專利名稱：亞磷酰胺化合物及低聚核糖核酸的制備方法
技術領域：
本發明涉及在2’位羥基導入了新的保護基的新的亞磷酰胺(phosphora-midite)化合物及該保護基的導入試劑。
背景技術：
低聚核糖核酸(低聚RNA)作為基因解析的RNA探針、RNA藥物原材料(反義RNA、核酶、利用了RNAi的基因表達控制)、人工酶、適體有用。
低聚RNA的固相合成法的確立在1980年代的后半期。最初報道的是使用以叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、三異丙基硅烷基(TIPS)為2’位羥基的保護基的亞磷酰胺化合物的RNA固相合成法(非專利文獻1)。
低聚RNA的化學合成與僅由脫氧核糖核酸(DNA)構成低聚脫氧核糖核酸(低聚DNA)的情況相比，存在較多需注意的問題。
首先，作為2’位羥基的保護基采用TBDMS基時，例如，將3’位羥基亞磷酰胺化時，會引發保護2’位羥基的TBDMS基轉移至3’位的副反應。
另外，如果使用像TBDMS基那樣的空間位阻大的取代基作為2’位羥基的保護基，則結合于3’位的磷原子的周圍的空間擁塞，因此生成核苷酸間連鍵的縮合反應的速度下降，低聚物化后，在除去2’位羥基的保護基時，會引發核苷酸間連鍵的切斷或重排反應。
為了解決上述問題，目前進行著以實施更有效的低聚RNA合成為目的的研究。
已知在脫去保護3’位和5’位的雙硅保護基的條件(中性條件)下，作為2’位羥基的保護基的1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)與雙硅保護基同時脫去(非專利文獻2)。基于這一情況，和田等發現在2’位羥基導入了中性條件下可脫保護的CEE基的亞磷酰胺化合物可作為用于制備低聚RNA的化合物使用(非專利文獻3、非專利文獻4)。
但是，在2’位羥基導入CEE基會生成新的不對稱中心，因此2’位羥基得到了保護的低聚RNA會轉變為非對映異構體混合物。所以，低聚RNA的制備過程中的精制和分離操作會變得復雜。另外，由于與2’位氧原子結合的碳上取代有甲基，因此考慮到結合于3’位羥基的磷原子的周圍的空間位阻，可能會出現縮合效率下降及縮合反應速度減慢的情況。
非專利文獻1N.A.Usman等，Journal American Chemical Society，Vol.109，7845(1987)非專利文獻2Wolfgang Pfleiderer等，Helvetica Chimica Acta，Vol.81，1545(1998)非專利文獻3和田猛，BIO INDUSTRY，Vol.21，No.1，17(2004)非專利文獻4T.Umemoto等，Tetrahedron Letters，Vol.45，9529(2004)發明的揭示本發明的目的主要是實現簡便且高收率的低聚RNA的合成法，提供有用的新的亞磷酰胺化合物。此外，還提供可在2’位羥基導入中性條件下易脫離的保護基的新的醚化合物。
本發明者進行認真研究的結果是，找到了可實現上述目的的化合物，從而完成了本發明。
I.本發明的亞磷酰胺化合物本發明可例舉以下的通式(1)表示的亞磷酰胺化合物(以下稱為“本發明的亞磷酰胺化合物”)， 式中，Bx表示可具有保護基的核酸堿基(nucleobase)，R1表示以下的通式(2)表示的取代基，
式中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，R2a、R2b相同或不同，表示烷基或R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成5～6元飽和氨基環基，該飽和氨基環基除氮原子以外還可具有1個氧原子或硫原子作為成環原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電性基團。
Bx所表示的核酸堿基只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，例如可例舉腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或它們的修飾體。
核酸堿基的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的化合物。
作為Bx的修飾體中的取代基，例如可例舉鹵素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，修飾體可以被1～3個上述取代基取代。
Bx所表示的核酸堿基可被保護，其中，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等具有氨基的核酸堿基中的氨基最好被保護起來。所述氨基的保護基，只要是可作為核酸的保護基使用的基團即可，無特別限定，具體例如可例舉苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、異丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-異丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亞甲基。
R2所表示的飽和氨基環基例如可例舉吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、嗎啉-1-基或硫代嗎啉-1-基。
WG1、WG2所表示的吸電性基團例如可例舉氰基、硝基、烷基磺酰基、鹵素，其中優選氰基。
本發明的亞磷酰胺化合物中的鹵素例如可例舉氟、氯、溴、碘。
本發明的亞磷酰胺化合物中的酰基例如可例舉直鏈狀或支鏈狀的碳數1～6的烷酰基、碳數7～13的芳酰基。具體例如可例舉甲酰基、乙酰基、正丙酰基、異丙酰基、正丁酰基、異丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基萘甲酰基、乙酰丙酰基。
本發明的亞磷酰胺化合物中的烷基例如可例舉直鏈狀或支鏈狀的碳數1～5的烷基。具體例如可例舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基。該烷基可被取代，所述取代基例如可例舉鹵素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，可以被1～3個上述取代基取代。
本發明的亞磷酰胺化合物中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基及烷基磺酰基中的烷基部分可例舉與前述烷基同樣的基團。
本發明的亞磷酰胺化合物中的烷氧基例如可例舉直鏈狀或支鏈狀的碳數1～4的烷氧基。具體可例舉甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中，優選碳數1～3的烷氧基，尤其好的是甲氧基。
本發明的亞磷酰胺化合物中的烷氧基烷基的烷氧基部分可例舉與前述烷氧基同樣的基團。
本發明的亞磷酰胺化合物中的芳烷基的芳基例如可例舉碳數6～12的芳基。具體例如可例舉苯基、1-萘基、2-萘基、聯苯基。該芳基可被取代，所述取代基例如可例舉鹵素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，可被1～3個上述取代基取代。
作為本發明的亞磷酰胺化合物中的烷基、芳基的取代基的鹵素、烷基及烷氧基，可分別例舉與前述同樣的基團。
本發明的亞磷酰胺化合物可作為制備低聚RNA的試劑使用。
本發明的亞磷酰胺化合物是2’位羥基具有中性條件下脫離的醚型保護基的亞磷酰胺化合物。此外，由于被導入2’位羥基的基團是直線狀的取代基，結合于3’位羥基的磷原子的周圍的空間不擁塞，所以與以往所用的亞磷酰胺化合物相比，具有合成低聚RNA時可在非常短的時間內實施縮合反應且縮合收率良好的特點。通過使用本發明的亞磷酰胺化合物，能夠采用與低聚RNA的制備幾乎同樣的方法制備高純度的低聚RNA。
本發明中的低聚DNA是指僅由脫氧核糖核酸(DNA)構成的低聚核酸。此外，本發明的低聚RNA是指由核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)構成的低聚核酸，其中至少含有1個核糖核酸(RNA)。
作為本發明的亞磷酰胺化合物的具體例，可例舉以下的1.～5.的化合物。
1.N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)2.N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)3.N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)4.N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)5.5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)附圖的簡單說明
圖1表示通過反相HPLC分析獲得的色譜圖。圖中，縱軸表示時間(分鐘)，橫軸表示吸收強度。
實施發明的最佳方式II.本發明的亞磷酰胺化合物的制法本發明的亞磷酰胺化合物可按照以下步驟制得。
以下所示的制法中，原料具有影響反應的取代基(例如，羥基、氨基、羧基)時，一般預先按照公知的方法用適當的保護基對原料進行保護后再實施反應。保護基可在反應后采用催化還原、堿處理、酸處理等公知方法脫去。
本發明的亞磷酰胺化合物可由公知化合物或易制備的中間體，通過實施例如以下的步驟a～步驟h的操作制得。
以下進行詳細說明。
(1)步驟a通過使烷基化試劑作用于以下的通式(14)表示的核苷衍生物，制備在2’位羥基導入中性條件下脫離的醚型保護基的下述通式(15)、(15’)表示的核苷衍生物的步驟。
式中，Bx、R1、WG1如前所述。
烷基化試劑例如可例舉以下的通式(13)表示的醚化合物。
式中，L表示鹵素、芳硫基、烷基亞砜基或烷硫基，WG1如前所述。
L所表示的鹵素、芳硫基中的芳基、烷基亞砜基及烷硫基中的烷基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的鹵素、芳基、烷基相同的基團。
作為醚化合物(13)的具體例，可例舉以下的1.～2.的化合物。
1.氯甲基2-氰基乙基醚2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚醚化合物(13)是可在堿性條件下對2’位羥基導入中性條件下可脫離的醚型取代基的新的烷基化試劑，作為制備本發明的亞磷酰胺化合物的試劑有用。
醚化合物(13)可通過實施以下的步驟1～步驟4來制備。
步驟1將以下的通式(20)表示的醇化合物烷硫基甲基化，制備以下的通式(24)表示的化合物的步驟。
式中，WG1如前所述，R3表示烷基或芳基。
化合物(24)是L為烷硫基的醚化合物(13)。
R3所表示的烷基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的烷基同樣的基團。
R3為甲基時，作為烷硫基甲基化試劑，例如可例舉二甲亞砜、乙酸酐及乙酸的混合溶液。二甲亞砜的用量相對于化合物(20)以10～200倍摩爾量為宜，優選20～100倍摩爾量。乙酸的用量相對于化合物(20)以10～150倍摩爾為宜，優選20～100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于化合物(20)以10～150倍摩爾量為宜，優選20～100倍摩爾量。反應溫度優選0℃～100℃。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以1～48小時為宜。
步驟2將化合物(24)鹵化，制備以下的通式(25)表示的化合物的步驟。
式中，WG1、R3如前所述，X2表示鹵素。
化合物(25)是醚化合物(13)中的L為鹵素的化合物。
X2所表示的鹵素可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的鹵素同樣的鹵素。
本步驟可按照公知的方法(例如，T.Benneche等，Synthesis 762(1983))實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。作為鹵化劑，例如可例舉硫酰氯、磷酰氯。鹵化劑的用量相對于化合物(24)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。反應溫度以0℃～100℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
步驟3將化合物(25)芳硫基化，制備以下通式(25a)表示的化合物的步驟。
式中，WG1、X2如前所述，R3a表示芳基。
化合物(25)是醚化合物(13)中的L為芳硫基的化合物。
R3a所表示的芳基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的芳基同樣的基團。
本步驟可采用公知方法實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、乙腈。作為芳硫基化試劑，例如可例舉苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化試劑的用量相對于化合物(25)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～5倍摩爾量。反應溫度以0℃～100℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以1～48小時為宜。
步驟4將化合物(24)氧化，制備下述通式(24a)表示的化合物的步驟。
式中，WG1、R3如前所述。
化合物(24a)是醚化合物(13)中的L為烷基亞砜基的化合物。
R3所表示的烷基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的烷基相同的基團。
本步驟可采用公知方法實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、甲醇。作為氧化劑，例如可例舉間氯過苯甲酸、偏高碘酸鹽、過氧化氫。氧化劑的用量相對于化合物(24)以1～10倍摩爾量為宜，優選1～2倍摩爾量。反應溫度以0℃～100℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以1～48小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(25)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(14)而實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。烷基化試劑的用量相對于化合物(14)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。本步驟中，也可根據需要使金屬試劑和堿作用于化合物(14)，制得中間體后再使烷基化試劑與之作用。所述金屬試劑例如可例舉二氯化二丁基錫。金屬試劑的用量相對于化合物(14)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯等有機堿。堿的用量相對于化合物(14)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。反應溫度以0℃～120℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(24)或(25a)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，Tetrahedron Letters，Vol.31，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(14)而實施。烷基化試劑的用量相對于化合物(14)以1～5倍摩爾量為宜，優選1.05～3倍摩爾量。作為酸，例如可例舉三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于化合物(14)以0.01～20倍摩爾量為宜，優選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氫呋喃、乙腈或它們的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，例如可例舉N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于化合物(14)以1～10倍摩爾量為宜，優選1.05～5倍摩爾量。反應溫度以-78℃～30℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以5分鐘～5小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(24a)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酐和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(14)而實施。烷基化試劑的用量相對于化合物(14)以1～5倍摩爾量為宜，優選1.05～3倍摩爾量。作為酸酐，例如可例舉三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于化合物(14)以0.01～20倍摩爾量為宜，優選0.02～10倍摩爾量。作為堿，例如可例舉四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于化合物(14)以0.01～20倍摩爾量為宜，優選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它們的混合溶劑。反應溫度以-78℃～30℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以5分鐘～24小時為宜。
(2)步驟b分離精制步驟a制得的核苷衍生物(15)的步驟。
本步驟可通過例如薄層色譜法、硅膠色譜法等常規的分離精制方法從步驟a制得的混合物進行分離精制。
(3)步驟c與步驟b分別進行，通過使烷基化試劑作用于以下的通式(16)表示的核糖核酸化合物，制得在2’位羥基導入了中性條件下脫離的醚型保護基的以下的通式(17)表示的核糖核酸化合物的步驟。
式中，Bx、WG1如前所述，A表示以下的通式(18a)或(18b)表示的硅取代基， 式中，R6表示烷基。
R6所表示的烷基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的烷基相同的基團。
烷基化試劑可例舉與前述相同的試劑。
烷基化試劑采用化合物(25)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(16)而實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。烷基化試劑的用量相對于化合物(14)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。本步驟中，也可根據需要使金屬試劑和堿作用于化合物(16)，制得中間體后再使烷基化試劑作用。所述金屬試劑例如可例舉二氯化二丁基錫、氯化叔丁基鎂。金屬試劑的用量相對于化合物(16)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯等有機堿。堿的用量相對于化合物(16)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。反應溫度以0℃～120℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(24)或(25a)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，Tetrahedron Letters，Vol.31，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(16)而實施。烷基化試劑的用量相對于化合物(16)以1～5倍摩爾量為宜，優選1.05～3倍摩爾量。作為酸，例如可例舉三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于化合物(16)以0.01～20倍摩爾量為宜，優選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氫呋喃、乙腈或它們的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，例如可例舉N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于化合物(16)以1～10倍摩爾量為宜，優選1.05～5倍摩爾量。反應溫度以-78℃～30℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以5分鐘～5小時為宜。
烷基化試劑采用化合物(24a)時，可如下實施。
本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酐和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(16)而實施。烷基化試劑的用量相對于化合物(16)以1～5倍摩爾量為宜，優選1.05～3倍摩爾量。作為酸酐，例如可例舉三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于化合物(16)以0.01～20倍摩爾量為宜，優選0.02～10倍摩爾量。作為堿，例如可例舉四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于化合物(16)以0.01～20倍摩爾量為宜，優選0.02～10倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它們的混合溶劑。反應溫度以-78℃～30℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以5分鐘～24小時為宜。
(4)步驟d與步驟a～步驟c分別進行，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸化合物(16)而制得下述通式(19)表示的核糖核酸化合物的步驟。
式中，A、Bx如前所述。
本步驟可按照公知方法，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的核糖核酸化合物(16)而實施。
二甲亞砜的用量相對于化合物(16)以10～200倍摩爾量為宜，優選20～100倍摩爾量。酸酐的用量相對于化合物(16)以10～150倍摩爾量為宜，優選20～100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于化合物(16)以10～150倍摩爾量為宜，優選20～100倍摩爾量。反應溫度以10℃～50℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
(5)步驟e通過使下述通式(20)表示的醇化合物、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于步驟d制得的核苷衍生物(19)，制備在2’位羥基導入了中性條件下脫離的醚型保護基的下述通式(17)表示的核糖核酸化合物的步驟。
式中，A、Bx、WG1如前所述。
本步驟可按照公知方法，通過使醇化合物(20)、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于核糖核酸化合物(19)而實施。
所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氫呋喃、乙腈或它們的混合溶劑。醇化合物(20)的用量相對于化合物(19)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。作為酸，例如可例舉三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作為針對于硫原子的鹵化劑，例如可例舉N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于化合物(19)以0.1～20倍摩爾量為宜，優選0.2～10倍摩爾量。反應溫度以-100℃～20℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以5分鐘～12小時為宜。
(6)步驟f通過實施脫去步驟c或步驟e制得的核糖核酸化合物(17)的3’位和5’位羥基的保護基的反應，制得下述通式(21)表示的核糖核酸化合物的步驟。
式中，A、Bx、WG1如前所述。
本步驟可通過將化合物(17)溶于有機溶劑，使氟化劑和酸的任意混合比的混合試劑與之反應而實施。作為可用于本步驟的氟化劑，例如可例舉氟化銨、氟化四正丁基銨(TBAF)、三乙胺三氫氟酸鹽、氟化氫吡啶。氟化劑的用量相對于化合物(17)以0.1～20倍摩爾量為宜，優選0.2～10倍摩爾量。反應溫度以0℃～120℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
(7)步驟g制備在步驟f制得的核糖核酸化合物(21)的5’位羥基導入酸性條件下可脫離的保護基(R1)的核糖核酸化合物(15)的步驟。
式中，A、Bx、R1、WG1如前所述，X3表示鹵素。
X3所表示的鹵素可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的鹵素相同的鹵素。
本步驟可按照公知的方法，通過使R1X3作用于化合物(21)而實施。R1X3的用量相對于化合物(21)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。所用溶劑只要對反應沒有影響即可，無特別限定，例如可例舉乙腈、四氫呋喃。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯等有機堿。堿的用量相對于化合物(21)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。反應溫度以0℃～120℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
(8)步驟h通過使亞磷酰胺化試劑和根據需要使用的活化劑作用于步驟b或步驟f制得的核苷衍生物(15)，制備3’位羥基被亞磷酰胺化的本發明的亞磷酰胺化合物的步驟。
式中，Bx、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。
作為亞磷酰胺化試劑，例如可例舉下述通式(22)、(23)表示的化合物。
式中，R2a、R2b、WG2如前所述，X1表示鹵素。
X1所表示的鹵素可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中的鹵素相同的鹵素。
本步驟是使亞磷酰胺化試劑作用于化合物(15)而將3’位羥基亞磷酰胺化的反應，可按照公知的方法實施。根據需要還可采用活化劑。所用溶劑只要對反應沒有影響即可，無特別限定，例如可例舉乙腈、四氫呋喃。
亞磷酰胺化試劑的用量相對于化合物(15)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。作為活化劑，例如可例舉1H-四唑、5-乙硫基四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶鹽、N，N-二異丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化劑的用量相對于化合物(15)以1～20倍摩爾量為宜，優選1～10倍摩爾量。反應溫度以0℃～120℃為宜。反應時間因所用原料的種類和反應溫度等而異，通常以30分鐘～24小時為宜。
以上所制備的本發明的亞磷酰胺化合物本身可通過例如濃縮、液相轉換、轉溶、溶劑萃取、結晶化、重結晶、分餾、層析等公知的方法進行分離精制。
III.低聚RNA的制法作為本發明，可例舉以采用本發明的亞磷酰胺化合物為特征的下述通式(3)表示的低聚RNA的制法。
以下進行詳述。
式中，各B獨立地表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它們的修飾體，各R分別獨立地表示H或羥基，且至少1個表示羥基，Z表示H或磷酸基，n表示1～100范圍內的整數。
n優選10～50范圍內的整數，更好為15～30范圍內的整數。
作為B的修飾體中的取代基，例如可例舉鹵素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，可以被1～3個上述取代基取代。
B的修飾體中的鹵素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中所述的各基團相同的基團。
采用本發明的亞磷酰胺化合物的低聚RNA(3)的制法可按照公知方法實施，例如可通過實施以下所示的步驟A～步驟G的操作，分階段地從3’至5’的方向縮合核酸單體化合物。
被用于下述步驟的化合物及試劑中，除了本發明的亞磷酰胺化合物以外，可使用任何通常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及試劑，無特別限定。另外，與采用現有的核酸合成試劑的情況相同，所有的步驟可采用人工方法或市售的DNA自動合成機來實施。采用自動合成機實施時，操作方法簡便，且合成的正確率高，所以優選使用自動合成機的方法。此外，下述步驟A～步驟G所記載的化合物及試劑中，除核酸單體化合物以外，可使用任何通常用于低聚DNA或低聚RNA的合成的化合物及試劑，無特別限定。
(1)步驟A通過使酸作用于下述通式(4)表示的化合物，將5’位羥基的保護基脫去，制備下述通式(5)表示的化合物的步驟。
式中，n、R1、WG2如前所述，各Bx分別獨立地表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它們的修飾體，各R4分別獨立地表示H、酰氧基或下述通式(6)表示的取代基， 式中，WG1如前所述，E表示酰基或下述通式(7)表示的取代基， 式中，Q表示單鍵或下述通式(8)表示的取代基， 式中，WG2如前所述，T表示H、酰氧基、上述通式(6)或(7)表示的取代基，但E和T中的任一方表示取代基(7)。
本步驟通過使酸作用于被承載于固相載體的下述通式(26a)、(26b)表示的化合物(n＝1的化合物(4))或通過實施步驟A～步驟D的操作而制備的被承載于固相載體的低聚RNA或低聚DNA(n＝2～100的化合物(4))(以下稱為被承載于固相載體的化合物)而實施。
式中，Bx、R1如前所述，R2L、R4L表示取代基(7)，R2表示酰氧基，R4表示H、酰氧基或取代基(6)。
R2、R4所表示的酰氧基中的酰基例如可例舉乙酰基、丙酰基、丁酰基、異丁酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-異丙基苯氧基乙酰基。
作為固相載體，可例舉例如可控孔度玻璃(controlled pore glass；CPG)、草酰化-可控孔度玻璃(例如參照Alul等，Nucleic Acids Research，Vol.19，1527(1991))、TentaGel支承體-氨基聚乙二醇衍生物化支承體(例如參照Wright等，Tetrahedron Letters，Vol.34，3373(1993))、空孔-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
作為連接基，例如可例舉3-氨基丙基、琥珀酰基、2，2’-二乙醇磺酰基、長鏈烷基氨基(LCAA)。
化合物(26a)、(26b)是按照公知方法制得的或可作為市售品獲得的被承載于固相載體的化合物，作為其優選例子，可例舉以下的通式(27)、(28)表示的化合物。
式中，Bx、R1、R4、WG2如前所述。
R4為取代基(6)的化合物(27)、(28)可按照公知方法由本發明的亞磷酰胺化合物制得。
作為可用于本步驟的酸，例如可例舉三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。該可用于本步驟的酸也可用適當的溶劑將其濃度稀釋至1～5％后再使用。作為溶劑，只要不會對反應有影響即可，無特別限定，可例舉二氯甲烷、乙腈、水或它們的混合溶劑。上述反應的反應溫度優選20℃～50℃。反應時間因所用酸的種類和反應溫度而異，通常以1分鐘～1小時為宜。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的化合物以1～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(2)步驟B采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的化合物(5)縮合，制備下述通式(9)表示的化合物的步驟。
式中，Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述。
本步驟可通過使核酸單體化合物和活化劑作用于被承載于固相載體的化合物而實施。
作為核酸單體化合物，可例舉本發明的亞磷酰胺化合物或可作為市售品獲得的下述通式(29)表示的化合物。
式中，R1、R2a、R2b、WG2如前所述，BY表示可具有保護基的核酸堿基。
作為BY所表示的核酸堿基，只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，例如可例舉腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或它們的修飾體。
該修飾體的定義與前述Bx相同。
作為BY的修飾體中的取代基，例如可例舉鹵素、烷基、芳烷基、烷氧基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，可被1～3個上述取代基取代。
BY的修飾體中的鹵素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基可例舉與本發明的亞磷酰胺化合物中所述的各基團相同的基團。
BY所表示的核酸堿基可以被保護，其中例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等具有氨基的核酸堿基的氨基最好被保護起來。該BY的氨基的保護基可例舉與前述Bx所述同樣的基團。
活化劑可例舉與前述同樣的試劑。
作為反應溶劑，只要不會對反應有影響即可，無特別限定，例如可例舉乙腈、四氫呋喃。上述反應的反應溫度以20℃～50℃為宜。反應時間因所用活化劑的種類和反應溫度而異，通常以1分鐘～1小時為宜。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的化合物以1～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(3)步驟C將步驟B中未反應的化合物(5)的5’位羥基封端的步驟。
式中，Bx、E、n、R4、T、WG2如前所述，R5表示甲基、苯氧基甲基。
本步驟是對步驟B中未反應的5’位羥基進行保護的反應，通過將封端劑作用于被承載于固相載體的化合物而實施。
作為封端劑，例如可例舉乙酸酐或苯氧基乙酸酐。該封端劑也可以用適當溶劑將其濃度稀釋至0.05～1M后再使用。作為溶劑，只要不會對反應有影響即可，無特別限定，例如可例舉吡啶、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或它們的混合溶劑。此外，可根據需要在本步驟中使用例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑作為反應促進劑。上述反應的反應溫度以20℃～50℃為宜。反應時間因所用封端劑的種類和反應溫度而異，通常以1分鐘～30分鐘為宜。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的化合物以1～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(4)步驟D通過使氧化劑作用于步驟B制得的化合物(9)，將亞磷酸基轉換為磷酸基的步驟。
式中，Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述。
本步驟是利用氧化劑將3價磷轉換為5價磷的反應，通過使氧化劑作用于被承載于固相載體的化合物而實施。
作為氧化劑，例如可例舉碘、過氧化氫叔丁基。該氧化劑也可用適當的溶劑將其濃度稀釋至0.05～2M后再使用。作為溶劑，只要不會對反應有影響即可，可例舉吡啶、四氫呋喃、水或它們的混合溶劑。例如可采用碘/水/吡啶-四氫呋喃、碘/吡啶-乙酸和過氧化劑(過氧化氫叔丁基/二氯甲烷等)。反應溫度以20℃～50℃為宜。反應時間因所用氧化劑的種類和反應溫度而異，通常為1分鐘～30分鐘。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的化合物以1～100倍摩爾量為宜，更好為10～50倍摩爾量。
(5)步驟E將步驟D制備的化合物(11)從固相載體解離(cleave)，除去各核酸堿基部及各2’位羥基的保護基的步驟。
式中，B、Bx、E、R、R1、R4、n、T、WG2、Z如前所述。
解離步驟是利用解離劑將所需鏈長的低聚RNA從固相載體及連接基解離的反應，可通過向承載有所需鏈長的低聚RNA的固相載體添加解離劑而實施。本步驟中可除去核酸堿基部的保護基。
作為解離劑，例如可例舉濃氨水、甲胺。本步驟中可使用的解離劑例如可用水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃或它們的混合溶劑稀釋后再使用。
其中，優選使用乙醇。
反應溫度以15℃～75℃為宜，優選15℃～30℃，更好為18℃～25℃。脫保護反應時間以1～30小時為宜，優選1～24小時，更好為1～4小時。被用于脫保護的溶液中的氫氧化銨的濃度以20～30重量％為宜，優選25～30重量％，更好為28～30重量％。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的化合物以1～100倍摩爾量為宜，更好為10～50倍摩爾量。
除去2’位羥基的保護基的步驟可通過使例如氟化四丁基銨、三氟化氫·三乙胺鹽等除去2’位羥基的保護基的試劑與化合物作用而實施。作為所用溶劑，只要是不會影響反應的溶劑即可，無特別限定，例如可例舉四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、二甲亞砜或它們的混合溶劑。如果需要，還可添加清除本步驟中作為副產物生成的丙烯腈的化合物，該化合物例如有烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它們的混合物。作為烷基胺，例如可例舉直鏈狀的碳數1～6的烷基胺。具體例如可例舉甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作為脒，例如可例舉苯甲脒、甲脒。作為硫醇，例如可例舉直鏈狀的碳數1～6的硫醇。具體例如可例舉甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、1-己硫醇。作為硫醇衍生物，例如可例舉具有相同或不同的直鏈狀的碳數1～6的烷基硫醇基的醇或醚。具體例如可例舉2-巰基乙醇、4-巰基-1-丁醇、6-巰基-1-己醇、巰基甲醚、2-巰基乙醚、3-巰基丙醚、4-巰基丁醚、5-巰基戊醚、6-巰基己醚。反應溫度以20℃～80℃為宜。反應時間因所用脫保護劑的種類和反應溫度而異，通常以1小時～100小時為宜。所用試劑的量相對于被除去的保護劑以50～500倍摩爾量為宜，更好為50～100倍摩爾量。
可利用例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、重結晶、硅膠柱色譜法、薄層色譜法、反相ODS柱色譜法、離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、透析、超濾等常規的分離精制方法，從上述反應混合物分離精制5’位得到保護的低聚RNA。
(6)步驟F將步驟E制備的化合物(12)的5’位羥基的保護基除去的步驟。
式中，B、n、R、R1、Z如前所述。
本步驟是最終除去低聚RNA的5’位羥基的保護基的步驟，可通過使酸作用于從固相載體解離得到的低聚RNA而實施。
作為可用于本步驟的酸，例如可例舉三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸等。本步驟中可使用的酸也可用適當的溶劑稀釋后再使用。作為溶劑，只要是不會對反應有影響的溶劑即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、水、pH為2～5的緩沖液或它們的混合溶劑。作為緩沖液，例如可例舉乙酸緩沖液。上述反應的反應溫度以20℃～50℃為宜。反應時間因所用酸的種類和反應溫度而異，通常以1分鐘～1小時為宜。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的化合物以1～100倍摩爾量為宜，更好為1～10倍摩爾量。
(7)步驟G分離精制步驟F制備的化合物(3)的步驟。
分離精制步驟是指通過單獨或組合使用例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、重結晶、C8-C18的反相柱色譜法、C8-C18的反相卡套柱(cartridge column)色譜法、陽離子交換柱色譜法、陰離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、高效液相色譜法、透析、超濾等通常的分離精制方法，從上述反應混合物分離精制所需低聚RNA的步驟。
作為洗脫溶劑，例如可例舉乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、水的單溶劑或任意比例的混合溶劑。這種情況下，也可以1mM～2M的濃度作為添加劑添加例如磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、乙酸銨、乙酸三乙基銨、乙酸鈉、乙酸鉀、Tris-HCl、乙二胺四乙酸，將溶液的pH調整至1～9的范圍。
通過重復實施步驟A～步驟D的操作，能夠制得所需鏈長的低聚RNA(3)。本制法中作為制備低聚RNA(3)的起始原料，可使用R4為取代基(6)的化合物(26a)、R4為H或酰氧基的化合物(26a)或R2為烷氧基的化合物(26b)等。但是，作為起始原料使用了R4為H或酰氧基的化合物(26a)或R2為烷氧基的化合物(26b)的情況下，核酸單體化合物中的至少1種必須使用本發明的亞磷酰胺化合物。
此外，本制法中，也可通過在步驟E的操作之前實施步驟F的操作，然后再實施步驟E的操作，接著通過步驟G的操作分離精制低聚RNA。
實施例以下，例舉實施例，對本發明進行更詳細的說明，但本發明并不僅限于此。
實施例1 氯甲基2-氰基乙基醚步驟1 甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制備將32g(450mmol)3-羥基丙腈溶于450ml二甲亞砜，加入324mL乙酸酐和231mL乙酸，室溫下攪拌24小時。將990g碳酸氫鈉溶于4.5L水調制成溶液，用1小時的時間將反應液滴入該溶液中，緊接著攪拌1小時，用乙酸乙酯萃取反應液，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得油狀物進行精制，獲得41g呈無色油狀物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70％)。
1H-NMR(CDCl3)2.18(s，3H)2.66(t，2H，J＝6.3Hz)3.77(t，2H，J＝6.3Hz)4.69(s，2H)步驟2 氯甲基2-氰基乙基醚的制備使3.3g(25mmol)步驟1獲得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲烷，冰冷下滴加2mL(25mmol)硫酰氯，再于室溫反應1小時。反應后蒸除溶劑，在真空中進行蒸餾，獲得2.5g呈無色油狀物的目標化合物(收率85％)。沸點84～85℃(0.3托)1H-NMR(CDCl3)2.72(t，2H，J＝6.3Hz)3.92(t，2H，J＝6.3Hz)5.52(s，2H)
實施例2 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將546mg(1mmol)5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷后加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺，再加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，然后于室溫反應1小時。升溫至80℃后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，緊接著攪拌30分鐘。反應結束后在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg，收率34％)。
1H-NMR(CDCl3)2.47(d，1H，J＝7.8Hz)；2.69(t，2H，J＝6.3Hz)；3.55(dd，1H，J＝11.3，2.2Hz)；3.62(dd，1H，J＝11.3，2.2Hz)；3.83(s，6H)；3.87(t，2H，J＝6.3Hz)；4.07-4.08(m，1H)；4.32(dd，1H，J＝5.3，1.9Hz)；4.54(q，1H，J＝5.3Hz)；4.94，5.11(2d，2H，J＝6.9Hz)；5.32(d，1H，J＝8.2Hz)；6.00(d，1H，J＝1.9Hz)；6.85-6.88(m，4H)；7.29-7.41(m，9H)；8.02(d，1H，J＝8.2Hz)；8.53(br.s，1H)ESI-質譜652[M+Na]+步驟2 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將209mg(0.332mmol)步驟1獲得的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmol)四唑溶于2mL乙腈，再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰胺，于45℃反應1.5小時。反應后加入飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(200mg，收率73％)。
ESI-質譜852[M+Na]+實施例3 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷步驟1 3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備氬氣氛下，將150mg(0.3mmol)3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷溶于7mL四氫呋喃，加入54mg(0.4mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將溫度調整為0℃，加入10mg(0.06mmol)三氟甲磺酸的四氫呋喃溶液2mL，攪拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌1小時。用硅藻土過濾反應液，用二氯甲烷洗滌后，有機相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。用薄層色譜法對所得殘渣進行精制，獲得3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg，收率85％)。
1H-NMR(CDCl3)0.97-1.12(m，28H)；2.68-2.73(m，2H)；3.78-3.86(m，1H)；3.96-4.05(m，2H)；4.12-4.30(m，4H)；5.0-5.04(m，2H)；5.70(d，1H，J＝8.2Hz)；5.75(s，1H)；7.90(d，1H，J＝8.2Hz)；9.62(br.s，1H)ESI-質譜570[M+H]+步驟2 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將200mg(0.35mmol)步驟1獲得的3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇，再加入65mg(1.76mmol)氟化銨，于50℃加熱攪拌5小時。放冷后加入乙腈攪拌，過濾濃縮。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(108mg，收率94％)。
1H-NMR(CD3OD)2.72-2.76(t，2H，J＝6.2Hz)；3.68-3.92(m，4H)；4.00-4.03(m，1H)；4.26-4.32(m，2H)；4.81-4.95(m，2H)；5.71(d，1H，J＝8.1Hz)；6.00(d，1H，J＝3.3Hz)；8.10(d，1H，J＝8.1Hz)ESI-質譜350[M+Na]+實施例4 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將14g(43mmol)2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于300mL四氫呋喃，在氬氣氛下加入68g(856mmol)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將19.6g(57.8mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入10mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(26.5g，收率98％)。
實施例5 N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)
步驟1 N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將588mg(1mmol)N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應1小時。然后，將溫度升至80℃，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，緊接著攪拌60分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg，收率35％)。1H-NMR(CDCl3)2.19(s，3H)；2.56(d，1H，J＝8.8Hz)；2.65(t，2H，J＝6.2Hz)；3.55(dd，1H，J＝10.5，2.5Hz)；3.63(dd，1H，J＝10.5，2.5Hz)；3.82(s，6H)；3.86(t，2H，J＝6.2Hz)；4.09-4.14(m，1H)；4.28(d，1H，J＝5.1Hz)；4.44-4.49(m，1H)；4.97，5.24(2d，2H，J＝6.9Hz)；5.96(s，1H)；6.86-6.88(m，4H)；7.09(d，1H，J＝6.9Hz)；7.26-7.42(m，9H)；8.48(d，1H，J＝6.9Hz)；8.59(br.s，1H)ESI-質譜693[M+Na]+步驟2 N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將205mg(0.306mmol)步驟1獲得的N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲烷，加入105mg(0.812mmol)二異丙基乙胺，再滴加116mg(0.49mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應1小時。反應后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(242mg，收率91％)。
ESI-質譜871[M+H]+實施例6 N4-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷步驟1 N4-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備混合1.00g(1.89mmol)N4-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)胞苷和500mg(3.79mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚，將混合物溶于10mL甲苯和10mL四氫呋喃的混合溶劑。然后，加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸銀，再加入分子篩4A，干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亞胺，將反應容器遮光，攪拌10分鐘。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亞胺，攪拌25分鐘。反應結束后加入二氯甲烷稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液進行洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得N4-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg，收率81％)。
1H-NMR(CDCl3)0.90-1.11(m，28H)；2.28(s，3H)；2.62-2.79(m，2H)；3.78-3.89(m，1H)；3.96-4.04(m，2H)；4.19-4.23(m，3H)；4.30(d，1H，J＝13.6Hz)；5.00(d，1H，J＝6.8Hz)；5.09(d，1H，J＝6.8Hz)；5.77(s，1H)；7.44(d，1H，J＝7.5Hz)；8.30(d，1H，J＝7.5Hz)；10.13(s，1H)ESI-質譜611[M+H]+步驟2 N4-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將500mg(0.819mmol)步驟1獲得的N4-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mL四氫呋喃和2.5mL甲醇的混合溶劑，加入150mg(4.10mmol)氟化銨，于50℃反應4小時。反應結束后，用乙腈稀釋，過濾，蒸除溶劑，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(210mg，收率70％)。
1H-NMR(D2O)2.13(s，3H)；2.66-2.71(m，2H)；3.72-3.78(m，3H)；3.90(dd，1H，J＝13.0，2.6Hz)；4.06-4.11(m，1H)；4.20(dd，1H，J＝7.1，5.2Hz)；4.29(dd，1H，J＝5.1，2.9Hz)；4.83(d，1H，J＝7.2Hz)；4.94(d，1H，J＝7.2Hz)；5.95(d，1H，J＝2.9Hz)；7.25(d，1H，J＝7.6Hz)；8.25(d，1H，J＝7.6Hz)ESI-質譜391[M+Na]+實施例7 N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將9.9g(26.8mmol)2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于190mL四氫呋喃，在氬氣氛下加入43g(538mmol)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將11.8g(34.9mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發器濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(15g，收率83％)。
實施例8 N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1 N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將627mg(1mmol)N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應1小時。然后，將溫度升至80℃，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，緊接著攪拌60分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(450mg，收率63％)。1H-NMR(CDCl3)1.92(s，3H)；2.47-2.51(m，2H)；2.68(br.s，1H)；3.30(dd，1H，J＝10.7，3.8Hz)；3.47(dd，1H，J＝10.7，3.8Hz)；3.55-3.60(m，1H)；3.65-3.70(m，1H)；3.74，3.75(2s，6H)；4.22-4.23(m，1H)；4.55-4.58(m，1H)；4.78，4.83(2d，2H，J＝7.0Hz)；5.01(t，1H，J＝5.1Hz)；5.99(d，1H，J＝5.1Hz)；6.76-6.79(m，4H)；7.17-7.44(m，9H)；7.88(s，1H)；8.36(br.s，1H)；12.06(br.s，1H)步驟2 N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)將400mg(0.563mmol)步驟1獲得的N2-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2mL二氯甲烷，加入181mg(1.4mmol)二異丙基乙胺，再滴加161mg(0.68mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應1小時。反應后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(471mg，收率92％)。
實施例9 N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1 N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將22.0g(36.0mmol)N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1，2-二氯乙烷，加入16.3mg(126mmol)二異丙基乙胺后加入12.1g(39.7mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應1小時。然后，將溫度升至80℃攪拌15分鐘，再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，緊接著攪拌30分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g，收率33％)。
1H-NMR(CDCl3)；2.51(t，2H，J＝6.2Hz)；2.58(d，1H，J＝5.5Hz)；2.61(s，3H)；3.45(dd，1H，J＝10.7，4.0Hz)；3.54(dd，1H，J＝10.7，3.2Hz)；3.62-3.79(m，2H)；3.79(s，6H)；4.25(br.q，1H，J＝4.6Hz)；4.59(q，1H，J＝5.2Hz)；4.87-4.94(m，3H)；6.23(d，1H，J＝4.4Hz)；6.80-6.83(m，4H)；7.22-7.32(m，7H)；7.40-7.43(m，2H)；8.20(s，1H)；8.61(br.s，1H)；8.62(s，1H)ESI-質譜695[M+H]+步驟2 N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將10.0g(14.4mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲烷，加入4.7g(36mmol)二異丙基乙胺，再滴加4.82g(20.3mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應1小時。反應后剩余30mL左右的溶劑，進行蒸除，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(12.0g，收率93％)。
ESI-質譜；895[M+H]+實施例10 N6-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步驟1 N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亞胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸銀懸浮于8mL二氯甲烷，加入分子篩4A，干燥。冰冷下，在其中加入將400mg(0.73mmol)N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷和145mg(1.11mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲烷而形成的溶液，緊接著攪拌3小時。反應結束后加入二氯甲烷稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液進行洗滌，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg，收率45％)。
1H-NMR(CDCl3)0.98-1.11(m，28H)；2.62(s，3H)；2.69(td，2H，6.5，J＝1.5Hz)；3.81-3.89(m，1H)4.02-4.09(m，2H)；4.17(d，1H，J＝9.4Hz)；4.28(d，1H，J＝13.4Hz)；4.50(d，1H，J＝4.5Hz)；4.67(dd，1H，J＝8.8，4.5Hz)；5.02(d，1H，J＝7.0Hz)；5.08(d，1H，J＝7.0Hz)；6.10(s，1H)；8.34(s，1H)；8.66(s，1H)；8.67(s，1H)ESI-質譜636[M+H]+步驟2 N6-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將300mg(0.47mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.1mL乙酸和2mL的0.5M氟化四丁基銨的四氫呋喃溶液的混合溶液，室溫下攪拌2小時。反應結束后用硅膠柱色譜法對所得反應混合物進行精制，獲得目標化合物(160mg，收率86％)。1H-NMR(DMSO-d6)2.25(s，3H)；2.53-2.68(m，2H)；3.41-3.46(m，1H)；3.56-3.64(m，2H)；3.69-3.73(m，1H)；4.00-4.01(m，1H)；4.36-4.37(m，1H)；4.72-4.78(m，3H)；5.20(bt，2H)；5.41(d，1H，J＝5.2Hz)；6.17(d，1H，J＝5.7Hz)；8.66(s，1H)；8.72(s，1H)；10.72(s，1H)ESI-質譜415[M+Na]+實施例11 N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將9.50g(24.2mmol)N6-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脫水吡啶，濃縮干燥后，氬氣氛下溶于100mL脫水吡啶。冰冷下，加入10.7g(31.2mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯，室溫下反應1小時20分鐘。反應結束后，用二氯甲烷稀釋，再用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(13.8g，收率82％)。
實施例12 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將720mg(1mmol)N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應1小時。然后，將溫度升至80℃，再滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，緊接著攪拌60分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(384mg，收率48％)。
1H-NMR(CDCl3)2.47-2.51(m，2H)；2.58(br.s，1H)；3.42(dd，1H，J＝10.1，3.8Hz)；3.46(dd，1H，J＝10.1，3.8Hz)；3.53-3.57(m，1H)；3.69-3.73(m，1H)；3.77(s，6H)；4.24-4.26(m，1H)；4.48-4.50(m，1H)；4.61-4.65(m，2H)；4.83，4.87(2d，2H，J＝7.0Hz)；4.88(t，1H，J＝5.7Hz)；6.05(d，1H，J＝5.7Hz)；6.80-6.82(m，4H)；6.92-6.96(m，3H)；7.07-7.11(m，2H)；7.20-7.42(m，9H)；7.84(s，1H)；8.99(s，1H)；11.81(br.s，1H)ESI-質譜825[M+Na]+步驟2 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將320mg(0.399mmol)步驟1獲得的N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于4mL二氯甲烷，加入128.8mg(0.996mmol)二異丙基乙胺，再滴加141.5mg(0.598mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應1小時。反應后蒸除溶劑，再利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(316mg，收率79％)。
ESI-質譜1003[M+H]+實施例13 N2-苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷步驟1 N2-苯氧基乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將2.0g(3.0mmol)N2-苯氧基乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)鳥苷溶于16mL四氫呋喃，加入0.99g(7.6mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子篩4A，氬氣氛下于-45℃攪拌10分鐘。然后，加入0.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mL四氫呋喃溶液，攪拌后加入1.02g(4.5mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌15分鐘。在反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，過濾后用乙酸乙酯萃取，有機相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再依次用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，接著用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。所得殘渣用硅膠柱色譜法精制，獲得N2-苯氧基乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(2.0g，收率89％)。
1H-NMR(CDCl3)0.99-1.11(m，28H)；2.59-2.77(m，2H)；3.82-4.05(m，3H)；4.15(d，1H，J＝9.3Hz)；4.25-4.35(m，2H)；4.52-4.56(dd，1H，J＝9.3，4.3Hz)；5.00，5.07(2d，2H，J＝7.2Hz)；5.95(s，1H)；6.99-7.12(m，3H)；7.35-7.40(m，2H)；8.09(s，1H)；9.38(br.s，1H)；11.85(br.s，1H)ESI-質譜766[M+Na]+步驟2 N2-苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備在2.83mL(2.83mmol)的1M氟化四丁基銨/四氫呋喃溶液中加入0.14mL(0.14mmol)乙酸，調制出溶液。將1.0g(1.35mmol)步驟1獲得的N2-苯氧基乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2.83mL四氫呋喃，在其中加入先前調制的溶液，氬氣氛下于室溫攪拌1小時。減壓下濃縮反應液后將其溶于二氯甲烷，用硅膠柱色譜法精制，獲得目標化合物(0.67g，收率99％)。
1H-NMR(DMSO-d6)2.59-2.66(m，2H)；3.41-3.63(m，4H)；3.98(m，1H)；4.32(m，1H)；4.58-4.62(t，1H，J＝5.3Hz)；4.71-4.78(dd，2H，J＝13.1，6.8Hz)；4.87(s，2H)；5.12(s，1H)；5.37(s，1H)；5.97(d，1H，J＝6.1Hz)；6.96-6.99(m，3H)；7.28-7.34(m，2H)；8.30(s，1H)；11.78(br.s，2H)ESI-質譜500[M-H]-實施例14 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將660mg(1.32mmol)N2-苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于9mL四氫呋喃，在氬氣氛下加入2.1g(26.4mmol)吡啶和600mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將540mg(1.58mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發器濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(800mg，收率75％)。
實施例15 N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步驟1 N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷的制備將2.00g(3.62mmol)N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷溶于25mL二甲亞砜，加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸，室溫下攪拌14小時。反應結束后在200mL水中加入反應液，用乙酸乙酯萃取，用飽和碳酸氫鈉水溶液進行洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷(1.36g，收率61％)。
1H-NMR(CDCl3)0.96-1.11(m，28H)；2.20(s，3H)；2.61(s，3H)；4.03(dd，1H，J＝13.4，2.4Hz)；4.18(d，1H，J＝9.1Hz)；4.27(d，1H，J＝13.4Hz)；4.63-4.71(m，2H)；5.00(d，1H，J＝11.5Hz)；5.07(d，1H，J＝11.5Hz)；6.09(s，1H)；8.31(s，1H)；8.65(s，1H)；8.69(s，1H)ESI-質譜635[M+Na]+步驟2 N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將1.00g(1.63mmol)步驟1獲得的N6-乙酰基-3’，5’-O-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷溶于25mL四氫呋喃。加入5.88g(82.7mmol)3-羥基丙腈，再加入分子篩4A，干燥，冷卻至-45℃。接著，加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亞胺，再加入490mg(3.26mmol)三氟甲磺酸，于-45℃攪拌15分鐘。反應結束后，在冷卻的狀態下加入三乙胺進行中和，用二氯甲烷稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得目標化合物(722mg，收率71％)。
實施例16 尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷將承載有市售的2’/3’-O-苯甲酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相載體(37mg，1μmol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(ExpediteTMApplied Biosystems公司)進行標題化合物的低聚RNA的合成。
作為核酸單體化合物使用5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合催化劑使用四唑，作為氧化劑使用碘溶液，作為封端劑溶液使用乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸單體化合物縮合20次后，作為解離劑使用10M甲胺的乙醇水溶液，室溫下用1～2小時實施從CPG固相載體的解離及各磷酸部位的保護基的脫離反應。減壓下濃縮反應混合物后，用反相柱(ODS)除去不需要的峰，再用洗脫溶劑(乙腈-50mM三乙胺-乙酸緩沖液)精制。減壓下濃縮殘渣后，用1M氟化四丁基銨的THF溶液室溫下反應1小時，脫離2’位羥基的保護基。對溶液進行脫鹽處理后，用80％乙酸除去5’末端的保護基(室溫下10分鐘)。減壓下濃縮后水層用乙醚洗滌，無需精制，獲得高純度的目標化合物。
MALDI-TOF-MS計算值6367.52[M+H]+實測值6366.50[M+H]+由圖1的反相HPLC分析的結果可明確化合物為高純度的。測定條件如下所述。
測定條件HPLC裝置送液單元LC-6A(株式會社島津制作所制)檢測器SPD-6A(株式會社島津制作所制)反相HPLC柱Mightysil RP-18GP＜4.6mmφ×15cm＞(關東化學株式會社制)柱溫35℃流動相梯度線性梯度20分鐘(B液0％-70％)A液含5％乙腈的50mM三乙胺-乙酸緩沖液B液含90％乙腈的50mM三乙胺-乙酸緩沖液流動相的流量1ml/分鐘紫外可視分光光度計檢測波長260nm實施例17 胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷將承載有市售的2’/3’-O-苯甲酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相載體(37mg，1μmol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(ExpediteTMApplied Biosystems公司)進行標題化合物的低聚RNA的合成。
作為核酸單體化合物使用5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N4-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N6-乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3’-O-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合催化劑使用5-乙硫基四唑，作為氧化劑使用碘溶液，作為封端劑溶液使用苯氧基乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸單體化合物縮合19次后，在固相上進行5’末端的羥基的保護基的除去處理。然后，作為解離劑使用濃氨水-乙醇混合液(3∶1)，于40℃用4小時實施從CPG固相載體的解離和各磷酸部位的保護基的脫離反應及堿基的保護基的除去處理。減壓下濃縮反應混合物后，用含10％正丙胺和0.6％的2-巰基乙醚的1M氟化四丁基銨的THF溶液于室溫反應1小時，除去2’位羥基的保護基。對溶液進行脫鹽處理后，用DEAE-離子交換樹脂(TOYOPEARL DEAE-650)進行精制，獲得高純度的目標化合物(112OD260，收率58％)。
將波長260nm的紫外吸光度(OD260)作為目標化合物的得量。以下，同樣將吸光度(OD260)作為目標化合物的得量。
MALDI-TOF-MS計算值6305.9[M+H]+實測值6304.8[M+H]+實施例18 腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷與實施例17同樣，獲得目標化合物(92OD260，收率31％)。
MALDI-TOF-MS計算值9519.8[M+H]+實測值9520.4[M+H]+實施例19 尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷與實施例17同樣，獲得目標化合物(254OD260，收率65％)。
MALDI-TOF-MS計算值12185.8[M+H]+實測值12183.3[M+H]+實施例20 腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[-3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胸苷與實施例17同樣，獲得目標化合物(75OD260，收率19％)。
MALDI-TOF-MS計算值12731.8[M+H]+實測值12731.7[M+H]+實施例21 尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鳥苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胸苷與實施例17同樣，獲得目標化合物(83OD260，收率15％)。
MALDI-TOF-MS計算值17476.6[M+H]+實測值17474.6[M+H]+產業上利用的可能性本發明的亞磷酰胺化合物由于被導入2’位羥基的醚型保護基是直線狀的取代基，結合于3’位的羥基的磷原子的周圍的空間不擁塞，因此與以往使用的亞磷酰胺化合物相比，在合成低聚RNA時可在非常短的時間內進行縮合反應，縮合收率良好。
因此，通過采用本發明的亞磷酰胺化合物，能夠使用與低聚DNA的制備幾乎同樣的方法來制得高純度的低聚RNA。
權利要求
1.下述通式(1)表示的亞磷酰胺化合物； 式中，Bx表示可具有保護基的核酸堿基，R1表示以下的通式(2)表示的取代基， R2a、R2b相同或不同，表示烷基或R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成5～6元飽和氨基環基，該飽和氨基環基除氮原子以外還可具有1個氧原子或硫原子作為成環原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電性基團；式(2)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基。
2.如權利要求1所述的亞磷酰胺化合物，其特征在于，WG1為氰基。
3.下述通式(3) 表示的低聚RNA的制法，其特征在于，采用權利要求1或2所述的亞磷酰胺化合物；式中，各B分別獨立地表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它們的修飾體，各R分別獨立地表示H或羥基，且至少1個表示羥基，Z表示H或磷酸基，n表示1～100范圍內的整數。
4.如權利要求3所述的低聚RNA(3)的制法，其特征在于，包括下述步驟A～G；步驟A通過使酸作用于下述通式(4)表示的化合物，將5’位羥基的保護基脫去，制備下述通式(5)表示的化合物的步驟， 式中，n如前所述，各Bx分別獨立地表示可具有保護基的核酸堿基，R1表示下述通式(2)表示的取代基， 式(2)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，各WG2表示吸電性基團，各R4分別獨立地表示H、酰氧基或下述通式(6)表示的取代基， 式(6)中，WG1表示吸電性基團，E表示酰基或下述通式(7)表示的取代基， 式(7)中，Q表示單鍵或下述通式(8)表示的取代基， 式(8)中，WG2如前所述，T表示H、酰氧基、上述通式(6)或(7)表示的取代基，但E或T中的任一方為取代基(7)；步驟B采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的化合物(5)縮合，制備下述通式(9)表示的化合物的步驟， 式中，Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述；步驟C將步驟B中未反應的化合物(5)的5’位羥基封端的步驟， 式中，Bx、E、n、R4、T、WG2如前所述，R5表示甲基、苯氧基甲基；步驟D使氧化劑作用于步驟B制得的化合物(9)，將亞磷酸基轉換為磷酸基的步驟， 式中，Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述；步驟E將步驟D制備的化合物(11)從固相載體解離，除去各核酸堿基部及各2’位羥基的保護基的步驟， 式中，B、Bx、E、n、R、R1、R4、T、WG2、Z如前所述；步驟F將步驟E制備的化合物(12)的5’位羥基的保護基除去的步驟， 式中，B、n、R、R1、Z如前所述；步驟G分離精制步驟F制備的低聚RNA(3)的步驟。
5.如權利要求4所述的低聚RNA的制法，其特征在于，通過重復實施步驟A～D制備所需鏈長的低聚RNA(3)。
6.如權利要求4或5所述的低聚RNA的制法，其特征在于，在步驟E中添加烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它們的混合物。
7.下述通式(13)表示的醚化合物， 式中，L表示鹵素、芳硫基、烷基亞砜基或烷硫基，WG1表示吸電性基團。
8.如權利要求7所述的醚化合物，其特征在于，WG1為氰基。
9.下述通式(1) 表示的亞磷酰胺化合物的制法，式中，Bx表示可具有保護基的核酸堿基，R1表示以下的通式(2)表示的取代基， R2a、R2b相同或不同，表示烷基或R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成5～6元飽和氨基環基，該飽和氨基環基除氮原子以外還可具有1個氧原子或硫原子作為成環原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電性基團，式(2)中，R11、R12、R13相同或不同，表示氫或烷氧基，其特征在于，包括下述步驟a～h；步驟a通過使烷基化試劑作用于以下的通式(14)表示的核苷衍生物，制備在2’位羥基導入中性條件下脫離的醚型保護基的下述通式(15)、(15’)表示的核苷衍生物的步驟， 式中，Bx表示可具有保護基的核酸堿基，R1、WG1如前所述；步驟b分離精制步驟a制得的核苷衍生物(15)的步驟；步驟c與步驟b分別進行，通過使烷基化試劑作用于以下的通式(16)表示的核糖核酸化合物，制得在2’位羥基導入了中性條件下脫離的醚型保護基的以下的通式(17)表示的核糖核酸化合物的步驟， 式中，Bx、WG1如前所述，A表示以下的通式(18a)或(18b)表示的硅取代基， 式中，R6表示烷基；步驟d與步驟a～步驟c分別進行，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸化合物(16)而制得下述通式(19)表示的核糖核酸化合物的步驟， 式中，A、Bx如前所述；步驟e通過使下述通式(20)表示的醇化合物、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于步驟d制得的核苷衍生物(19)，制備在2’位羥基導入了中性條件下脫離的醚型保護基的下述通式(17)表示的核糖核酸化合物的步驟， 式中，A、Bx、WG1如前所述；步驟f通過實施脫去步驟c或e制得的核糖核酸化合物(17)的3’位和5’位羥基的保護基的反應，制得下述通式(21)表示的核糖核酸化合物的步驟， 式中，A、Bx、WG1如前所述；步驟g制備在步驟f制得的核糖核酸化合物(21)的5’位羥基導入酸性條件下可脫離的保護基(R1)的核糖核酸化合物(15)的步驟， 式中，Bx、R1、WG1如前所述，X3表示鹵素；步驟h通過使亞磷酰胺化試劑和根據需要使用的活化劑作用于步驟b或g制得的核苷衍生物(15)，制備3’位羥基被亞磷酰胺化的下述通式(1)表示的亞磷酰胺化合物的步驟， 式中，Bx、R1、WG1如前所述，R2a、R2b相同或不同，表示烷基或R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成5～6元飽和氨基環基，該飽和氨基環基除氮原子以外還可具有1個氧原子或硫原子作為成環原子，WG2表示吸電性基團。
10.如權利要求9所述的亞磷酰胺化合物的制法，其特征在于，烷基化試劑是下述通式(13)表示的醚化合物， 式中，L表示鹵素、芳硫基、烷基亞砜基或烷硫基，WG1表示吸電性基團。
11.如權利要求9或10所述的亞磷酰胺化合物的制法，其特征在于，WG1為氰基。
12.如權利要求9～11中任一項所述的亞磷酰胺化合物的制法，其特征在于，亞磷酰胺化試劑為下述通式(22)或(23)表示的化合物， 式中，R2a、R2b相同或不同，表示烷基或R2a、R2b與鄰接的氮原子一起形成5～6元飽和氨基環基，該飽和氨基環基除氮原子以外還可具有1個氧原子或硫原子作為成環原子，WG2表示吸電性基團，X1表示鹵素。
13.如權利要求9～12中任一項所述的亞磷酰胺化合物的制法，其特征在于，活化劑為1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巰基-1H-四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶鹽、N，N-二異丙基乙胺或2，4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。
全文摘要
本發明的目的是提供低聚RNA的合成中有用的新的亞磷酰胺化合物。下述通式(1)表示的亞磷酰胺化合物，式中，Bx表示可具有保護基的核酸堿基，R
文檔編號C07C255/13GK101048423SQ20058003637
公開日2007年10月3日 申請日期2005年8月25日 優先權日2004年8月26日
發明者大木忠明, 石山幸一, 益富豐 申請人:日本新藥株式會社