差別是否造成了非谷氨酰胺饑餓的培養基9在培養過程末期乳酸鹽和銨鹽水平的降低。已經確定這些因素并不會造成所觀測的降低。培養基1和培養基9的氨基酸和維生素濃度也有差異。本實施例測試了這兩種培養基間氨基酸和維生素濃度的差別是否造成了觀察到的降低。
材料與方法將抗GDF-8細胞在1L生物反應器中培養12天。最初在37℃培養細胞，第4天在8-10×106細胞/ml時變為31℃。表18列出了測試的多種實驗條件。在多種實驗條件下的培養基1中添加氨基酸、維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E(表19列出的成分)和鐵，使這些成分的水平與培養基9中相同。每日取出樣本，留作蛋白質A HPLC滴度分析。
表18.測試的氨基酸和維生素條件
注AA＝氨基酸，H/P＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺、E微量元素E。
表19.微量元素E的成分
結果與結論除了含有添加氨基酸的培養基1，所有測試條件都出現了培養過程末期乳酸鹽和銨鹽水平的降低，說明與培養基1相比，培養基9中升高的氨基酸水平可能不是造成乳酸鹽和銨鹽水平下降的原因(見圖49和50)。然而，含有添加維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E和鐵的培養基1，相對于含有添加了氨基酸的培養基1，培養過程末期乳酸鹽和銨鹽水平更低(見圖49和50)。說明這些成分可能造成了培養基9中觀察到的降低。
在含有添加維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E和鐵的培養基1中生長的培養物，在實驗過程中的銨鹽水平最低，因為在初始培養基中天冬酰胺和谷氨酰胺的總量較低(見圖50)。
實施例12.維生素、微量元素E和鐵水平對培養基9中培養的抗GDF-8細胞中觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平下降的影響實施例11確定了培養基9中相對培養基1升高的維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E和鐵可能造成了培養過程末期觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平的降低。此處，對這些成分進行獨立和組合測試，以確定哪個或哪些成分導致了觀察到的降低。
材料與方法將抗GDF-8細胞在1L生物反應器中培養12天。細胞最初培養于37℃，并于第4天8-10×106細胞/ml時變為31℃(除了含有微量E元素的培養基1，其在第4天6×106細胞/ml時改變)。表20列出了測試的多種實驗條件。在所有實驗條件的培養基1中添加氫化可的松和腐胺，使得這些成分的水平與培養基9中相同。向多種實驗條件的培養基1中添加維生素、微量元素E(表19列出的成分)和鐵，使得這些成分的水平與培養基9中相同。每日取出樣本，留作蛋白質A HPLC滴度分析。
表20.測試的氨基酸和維生素條件
注E微量元素E。
結果與結論在所有測試的條件下，只有含有13mM谷氨酰胺的培養基9和含有微量元素E的培養基1，在培養過程末期乳酸鹽和銨鹽水平降低(見圖54和圖55)。應當注意的是，含有微量元素E的培養基1中觀察到的水平降低實際上可能是由于溫度改變時該培養物的細胞為6×106細胞/ml。
含有13mM谷氨酰胺的培養基9的抗GDF-8滴度比任何配方的培養基1都高。
實施例13.培養基1、3和9在細胞生長和抗GDF-8滴度方面的比較進行本實驗測量培養基1、3和9在細胞生長和抗GDF-8滴度方面的差異。
材料與方法在如表21所列的不同培養基和補料條件下培養抗GDF-8細胞。表22列出了相關培養基信息。在1L生物反應器中培養細胞12天，第4天時將其從37℃轉變至31℃。
表21.測試的培養基和補料條件
注培養基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養基5表22.培養基概述
注培養基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養基5結果與結論培養基9中培養的抗GDF-8細胞的細胞密度和抗GDF-8滴度最高，而培養基3中培養的抗GDF-8細胞的細胞密度和抗GDF-8滴度最低(見圖57和圖58)。培養基9比培養基1的結果更好，提示在起始培養基中提供培養基成分優于通過多步補料提供。此外，培養基1和培養基9優于培養基3，提示提供氨基酸濃度高于約70mM產生的效果優于提供氨基酸濃度低于約70mM。最后，在起始培養基中提供氨基酸濃度高于約70mM，能產生最高的細胞密度和滴度(對比培養基9和培養基1)。
實施例14.用于生物反應器中培養抗GDF-8細胞的培養基9的最佳谷氨酰胺和天冬氨酰總水平的統計分析材料與方法使抗GDF-8細胞生長于1L生物反應器，并于表23中所述的天數時將其從37℃變為31℃。對最終滴度進行T檢驗，以確定僅谷氨酰胺的最佳水平和谷氨酰胺與天冬酰胺組合的最佳總水平。表23總結了在培養基9中生長的抗GDF-8細胞的一些相關實驗條件和最終結果。
表23.培養基9中生長的抗-GDF-8細胞的相關實驗條件和最終結果
注培養基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養基5結果與結論圖59顯示了僅谷氨酰胺和谷氨酰胺與天冬酰胺總組合的多種水平下的外推抗GDF-8滴度。表24為比較谷氨酰胺水平為2至15mM間以及此范圍外的標準化滴度的T檢驗結果。表25為比較組合谷氨酰胺和天冬酰胺水平為16至36mM之間以及此范圍外的標準化滴度的T檢驗結果。
兩次T檢驗結果均顯示，比較的兩組間抗GDF-8滴度存在顯著差異。在含2-15mM濃度的谷氨酰胺且16-36mM濃度的組合谷氨酰胺和天冬酰胺的培養基9中生長的培養物，相對于在含谷氨酰胺及組合谷氨酰胺和天冬酰胺水平在此范圍外培養基中生長的培養物，抗GDF-8滴度較高。在所有實驗中天冬酰胺的水平都高于9mM。
表24.比較2mM＜Gln＜15mM和Gln＞15mM、Gln＜2mM條件下標準化滴度的T檢驗結果
表25.比較16mM＜Gln+Asn＜36mM和Gln+Asn＞36mM、Gln+Asn＜16mM條件下標準化滴度的T檢驗結果
實施例15.培養基對細胞培養的影響該實施例研究了在中等規模下，用高密度接種培養的三種細胞培養基變量的表現。基于小規模的生物反應器數據，預期所有測試培養基都比1期培養基(添加了11號補料培養基的培養基10)有所改進。
材料與方法如表26所示，在不同的培養基中測試表達人源化抗Aβ肽IgG1單克隆抗體的CHO細胞(“抗Aβ細胞”)(見Basi等人，Humanized Antibodiesthat Recognize Beta Amyloid Peptide，WO02/46237)。pH值的低端設置點為7.0，除1期中由含0.58M碳酸氫鈉和0.71M碳酸鈉控制外，均通過0.95M Na2CO3和0.05M K2CO3控制。根據需要利用空氣噴射控制溶解氧為30％；以60rpm攪拌，補料培養基為培養基5(如所示，含或不含谷氨酰胺)。所有培養物都以130L的規模生長，僅03P49B501以500L規模生長。簡言之，培養基1富集了各種營養物質而不考慮相對吸收率，而培養基12從不加選擇的富集形式中去除了顯然為非必需的營養物而達到平衡。
表27列出了培養基10、11和12的成分。
表26.初步試驗的起始培養基、補料量和接種來源
*1期過程中添加不如培養基5富集的培養基12。
表27.培養基10、11和12的成分
結果與結論培養基的改變引發了實驗過程中的穩步改善。就細胞生長、存活力、乳酸鹽水平的降低、銨鹽水平的降低和滴度而言，谷氨酰胺水平低的培養基優于升高者(見圖60-64)，而平衡型(分批)的培養基優于富集型培養基(培養基1，見圖60-64)。高密度接種物起始的培養物相對于低密度接種物起始的培養物，最終滴度更高(見圖64)。
和小規模生物反應器中觀察到的不同，第一種培養基(含高谷氨酰胺的培養基1)產生的滴度比原始過程低(見圖64)。改變溫度后乳酸鹽的攝取也不變(見圖62)。這提示該培養基可能具有規模敏感性。與這些中等規模實驗同時進行的小規模(2L)平行實驗支持該結論(數據未示)。至少在這些實驗中，其后含有較少谷氨酰胺的培養基配方對規模不敏感(見圖60-65)。一式兩份重復的這些過程(分批2和3，以及分批5和6)顯示了良好的試驗重復性(見圖60-65)，提高了該實驗收集的數據的可靠性。
實施例16.用培養基9生產TNFR-Ig材料與方法將表達二聚體融合蛋白的CHO細胞(“TNFR-Ig細胞”)，從灌流式生物反應器中以高密度接種至培養基9，并稀釋至3×106活細胞/ml，用于生產生物反應器步驟；所述融合蛋白由人75千道爾頓(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)胞外配基結合部分連接至IgG1的Fc部分組成。
結果與結論圖66、67、68、69、70、71和72分別顯示了細胞生長、細胞存活力、殘留葡萄糖、谷氨酰胺水平、乳酸鹽濃度、銨鹽濃度和相對產物滴度。對該過程進行較小修飾的范圍內，所有條件都能得到較好的細胞生長、高細胞存活力和高最終總滴度。
對于本實驗的所有條件，抑制性代謝副產物乳酸鹽或被消耗，或濃度穩定，提示乳酸鹽產生受抑。與之類似，抑制性代謝產物銨鹽起初水平上升，但溫度改變后一段時間，銨鹽開始被細胞消耗。在本實施例中，使TNFR-Ig細胞培養物置于化學誘導物丁酸鈉和HMBA中。
實施例17.大規模和小規模培養條件的比較材料與方法為確定培養物的規模是否影響相關的培養物特性，使抗GDF-8細胞在小規模1升生物反應器或大規模6000升生物反應器中生長。細胞在37℃生長并在第4天變為31℃。
結果與結論如圖73、74、75和76所示(分別顯示了細胞密度、滴度、乳酸鹽水平和銨鹽水平)，這些特性在6000升大規模和1升小規模培養之間沒有相應差異。第4天改變溫度后，乳酸鹽和銨鹽水平都開始下降。該實施例證實，當培養物在相同的生長條件下時，培養物的規模并不影響細胞密度、細胞存活力、乳酸鹽水平和銨鹽水平。
權利要求
1.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及含有谷氨酰胺的培養基，其具有選自以下的培養基特征及其組合(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
2.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM的培養基且所述培養基含有谷氨酰胺；且所述培養基具有選自以下的兩項培養基特征及其組合(i)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
3.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2的培養基；且所述培養基含有谷氨酰胺；且所述培養基具有選自以下的兩項培養基特征及其組合(i)每單位體積培養基中含有累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
4.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2的培養基；且所述培養基含有谷氨酰胺；且所述培養基具有選自以下的兩項培養基特征及其組合(i)每單位體積培養基中含有累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
5.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1的培養基，且所述培養基含有谷氨酰胺；且所述培養基具有選自以下的兩項培養基特征及其組合(i)每單位體積培養基中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
6.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM的培養基；且所述培養基含有谷氨酰胺；且所述培養基具有選自以下的兩項培養基特征及其組合(i)每單位體積培養基中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
7.權利要求1的方法，其中所述改變至少一個培養條件步驟中的所述細胞培養條件選自(i)溫度，(ii)pH，(iii)重量摩爾滲透壓濃度，(iv)化學誘導物水平，及其組合。
8.權利要求1的方法，其中所述培養基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于13mM。
9.權利要求1的方法，其中所述培養基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于10mM。
10.權利要求1的方法，其中所述培養基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于7mM。
11.權利要求1的方法，其中所述培養基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于4mM。
12.權利要求1的方法，其中所述培養基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于13mM。
13.權利要求1的方法，其中所述培養基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于10mM。
14.權利要求1的方法，其中所述培養基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于7mM。
15.權利要求1的方法，其中所述培養基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于4mM。
16.權利要求1的方法，其中僅在細胞培養初始向起始培養基提供谷氨酰胺。
17.權利要求1的方法，其中培養基中可溶性鐵的濃度大于5μM。
18.權利要求1的方法，其中周期性測量所述培養物中的活細胞密度。
19.權利要求1的方法，其中周期性測量所述培養物的存活力。
20.權利要求1的方法，其中周期性測量所述培養物中的乳酸鹽水平。
21.權利要求1的方法，其中周期性測量所述培養物中的銨鹽水平。
22.權利要求1的方法，其中周期性測量所述培養物的滴度。
23.權利要求1的方法，其中周期性測量所述培養物的摩爾滲透壓濃度。
24.權利要求18-23的方法，其中所述測量每日進行。
25.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為2×102細胞/mL。
26.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為2×103細胞/mL。
27.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為2×104細胞/mL。
28.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為2×105細胞/mL。
29.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為2×106細胞/mL。
30.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為5×106細胞/mL。
31.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物細胞的起始密度至少為10×106細胞/mL。
32.權利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約1000L培養物。
33.權利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約2500L培養物。
34.權利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約5000L培養物。
35.權利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約8000L培養物。
36.權利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約10,000L培養物。
37.權利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約12,000L培養物。
38.權利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為30至42攝氏度的第一溫度范圍。
39.權利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為32至40攝氏度的第一溫度范圍。
40.權利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為34至38攝氏度的第一溫度范圍。
41.權利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為36至37攝氏度的第一溫度范圍。
42.權利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為37攝氏度的第一溫度范圍。
43.權利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為25至41攝氏度的第二溫度范圍。
44.權利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為27至38攝氏度的第二溫度范圍。
45.權利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為29至35攝氏度的第二溫度范圍。
46.權利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為29至33攝氏度的第二溫度范圍。
47.權利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為30至32攝氏度的第二溫度范圍。
48.權利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為31攝氏度的第二溫度范圍。
49.權利要求1的方法，還包括繼第一次改變至少一個培養條件后的第二次改變步驟，包括改變至少一個培養條件，從而向培養物應用第三組條件。
50.權利要求49的方法，其中第二次改變步驟包括改變選自以下的至少一個培養條件及其組合(i)溫度，(ii)pH，(iii)重量摩爾滲透壓濃度，(iv)化學誘導物水平。
51.權利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為25至40攝氏度的第三溫度范圍。
52.權利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為27至37攝氏度的第三溫度范圍。
53.權利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為29至34攝氏度的第三溫度范圍。
54.權利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為30至32攝氏度的第三溫度范圍。
55.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為0-8天。
56.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為1-7天。
57.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為2-6天。
58.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為3-5天。
59.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為約4天。
60.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為約5天。
61.權利要求1的方法，其中所述第一段時間為約6天。
62.權利要求1的方法，其中所述第一段時間和所述第二段時間的總長度為至少5天。
63.權利要求1的方法，其中在維持所述培養物的第二段時間的步驟中，乳酸鹽水平繼培養物中乳酸鹽水平達到最大水平后下降。
64.權利要求1的方法，其中在維持所述培養物的第二段時間的步驟中，銨鹽水平繼培養物中銨鹽水平達到最大水平后下降。
65.權利要求1的方法，其中所述產生多肽的總量比在除了缺少所述培養基特征外的相同培養基相同條件下生產多肽總量高至少1.5倍。
66.權利要求1的方法，其中所述產生多肽的總量比在除了缺少所述培養基特征外的相同培養基相同條件下生產多肽總量高至少2倍。
67.權利要求1的方法，其中還向所述細胞培養物提供增補成分。
68.權利要求67的方法，其中所述增補成分于多個時間間隔加入。
69.權利要求67的方法，其中所述增補成分選自激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質或葡萄糖或其他能源。
70.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養基，且該培養基具有至少兩項選自以下的培養基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
71.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養基，且該培養基具有至少三項選自以下的培養基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
72.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養基，且該培養基具有至少四項選自以下的培養基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
73.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養基，其特征在于(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
74.在大規模生產細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟提供細胞培養物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細胞培養條件下表達的哺乳動物細胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養基，且其每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養物在起始生長階段的第一組培養條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細胞增殖至活細胞密度達到所述培養物在此第一組培養條件下可達到的最大可能活細胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養條件，從而應用第二組培養條件；將所述培養物在第二組培養條件下維持第二段時間，使多肽在細胞培養物中累積。
75.權利要求1的方法，其中所述培養基包括含有谷氨酰胺的培養基，且該培養基具有選自以下的培養基特征及其組合(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)起始谷氨酰胺與起始天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)起始谷氨酰胺與起始總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)起始無機離子與起始總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合起始濃度大于約16mM。
76.權利要求1-6或70-75中任一項的方法，其中乳酸鹽水平低于除了缺少所述培養基特征外的相同培養基相同條件下的觀測水平；銨鹽水平低于除了缺少所述培養基特征外的相同培養基相同條件下的觀測水平；且產生多肽的總量至少與除了缺少所述培養基特征外的相同培養基相同條件下所觀測的一樣高。
77.權利要求1的方法，其中在生產所述多肽的過程中不向所述培養物中添加額外成分。
78.權利要求1的方法，其中在生產所述多肽的過程中不向所述培養物中添加額外的谷氨酰胺。
79.權利要求1的方法，其中在轉變為第二組培養條件的所述步驟前，所述培養物中谷氨酰胺濃度基本耗盡。
80.權利要求1的方法，其中大約在轉變為第二組培養條件的所述步驟的同時，所述培養物中谷氨酰胺濃度基本耗盡。
81.權利要求1的方法，其中用甘氨酰谷氨酰胺替代所述培養物中的谷氨酰胺。
82.權利要求1的方法，其中所述培養基含有(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM。
83.權利要求1的方法，其中所述培養基含有(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM。
84.權利要求1的方法，其中每單位體積所述培養基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的累積總量大于約25mM。
85.權利要求1的方法，其中每單位體積所述培養基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的累積總量大于約35mM。
86.權利要求1的方法，其中每單位體積所述培養基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的起始總量大于約25mM。
87.權利要求1的方法，其中每單位體積所述培養基內組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的起始總量大于約35mM。
88.權利要求1的方法，其中所述培養基具有選自以下的培養基特征(i)每單位體積中組氨酸累積總量大于約1.7mM；(ii)每單位體積中異亮氨酸累積總量大于約3.5mM；(iii)每單位體積中亮氨酸累積總量大于約5.5mM；(iv)每單位體積中甲硫氨酸累積總量大于約2.0mM；(v)每單位體積中苯丙氨酸累積總量大于約2.5mM；(vi)每單位體積中脯氨酸累積總量大于約2.5mM；(vii)每單位體積中色氨酸累積總量大于約1.0mM；(viii)每單位體積中酪氨酸累積總量大于約2.0mM；和(ix)每單位體積中脯氨酸累積總量大于約2.5mM。
89.權利要求1的方法，其中所述培養基具有選自以下的培養基特征(i)每單位體積中組氨酸起始量大于約1.7mM；(ii)每單位體積中異亮氨酸起始量大于約3.5mM；(iii)每單位體積中亮氨酸起始量大于約5.5mM；(iv)每單位體積中甲硫氨酸起始量大于約2.0mM；(v)每單位體積中苯丙氨酸起始量大于約2.5mM；(vi)每單位體積中脯氨酸起始量大于約2.5mM；(vii)每單位體積中色氨酸起始量大于約1.0mM；(viii)每單位體積中酪氨酸起始量大于約2.0mM；和(ix)每單位體積中脯氨酸起始量大于約2.5mM。
90.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積絲氨酸累積總量大于約7mM。
91.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積絲氨酸累積總量大于約10mM。
92.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積天冬酰胺累積總量大于約8mM。
93.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積天冬酰胺累積總量大于約12mM。
94.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積天冬酰胺起始總量大于約8mM。
95.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積天冬酰胺起始總量大于約12mM。
96.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積磷的累積總量大于約2.5mM。
97.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積磷的累積總量大于約5mM。
98.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積谷氨酸的累積總量小于約1mM。
99.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積泛酸鈣的累積總量大于約8mg/L。
100.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積泛酸鈣的累積總量大于約20mg/L。
101.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積煙酰胺的累積總量大于約7mg/L。
102.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積煙酰胺的累積總量大于約25mg/L。
103.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累積總量大于約5mg/L。
104.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累積總量大于約35mg/L。
105.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積核黃素的累積總量大于約1.0mg/L。
106.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積核黃素的累積總量大于約2.0mg/L。
107.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積鹽酸硫胺素的累積總量大于約7mg/L。
108.權利要求1的方法，其中所述培養基中每單位體積鹽酸硫胺素的累積總量大于約35mg/L。
109.權利要求1-23或權利要求25-75或權利要求77-108中任一項的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
110.權利要求1-23或權利要求25-75或權利要求77-108中任一項的方法，其中所述多肽為抗LewY。
111.權利要求24的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
112.權利要求24的方法，其中所述多肽為抗LewY。
113.權利要求76的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
114.權利要求76的方法，其中所述多肽為抗LewY。
全文摘要
(本發明)提供在細胞培養物中大規模生產蛋白質和/或多肽的改良系統，特別是在具有下列一項或多項特征的培養基中i)累積氨基酸濃度大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1；或v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積濃度在約16mM和36mM之間。此類系統的應用使能夠產生高水平的蛋白質，并減少某些不良因子如銨鹽和/或乳酸鹽的蓄積。此外，(本發明)還提供了包括溫度改變的培養方法，通常包括當培養物達到其最大細胞密度約20－80％時降低溫度。備選地或額外地，本發明提供了使培養物中乳酸鹽和/或銨鹽水平達到峰值后降低的方法。
文檔編號C07K16/30GK101048511SQ200580036899
公開日2007年10月3日 申請日期2005年8月26日 優先權日2004年8月27日
發明者D·德拉波, Y-T·盧安, J·R·梅瑟, W·王, D·拉斯科 申請人:惠氏研究愛爾蘭有限公司