17－去甲基雷帕霉素及其類似物、它們的制備方法和它們作為免疫抑制劑、抗癌劑、抗真...的制作方法

專利名稱：17－去甲基雷帕霉素及其類似物、它們的制備方法和它們作為免疫抑制劑、抗癌劑、抗真 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及聚酮化合物和其他天然產物的生產，并且涉及化合物文庫和單個的新型化合物。因此，一方面，本發明提供了17-去甲基雷帕霉素(17-demethylrapamycin)及其類似物，它們的生產方法，包括重組菌株，以及本發明的化合物的分離和用途。另一方面，本發明提供了這些新的17-去甲基雷帕霉素類似物在誘導或維持免疫抑制作用，刺激神經元再生或治療癌癥、B-細胞惡性腫瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維變性疾病，和調控傷口愈合中的用途。在具體實施方案中，本發明提供了用于控制雷帕霉素的生產的生物合成基因的工程化的方法，以便制備能產生17-去甲基雷帕霉素及其類似物的工程菌株。本發明還涉及通過將非天然啟動酸(non-natural starter acid)供給所述菌株制備17-去甲基雷帕霉素類似物文庫的方法，以及由此生產的化合物的文庫，并涉及衍生菌株的產生，其中表達克隆的基因或基因盒，以便產生其他類似物，并且以便加工用于它們的制備，并且涉及其中所使用的工具(例如，核酸，載體，基因盒和遺傳修飾菌株)。
背景技術：
雷帕霉素(西羅莫司(sirolimus))(圖1)由吸濕鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491生產的親脂性大環內酯(Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)，其具有連接在六氫哌啶羧酸內酯(pipecolic acid lactone)上的1，2，3-三羰基部分(Paiva等，1991)。其他相關的大環內酯(圖2)包括FK506(他克莫司(tacrolimus))(Schreiber and Crabtree，1992)，FK520(子囊霉素(ascomycin)或免疫霉素(immunomycin))(Wu等，2000)，FK525(Hatanaka H，等，1989)，FK523(Hatanaka，H.，等，1988)，antascomicins(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)。對于本發明來說，雷帕霉素是首先通過McAlpine等(1991)的編號規定，然后通過Findlay等(1980)或化學文摘(Chemical Abstracts)(11th累積索引(Cumulative Index)，1982-1986p60719CS)的編號規定進行說明。
雷帕霉素的聚酮化合物主鏈是通過一共七個丙酸和七個乙酸單元與莽草酸衍生的環己烷羧酸起始單元從頭到尾稠合(heat-to-tail condensation)產生的(Paiva等，1991)。L-賴氨酸衍生的氨基酸，六氫吡啶羧酸通過酰胺鍵稠合在聚酮化合物主鏈的最后一個乙酸上(Paiva等，1993)，然后通過內酯化作用形成所述大環。已經對包括所述生物合成基因簇的107kb基因組區進行了測序(Schwecke等，1995)。分析所述開放讀框發現了編碼模塊聚酮化合物合酶(PKS)的三個大基因(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。包埋在PKS基因之間的是編碼蛋白的rapP基因，所述蛋白與非核糖體肽合成酶的激活結構域具有序列相似性，并且被認為起著類似作用(Knig等，1997)。在編碼PKS基因的區域的兩側有24個額外的開放讀框，它們所編碼的酶被認為是雷帕霉素生物合成所必需的(Molnar等，1996)。其中包括以下聚酮化合物后修飾酶兩種細胞色素P-450單加氧酶，稱為RapJ和RapN，和相關的鐵氧化還原蛋白RapO，以及三種SAM-依賴型O-甲基轉移酶RapI，RapM和RapQ。其他相鄰的基因在雷帕霉素的調控和輸出方面具有推定的作用(Molnar等，1996)。所述基因簇還包括基因rapL，它的產物RapL被認為能通過L-賴氨酸的環脫氨作用催化雷帕霉素前體L-甲基哌啶的形成(Khaw等，1998；Paiva等，1993)。
雷帕霉素的聚酮化合物核心是通過非常大的，多功能蛋白組裝的，包括I型聚酮化合物合酶(rap PKS)。該多肽復合物包括加載模塊(loading module)和十四個延伸模塊(extension module)，每一個模塊負責將特異性酰基-CoA前體添加到生長中的聚酮化合物鏈上，并且負責β-酮羰基的還原程度。每一個模塊進行若干種生物化學反應，這些反應是由所述多肽的特定的結構域執行的。所有延伸模塊包括酰基轉移酶(AT)結構域，它從前體上選擇酰基并且將它提供給酰基載體蛋白(ACP)結構域，以及β-酮合酶(KS)結構域，其通過脫羧稠合作用將預先存在的聚酮化合物鏈添加到新的酰基-ACP上。在某些延伸模塊上存在其他結構域β-酮還原酶(KR)結構域，它將β-酮基還原成羥基，脫水酶(DH)結構域，它作用于羥基以形成雙鍵，以及烯酰還原酶(enoyl reductase)(ER)結構域，它還原雙鍵以形成飽和的碳。可預測模塊3和6中存在的β-酮加工結構域是無活性的，因為這些結構域的作用沒有體現在最終結構上。最終的延伸模塊(延伸模塊14)似乎不包括任何β-酮-加工結構域。雷帕霉素生物合成的啟動是通過4，5-二羥基環己-1-烯羧酸的并入(incorporation)進行的，后者是由莽草酸途徑衍生的(Lowden，P.A.S.，等2001)，并且是其他FKBP-結合分子諸如FK506和FK520所共有的(common)(圖2)。在聚酮化合物的生物合成之后，由rapP編碼的NRPS模塊結合了六氫吡啶羧酸(L-賴氨酸衍生的)，它通過酰胺鍵稠合在聚酮化合物主鏈的最后一個乙酸上(Paiva等，1993)。隨后通過內酯化作用形成大環。
三種雷帕霉素PKS基因、NRPS-編碼基因和側翼晚期基因(flanking lategene)序列的每一種的核苷酸序列以及相應的多肽在Aparicio等，1996，和Schwecke等，1995中鑒定，并且由NCBI以保藏號X86780保藏，對該序列的修正最近已經在WO 04/007709中公開。
雷帕霉素生物合成基因簇的第一種無酶產物已經被命名為前-雷帕霉素(WO 04/007709，Gregory等，2004)。全面加工過的雷帕霉素的生產需要通過由雷帕霉素晚期基因所編碼的酶，RapJ，RapN，RapO，RapM，RapQ和RapI對聚酮化合物/NRPS核心進行額外加工。
雷帕霉素具有重要的藥理學價值，因為該化合物表現出寬的活性光譜；這強調了制備所述藥物的新型類似物的必要性。雷帕霉素表現出中等抗真菌活性，主要是抗念珠菌屬(Candida)的菌種，不過還能抗絲狀真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)。雷帕霉素通過靶向多種細胞類型中的信號傳導途徑，例如，通過抑制使細胞周期從G1期發展到S-期的信號傳導途徑來抑制細胞增殖(Kuo等，1992)。在T細胞中，雷帕霉素抑制來自IL-2受體的信號傳導和隨后的導致免疫抑制的T細胞自發增殖。雷帕霉素的抑制作用并不局限于T細胞，因為雷帕霉素能抑制多種哺乳動物細胞類型的增殖(Brunn等，1996)。因此，雷帕霉素是有效的免疫抑制劑，在預防器官同種異體移植排斥和治療自身免疫疾病方面具有已經確定的或推測的治療應用(Kahan等，1991)。40-O-(2-羥基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，Certican，everolimus)是半合成的雷帕霉素類似物，它表現出免疫抑制藥理學作用(Sedrani，R.等，1998；Kirchner等，2000；U.S.5,665,772)。該藥物于2003年在歐洲獲得批準，并且預計不久將在美國上市。雷帕霉素酯CCI-779(Wyeth-Ayerst)在體外抑制細胞生長，并且在體內抑制腫瘤生長(Yu等，2001)。CCI-779目前正處在第III階段臨床試驗。雷帕霉素在治療慢性斑塊性銀屑病方面的價值(Kirby and Griffiths，2001)，在諸如刺激PC12細胞的神經突長出方面的潛在用途(Lyons等，1994)，在機械損傷之后通過血管和平滑肌細胞阻斷對細胞因子的增殖響應(Gregory等，1993)，以及它在預防同種異體移植纖維化方面的作用(Waller and Nicholson，2001)是強化研究的領域(Kahan and Camardo，2001)。最近的報導揭示了雷帕霉素與進行長期免疫抑制治療的器官同種異體移植患者與進行其他免疫抑制方案的患者相比較低的癌癥發病率相關，并且這種降低的癌癥發病率歸因于抑制了血管生成(Guba等，2002)。已報導親免素(immunophilin)配體的神經營養活性獨立于它們的免疫抑制活性(Steiner等，1997)，并且神經生長刺激作用通過成熟類固醇受體復合物的破壞而得到促進，正如在專利申請WO01/03692中所概括的。已經報導了諸如高脂血癥和血小板減少癥以及潛在的致畸效應的副作用(Hentges等，2001；Kahan and Camardo，2001)。
在高等真核生物中，雷帕霉素通過抑制p70S6k激酶，一種絲氨酸/蘇氨酸激酶來影響細胞內的信號傳導級聯反應，所述酶使核糖體蛋白S6磷酸化(Ferrari等，1993；Kuo等，1992)。S6蛋白位于核糖體40S亞基中，并且據信是與tRNA和mRNA結合相關的重要功能位點。已經推測了由p70S6k通過S6磷酸化作用對mRNA翻譯產生的調控作用(Kawasome等，1998)。雷帕霉素通過它對其他生長相關事件的影響來抑制蛋白合成，包括細胞周期蛋白-依賴性激酶活性，cAMP-響應元件調節子(CREM)的磷酸化，和伸長因子結合蛋白4E-BP1(PHAS1)的磷酸化(Hung等，1996)。所述藥物誘導與翻譯起始因子elF-4E結合的4E-BP1的脫磷酸化種類的積累，因此，抑制cap-依賴性rRNAs的翻譯起始(Hara等，1997；Raught等，2001)。
迄今為止所表征的雷帕霉素的藥理學作用據信是通過與被稱為FKBP或親免素的細胞液受體的相互作用介導的。親免素(該術語用于表示免疫抑制劑結合蛋白)催化順式和反式肽酰-脯氨酸鍵的異構化，并且屬于存在于多種生物中的酶的高度保守的家族(Rosen and Schreiber，1992)。FKBP和親環素表示兩大類屬于親免素家族的酶(Schreiber and Crabtree，1992)。真核T-細胞中的主要細胞內雷帕霉素受體是FKBP12(DiLeIIa and Craig，1991)，并且所得到的復合物特異性地與靶蛋白相互作用，以抑制細胞的信號轉導級聯反應。對FKBP12-雷帕霉素復合物的晶體結構進行分析，已經鑒定了稱作′結合結構域′的雷帕霉素-結合藥效團(pharcophore)(Van Duyne等，1993)(參見圖1)。′結合結構域′是與親免素相互作用所需要的，并且由包括酯鍵，六氫吡啶羧酸-衍生的環，二羰基(dicarbonyl)和半酮縮醇環(hemiketal ring)的C-1至C-14區組成。所述相互作用的特征是，很多疏水性接觸，以及一些氫鍵，包括與環己烷環上的羥基結合的氫鍵。所述哌可啉基(pipecolinyl)環(C2-N7)穿入蛋白最深，其中，它周圍是高度保守的內襯疏水結合腔(binding cavity)的芳族氨基酸殘基。C1和C8羰基都參與了氫鍵結合，而C9羰基突出進入由FKBP12中三個完全保守的芳族氨基酸殘基(一個酪氨酸和兩個苯丙氨酸殘基)形成的凹穴(pocket)。與靶蛋白相互作用的親免素-配體復合物的結構域從FKBP上突出。
大部分親免素都沒有表現出直接與免疫抑制活性相關，并且對有關它們的天然配體的了解相對較少，盡管已經報導了被稱為FKBP-相關蛋白(FAP)的FKBP的天然配體的候選物，如FAP48和FAP1。在形成復合物期間FAP與FKBP之間的特異性相互作用以劑量依賴性方式受到了雷帕霉素的抑制(Chambraud等，1996；Kunz等，2000)。親免素似乎在多種細胞活性中起作用，例如蛋白折疊；蛋白的組裝和運輸；分子復合物包括熱休克蛋白的共調節；類固醇受體；離子通道；細胞-細胞相互作用和基因的轉錄和翻譯(Galat2000；Hamilton and Steiner 1998)。所有親免素都具備肽酰-脯氨酰順-反異構作用的蛋白折疊特性，并且發現，若干親免素位于內質網中，它是細胞中蛋白合成的主要位點。除了FKBP12(U.S.5,109,112)之外，其他親免素包括FKBP12.6(U.S.5,457,182)，FKBP13(Hendrickson等，1993；U.S.5,498,597)，FKBP25(Hung and Schreiber，1992；Jin等，1992)，FKBP14.6(U.S.5,354,845)，FKBP52(U.S.5,763,590)，FKBP60(Yem等，1992)和FKBP65(Patterson等，2000)。
已經在酵母中鑒定了雷帕霉素-FKBP12復合物的靶物，稱為TOR(雷帕霉素的靶物)(Alarcon等，1999)，并且將哺乳動物蛋白稱作FRAP(FKBP-雷帕霉素相關蛋白)或mTOR(雷帕霉素的哺乳動物靶物)(Brown等，1994)。所述蛋白顯示與磷脂酰肌醇3-激酶的磷酸轉移酶結構域的顯著相似性，并且發現mTOR的FKBP12-雷帕霉素結合結構域(FRB)中的點突變破壞mTOR激酶活性，這提供了FRB參與激酶結構域功能的證據(Vilella-Bach等，1999)。已經獲得了具有包括FRB結構域的mTOR截短形式的FKBP12-雷帕霉素的晶體結構(Chen等，1995)，因此定義了雷帕霉素的′效應子′結構域(Choi等，1996；Liang等，1999)。對晶體結構進行的分析發現與雷帕霉素和每個蛋白之間的相互作用相比，蛋白-蛋白接觸是比較有限的。沒有發現雷帕霉素和FRB之間的氫鍵。相互作用集中在雷帕霉素的三烯區和FRB的主要芳族殘基之間的一系列疏水性接觸上(Liang等，1999)。雷帕霉素嵌入最深的原子是結合在C23上的甲基(參見圖1)。雷帕霉素的C23-C34區和環己基環形成了與FRB的疏水性接觸。在二元和三元絡合物之間存在雷帕霉素的小的構象變化是明顯的(Liang等，1999)。
檢測到了在C16甲氧基上修飾過的雷帕霉素類似物的生物學效應和它們結合FKBP12的能力之間的趨異性(divergence)，并且推測了C16取代基在FKBP12和mTOR之間的界面空間中的位置(Luengo等，1995)。具有非-免疫抑制28-O-甲基雷帕霉素的FKBP12的晶體結構分析，揭示了環己基環的取向的重大差異，它可能導致mTOR結合的破壞(Kallen等，1996)。
已經描述了mTOR信號傳導和神經元中的定位蛋白合成之間的聯系；它對參與翻譯控制的蛋白磷酸化狀態的影響；翻譯機構(translation machinery)的成分在轉錄和翻譯水平上的豐度；氨基酸透性酶活性的控制，以及參與代謝途徑的多種酶的轉錄調節(Raught等，2001)。雷帕霉素敏感型信號傳導途徑似乎還在胚胎大腦發育，學習和記憶形成方面發揮重要作用(Tang等，2002)。在酵母中對TOR蛋白的研究也已發現了它們在調節營養物敏感型信號傳導途徑中的作用(Hardwick等，1999)。類似地，已將mTOR鑒定為蛋白激酶B(akt)作用的直接靶物，并且在胰島素信號傳導中起著關鍵作用(Shepherd等，1998；Navé等，1999)。也已將哺乳動物TOR與肌動蛋白細胞骨骼的極化和翻譯起始的調控相關(Alarcon等，1999)。磷脂酰肌醇3-激酶，如mTOR，在腫瘤病理學的若干方面起作用，如細胞-周期進展，粘附，細胞存活和血管生成(Roymans and Siegers，2001)。
存在于不同細胞類型中的多種FKBP還強調分離具有潛在改變的結合和/或效應子結構域的新型FKBP-配體類似物的效用。例如，正是旋轉異構酶FKBP52的抑制作用，形成了類固醇受體復合物的一部分，這已經被確認為雷帕霉素類似物(以及其他結合FKBP12的化合物)調節神經再生和神經突長出的機制(WO 01/03692)。
雷帕霉素和雷帕霉素類似物的藥物動力學研究已經證實需要開發新型雷帕霉素化合物，該化合物在溶液中更穩定，具有更高的對于代謝攻擊(metabolic attack)的抗性和/或具有改善的生物利用率。利用化學可利用位點修飾雷帕霉素已經進行過廣泛的研究(參見下文)。不過，該方法局限于可用于化學修飾的少數部位，并且進一步受到它的效用的限制，因為在分子上存在其他反應性位點的情況下難于對特定位置進行選擇性修飾。
已經報導了利用所述分子的化學可利用位點的多種合成的雷帕霉素類似物。以下化合物的說明適合圖1所示的雷帕霉素分子的編號系統。所述分子上的可用于衍生化或置換的化學可利用位點包括C40和C28羥基(例如，U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)，C39和C16甲氧基(例如，WO 96/41807；U.S.5,728,710)，C32，C26和C9酮基(例如，U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)。在C17，C19和/或C21上的氫化，對三烯的靶向，導致了抗真菌活性的保留，不過相對損失了免疫抑制作用(例如，U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)。通過衍生化已經獲得了所述分子穩定性(例如，在C32，C40和/或C28上形成肟，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048)，對代謝攻擊的抗性(例如，U.S.5,912,253)，生物利用率(例如，U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO98/04279)和藥物前體(prodrug)產生(例如，U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)的顯著改善。然而，化學修飾需要大量的雷帕霉素模板，并且，作為堿性和酸性不穩定化合物，它是難于處理的。由于化學衍生化可以是組選擇性的，它通常難于是位點選擇性的。因此，化學修飾通常需要多個保護和脫保護步驟，并且能夠以可變的產量產生混合產物。
生產新型雷帕霉素類似物的生物學方法最初是緩慢生產的，因為在用生產生物的操作(working)中遇到難題(Lomovskaya等，1997；Kieser等，2000)，盡管可以利用來自吸濕鏈霉菌的雷帕霉素的生物合成基因簇的序列(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。本發明人的最近的專利申請描述了通過操作后PKS修飾基因獲得的比以前通過修飾雷帕霉素生物合成途徑所能獲得的更寬范圍的雷帕霉素類似物(WO 04/007709)。通過用其他物質取代整合到雷帕霉素結構中的雷帕霉素PKS的天然啟動酸還可以獲得其他類似物(WO04/007709)。盡管上述方法提供了接近雷帕霉素分子周圍的明顯更多的化學空間的途徑，該技術不能允許修飾由I型聚酮化合物合酶基因編碼的雷帕霉素分子的核心構架。
也已經描述了利用諸如生物轉化和基于噬菌體的遺傳學修飾的其他生物學方法分離雷帕霉素類似物。從突變菌株和生產雷帕霉素的菌株中分離次要(minor)代謝物，已經提供了少量雷帕霉素類似物。這些菌株通常是低產量的，并且產生雷帕霉素類似物的混合物。報導了從吸濕鏈霉菌NCIMB 40319的培養上清液中分離27-O-去甲基雷帕霉素和27-去甲氧基雷帕霉素(Box等，1995)。27-O-去甲基雷帕霉素的抗真菌活性比雷帕霉素的活性低，不過，FKBP12 PPIase活性的抑制似乎提高了。與雷帕霉素相比，ConA-刺激的鼠脾T細胞增殖的抑制和LPS-刺激的鼠脾B細胞增殖的抑制減弱了(Box等，1995)。類似地，雷帕霉素類似物脯氨酰雷帕霉素，27-O-去甲基雷帕霉素和27-去甲氧基雷帕霉素的抗真菌活性(雷帕霉素分子的編號系統如圖1所示)低于雷帕霉素的抗真菌活性(Wong等，1998)。在向培養物中添加細胞色素P450抑制劑和/或前體之后或在對分離的雷帕霉素進行生物轉化之后，還從游動放線菌屬(Actinoplanes)的菌種N902-109中分離了雷帕霉素類似物(16-O-去甲基雷帕霉素，27-O-去甲基雷帕霉素，39-O-去甲基雷帕霉素，16，27-O-雙去甲基雷帕霉素，脯氨酰雷帕霉素，26-O-去甲基脯氨酰雷帕霉素，9-脫氧雷帕霉素，27-去甲氧基雷帕霉素，27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素，9-脫氧-27-去甲氧基雷帕霉素，28-脫氫雷帕霉素，9-脫氧-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素)(Nishida等，1995)。不過，所述抑制劑的使用只允許靶向特定的酶功能，并且不是位點選擇性的，因此通常能得到產物混合物。通過這種方法不可能合理地生產單一選擇的類似物。所得到的雷帕霉素類似物混合物的生產而不是單一的所需產物的生產，還影響了產率。評估了所述化合物的混合淋巴細胞反應(MLR)抑制活性，并且在失去C27或/和C16上的甲基之后幾乎檢測不到對所述活性的影響。觀察到9-脫氧雷帕霉素活性的更顯著的降低；另外，C27上的甲氧基，C28上的羥基的失去，以及用脯氨酰取代六氫吡啶羧酸-衍生的基團，都導致了效力的減弱(Nishida等，1995)。類似地，已經報導了雷帕霉素的生物轉化和16，39-O-雙去甲基雷帕霉素的分離(WO 94/09010)。使用在環己基環上修飾過的化合物，例如39-O-去甲基雷帕霉素和C40修飾，如SDZRAD和CCI-779進行的細胞增殖試驗中一些抑制活性的保留，，確定了所述分子的該區域是制備具有免疫抑制和抗癌特性的新型雷帕霉素類似物的目標。
已經報導了在向生產雷帕霉素的野生型吸濕鏈霉菌的培養物中添加環己烷羧酸，環庚烷羧酸，環己-1-烯羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環己-3-烯羧酸，3-羥基環己-4-烯羧酸和環庚-1-烯羧酸之后，產生了新型雷帕霉素類似物，因此說明了雷帕霉素聚酮化合物合酶的加載模塊中的靈活性(PAS.Lowden，Ph.D dissertation，University of Cambridge，1997；Lowden等，2004)。這些新型雷帕霉素類似物是以與天然起始物4，5-二羥基環己-1-烯羧酸競爭中產生的，導致了較低的產量和混合的產物。
通過將(±)哌啶甲酸添加到生產雷帕霉素的吸濕鏈霉菌NRRL5491中，來抑制L-六氫吡啶羧酸產生，并且同時添加含硫哌可酸鹽(pipecolate)類似物(S)-1，4-噻嗪烷-3羧酸或(S)-1，4-噻嗪烷-4羧酸從而分離了雷帕霉素的兩種新型含硫雷帕霉素類似物(Graziani等，2003)。
已經報導了采用噬菌體技術介導的方法分離兩種重組吸濕鏈霉菌菌株，所述菌株產生各種雷帕霉素類似物(Lomovskaya等，1997)。在存在添加的脯氨酸類似物的條件下，吸濕鏈霉菌rapL缺失突變體合成了新型雷帕霉素類似物脯氨酰雷帕霉素、4-羥基脯氨酰雷帕霉素和4-羥基脯氨酰-26-去甲氧基-雷帕霉素(Khaw等，1998)。類似地，新型雷帕霉素3-羥基-脯氨酰-雷帕霉素、3-羥基-脯氨酰-26-去甲氧基-雷帕霉素和反式-3-氮雜-二環[3，1，0]己烷-2-羧酸雷帕霉素已經從相同突變菌株的補料培養物中鑒定，如WO 98/54308中所述。在增殖試驗中評估了脯氨酰雷帕霉素和4-羥基脯氨酰-26-去甲氧基-雷帕霉素的活性，并且，后一種化合物的抑制活性明顯比雷帕霉素的抑制活性低(Khaw等，1998)。五個連續基因，rapQONML的缺失(負責C16，C27處的后-聚酮化合物修飾，和L-六氫吡啶羧酸的生產)以及利用基于噬菌體的方法用吸濕鏈霉菌ATCC29253上的新霉素抗性標記取代它們，導致了在補加六氫吡啶羧酸時產生16-O-去甲基-27-去甲氧基雷帕霉素(Chung等，2001)。沒有證實該缺失突變體的補償作用(complementation)。另外，在這項研究中沒有確定rapM或rapQ的位點特異性；因此，Chung等(2001)沒有實現需要在C16-OH或C27-OH的甲基化的雷帕霉素類似物的合理設計。所述基于噬菌體的方法存在多種缺陷，正如在下面更詳細地披露的，例如，自基因序列的公開九年時間中報道的僅僅三株重組吸濕鏈霉菌菌株。它存在獲得工程菌株的困難的和持久的過程，并且與本發明人較早申請中披露的方法(WO 04/007709)相比在實用方面受到顯著制約。
使用生物學方法操作雷帕霉素修飾基因的常規途徑包括在宿主菌株的染色體中單個基因的突變或缺失或/和單獨地或作為基因盒插入單個基因作為同源或異源基因的額外拷貝(WO 01/79520，WO 03/048375)。然而，使用所述生物學方法分離新型雷帕霉素類似物由于難于轉化生產雷帕霉素的生物體吸濕鏈霉菌而受到限制。已經報導了用質粒DNA轉化的常用方法或或接合轉移用于生產雷帕霉素的菌株是不成功的(Lomovskya等，1997，Schwecke等，1995，Kieser等，2000)。在WO 04/007709之前的現有技術的狀態使用Lomovskya等(1997)的方法，這是一種基于噬菌體的勞動力密集型方法，它受到了轉入吸濕鏈霉菌中的克隆的DNA片段大小的嚴重限制(Kieser等，2000)。該技術受限于轉移最大約為6.4kbp的克隆DNA。因此，在利用該技術補償缺失突變體時，技術人員受限于采用該大小極限內的遺傳材料，例如，除需要的啟動子，同源性區(如果需要的話)和抗性標記外，補償局限于兩種典型的功能基因(其大小通常各為大約1kbp)。WO 04/007709首次公開了用于有效轉化諸如吸濕鏈霉菌吸濕亞種NRRL5491的菌株的重組技術方法，該菌株包括雷帕霉素生物合成基因簇。在此之前，盡管從1995年雷帕霉素生物合成基因簇的遺傳信息就已經是可用的(Schwecke等，1995)，但迄今為止，在該領域所取得的進展有限(Khaw等，1998；Chung等，2001；WO 01/34816)。WO 04/007709描述了通過補償缺失突變體操縱雷帕霉素生物合成途徑并且生產多種雷帕霉素類似物的方法，其中，后-PKS加工的量是特異性變化的，并且可選擇地向菌株中加入外源啟動酸，在該菌株中，至少rapK已經缺失或失活。
以前的研究已經證實，聚酮化合物合酶(PKS)基因原則上可以進行操作，以便提供新型聚酮化合物。這些改變包括●缺失已經顯示紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)中的生產紅霉素的(ery)PKS的模塊5的KR結構域的DNA編碼部分的框內缺失導致了紅霉素類似物的形成，即5，6-雙脫氧-3-α-碳霉糖基-5-氧紅霉內酯B(5，6-dideoxy-3-α-mycarosyl-5-oxoerythronolide B)和5，6-雙脫氧-5-氧紅霉內酯B(5，6-dideoxy-5-oxoerythronolide B)(Donadio等，1991)。
●單個結構域的失活通過對相應的編碼PKS的DNA進行遺傳工程改造并且將它導入紅色糖多孢菌，改變ery PKS的模塊4上的ER結構域的活性位點殘基，導致了6，7-脫水紅霉素C的產生(Donadio等，1993)。
●加載模塊交換WO 98/01546公開了用來自除蟲菌素(avermectin)(ave)PKS的加載模塊取代ery PKS的加載模塊，以便產生雜合體I型PKS基因，其整合了不同的起始單位，以便制備新型紅霉素類似物。制備了雜合的tylactone加載/platenolide聚酮化合物合酶(Kuhstoss等，1996)，其將甲基丙二酰-CoA的tylactone加載模塊的特異性成功地轉移到platenolide分子上。在WO00/00618中公開了KSQ功能的說明(Bisang等，1999)以及含有KSQ的加載模塊的操作。也已經在WO 03/070908中描述了棘甙(spinosyn)生物合成途徑中的加載模塊交換。
●AT交換Oliynyk等，(1996)和WO 98/01546描述了AT結構域交換，其中紅霉素模塊1AT被雷帕霉素模塊2的AT結構域取代并相應改變了延長單位(extender unit)的模塊1的特異性。例如，已經描述了紅霉素聚酮化合物合酶(WO 98/01546，Ruan等，1997；Stassi等，1998)和棘甙聚酮化合物合酶(WO03/070908)中的其他AT結構域交換。
●還原性環交換例如，在WO 98/01546，WO 00/01827和Kao等，(1997)中描述了在每一次縮合期間形成的β-酮基的還原處理量的改變。
●結構域交換方法的組合在McDaniel等，(1999)中舉例說明。
●定點誘變WO 02/14482，Reeves等，(2001)，Reid等，(2003)和Del Vecchio等，(2003)證實了可以通過特定殘基的選擇的誘變影響AT結構域的底物特異性。
●環縮作用例如，使用不完整的模塊聚酮化合物合酶(Kao等1994)，或移動紅霉素PKS的模塊1，2，3，5或6的紅霉素鏈終止硫酯酶結構域下游(Cortés等，1995；Kao等，1995；Kao等，1996；Bhm等，1998)，導致了預期的截短的紅霉素分子的產生。
●環擴大將雷帕霉素模塊插入紅霉素PKS模塊1和2之間的紅霉素PKS的第一個ORF，導致了預期的16-員大環內酯的產生(Rowe等，2001)。
PKS簇的修飾并不局限于上文所述。
不過，已經發現，并非PKS基因的所有操作都能產生預期的新型類似物。當Donadio等(1993)使紅霉素PKS的烯酰還原酶(ER)結構域失活時，所得到的脫水-類似物不能完全加工，因為它不再是碳霉糖-O-甲基轉移酶的底物。類似地，改變聚酮化合物起始單位，在地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)中阻止了利福霉素(rifamycin)類似物的完整的延伸以及加工(Hunziker等，1998)。
如果雷帕霉素類似物可以通過對生物合成簇中的聚酮化合物合酶基因進行工程改造來制備，它們將是非常理想的，因為推測它們具有令人感興趣的生物學活性。
雷帕霉素生物合成簇的序列首先于1995年公開(Schwecke等；Aparicio等，1996)。盡管有大量上述有關PKS操作的現有技術，迄今為止還沒有報導雷帕霉素簇的核心聚酮化合物合酶的成功的聚酮化合物工程改造。雷帕霉素的生產菌吸濕鏈霉菌，是難于操作的生物(Lomovskaya等，1997)。
在US 6,670,168中要求了被修飾以產生17-去甲基雷帕霉素的宿主細胞，不過，該專利缺少如何制備該化合物的任何說明或工作實施例，只是假設這種菌株可以通過取代模塊10的AT結構域來構建。假設在該位置上的取代可以導致17-去甲基雷帕霉素的事實對任何本領域技術人員來說是顯而易見的，但考慮到上文所強調的困難，如何進行這種取代并非顯而易見，并且在US6,670,168中沒有提供對這種作用的教導。鑒于用吸濕鏈霉菌操作的公知困難，以及缺少如何制備這種重組宿主菌株的詳細說明，顯然只是對這些作者所希望取得的進行了描述，而未能披露所述菌株。另外，US 6,670,168沒有為本領域技術人員提供有關如何制備或分離17-去甲基雷帕霉素的任何教導。有關雷帕霉素類似物的生物合成的技術狀態局限于WO 04/007709，其中對編碼后PKS修飾酶的基因進行操作，以及描述添加外源啟動酸用于整合到雷帕霉素中的相關申請。在對雷帕霉素的PKS進行工程改造方面的進展的總體性缺乏是由于轉化生產生物吸濕鏈霉菌NRRL5491的技術難度造成的。
本發明涉及17-去甲基雷帕霉素及其類似物的制備。獲得17-去甲基雷帕霉素類似物需要對雷帕霉素PKS進行工程改造。在該技術的當前狀態中并非顯而易見的是，可以完成產生所述菌株所需要的工程改造。在本發明中，最初的目標是對吸濕鏈霉菌MG2-10進行工程改造。當如WO 04/007709和Gregory等(2004)所公開的添加外源酸3，4-二羥基環己烷羧酸時，吸濕鏈霉菌MG2-10能產生前-雷帕霉素。對該生物體進行了工程改造，以制備工程菌株，在添加外源酸3，4-二羥基環己烷羧酸時，該菌株能產生17-去甲基前-雷帕霉素。技術的當前狀態教導了如何將該菌株作為通過晚期基因盒(late gene cassette)進行互補的基礎菌株(WO 04/007709)和/或作為添加外源酸(WO 04/007709)并產生其他雷帕霉素類似物的基礎菌株用于其他實驗，但是沒有教導如何通過PKS工程改造用吸濕鏈霉菌制備這種菌株。令人驚訝地，與Oliynyk等，1996所描述的技術類似，本發明描述了可將PKS工程改造方法成功地應用于雷帕霉素PKS。這一結果是出乎預料的，因為上述重組DNA技術以前從未成功地應用于吸濕鏈霉菌。生產17-去甲基前-雷帕霉素類似物的菌株的制備，是通過晚期基因框進行互補的有用的基礎菌株(WO 04/007709)和/或作為添加外源酸的基礎菌株(WO 04/007709)。上述每一種雷帕霉素類似物然后可以通過半合成進一步修飾。這是一種真正的組合方法的首次驗證，該方法可用于制備雷帕霉素類似物文庫，它可以在下列一種或多種進行改變PKS工程改造水平，輔助基因水平，啟動酸摻入，氨基酸摻入，以及該分子上的可接觸的化學官能度，對于半合成方法來說這些功能度仍然是可以接觸的。

發明內容
一方面，本發明提供了17-去甲基雷帕霉素及其類似物，具體地講，本發明提供了根據下式的17-去甲基雷帕霉素類似物 其中x表示直接鍵，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-X-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示選自下組的結構片段A，B，C，D，E和F，
其中波形線表示片段結合位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，鹵基，硫醇或C1-4烷基；或R4可替換地表示5-至7-員雜環，其包括選自下組的一個或多個雜原子O，S和N，所述雜環是用選自C1-4烷基，OH，F和Cl的一個或多個取代基任選取代的；和R5和R6各自獨立地為H或OH，或其可以藥用的衍生物。
另一方面，本發明提供了用本發明方法制備的17-去甲基雷帕霉素類似物的文庫。
所述新型雷帕霉素類似物是直接使用的，以及作為模板用于其他半合成或生物轉化，來產生化合物，該化合物可用作免疫抑制劑，抗真菌劑，抗癌劑，抗炎劑，神經再生劑或用于治療移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，血管疾病和纖維變性疾病的試劑或用于調控傷口愈合的試劑。
另一方面，本發明提供了將17-去甲基雷帕霉素或其類似物用于醫藥的用途。另一方面，本發明提供了將17-去甲基雷帕霉素或其類似物用于制備藥物的用途，所述藥物用于誘導或維持免疫抑制作用，刺激神經元再生或癌癥治療，B-細胞惡性腫瘤，真菌感染，移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，炎性疾病，血管疾病或纖維變性疾病，或用于調控傷口愈合。
在一種實施方案中，17-去甲基雷帕霉素或其類似物被用于組合治療，所述組合治療用于誘導或維持免疫抑制作用，刺激神經元再生或癌癥治療，B-細胞惡性腫瘤，真菌感染，移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，炎性疾病，血管疾病或纖維變性疾病，或用于調控傷口愈合。
本發明還提供了藥物組合物，其包括17-去甲基雷帕霉素或其類似物，或可以藥用的鹽連同可以藥用的載體。
另一方面，本發明還提供了用于生產17-去甲基雷帕霉素或其類似物的方法，所述方法包括(a)用丙二酰-CoA-特異性AT結構域取代雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域，(b)在合適的宿主細胞中表達工程改造的雷帕霉素PKS，
(c)在能產生17-去甲基雷帕霉素或其類似物，包括選擇性地提供外源前體的條件下，培養所述宿主細胞，(d)任選地分離由此產生的化合物。
在優選實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素(monensin)，spinosyn，FK506，紅霉素，FK520，兩性霉素(amphotericin)，安哥拉霉素(angolamycin)，泰樂菌素(tylosin)，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素和FK506。在更高度優選的實施方案中，所述AT結構域選自下組雷帕霉素模塊2，莫能菌素模塊3，莫能菌素模塊6，莫能菌素模塊8，FK506模塊3和FK506模塊7。在最高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域來自雷帕霉素的模塊2。
本領域技術人員可以理解的是，該轉化可嘗試用于多種丙二酰-CoA選擇性酰基轉移酶結構域中的任意一種，所述結構域來自任何I型PKS或混合的NRPS/PKS。本領域技術人員還可以理解的是，丙二酰-CoA通過模塊10AT的摻入可以通過使天然rap AT10突變以改變它們的特異性來實現，例如，使用如WO 02/14482中所述的方法，或通過用包括對丙二酰-CoA具有選擇性的AT結構域的模塊取代完整的模塊10來實現，所述模塊包括天然模塊和組合模塊。
另一方面，本發明提供了制備重組菌株的方法，該菌株包括編碼工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇，其中，模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代。在優選實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列PKS簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素，FK506，紅霉素，FK520，兩性霉素，安哥拉霉素，泰樂菌素，′hyg′，FK523，metidamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素，FK506。在更高度優選的實施方案中，所述AT結構域選自下組雷帕霉素模塊2，莫能菌素模塊3，莫能菌素模塊6，模塊8，FK506模塊3和FK506模塊7。在最高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域來自雷帕霉素的模塊2。
盡管本文已經在吸濕鏈霉菌MG2-10(該菌株的制備在WO 04/007709和Gregory等，(2004)中公開)中舉例說明了雷帕霉素聚酮化合物合酶途徑的工程改造，但本領域技術人員可以理解的是，這些方法可同樣應用于野生型吸濕鏈霉菌NRRL5491和其他相關菌株。優選的工程菌株選自下組吸濕鏈霉菌MG2-10和吸濕鏈霉菌NRRL 5491。
本發明以上方面的一種實施方案提供了用于生產17-去甲基雷帕霉素及其類似物的方法，以及制備重組菌株的方法，所述菌株包含編碼工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇，所述方法包括以下附加步驟(a)分離待導入的AT作為具有合適的側翼限制位點單DNA片段，(b)利用合適的限制位點擴增并且分離與目標AT的側翼序列同源的DNA序列的區域，(c)將如(a)和(b)中所述三種DNA片段連接在一起，以得到LHS同源性，隨后是供體AT結構域，隨后是RHS同源性的框內序列，(d)將來自(c)的完整序列導入用于導入宿主菌株的載體，以得到最終質粒，所述質粒包括i)用于接合的oriT，ii)一種或多種抗性標記，iii)溫度敏感型復制起點，以便可以通過在37℃下培養選擇整合體，和iv)大腸桿菌復制起點，(e)使用如上面(d)中所述的最終質粒通過接合轉化所述宿主菌株，(f)通過對相關抗生素的抗性選擇轉化體，(g)通過在37℃培養，用抗生素選擇產生初級整合體，(h)同樣在37℃，通過在不存在抗生素選擇的條件下生長篩選次級重組體，(i)通過它產生目標產物的能力鑒定需要的菌株，和(i)任選地通過標準方法驗證所述菌株的遺傳學。
另一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，和；(b)在適合聚酮化合物生產的條件下將非天然啟動酸加入所述重組菌株的培養物，和(c)任選地分離由此產生的化合物。
因此，本發明提供了用于制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，該類似物整合了非天然啟動酸。在優選實施方案中，所述重組菌株已進行了rapK缺失或失活。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株進行了rapK缺失或失活，而補料給該菌株的非天然啟動酸選自下組環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在一種實施方案中，所述菌株不是產生17-去甲基雷帕霉素的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。在另一種實施方案中，所述菌株不是能在不提供外源前體的條件下產生17-去甲基雷帕霉素的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。
另一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代(如上文更詳細地描述)，(b)附加地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)培養由此獲得的菌株，如果需要的話，任選在存在外源前體的條件下培養，以生產17-去甲基雷帕霉素類似物，和(d)任選地分離由此產生的化合物。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapI，rapJ和rapQ。在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapJ，rapM和rapQ。
另一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代(如上文更詳細地描述)，(b)附加地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)沿反式方向重新導入輔助基因的全部或亞組，以補償或部分補償所述缺失，(d)培養由此獲得的菌株，如果需要的話，任選地在存在外源前體的條件下培養，以生產17-去甲基雷帕霉素類似物，和
(e)任選地分離由此產生的化合物。
在優選實施方案中，在步驟(b)中，使所有的雷帕霉素輔助基因缺失或失活。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是與選自下組的一個或多個輔助基因遺傳互補的rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同系物。在特定實施方案中，所述菌株是與所有所述的輔助基因互補的。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是與輔助基因rapK，rapM，rapN，rapO和rapL或其同源物遺傳互補的。在可替換的優選實施方案中，所述重組菌株是與雷帕霉素輔助基因rapK，rapI，rapN，rapO和rapL或其同源物遺傳互補的。
在本發明的另一方面，將上述修飾組合，因此，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)附加地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)任選地沿反式方向重新導入輔助基因的全部或亞組，以補償或部分補償所述缺失，(d)在生產聚酮化合物的合適條件下將非天然啟動酸供給所述重組菌株，和(e)任選地分離由此產生的化合物。
在優選實施方案中，已經缺失或失活的一個(或多個)輔助基因包括rapK。
在優選實施方案中，在步驟(b)中，使所有雷帕霉素輔助基因缺失或失活。在特定方面，本發明提供了通過對重組菌株進行遺傳互補用非天然啟動酸制備17-去甲基雷帕霉素類似物的替代方法，其中所有雷帕霉素輔助基因已經用雷帕霉素輔助基因rapI，rapJ，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物缺失或失活，這產生了包含除了rapK以外的所有輔助基因的菌株，并且供給外源啟動酸。在優選實施方案中，所述外源非天然啟動酸是環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸是環庚烷羧酸。在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸選自下組3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在另一種實施方案中，本發明提供了用輔助基因活性和非天然啟動酸的組合制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法。在優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapM和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸是環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，供給具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，供給具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然啟動酸是環庚烷羧酸。在優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapM和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK和rapM，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapM，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI，rapJ和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapJ，rapM和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種實施方案中，本發明提供了通過對重組菌株進行遺傳互補制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，在所述重組菌株中，所有雷帕霉素輔助基因已經用選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物中的一個或多個輔助基因連同供給的天然或非天然啟動酸缺失或失活。在優選實施方案中，所述重組菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的非天然啟動酸環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在優選實施方案中，所述重組菌株是用rapJ，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的非天然啟動酸環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中所述重組菌株是用rapJ，rapM，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸與3-甲基環己烷羧酸一起。
在另一種優選實施方案中所述重組菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中所述重組菌株是用rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中所述重組菌株是用rapM，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用rapI，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
另一方面，本發明提供了用于制備17-去甲基雷帕霉素類似物的文庫的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)任選地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)任選地將全部或亞組雷帕霉素輔助基因沿反式方向重新導入，以便補償或部分補償所述缺失，(d)將一系列非天然啟動酸供給所述重組菌株的生產培養物，以制備多種17-去甲基雷帕霉素類似物，(e)在合適條件下將天然或新型氨基酸供給所述重組菌株的生產培養物，從而生產聚酮化合物，(f)任選地分離由此產生的化合物，和(g)任選地對分離的雷帕霉素類似物進行半合成。
在下面的說明書、實施例和權利要求書中將更詳細地描述本發明的這些和其他實施方案。


圖1雷帕霉素的結構A是′結合結構域′，而B是′效應子結構域′。
圖2雷帕霉素(A)，FK506(B)，FK520(C)和meridamycin(D)的結構。
圖3MG2-10的遺傳工程以制備MG7-9。
圖4通過質譜碎裂39-去甲氧基-17-去甲基前-雷帕霉素。
圖517-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的LC-FT-ICR-MS分析。
圖617-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的LC-FT-ICR-MSn分析。
圖717-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的顯著NMR相關。
圖8質粒pLL150的示意圖。
定義在本文中使用冠詞″a″和″an″表示一種或一種以上(即至少一種)的該冠詞的語法實體。作為實例，″類似物″表示一種類似物或一種以上類似物。
如本文中使用的術語″類似物″表示在結構式與其他類似物相似但是在組成上略微不同的化合物(例如，一個原子被另一個原子取代或存在或不存在特定的官能團)。
如本文中使用的術語″17-去甲基雷帕霉素及其類似物″意圖包括以下結構式I范圍內的化合物 其中x表示直接鍵，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-x-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示選自下組A，B，C，D，E和F的結構片段，
其中，波形線指示片段結合位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，鹵基，硫醇或C1-4烷基；或R4還可以表示5-至7-員雜環，所述雜環包含選自O，S和N的一個或多個雜原子，所述雜環用選自C1-4烷基，OH，F和Cl的一個或多個取代基任選地取代；和R5和R6各自獨立地為H或OH，或其可以藥用的衍生物，該化合物以下被稱作″本發明的化合物″。
如本文中使用的術語″可以藥用的衍生物″包括可以藥用的鹽(例如，酸加成鹽)。它還包括涉及溶劑化物(例如，水合物)。
如本文中使用的術語″鹵基″包括氟，氯，溴和碘。
如本文中使用的術語″硫醇″包括基團SH。
除非另有說明，本文所提到的C1-4烷基可以是直鏈的，或者，在存在足夠數量的C-原子時(即最少3個)可以是分支的。所述C1-4烷基還可以被一個或多個鹵基(例如，氟)原子取代。
R4可表示的雜環基團的在性質上可為完全飽和的，部分不飽和的，全部芳族的或部分芳族的。所述基團還可以是單環的或，可能的話，是雙環的。可提及的雜環R4基團的意義可以包括二噁烷基(dioxane)，間二氧雜環戊烯基(dioxolyl)，呋喃基(furanyl)，六氫嘧啶基(hexahydropyrimidinyl)，乙內酰脲基(hydantoinyl)，咪唑基(imidazolyl)，異噁唑烷基(isoxazolidinyl)，異噁唑基(isoxazolyl)，馬來酰亞胺基(maleimido)，嗎啉基(morpholinyl)，噁二唑基(oxadiazolyl)，1，2-或1，3-oxazinanyl，噁唑基(oxazolyl)，哌嗪基(piperazinyl)，哌啶基(peperidinyl)，吡喃基(pyranyl)，吡嗪基(pyrazinyl)，吡唑基(pyrazolyl)，吡啶基(pyridinyl)，吡啶酮基(pyridonyl)，嘧啶基(pyrimidinyl)，吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)，吡咯烷基(pyrrolidinyl)，吡咯啉基(pyrrolinyl)，吡咯基(pyrrolyl)，二氧噻吩烷基(sulfolanyl)，3-二氧噻吩烯基(3-sulfolenyl)，四氫呋喃基(tetrahydrofuranyl)，四氫吡喃基(tetrahydropyranyl)，3，4，5，6-四氫吡啶基(3，4，5，6-tetrahydropyridinyl)，1，2，3，4-四氫嘧啶基(1，2，3，4-tetrahydropyrimidinyl)，3，4，5，6-四氫嘧啶基(3，4，5，6-tetrahydropyrimidinyl)，四唑基(tetrazolyl)，噻二唑基(thiadiazolyl)，噻唑烷基(thiazolidinyl)，噻唑基(thiazolyl)，噻吩基(thienyl)，和三唑基(triazolyl)等(例如，飽和的或部分不飽和的單環基團，如二噁烷基，間二氧雜環戊烯基，六氫嘧啶基，乙內酰脲基，異噁唑烷基，馬來酰亞胺基，嗎啉基，哌嗪基，哌啶基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，吡咯啉基，二氧噻吩烷基，3-二氧噻吩烯基，四氫呋喃基，四氫吡喃基，3，4，5，6-四氫吡啶基，1，2，3，4-四氫嘧啶基，3，4，5，6-四氫嘧啶基，和噻唑烷基等或，尤其是包括一個選自N，S或，特別是O的雜原子的飽和的單環基團，如哌啶基，吡咯烷基，四氫呋喃基，和四氫吡喃基等)。然而，在與本發明的化合物相關的具體實施方案中，R4表示選自下組的結構片段A，B，C，D，E和F(即它不表示雜環基團)。
如本文中使用的術語″修飾基因″包括聚酮化合物的后-聚酮化合物合酶修飾所需要的基因，例如，但不局限于，細胞色素P-450單加氧酶，鐵氧化還原蛋白和SAM-依賴型O-甲基轉移酶。在雷帕霉素系統中，所述修飾基因包括rapN，rapO，rapM，rapI，rapQ，和rapJ。本領域技術人員可以理解的是，這些基因的同源物存在于相關的生物合成基因簇中，并且還預期這些同源基因在本發明方法中的用途。
如本文中使用的術語″前體補償基因″包括供給所述天然或非天然前體所需要的基因，合成任何天然或非-天然整合的前體所需要的基因，以及整合任何天然或非-天然整合的前體所需要的基因。例如，但不局限于在雷帕霉素系統中，這些基因包括rapL，rapK，rapP和rapA。本領域技術人員可以理解的是，這些基因的同源物存在于相關生物合成基因簇中，并且還預期這些同源基因在本發明的方法中的用途。
如本文中使用的術語″輔助基因″包括涉及修飾基因，前體供給基因或同時包括修飾基因和前體供給基因。
如本文中使用的術語″前體″包括天然啟動酸(即4，5-二羥基環己-1-烯羧酸)，非天然啟動酸，天然整合的氨基酸(即六氫吡啶羧酸，脯氨酸)，非-天然整合的氨基酸，丙二酰-CoA和甲基丙二酰-CoA。
如本文中使用的術語″非-天然啟動酸″表示在聚酮化合物合成中可以作為啟動酸整合的任何化合物，它不是PKS通常選擇的啟動酸。
為了避免疑問，術語″前體″和″非-天然啟動酸″包括寡聚酮化合物(oligoketides)(例如，二聚酮化合物(diketide)和三聚酮化合物(triketides))的N-乙酰半胱胺硫酯(N-acylcysteamine thioester)，以及可以整合到最終產物中的羧酸的N-乙酰半胱胺硫酯或酯。
如本文中使用的術語″天然模塊″指一組從KS到ACP結構域的連續的結構域，其包括KS-AT-ACP(按該順序排列)并任選地包括一個或多個選自下組的結構域β-酮還原酶(KR)結構域，KR結構域和脫水酶(DH)結構域，以及KR結構域，DH結構域和烯酰還原酶(ER)結構域。
如本文中使用的術語″組合模塊″表示一組連續的結構域，它從天然模塊上的一個點延伸到隨后的模塊的相應的點，例如，從模塊A的AT結構域的起點到模塊B的AT結構域的起點，或從模塊B的KS結構域的中間到模塊C的KS結構域的中間。所述組合模塊可以是″雙重的″或較大的，即可以包括相同數量的結構域，如兩個或更多個天然模塊。
如本文中使用的術語″前-雷帕霉素″表示在任何修飾基因作用之前，通過雷帕霉素聚酮化合物合酶(包括rapA，rapB，和rapC)和rapP的活性產生的的最初的無酶產物，并尤其表示具有以下所示結構的化合物 如本文中使用的術語″自身免疫疾病″包括，但不局限于系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythrematosis)(SLE)，類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)，重癥肌無力(myasthenia gravis)和多發性硬化(multiple sclerosis)。
如本文中使用的術語″炎性疾病″包括，但不局限于牛皮癬(psoriasis)，皮炎(dermatitis)，濕疹(eczema)，皮脂溢(seborrhoea)，炎性腸病(inflammatorybowel disease)(包括，但不局限于潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)和克羅恩氏病(Crohn’s disease))，肺炎(pulmonary inflammation)(包括哮喘(asthma)，慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)，肺氣腫(emphysema)，急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome)和支氣管炎(bronchitis))和眼葡萄膜炎(eye uveitis)。
如本文中使用的術語″癌癥″表示新的惡性腫瘤生長，這些腫瘤來自上皮，存在于皮膚中，或者更常見的是存在于身體器官的襯里(lining)中，例如，乳房，前列腺，肺，腎，胰，胃，或腸。癌傾向于滲透到相鄰的組織中，并且擴散(轉移)到遠處的器官，例如，擴散到骨，肝，肺或大腦中。在本文中，術語癌同時包括轉移類型的腫瘤細胞，如，但不局限于，黑素瘤(melanoma)，淋巴瘤(lymphoma)，白血病(leukaemia)，纖維肉瘤(fibrosarcoma)，橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)，和肥大細胞瘤(mastocytoma)，以及各種類型的組織癌，如，但不局限于，結腸直腸癌，前列腺癌，小細胞肺癌和非-小細胞肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，腎癌，胃癌，神經膠母細胞瘤(gliobastoma)，原發性肝癌和卵巢癌。
如本文中使用的術語″B-細胞惡性腫瘤″包括一組疾病，所述疾病包括慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukaemia)(CLL)，多發性骨髓瘤(multiple myeloma)，和非-Hodgkin′s淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)。它們是血液和血液形成器官的腫瘤性疾病。它們導致骨髓和免疫系統功能障礙，使得宿主高度易受感染和出血。
如本文中使用的，術語″血管疾病″包括，但不局限于增殖過度血管疾病(hyperproliferative vascular disorder)(例如，再狹窄(restenosis)和血管閉塞(vascular occlusion))，移植血管動脈粥樣硬化(graft vascular atherosclerosis)，心血管疾病(cardiovascular disease)，腦血管疾病(cerebral vascular disease)和外周血管疾病(peripheral vascular disease)(例如，冠狀動脈病(coronary arterydisease)，動脈硬化(arteriosclerosis)，動脈粥樣硬化(atherosclerosis)，非動脈粥樣硬化的動脈硬化(nonatheromatous arteriosclerosis)或血管壁損傷)。
如本文中使用的術語″神經元再生″表示刺激神經細胞生長，并且包括神經突長出，和神經細胞的功能性恢復。神經元再生可具有重要治療益處的疾病和病癥包括，但不局限于，阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)，帕金森氏癥(Parkinson’s disease)，亨廷頓舞蹈病(Huntingdon′s chorea)，肌萎縮性脊髓側索硬化癥(amytotrophic lateral sclerosis)，三叉神經痛(trigeminal neuralgia)，舌咽神經痛(glossopharyngeal neuralgia)，貝耳氏麻痹(Bell’s palsy)，肌萎縮(muscular dystrophy)，中風(stroke)，進行性肌萎縮(progressive muscularatrophy)，進行性延髓繼承性肌萎縮(progressive bulbar inherited muscularatrophy)，頸椎病(cervical spondylosis)，Gullain-Barre綜合癥，癡呆(dementia)，周圍神經病(peripheral neuropathies)和周圍神經損傷(peripheral nerve damage)，無論是由物理損傷(例如，脊髓損傷或創傷(trauma)，坐骨或面神經損害或損傷)引起的或由疾病狀態(例如，糖尿病)引起的。
如本文中使用的術語″纖維變性疾病″表示與細胞外基質的過量產生相關的疾病，并且包括(但不局限于)結節病(sarcoidosis)，瘢痕疙瘩(keloid)，腎小球性腎炎(glomerulonephritis)，晚期腎病(end stage renal disease)，肝纖維癥(liver fibrosis)(包括，但不局限于硬化(cirrhosis)，酒精性肝病(alcohol liverdisease)和脂肪-肝炎(steato-heptatitis))，慢性移植腎病(chronic graftnephropathy)，血管病變(vasculopathy)，心纖維化(cardiac fibrosis)，肺纖維化(pulmonary fibrosis)(包括，但不局限于特發性肺纖維化(idiopathic pulmonaryfibrosis)和隱原性纖維化肺泡炎(cryptogenic fibrosing alveolitis))，黃斑變性(macular degeneration)，視網膜和玻璃體視網膜病變(retinal and vitrealretinopathy)和化療或輻射引起的纖維化。
如本文中使用的，術語″傷口愈合″表示在皮膚和其他軟組織損傷之后的修復過程，并且包括，但不局限于，手術后傷口的愈合，治療燒傷或肥大性或瘢痕疙瘩的疤痕，以及預防手術粘連。
本發明的說明一方面，本發明提供了17-去甲基雷帕霉素及其類似物，具體地，本發明提供了根據以下結構式的17-去甲基雷帕霉素類似物
其中x表示直接鍵，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-X-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示選自下組的結構片段A，B，C，D，E和F， 其中，波形線表示片段結合的位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，鹵基，硫醇或C1-4烷基；或R4還可以表示5-至7-員雜環，其包括選自下組的一個或多個雜原子O，S和N，所述雜環任選地用選自C1-4烷基，OH，F和Cl的一個或多個取代基取代；和R5和R6各自獨立地為H或OH，或其可以藥用的衍生物。
在一種實施方案中，R4表示選自下組的結構片段A，B，C，E和F(例如，選自下組的結構片段A，C，E和F)，如上文所定義的，其中，R7和R8是上文所定義的(例如，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，Cl或F(如H，OH，OMe或F))。
在另一種實施方案中R4表示選自下組的結構片段A(i)，C(i)，E(i)和F(i) 其中，R7和R8是上文所定義的(例如，R7表示H或OH，而R8表示H，OH或OMe)。
在另一種優選實施方案中，R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R8是H，而R7是H，OMe，或者尤其是OH。
在優選實施方案中，當R5表示OH時，R6表示H，而當R6表示OH時，R5表示H；x表示直接鍵，或者尤其是CH2。
在另一種實施方案中，R2表示OH。
在另一種實施方案中，R4表示在4位上具有氧的6-員環(即，四氫吡喃-4-基)。
本發明的化合物的優選實施方案是這樣的，其中R1表示(H，H)或＝O；R2表示OH或OMe；R3表示OH或OMe；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH，而R8表示H，OH或OMe；和x表示CH2。
在更高度優選的實施方案中R1表示(H，H)；R2表示OH；R3表示H；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH，而R8表示H；和x表示CH2。
在優選實施方案中R1表示(H，H)；R2表示OH；
R3表示H；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7和R8都表示OH；和x表示CH2。
在更高度優選的實施方案中R1表示(H，H)；R2表示OH；R3表示H；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH，而R8表示F；和x表示CH2。
在更高度優選的實施方案中R1表示＝O；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH而R8表示F或Cl；和x表示CH2。
在更高度優選的實施方案中R1表示＝O；R2表示OH；R3表示OMe；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH，而R8表示H；和x表示CH2。
在更高度優選的實施方案中R1表示＝O；R2表示OH；R3表示OH；R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH，而R8表示H；和x表示CH2。
在更高度優選的實施方案中R1表示＝O；R2表示OH；R3表示OMe；
R4表示結構片段C(i)，如上文所定義，其中R7表示OH，而R8表示OMe；和x表示CH2。
在一種實施方案中，所述化合物不是17-去甲基雷帕霉素。
與上述本發明的化合物所有實施方案相關，其中，基團R4表示取代的環己烷環，可被提及的其他實施方案包括，其中環己烷環上的取代基的相關立體化學是這樣的，以使每一個取代基(包括基團R4可以結合的聚酮化合物環)在環己烷環處于椅式構象時，可同時采取平伏位置(equatorial position)。因此，例如，可被提及的本發明的化合物包括以下化合物，其中結合在結構片段C，D，F，C(i)和F(i)的環己烷環的2-，4-和/或6-位的基團相對于結合在環己烷基團的1-位的聚酮化合物環來說是反式的。另外，可被提及的本發明的其它化合物包括以下化合物，其中，結合在結構片段C，D，F，C(i)和F(i)的環己烷環的3-和/或5-位的基團相對于結合在環己烷基團的1-位的聚酮化合物環來說是順式的。因此，可被提及的本發明的其它化合物包括以下化合物，其中，當基團R4表示結構片段C(i)時，相對于結合在環己烷環的1-位的聚酮化合物環來說，基團R7(如果存在，尤其是如果為OH或OMe基團的話)具有反式-立體化學，而基團R8(如果存在，尤其是如果為OH或OMe基團的話)具有順式-立體化學。類似地，當基團R4表示環己-3-烯環(即，結構片段A或A(i))時，可被提及的本發明的化合物包括以下化合物，其中，相對于結合在環己烯環的1位的聚酮化合物環來說，2-和/或6-位的取代基具有反式-立體化學，3-位的取代基具有順式-立體化學。
本領域技術人員可以理解的是，本文所描述的用于制備17-去甲基雷帕霉素及其類似物的方法可用于制備相關類似物的文庫。因此，另一方面，本發明提供了使用本發明的方法制備的17-去甲基雷帕霉素類似物的文庫。具體地，本發明提供了在下列一個或多個方面不同的17-去甲基雷帕霉素類似物的文庫整合的啟動酸，整合的氨基酸，后-PKS加工的程度和半合成衍生化。
所述新型雷帕霉素類似物是直接使用的，并且作為模板用于其他半合成或生物轉化，以產生化合物，該化合物可用作免疫抑制劑，抗真菌劑，抗癌劑，抗炎劑，神經再生劑，或用于治療移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，血管疾病和纖維變性疾病的試劑或用于調控傷口愈合的試劑。用于雷帕霉素及其類似物的半合成衍生化的方法為本領域所熟知，并且包括(但不局限于)在以下文獻中描述的改進，例如，U.S.5,665,772；U.S.5,362,718,WO 96/41807；U.S.5,728,710，U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772，U.S.5,391,730；U.S.5,023,262，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048，U.S.5,912,253，U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279，U.S.6,015,815和U.S.5,432,183)。
另一方面，本發明提供了17-去甲基雷帕霉素或其類似物在醫藥中的用途。另一方面，本發明提供了將17-去甲基雷帕霉素或其類似物在制備用于如下方面的藥品誘導或維持免疫抑制作用，刺激神經元再生或治療癌癥、B-細胞惡性腫瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維變性疾病或用于調控傷口愈合的制劑中的用途。
也已知雷帕霉素類似物可用于治療其他癥狀，包括，但不局限于淋巴管平滑肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis)和結節性硬化癥(tuberous sclerosis)。與本發明的化合物相關的用途和方法還擴展到這些其他適應證(indication)。
本領域技術人員可以通過常規試驗確定這些化合物可以抑制真菌生長的能力(例如，Baker，H.，等，1978；NCCLS Reference method for broth dilutionantifungal susceptibility testing for yeastsApproved standard M27-A，17(9)，1997)。另外，本領域技術人員可以通過常規試驗確定這些化合物抑制腫瘤細胞生長的能力(參見Dudkin，L.，等，2001；Yu等2001)。另一方面，本發明的化合物可用于誘導免疫抑制，用于確定化合物在這些方面的效力的試驗是本領域技術人員所公知的，例如，但不局限于免疫抑制劑活性-Warner，L.M.，等，1992，Kahan等(1991) & Kahan & Camardo，2001)；同種異體移植-Fishbein，T.M.，等，2002，Kirchner等2000；自身免疫/炎癥/哮喘-Carlson，R.P.等，1993，Powell，N.等，2001；I型糖尿病-Rabinovitch，A.等，2002；牛皮癬-Reitamo，S.等，2001；類風濕性關節炎-Foey，A.，等，2002；纖維化-Zhu，J.等，1999，Jain，S.，等，2001，Gregory等1993。
可在用于此目的的標準試驗中驗證本發明的化合物誘導免疫抑制的能力。另一方面，本發明的化合物可用于和抗纖維變性，神經再生和抗血管生成機制有關，本領域技術人員可以通過常規試驗確定這些化合物抑制血管發生(angiogenesis)的能力(例如，Guba，M.，等，2002)。本領域技術人員能夠通過常規試驗確定這些化合物治療血管過度增殖性疾病例如，用于支架(stent)(例如，Morice，M.C，等，2002)的應用。另外，本領域技術人員可以通過常規試驗確定這些化合物的神經再生能力(例如，Myckatyn，T.M.，等，2002，Steiner等1997)。
本發明還提供了藥物組合物，其包括17-去甲基雷帕霉素或其類似物，或它的可以藥用的鹽，連同可以藥用的載體的。
本發明的上述化合物或它的制劑可以通過任何常規方法施用，例如，但不局限于它們可以通過腸胃外，口服，局部(包括口腔，舌下，或透過表皮)，通過醫療器械(例如，支架)，通過吸入或通過注射(皮下或肌內)。所述治療可由單劑或在一段時間內多劑組成。
盡管本發明的化合物可以單獨施用，但它優選作為藥物制劑連同一種或多種可接受的載體存在。所述載體在與本發明的化合物兼容的意義上必須是可接受的，并且對它的受體是無害的。合適載體的例子在下文進行更詳細地描述。
本發明的化合物可以單獨或者與其他治療劑組合施用，兩種(或更多種)試劑的共施用用于顯著降低待施用的每一種的劑量，從而減少出現的副作用。
在一種實施方案中，將17-去甲基雷帕霉素或其類似物與另一種治療劑共施用，用于誘導或維持免疫抑制，用于治療移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病或炎性疾病，優選的試劑包括，但不局限于，免疫調節劑，例如，咪唑硫嘌呤(azathioprine)，皮質激素(corticosteroid)，環磷酰胺(cyclophosphamide)，環孢素A(cyclosporin A)，FK506，霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)，OKT-3和ATG。
在另一種實施方案中，將17-去甲基雷帕霉素或其類似物與另一種治療劑共施用用于治療癌癥或B-細胞惡性腫瘤，優選的試劑包括，但不局限于，氨甲喋呤(methotrexate)，亞葉酸(leukovorin)，阿霉素(adriamycin)，prenisone，博來霉素(bleomycin)，環磷酰胺，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，紫杉醇(paclitaxel)，多西紫杉醇(docetaxel)，長春新堿(vincristine)，長春堿(vinblastine)，長春瑞濱(vinorelbine)，多柔比星(doxorubicin)，他莫昔芬(tamoxifen)，托瑞米芬(toremifene)，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，阿納托唑(anastrozole)，戈舍瑞林(goserelin)，抗-HER2單克隆抗體(例如，赫賽汀(HerceptinTM))，卡培他濱(capecitabine)，鹽酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride)，EGFR抑制劑(例如，lressa，TarcevaTM，ErbituxTM)，VEGF抑制劑(例如，AvastinTM)，蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM)，Glivec或hsp90抑制劑(例如，17-AAG)。另外，17-去甲基雷帕霉素或其類似物可以與其他治療組合施用，所述的其它治療包括，但不局限于，放射治療或手術。
在一種實施方案中，將17-去甲基雷帕霉素或其類似物與另一種治療劑共施用，用于治療血管疾病，優選的試劑包括，但不局限于，ACE抑制劑，血管緊張素II受體拮抗劑(angiotensin II receptor antagonist)，纖維酸衍生物(fibricacid derivative)，HMG-CoA還原酶抑制劑，β腎上腺素能阻斷劑(adrenergicblocker)，鈣通道阻斷劑(calcium channel blocker)，抗氧化劑，抗凝血劑和血小板抑制劑(例如，波立維(PlavixTM))。
在一種實施方案中，將17-去甲基雷帕霉素或其類似物與另一種治療劑共施用，用于刺激神經元再生，優選的試劑包括，但不局限于，神經營養因子，例如，神經生長因子，神經膠質衍生的生長因子，大腦衍生的生長因子，纖毛神經營養因子和神經營養蛋白-3(neurotrophin-3)。
在一種實施方案中，將17-去甲基雷帕霉素或其類似物與另一種治療劑共施用，用于治療真菌感染；優選的試劑包括，但不局限于，兩性霉素B，氟胞嘧啶(flucytosine)，棘球白素(echinocandin)(例如，卡泊芬凈(caspofungin)，阿尼芬凈(anidulafungin)或米卡芬凈(micafungin))，灰黃霉素(griseofulvin)，咪唑或三唑抗真菌劑(例如，克霉唑(clotrimazote)，咪康唑(miconazole)，酮康唑(ketoconazole)，益康唑(econazole)，布康唑(butoconazole)，奧昔康唑(oxiconazole)，特康唑(terconazole)，伊曲康唑(itraconazole)，氟康唑(fluconazole)或伏力康唑(voriconazole))。
共施用包括作為相同治療方案的一部分給患者遞送兩種或兩種以上治療劑的任何方法，正如對于技術人員顯而易見的。盡管兩種或兩種以上藥劑可以在單一劑型同時施用，這樣做并非是必需的。所述藥劑可以以不同劑型并且在不同的時間施用。
所述制劑可方便地以單位劑型形式存在，并且可以通過藥學領域的任何公知方法來制備。所述方法包括以下步驟使活性成分(本發明的化合物)與構成一種或多種輔助成分的載體結合。一般，通過使活性成分均勻并且緊密地與液體載體或細碎的固體載體或這兩者結合，然后，如果需要的話對產品進行成型來制備所述制劑。
本發明的化合物通常是口服或通過任何腸胃外途徑，以包括所述活性成分的藥物制劑形式服用，任選地以無毒有機，或無機的，酸，或堿，加成鹽的形式，以可以藥用的劑型施用。根據待治療的疾病和患者，以及施用途徑，能夠以變化的劑量施用所述組合物。
例如，能夠以片劑，膠囊，胚珠(ovule)，酏劑，溶液或懸浮液的形式通過口服，口腔(buccally)，或舌下施用本發明的化合物，它還可以含有芳香劑或著色劑，用于直接，延遲或控制釋放應用。本發明的化合物還可以通過海綿體內(intracavernosal)注射施用。
適合口服施用的本發明的化合物的溶液或懸浮液還可以含有賦形劑，例如，N，N-二甲基乙酰胺，分散劑，例如，聚山梨醇酯80(polysorbate 80)，表面活性劑，和增溶劑，例如，聚乙二醇，Phosal 50PG(它由磷脂酰膽堿，大豆脂肪酸，乙醇，甘油單酯/甘油二酯，丙二醇和抗壞血酸棕櫚酸酯(ascorbylpalmitate)組成)。
片劑可以包括賦形劑，如微晶纖維素，乳糖(例如，乳糖一水合物，或無水乳糖(lactose anyhydrous))，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸氫鈣(dibasic calciumphosphate)和甘氨酸，崩解劑，如淀粉(優選玉米，馬鈴薯或木薯淀粉)，羥基乙酸淀粉鈉(sodium starch glycollate)，交聯羧甲纖維素鈉(croscarmellosesodium)和某些復合硅酸鹽，以及顆粒粘合劑，如聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，羥基-丙基纖維素(HPC)，聚乙二醇8000(macrogol 8000)，蔗糖，明膠和阿拉伯樹膠。另外，還可以包括潤滑劑，如硬脂酸鎂，硬脂酸，山崳酸甘油酯(glyceryl behenate)和滑石。
還可將相似類型的固體組合物用作明膠膠囊中的填料。在此方面優選的賦形劑包括乳糖(lactose)，淀粉，纖維素，乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。對于含水懸浮液和/或酏劑(elixir)來說，本發明的化合物可以與各種甜味劑或芳香劑、著色物質或染料組合，與乳化劑和/或懸浮劑組合，以及與諸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其組合的稀釋劑組合。
片劑可以通過壓縮或模制(moulding)制備，任選地使用一種或多種輔助成分。壓縮片劑可以通過在合適的機器中將自由流動形式的活性成分，如粉末或顆粒進行壓縮來制備，任選地與粘合劑(例如，聚維酮(povidone)，明膠，羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如，羥基乙酸淀粉鈉，交聯的聚維酮，交聯的羧甲基纖維素鈉)，表面活性劑或分散劑混合。模制的片劑可以通過在合適的機器中將用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末狀化合物的混合物進行模制來制備。所述片劑可任選地包衣或刻痕(score)，并且可以配制，以提供其中的活性成分的緩慢或控制釋放，例如，以變化的比例使用羥丙基甲基纖維素，以提供需要的釋放曲線(release profile)。
適合口服施用的根據本發明的制劑能夠作為分離單元提供，如膠囊，扁囊劑(cachet)或片劑，其各自含有預定量的活性成分；粉末或顆粒；含水液體或非水液體中的溶液或懸浮液；或水包油液體乳液或油包水液體乳液。所述活性成分還能夠作為大丸劑(bolus)，藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)存在。
適合在口腔中局部施用的制劑包括在芳香底料(basis)中含有活性成分的錠劑(lozenge)，所述底料通常包括蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠(tragacanth)；還包括在惰性底料中含有活性成分的錠劑(pastille)，所述惰性底料如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠；以及漱口水，其在合適液體載體中含有活性成分。
應當理解的是，除了上面具體提到的成分之外，本發明的制劑可以包括本領域常用于所述制劑類型的其他試劑，例如，適合口服施用的那些試劑可以包括芳香劑。
適合局部施用的藥物組合物可以配制成軟膏(ointment)，乳劑(cream)，懸浮液，洗液，粉末，溶液，糊劑，凝膠，浸泡過的敷料，噴霧劑，氣霧劑或油劑，經皮膚的裝置，和撲粉(dusting powder)等。所述組合物可以通過包含活性劑的常規方法制備。因此，它們還可以包括兼容性常規載體和添加劑，如防腐劑，有助于藥物滲透的溶劑，乳劑或軟膏中的潤滑劑和用于洗劑的乙醇或油醇(oleyl alcohol)。所述載體可以以組合物的大約1％至大約98％存在。更常見的是，它們形成組合物的大約80％。僅僅是用于說明目的，通過將足量的親水材料和水混合來制備乳劑或軟膏，它含有大約5-10重量％的化合物，以足量產生具有需要的一致性(consistency)的乳劑或軟膏。
適合經過皮膚施用的藥物組合物能夠作為獨立貼片提供，用于與受體的表皮保持長時間地緊密接觸。例如，活性劑可以通過離子電滲療法(iontophoresis)從貼片中輸送。
為了施用于外部組織，例如，口腔和皮膚，所述組合物優選作為外用軟膏或乳劑應用。在配制成軟膏時，所述活性劑可以用在石蠟或可彌散于水的軟膏底料中。
另外，所述活性劑能夠用水包油乳劑底料或油包水底料配制成乳劑。
為了腸胃外施用，使用活性成分和無菌載體制備流體單位劑型，所述載體例如，但不局限于水，醇，多元醇，甘油和植物油，優選水。取決于載體和使用的濃度，活性成分可以懸浮或溶解在載體中。在制備溶液時，所述活性成分可以溶解在水中用于注射，并且在填充到合適的小瓶或安培瓶中之前進行過濾消毒，然后密封。
有利地，可以將諸如局部麻醉劑，防腐劑和緩沖劑的試劑溶解在載體中。為了提高穩定性，可以在填充到小瓶中之后對所述組合物進行冷凍，并且在真空下除去水分。然后將冷凍干燥的粉末密封在所述小瓶中，并且可供給裝水用于注射的附帶小瓶，以在使用之前重建所述液體。
腸胃外懸浮液是以與溶液大體上相同的方式制備的，所不同的是將活性成分懸浮在而不是溶解在載體中，并且不能夠通過過濾進行消毒。可以在懸浮到無菌載體中之前通過暴露于環氧乙烷對活性成分進行消毒。有利地，在該組合物中包括表面活性劑或濕潤劑，以促進活性成分的均勻分布。
本發明的化合物還可以使用本領域公知的醫療器械施用。例如，在一種實施方案中，本發明的藥物組合物可以用皮下無針注射裝置施用，例如，公開于以下文獻中的裝置U.S.5,399,163；U.S.5,383,851；U.S.5,312,335；U.S.5,064,413；U.S.4,941,880；U.S.4,790,824；或U.S.4,596,556。可用于本發明中的眾所周知的植入物和模塊的例子包括US 4,487,603，該專利公開了可植入的微型輸液泵，用于以控制的速度分配藥物；US 4,486,194，它公開了通過皮膚施用藥物的治療設備；US 4,447,233，它公開了用于以精確的輸液速度輸送藥物的藥物輸液泵；US 4,447,224，它公開了變速流可植入的輸液裝置，用于連續輸送藥物；US 4,439,196，它公開了具有多個腔室的滲透壓藥物輸送系統；和US 4,475,196，它公開了滲透壓藥物輸送系統。在具體實施方案中，本發明的化合物可以使用藥物洗脫支架來輸送，例如，對應于在WO 01/87263以及相關出版物中所描述的那些或由Perin(Perin，EC，2005)所描述的那些。多種其他此類植入物，輸送系統，和模塊為本領域技術人員所公知。
在本方面的另一種實施方案中，本發明的化合物能夠以″前藥(prodrug)″的形式提供給患者，這特別適用于抗癌劑的情形，不過，還可應用于其他適應癥。
本申請所使用的術語″前藥″表示前體或衍生形式的藥物活性物質，與母體藥物相比它具有較低的毒性，并且能夠通過酶促方式激活或轉化成活性更高的母體形式(參見，例如，Wilman D.E.V.，1986和Stella VJ.等，1985)。
本發明的化合物的待施用的劑量可以根據具體化合物、相關的疾病、受試者(subject)以及疾病的性質和嚴重程度，和受試者的身體情況，和選擇的施用途徑而改變。本領域技術人員能夠方便地確定合適劑量。
根據施用方法，所述組合物可以包括本發明的化合物的0.1重量％，優選10-60重量％或以上。
本領域技術人員可以理解的是，可以通過要治療的癥狀的性質和程度，施用的形式、途徑和部位，以及被治療的具體受試者的年齡和狀態來確定本發明的化合物的最佳用量和單獨劑量的間隔，并且醫生將最終確定待使用的合適劑量。該劑量可以以合適的頻率重復。根據常規臨床實踐，如果出現副作用，可以改變或減少所述劑量和/或頻率。
另一方面，本發明提供了用于生產17-去甲基雷帕霉素或其類似物的方法，所述方法包括(a)用丙二酰-CoA-特異性AT結構域取代所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域，(b)在合適的宿主細胞中表達工程改造的雷帕霉素PKS，(c)在能產生17-去甲基雷帕霉素或其類似物的條件下培養宿主細胞，包括任選地供給外源前體(d)任選地分離由此產生的化合物。
在具體實施方案中，所產生的化合物不是17-去甲基雷帕霉素。
這種取代導致與雷帕霉素或前-雷帕霉素相比，雷帕霉素PKS模塊10整合了丙二酰-CoA并缺少位于C17的甲基分支。在優選實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列聚酮化合物合酶基因簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素，FK506，紅霉素，FK520，兩性霉素，安哥拉霉素，泰樂菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素或FK506。在更高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下組來自雷帕霉素模塊2的AT結構域，來自莫能菌素模塊3的AT結構域，來自莫能菌素模塊6的AT結構域，來自莫能菌素模塊8的AT結構域，來自FK506模塊3的AT結構域和來自FK506模塊7的AT結構域。在最高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域是來自雷帕霉素模塊2的AT結構域。
應當指出的是，已經在保藏的序列中鑒定了多種錯誤，例如，在WO04/007709中報道的那些。本文作者預測，在保藏的序列中可能還有其他錯誤，這些錯誤中的一些可能存在于用于本發明工程改造簇的區域。序列表中的序列表示合成的寡核苷酸的序列，它是根據公開的序列和已測序的通過多核苷酸鏈式反應(PCR)擴增的DNA片段設計的。因此，它們可能與保藏的序列不相同。本領域技術人員可以理解的是，已經測序的克隆的DNA片段具有生物學正確的序列以形成功能性蛋白，并且在保藏序列中的錯誤對此沒有影響。還鑒定了(NCBI登錄號X86780)PKS基因的預測的翻譯產物，以及所述結構域和模塊的邊界(Aparicio等，1996)。本領域技術人員可以理解的是，如Schwecke等，(1995)所定義的，在結構域和所述邊界的定義中存在的一定量的流動性應當被視為邊界可以存在的例子。
本領域技術人員可以理解的是，在I型聚酮化合物合酶(和混合的PKS-NRPS)中，存在多個丙二酰-CoA特異性AT結構域，這些結構域可用作供體AT結構域，并且這種轉化可用于來自任何I型PKS或混合的NRPS/PKS的多種丙二酰-CoA選擇性酰基轉移酶結構域中的任意一個。本領域技術人員還可以理解的是，模塊10AT對丙二酰-CoA的整合可以通過使rapAT10突變以改變它的特異性而實現，例如，使用WO 02/14482中描述的方法，或通過用包含對丙二酰-CoA具有選擇性的AT結構域的模塊取代模塊10，所述模塊包括天然模塊或組合模塊。
將所述丙二酰-CoA特異性AT導入雷帕霉素PKS的模塊10是通過導入供體結構域側翼的限制位點，并且在框內并在與雷帕霉素模塊10的酰基轉移酶相同的位置克隆來實現。本領域技術人員可以理解的是，這一目的可以通過使用多個限制酶位點和多種結合位置來實現。在優選實施方案中，將雷帕霉素AT2的丙二酰-CoA特異性AT結構域導入其側翼為限制酶位點MscI和AvrII的DNA片段上。MscI位點被導入與編碼保守氨基酸序列PGQ的DNA序列重疊的AT結構域的開始部分，參見下文。AvrII位點被導入與編碼保守氨基酸序列VLG的DNA序列重疊的AT結構域的末端，，參見下文。本領域技術人員可以理解的是，在該克隆策略中，MscI位點是甲基化的，并且通過諸如ET12567的大腸桿菌菌株傳代，以制備dcm-DNA，是用限制酶MscI消化之前所必需的。其他實施方案涉及使用不同的限制位點，例如，但不局限于SpeI和AvrII，MscI和BglII，SpeI和BglII。另一種限制位點組合是SpeI和AvrII。
產生位于AT結構域起始部分的MscI位點
Rap At10 P P G Q G(SEQ ID NO1)ttt ccc ggg cag gga (SEQ ID NO2)Rap AT2 F P G Q G(SEQ ID NO3)ttc ccg ggt cag ggg (SEQ ID NO4)MscI結合 F P G Q G(SEQ ID NO5)ttt cct ggc cagggg (SEQ ID NO6)產生位于AT結構域末端的AvrII位點Rap AT10 A V L G D(SEQ ID NO7)gcg gtg ctg ggt gat (SEQ ID NO8)Rap AT2 A V L G D(SEQ ID NO9)gcg gtg ctg ggt gat (SEQ ID NO10)AvrII結合 A V L G D(SEQ ID NO11)gcg gtc cta ggt gat (SEQ ID NO12)在優選實施方案中，對吸濕鏈霉菌MG2-10的雷帕霉素聚酮化合物合酶進行工程改造，以在模塊10中具有丙二酰-CoA特異性AT。在高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA AT是雷帕霉素AT2，如本文的實施例1所述。
本領域技術人員可以理解的是，有多種方法可以將DNA導入細胞，以實現PKS基因簇的工程改造。在實施例1中，我們描述了使用溫度敏感型起點質粒的接合方法。本領域技術人員可以理解的是，還可以使用其他方法，例如，但不局限于，不使用自我復制載體的同源重組，如WO 03/033699所述的方法。因此，制備工程改造的雷帕霉素PKS重組方法不應當局限于上述可選擇的方法。
不過，本文所描述的方法是用于制備工程改造的PKS簇的優選方法。迄今為止，還沒有用上述可選擇的方法對rapA，rapB或rapC進行工程改造的成功報導。
另一方面，本發明提供了制備重組菌株的方法，該菌株包含編碼雷帕霉素聚酮化合物合酶的工程改造的生物合成基因簇，其中模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，如上文所述。在優選實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列聚酮化合物合酶基因簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素，FK506，紅霉素，FK520，兩性霉素，安哥拉霉素，泰樂菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素或FK506。在更高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下組雷帕霉素模塊2，莫能菌素模塊3，莫能菌素模塊6，莫能菌素模塊8，FK506模塊3和FK506模塊7。在最高度優選的實施方案中，所述丙二酰-CoA特異性AT結構域來自雷帕霉素的模塊2。
盡管在本文中已經以吸濕鏈霉菌MG2-10為例說明了對雷帕霉素聚酮化合物合酶途徑的工程改造(它的產生在WO 04/007709和Gregory等，(2004)中公開)，本領域技術人員將理解的是，這些方法同樣適用于野生型吸濕鏈霉菌NRRL5491和其他相關菌株(參見下文)。優選地，所述工程菌株選自下組吸濕鏈霉菌MG2-10和吸濕鏈霉菌NRRL5491。
在本上下文中，與吸濕鏈霉菌NRRL5491相關的菌株包括游動放線菌屬的菌種N902-109(例如，FERM BP-3832)，鏈霉菌屬的菌種AA6554，吸濕鏈霉菌子囊霉素變種MA 6475(例如，ATCC 14891)，吸濕鏈霉菌子囊霉素變種MA 6678(例如，ATCC 55087)，吸濕鏈霉菌子囊霉素變種MA 6674，吸濕鏈霉菌子囊霉素變種(例如，ATCC 55276)，筑波鏈霉菌(Streptomycestsukubaensis)No.9993(例如，FERM BP-927)，吸濕鏈霉菌yakushimaensis亞種，鏈霉菌屬菌種(例如，DSM 4137)，鏈霉菌屬菌種(例如，DSM 7348)，小單孢菌屬菌種A92-306401(例如，DSM 8429)和鏈霉菌屬菌種MA 6858(例如，ATCC 55098)。在一種實施方案中，所述菌株不是能產生17-去甲基雷帕霉素的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。在另一種實施方案中，所述菌株不是能在不提供外源前體的情況下產生17-去甲基雷帕霉素的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。在另一種實施方案中，所述菌株不是包括五個連續基因，rapQONML的缺失的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。
任選地，該方法可與WO 04/007709中公開的方法組合，以允許生產17-去甲基雷帕霉素類似物，它與天然雷帕霉素結構的差別在于由后-PKS酶的加工程度，或在于整合了非天然啟動酸。
本發明以上各方面的實施方案提供了用于生產17-去甲基雷帕霉素及其類似物的方法，以及制備重組菌株的方法，該菌株包括編碼工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇，所述方法包括以下額外步驟(a)分離要導入的AT，它是具有合適的側翼限制位點單一DNA片段，(b)利用相同的合適的限制位點擴增并且分離與目標AT的側翼序列同源的DNA序列的區域，(c)將如(a)和(b)中所述三種DNA片段連接在一起，以便得到LHS同源性，隨后是供體AT結構域，隨后是RHS同源性的框內序列，
(d)將來自步驟(c)的完整序列導入用于導入宿主菌株的載體，以便得到最終質粒，所述質粒包括i)用于接合的oriT，ii)一種或多種抗性標記，iii)溫度敏感型復制起點，以便可以通過在37℃培養來選擇整合體，和iv)大腸桿菌復制起點，(e)通過使用如上面(d)中所述的最終質粒的接合來轉化所述宿主菌株，(f)通過對相關抗生素的抗性選擇轉化體，(g)通過在37℃具有抗生素選擇的培養產生初級整合體，(h)同樣在37℃，通過在不存在抗生素選擇的條件下的生長來篩選次級重組體，(i)通過它產生目標產物的能力鑒定需要的菌株，和(j)任選地通過標準方法驗證所述菌株的遺傳學。
本領域技術人員可以理解的是，在步驟(b)中所提到的合適的限制位點必須是這樣的，以便連接在一起時這三個序列是框內的-它們不一定與用于AT的兩個位點相同；具體地，同源性的左側區域的RHS上的限制位點必須與所述AT的LHS上的位點相同，或者兼容以提供框內序列；同源性左側區域的LHS上的限制位點可以是適合進行隨后的克隆步驟的任何位點。類似地，同源性右側區域的LHS上的位點必須與所述AT的RHS上的位點相同或兼容，以提供框內序列；同源性的右側區域的RHS上的限制位點可以是適合進行隨后的克隆步驟的任何位點。
另一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)在適合聚酮化合物生產的條件下，將非天然啟動酸供給所述重組菌株的培養物，和(c)任選地分離由此產生的化合物。
因此，本發明提供了用于制備已經整合了非天然啟動酸的17-去甲基雷帕霉素類似物的方法。具體地，本發明提供了將環狀和雜環啟動酸整合到17-去甲基雷帕霉素類似物中，所述方法包括將所述可選的啟動酸供給菌株，該菌株包括工程改造的雷帕霉素生物合成基因簇，所述基因簇負責17-去甲基前-雷帕霉素核心的合成。在一種實施方案中，所述重組菌株已經缺失或失活了前體提供基因。在優選實施方案中，已經缺失或失活所述前體提供基因是rapK。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株已經缺失或失活了rapK，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在一種實施方案中，所述菌株不是能產生17-去甲基雷帕霉素的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。在另一種實施方案中，所述菌株不是在不提供外源前體的條件下能產生17-去甲基雷帕霉素的重組吸濕鏈霉菌宿主細胞。
本發明的此方面提供了通過整合非天然前體(例如，環狀或雜環啟動酸)有效生產多種基礎產物的方法。方法還可以體現如下面所述的其他方面。
因此，一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，該方法整合環狀或雜環啟動酸，所述方法包括(a)修飾包含工程改造的雷帕霉素PKS基因的所述重組菌株，以額外使至少一個前體提供基因缺失或失活；和(b)將環狀或雜環非天然啟動酸供給所述重組菌株。
在優選實施方案中，所述重組菌株是使用WO 04/007709中以及本文所述的方法制備的。在優選實施方案中，已缺失或失活的前體提供基因之一是rapK。
在一種實施方案中，供給的外源酸包括(但不局限于)環烷基羧酸，或它們的簡單的酯，環的大小從5至7個原子變化。在優選實施方案中，所述羧酸是WO 04/007709中所描述的那些羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸是在本文的實施例2中所述的啟動酸。在更優選的實施方案中，供給該菌株的非天然啟動酸選自下組環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在一種實施方案中，可以添加的雜環啟動酸可以包括(但不局限于)雜環羧酸，或它的簡單的酯，環的大小從5至7個原子變化，所述環可以包括一個或多個雜原子，其中，所述環包括一個以上雜原子，所述雜原子可以相同或不同。所述雜原子可選自下組O，S和N。當所述環包括N時，它可以是游離堿(NH)，酰化的胺(N-酰基)，烷基化的胺(N-烷基)或烷基化的N-氧化物(N-烷基，N-O)。當所述環包括S時，它可以是環狀硫醚，亞砜或砜。在上述所有雜環羧酸中，所述環的其余部分可以是未取代的或可以任選地包括一個或多個取代基，其包括，但不局限于C1-4烷基，OH，F和Cl。優選地，在一種實施方案中，所述雜環羧酸包括在4位具有氧原子的6員環。在另一種優選實施方案中，所述雜環羧酸是四氫-2H-吡喃-4-羧酸。
另一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代(如上文更詳細地描述的)，(b)附加地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)培養由此獲得的菌株，如果需要的話，任選地在存在外源前體的條件下培養，以生產17-去甲基雷帕霉素類似物，和(d)任選地分離由此產生的化合物。
在優選實施方案中，已經缺失或失活的輔助基因是rapI，rapJ和rapQ。在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapJ，rap和rapQ。
在本發明的另一方面，改變的雷帕霉素PKS是在宿主細胞中表達的，在所述宿主細胞中，一個或多個雷帕霉素輔助基因已經缺失或失活。在另一種實施方案中，改變的雷帕霉素PKS是在宿主細胞中表達的，在所述宿主細胞中，所有輔助基因已經缺失或失活，例如，但不局限于，宿主菌株吸濕鏈霉菌MG2-10(WO 04/007709；Gregory等，2004)。本領域技術人員可以理解的是，根據WO 04/007709所公開的內容，如果rapK已經缺失或失活的話，就需要提供外源酸，用于生產17-去甲基雷帕霉素或其類似物。
另一方面，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代(如上文更詳細地描述的)，
(b)附加地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)沿反式方向重新導入輔助基因的全部或亞組，以補償或部分補償所述缺失，(d)培養由此獲得的菌株，如果需要的話，任選地在存在外源前體的條件下培養，以生產17-去甲基雷帕霉素類似物，和(e)任選地分離由此產生的化合物。
在優選實施方案中，在步驟(b)中使所有雷帕霉素輔助基因缺失或失活。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用選自下組的一個或多個輔助基因選遺傳互補的rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物。在具體實施方案中，所述菌株是用所有輔助基因互補的。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用雷帕霉素輔助基因rapK，rapM，rapN，rapO和rapL或其同源物遺傳互補的。在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用雷帕霉素輔助基因rapK，rapI，rapN，rapO和rapL或其同源物遺傳互補的。
因此，在本發明的具體方面，AT交換是在吸濕鏈霉菌MG2-10中進行的(在WO 04/007709和Gregory等，(2004)中公開)，其中已經去除了所有輔助基因，以制備一種菌株，它需要用外源酸進行化學補償以生產雷帕霉素。例如，添加環己烷羧酸，導致了17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的產生，而添加啟動酸3，4-二羥基環己烷羧酸，導致了17-去甲基前-雷帕霉素的產生。在優選實施方案中，通過進行AT交換在吸濕鏈霉菌MG2-10中產生的菌株是吸濕鏈霉菌MG7-9，它如實施例1所述是通過將雷帕霉素模塊2的酰基轉移酶導入模塊10以取代天然AT10而產生的。
本領域技術人員可以理解的是，在吸濕鏈霉菌MG7-9中，沒有rapL的拷貝，并且所述化學補償并非指添加六氫哌啶羧酸或可替換的氨基酸。通過用賴氨酸補充復合生產培養基，以提供具有六氫吡啶羧酸的菌株(通過未經確定，而是通過觀察生產的前-雷帕霉素類似物建立的方法)。培養該菌株(吸濕鏈霉菌MG7-9)導致了17-去甲基脯氨酰雷帕霉素類似物的共同產生，觀察到它的生產水平較低，并且對于RapL缺陷的菌株觀察到了類似的結果。通過將外源天然和新型氨基酸添加到生產培養基中與六氫吡啶羧酸直接競爭，可以將外源天然和新型氨基酸整合到野生型雷帕霉素分子上。本領域技術人員可以理解的是，類似地，可將天然或非天然氨基酸供給rapL缺失的菌株，如，但不局限于吸濕鏈霉菌MG7-9，以提供其他新型雷帕霉素類似物。
任選地，可將一個或多個缺失的輔助基因導入所述宿主細胞，處于合適的啟動子控制之下。在優選實施方案中，可以將一個或多個缺失的基因導入鏈霉菌噬菌體phiBTI的染色體噬菌體結合位點(Gregory等，2003)。本領域技術人員可以理解的是，沿反式方向的補償并不局限于該噬菌體結合位點，或實際上局限于結合位點的使用。因此，缺失的輔助基因的補償還可以通過，但不局限于，例如，通過使用pSET152的衍生物(Bierman等，1992)將在合適啟動子控制之下的一個或多個輔助基因導入其他噬菌體結合位點，如鏈霉菌噬菌體DhiC31的結合位點而實現。所述整合同樣可以通過使用其他可利用的整合功能來實現，所述整合功能包括，但不局限于基于pSAM2整合酶的載體(例如，pPM927(Smovkina等，1990))，R4整合酶(例如，pAT98(Matsuura等，1996))，VWB整合酶(例如，pKT02(Van Mellaert等，1998))，和L5整合酶(例如，Lee等，1991)。本領域技術人員可以理解的是，預計有多種放線菌噬菌體都包含整合功能，這些功能能夠隨同合適的啟動子一起轉移到輸送載體上，以產生可用于將基因導入吸濕鏈霉菌的其他系統。實際上，已經鑒定了很多其他的吸濕鏈霉菌噬菌體，并且能夠由此獲得整合功能，并且以類似方式使用。隨著越來越多的噬菌體被鑒定，預計會出現能類似使用的其他可利用的整合酶。在某些情況下，可能需要通過添加用于整合酶的特定attB位點來改變宿主菌株，以實現高效整合。導入在合適啟動子控制之下的輔助基因還可以通過，但不局限于以下方法實現，同源重組到染色體中的中性位置，同源重組到染色體的非中性位置(例如，用于破壞選擇的基因)。還可以使用自我復制的載體，例如，但不局限于，含有鏈霉菌復制起點的載體，所述復制起點來自pSG5(例如，pKC1139 Bierman等，1992)，pIJ101(例如，pIJ487，Kieser等，2000)和SCP2*(例如，pIJ698，Kieser等，2000)。可以將一種以上上述系統用于重組菌株的工程改造，以制備17-去甲基雷帕霉素類似物。本領域技術人員可以理解的是，還可以產生生物合成途徑，根據需要通過使每一個輔助基因失活或缺失，該途徑能夠產生與所有輔助基因的缺失相同的產物，和沿反式方向的補償。需要時通過添加游離酸使所述基因在所述宿主細胞中表達，導致了17-去甲基雷帕霉素類似物的產生，該類似物整合了天然或非天然啟動酸和/或具有改變的后聚酮化合物加工水平。在另一種實施方案中，改變的雷帕霉素PKS能夠在異源宿主細胞中表達，該宿主天然缺乏雷帕霉素輔助基因(或它的等同物)，連同所述輔助基因的選擇。在優選實施方案中，至少rapK是缺失的或RapK以其他方式不存在于宿主菌株中，并且可以將多種外源羧酸供給所述宿主菌株，以產生整合了非天然啟動酸的17-去甲基雷帕霉素類似物。
在本發明的另一方面，組合了上述修飾，因此，本發明提供了制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)附加地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)任選地沿反式方向重新導入輔助基因的全部或亞組，以補償或部分補償所述缺失，(d)在合適條件下將非天然啟動酸供給所述重組菌株用于生產聚酮化合物，和(e)任選地分離由此產生的化合物。
在優選實施方案中，已經缺失或失活的輔助基因包括rapK。
在優選實施方案中，在步驟(b)中使所有雷帕霉素輔助基因缺失或失活。在具體方面，本發明提供了用于制備17-去甲基雷帕霉素類似物的可選擇的方法，所述類似物通過對重組菌株進行遺傳互補已經整合了非天然啟動酸，在所述菌株中，所有雷帕霉素輔助基因已經用雷帕霉素輔助基因rapI，rapJ，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物缺失或失活，制備包括除rapK以外的所有輔助基因的菌株，并且供給外源啟動酸。在優選實施方案中，所述外源非天然啟動酸是環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸是環庚烷羧酸。在另一種優選實施方案中，所述非天然啟動酸選自下組3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
另一方面，本發明提供了通過使所述重組菌株發酵，同時與輔助基因活性和非天然啟動酸組合用于制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法。在優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapM和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸是環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，供給具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。在另一種優選實施方案中，供給具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然啟動酸是環庚烷羧酸。在優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapM和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK和rapM，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI和rapM，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapI，rapJ和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，已經缺失的輔助基因是rapK，rapJ，rapM和rapQ，而供給該菌株的非天然啟動酸選自下組3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的非天然啟動酸是環己烷羧酸。
另一方面，本發明提供了通過對重組菌株進行遺傳互補制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，其中所有雷帕霉素輔助基因已經用選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物的一個或多個輔助基因連同添加天然或非天然啟動酸來缺失或失活。在優選實施方案中，所述重組菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的非天然啟動酸環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在優選的實施方案中，所述重組菌株是用rapJ，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的非天然啟動酸環己烷羧酸，3-甲基環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用rapJ，rapM，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是3-甲基環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，供給的啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用rapM，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
在另一種優選實施方案中，所述重組菌株是用rapI，rapN，rapO和rapL遺傳互補的，并且供給選自下組的啟動酸3-甲基環己烷羧酸，環己烷羧酸，環庚烷羧酸，3-氟-4-羥基環己烷羧酸，4-氟-3-羥基環己烷羧酸，3-氯-4-羥基環己烷羧酸和4-氯-3-羥基環己烷羧酸。在更高度優選的實施方案中，所供給的啟動酸是環己烷羧酸。
另一方面，本發明提供了用于制備17-去甲基雷帕霉素類似物的文庫的方法，所述方法包括(a)制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)任選地使選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)任選地沿反式方向重新導入所述雷帕霉素輔助基因的全部或亞組，以補償或部分補償所述缺失，和，(d)將一系列非天然啟動酸供給所述重組菌株，以制備多種17-去甲基雷帕霉素類似物，(e)在適于生產聚酮化合物的條件下添加天然或新型氨基酸，(f)任選地分離由此產生的化合物，和(g)任選地對分離的雷帕霉素類似物進行半合成。
通過如下實施例進一步說明本發明，這些實施例不應當被理解為是對本發明范圍的限定。
實施例材料所有分子生物學酶和試劑是通過商業來源獲得的。
細菌菌株和生長條件將大腸桿菌DH10B(GibcoBRL)生長在如Sambrook等(1989)所述的2xTY培養基中，如Paget等(1999)所述的大腸桿菌ET12567(pUZ8002)生長在含有卡那霉素(25mg/L)的2xTY培養基中。載體pUC18是從New England Biolabs獲得的。載體pKC1139在Practical Streptomyces Genetics，Kieser等，(2000)中描述。用100mg/L氨芐青霉素或50mg/L阿泊拉霉素(apramycin)選擇大腸桿菌轉化體。
將吸濕鏈霉菌MG2-10(WO 04/007709；Gregory等，2004)及其衍生物在28℃保存在培養基1瓊脂平板(參見下文)上，并且如(Khaw等，1998)所描述的在TSBGM(含有1.0％葡萄糖和100mM MES的胰酶大豆肉湯，pH 6.0)中培養，需要時添加50mg/L阿泊拉霉素。
液體培養物生長在28℃，在錐形燒瓶或falcon管中，以300rpm的速度搖動。
培養方法所有菌株的孢子母液是在培養基1上生長之后制備的，保存在蒸餾水中的20％w/v甘油10％w/v乳糖中，并保藏在-80℃。通過將0.1mL的冷凍原液接種到裝在250mL燒瓶中的50mL培養基2(參見下文)中來制備營養培養物。所述培養物在28℃、300rpm培養36至48小時。
培養步驟將營養培養物以0.5mL接種到裝在50mL管中的7mL培養基3中。在26℃、300rpm培養進行7天培養。所選羧酸(″非天然起始物″或″天然起始物″)的供給/添加在接種24小時之后進行，并且以1mM供給，除非另有說明。
培養基1

然后通過在121℃高壓滅菌20分鐘來滅菌培養基。
培養基2RapV7種子培養基


然后通過在121℃高壓滅菌20分鐘來滅菌培養基。
滅菌之后在每7mL培養基中添加0.16mL 4％葡萄糖。
培養基3MD6培養基(發酵培養基)

滅菌之前將0.4mL Sigma α-淀粉酶(BAN 250)添加到1L培養基中。
培養基在121℃滅菌20分鐘。
滅菌之后在每7mL培養基中添加0.35mL無菌的40％果糖和0.10mL L-賴氨酸(140mg/mL，溶解在水中，過濾滅菌)。
培養基4RapV7a種子培養基

然后通過在121℃高壓滅菌20分鐘對培養基進行滅菌。
培養基5MD6/5-1培養基(發酵培養基)

在121℃滅菌培養基30分鐘。
滅菌之后每升添加15g果糖。
抗癌活性的體外生物分析在單層增殖試驗中對一組12個人類腫瘤細胞系進行抗癌活性的化合物的體外評估，該評估在Oncotest Testing Facility，Institute for ExperimentalOncology，Oncotest GmbH，Freiburg進行。12個所選細胞系的特征歸納在表1中。
表1試驗細胞系

癌試驗細胞系是由人類腫瘤異種移植物建立的，如Roth等1999所描述。供體異種移植物的來源由Fiebig等1992描述。其他細胞系是從NCI(H460、SF-268、OVCAR-3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-468)獲得或者從DSMZ，Braunschweig，德國(LNCAP)購買。
所有細胞系，除非另有說明，都在37℃在濕潤空氣(95％空氣、5％CO2)中，在“已經混合”培養基中生長，該培養基含有RPMI 1640培養基、10％胎牛血清和0.1mg/mL慶大霉素(PAA，Clbe，德國)。
單層試驗使用改進的碘化丙啶分析方法評估試驗化合物對12個人類腫瘤細胞系生長的影響(Dengler等，1995)。
簡要地，通過胰蛋白酶消化從指數期培養物中收獲細胞，計數并平鋪到96孔平底微量滴定板上，平鋪的細胞密度取決于細胞系(5-10.000活細胞/孔)。恢復24小時之后使細胞恢復指數生長，將0.01mL培養基(每個平板6個對照孔)或含有39-去甲氧基雷帕霉素的培養基添加到所述孔中。每一種濃度重復平鋪三次。39-去甲氧基雷帕霉素是以兩種濃度(0.001mM和0.01mM)使用的。在連續培養4天之后，用0.2mL含水碘化丙啶(PI)溶液(7mg/L)取代含或不含39-去甲氧基雷帕霉素的細胞培養基。為了測定活細胞的比例，通過冷凍平板對細胞進行透化。解凍平板之后，使用Cytofluor 4000微量培養板讀數器測量熒光(激發530nm，發射620nm)，提供與活細胞總數的直接關系。
生長抑制作用表達為處理/對照×100(％T/C)，并且用于選擇細胞系。對于活性化合物來說，通過將化合物濃度對細胞活力作圖來估算并且也提供了檢查的整個細胞系組中的平均IC50& IC70值。
實施例1 工程菌株吸濕鏈霉菌MG7-9的分離i)質粒pALK83的制備將引物MG308 5′-GTCCTAGGTGATGTCCCGGCAACACG-3′(SEQ IDNO13)和MG309 5′-CACCTGCAGGCCCAACTCGGCCAGCTCGCT-3′(SEQID NO14)用于擴增雷帕霉素模塊10酰基轉移酶(rapAT10)上游的同源區(從雷帕霉素簇的nt11693到nt13289，如Schwecke等，1995所述)，使用從吸濕鏈霉菌NRRL5491制備的粘粒DNA(cos26，參見Schwecke等，1995)作為模板。用T4多核苷酸激酶對1596bp的PCR產物(SEQ ID NO15)進行磷酸化，并且連接到已經去磷酸化的用SmaI消化過的pUC 18中。轉化入大腸桿菌DH10B之后，分離質粒pMG255-4。將引物MG3105′-CCTGGCCAGGAAAGACGAACACGATCCT-3′(SEQ ID NO16)和MG3115′-CGAAGCTTGAGCCGCTGGCGATCGTGGGA-3′(SEQ ID NO17)用于擴增雷帕霉素模塊10AT下游的同源區(從雷帕霉素簇的nt14191到nt15742，如Schwecke等，1995所述)，使用從吸濕鏈霉菌NRRL5491制備的粘粒DNA(cos26，參見Schwecke等，1995)作為模板。用T4多核苷酸激酶對1551bp的PCR產物(SEQ ID NO18)進行磷酸化，并且連接到已經去磷酸化的用SmaI消化過的pUC18中。轉化入大腸桿菌DH10B之后，分離質粒pMG256-1。通過序列分析驗證每一種質粒的插入片段的完整性。
將質粒pCJR26(Rowe等，1998)和pMG256-1各自轉化入大腸桿菌ET12567，并且分離未甲基化的(dam-，dcm-，hsdn-)質粒DNA。用AvrII/HindIII消化質粒pMG255-4，并且分離大約4.3kbp的片段；用MscI/AvrII消化去甲基化的pCJR26，并且分離大約1kbp的片段；用HindIII消化、用MscI部分消化去甲基化的pMG256-1，并且分離大約1.5kbp的片段。連接這三個DNA片段，并用于轉化大腸桿菌DH10B。分離所得質粒pMG291-14。用HindIII/XbaI消化該質粒，并且分離大約4kbp的片段，連接到HindIII/XbaI消化過的pKC1139中，并且將所述DNA用于轉化大腸桿菌DH10B。所得質粒pALK83包含模塊2的雷帕霉素酰基轉移酶結構域，其側翼是允許同源重組入模塊10的DNA區域，以通過雙重組實現AT交換。
ii)工程菌株吸濕鏈霉菌MG7-9的分離用pALK83轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌-供體菌株。利用該菌株通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG2-10(WO04/007709；Gregory等，2004)。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在(patch)添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸(nalidixic acid)的培養基1上。然后將該貼片用于接種盛有含50mg/L阿泊拉霉素的TSBGM的燒瓶。在28℃將該培養物培養2天，然后在37℃培養2天。將該培養物在含有50mg/L阿泊拉霉素的培養基1的平板上進行劃線，并且在37℃培養7天。將單一菌落重新貼在含有50mg/L阿泊拉霉素的培養基1的平板上，并且在37℃再生長7天。將所述貼片用于接種不含抗生素的TSBGM燒瓶，并且在37℃生長3天。將該培養物在培養基1的平板上劃線，并且將單菌落用于貼在含和不含阿泊拉霉素(50mg/L)的培養基1的平板上，以便觀察敏感度，其代表了涉及質粒主鏈損失的第二個重組事件。將十四個阿泊拉霉素敏感型貼片用于接種14×7mL的培養基2(rapV7)，并且將這些種子培養物在28℃生長3天。然后將這些培養物用于接種(將0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃培養5天，在24小時之后添加環己烷羧酸至最終濃度為1mM。通過LCMS分析所述培養物的提取物的雷帕霉素類似物的生產。發現九種獨立的培養物能產生新型化合物，具有接近于17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的分子量。根據生產水平和魯棒性選擇所述培養物中的一種進行較大規模的培養，以分離所述新型化合物；將該菌株命名為吸濕鏈霉菌MG7-9。
iii)分析來自吸濕鏈霉菌MG7-9的新型雷帕霉素類似物根據以下分析數據，認為所觀察到的新型雷帕霉素類似物是期望的17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素。正如所預料的，由于失去了甲基，所述新型雷帕霉素類似物的極性(保留時間5.9-6.2分鐘)比39-去羥基前-雷帕霉素(保留時間6.35-6.95分鐘)更高。
對MG7-9提取物進行的LCMS和LCMSn分析顯示，所述新型雷帕霉素類似物的m/z比例比39-去羥基前-雷帕霉素低14個質量單位，與缺少一個甲基吻合。所觀察到的離子[M-H-]810.8，[M+Na]+834.8，[M+K]+850.8。按照以前確定的碎裂途徑(圖4)(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University ofCambridge，2000)碎裂鈉加合物，得到了預測的17-去甲基-39-去甲氧基前-雷帕霉素的離子。該質譜碎裂數據縮小了所述新型rapalogue的范圍，其中在天然形式包括3個甲基的片段C16-C27中發生了甲基的丟失。這些甲基結合在C17(三烯)，C23(從三烯上去掉一個碳)和C25(從三烯上去掉3個碳)上。觀察到了雷帕霉素的UV三烯特征，不過中央峰的UV最大值發生了偏移(由39-去羥基前-雷帕霉素的λ＝278nm變為λ＝270nm)。這強烈地說明了在所述三烯上的官能度已經發生了改變，因為這種波長的變化在C16(OH/OCH3)的官能度變化中沒有被觀察到；所觀察到的變化與預期的C17上甲基的喪失保持一致。
還通過LC高分辨率-傅立葉轉變-離子回旋共振，質譜分析(LC-FT-ICR-MS)分析了積累的產物。獲得了母離子的鈉加合物的精確質量數據(分析值834.51342(圖5，A)，C47H73NO10Na的計算值834.51319，偏差0.28ppm)，以及關鍵子離子的質量數據，如下表所示(有關碎裂途徑參見所附的圖4)。

(還可參見圖6)該質譜碎裂數據與17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素完全吻合。
iv)發酵所述新型雷帕霉素類似物用于分離所有菌株的孢子母液是在培養基1上生長之后制備的，保存在蒸餾水中的20％w/v甘油10％w/v乳糖中，并且在-80℃保存。通過將0.1mL的冷凍母液接種到裝在250mL燒瓶中的50mL培養基4中來制備初級營養培養物。將該培養物在28℃以250rpm的速度搖動培養48小時。然后將該培養物在裝在2000mL燒瓶中的400mL培養基4中進行繼代培養，以提供二級營養培養物。將該培養物在28℃、250rpm培養24小時。
將營養培養物以7.5％v/v接種到裝在20L發酵罐中的15L培養基5中(參見上文)。培養在26℃，0.5vvm≥30％溶解氧最小端速為1.18ms-1，最大端速為2.75ms-1進行6天。在接種之后24和48小時添加環己烷羧酸，以提供2mM/L的最終濃度。在接種48小時之后，加入200mL水中的9.5g L-賴氨酸。
v)提取和純化將發酵培養液(12L)與等體積的甲醇一起攪拌2小時，然后離心使細胞沉淀(10min，3500rpm)。將上清液與DiaionHP20樹脂(43g/L)一起攪拌1.5小時，然后過濾。用丙酮(總體積7.5L)分批洗滌所述樹脂，以分離rapalogue，并且在真空中除去溶劑。然后將所得的濃縮水溶液(800mL)用水稀釋到1L，并且用EtOAc(3×1L)萃取。在真空中除去溶劑，以得到粘性褐色提取物(10.9g)。將該提取物溶解在丙酮中(大約20mL)，涂在二氧化硅上，加樣到硅柱(3×6.5cm直徑)上，并且用丙酮/己烷(20％-40％)分步梯度洗脫。合并含有rapalogue的級份，并且在真空中除去溶劑。在Sephadex LH20上對殘余物(840mg)進行進一步的層析，用10∶10∶1氯仿/庚烷/乙醇洗脫。將半純化的rapalogue(151mg)溶解在乙腈(2.7mL)，離心(10min，13200rpm)并且通過反相(C18)制備型HPLC，使用Gilson HPLC，用21mL/min的60％乙腈/水洗脫Phenomenex 21.2×250mm Luna 5μm C18 BDS柱來進行純化。合并大部分純的級份(通過分析HPLC確定)并且在真空中除去溶劑，以得到17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素(10mg)。
vi)特征進行多種NMR實驗，即1H、13C、APT、COSY、HMQC、HMBC、TOCSY。對這些數據進行的充分和深入的檢查，能夠對17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的兩種旋轉異構體(rotomer)的大部分質子和碳進行排布。烯屬甲基共振的缺乏從1H NMR光譜中直接地表現出來。在COSY光譜中可以看出H16和烯屬次甲基(沒有出現在39-去羥基前-雷帕霉素的光譜上)之間的相關性，這證實了所述化合物缺少C-17上的甲基。圖7中顯示所述化合物每種已知的旋轉異構體包含C17的部分的重要NMR相關性(在該結構酰胺部分的兩者之間的差異沒有示出)。
表217去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素的1H和13C NMR數據



a，b，c，d，e這些分配可以相互交換1H-NMR的NMR數據是在CDCl3中在500MHz獲得的，13C-NMR的NMR數據是在CDCl3中在125MHz下獲得的。
實施例2-將啟動酸系列供給吸濕鏈霉菌MG7-9表3用于系列供給實驗的酸的來源

方法A合成(1R*，3R*，4R*)-3，4-二羥基環己烷羧酸
(1R*，3R*，4R*)-3，4-二羥基環己烷羧酸可以方便地從商業上可得到的外消旋3-環己烯羧酸獲得。通過用間-氯過苯甲酸處理將該酸環氧化，并且通過添加堿(三乙胺)原位轉化成(1R*，3R*，4R*)-4-羥基環己烷-1，3-碳內酯，因此建立了相對立體化學。然后通過氫氧化鉀水溶液的作用水解這種內酯，并且用離子交換樹脂純化最終產物(Corey，E.J.and Huang，H.1989)。
方法B合成乙基(1R*，5R*)5-羥基環己-3-烯羧酸酯 以外消旋形式制備標題化合物，通過從環己-3-烯羧酸制備(1R*，3R*，4R*)-4-碘環己烷-1，3-碳內酯，然后用堿DBU(1，8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯)處理以消除HI。然后用溶解在乙醇中的氫氧化鉀處理所得(1R*，5S*)-環己-3-烯-1，5-碳內酯，以得到標題化合物(Marshall，J.A.，and Shiping，X.，1995)。
方法C合成乙基(1R*，4R*)-3-氟-4-羥基環己烷羧酸酯 將按照方法A制備的(1R*，3R*，4R*)-4-羥基環己烷-1，3-碳內酯，作為(1R*，3R*，4R*)-4-(1-四氫吡喃基)氧環己烷-1，3-碳內酯進行保護，用乙醇中的氫氧化鉀處理，以產生乙基(1R*，3R*，4R*)-3-羥基-4-(1-四氫吡喃基)氧環己烷羧酸酯。通過激活-取代方法(Yin等，2004)，將氟導入3位，并且用酸性DOWEX樹脂除去4-(1-四氫吡喃基)基團。
i)系列添加實驗吸濕鏈霉菌MG7-9在28℃在培養基1上生長14天，直到發生孢子形成。將0.5cm截面直徑的瓊脂、菌絲體和孢子從平板上取出，并且轉移到裝在帶有泡沫塞的50mL falcon管中的7mL培養基2(rapV7)中，并且在28℃以300rpm搖動培養48小時。然后將0.5mL該種子培養物轉移到裝在具有泡沫塞的50mLfalcon管中的7mL培養基3(MD6)中，并且在26℃以300rpm搖動生長24小時。將溶解在0.05mL甲醇中的每一種啟動酸添加到合適培養物中，至2mM的最終濃度(啟動酸的列舉參見表4)。然后在26℃將該培養物再生長4天。從每一個燒瓶中取出1mL培養物，并且添加到裝在2mL eppendorf試管中的1mL乙腈中，在室溫下振蕩1小時，然后以13,000rpm在microfuge上離心15分鐘。取出0.2mL的上層放入HPLC試管，并且使用UV和LCMS檢測通過HPLC進行分析。
表4提取物分析 *＝還未確定整合的啟動酸中羥基和氟基基團的區域化學和/或立體化學；這反映在下面的結構示意圖上。然而，應當注意的是，該示意圖旨在反映所獲得的單一產物，如果需要的話，本領域技術人員在閱讀以上實施例之后能夠分離并且鑒定該產物。
實施例3-接合載體pLL150的構建。
用SpeI和BstEII消化質粒pSGset1(WO 04/007709)，并且分離2.481kbp的片段，將該片段與同樣用SpeI和BstEII消化的載體pRT801(Gregory等，2003)連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化篩選菌落，并且分離最終質粒pLL150。參見圖8。
實施例4-通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9來分離17-去甲基雷帕霉素i)制備含有雷帕霉素輔助基因rapK，rapI，rapJ，rapN，rapO，rapM，rapQ和rapL(rap KIJN/OMQL)的補償質粒pLL158。
用SpeI和HindIII消化質粒pSGsetrapKIJN/OMQL(WO 04/007709)，并且分離8.516kbp的片段(包含rap KIJN/OMQL)，并且與同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定并驗證最終的質粒pLL158。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL158)菌株用pLL158轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。在培養基1(含有50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸)上分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在含有50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。這些貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本(plug)接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃以300rpm培養2天。然后將這些培養物用于接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃以300rpm培養6天。通過添加等體積的乙腈從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。然后通過LC-MS對樣品的17-去甲基雷帕霉素產量進行分析評估。
iii)17-去甲基雷帕霉素的分析根據LCMS數據推測，所觀察到的新型rapalogue是17-去甲基雷帕霉素。這些數據表明，所述新型rapalogue比雷帕霉素小14個質量單位，與缺少一個甲基吻合。觀察到的離子[M-H]898.7，[M+Na]+922.7，[M+K]+938.6。觀察到了雷帕霉素的UV三烯特征，但是中央峰的UV最大值發生了偏移(由雷帕霉素的λ＝278nm變為λ＝270nm)。
iv)17-去甲基雷帕霉素的發酵用于分離通過將0.1mL的冷凍母液接種到裝在250mL燒瓶中的50mL培養基4中制備初級營養培養物。該培養物在28℃以250rpm搖動培養48小時。然后將該培養物在2000mL燒瓶中的400mL培養基4中進行繼代培養，以得到二級營養培養物。該培養物在28℃、250rpm培養24小時。
將營養培養物以7.5％v/v接種到裝在20L發酵罐中的15L培養基5(參見上文)中。在26℃培養6天，0.5vvm≥30％溶解氧最小端速為1.18ms-1，最大端速為2.75ms-1。在接種48小時之后，加入200mL水中的9.5g L-賴氨酸。
v)提取和純化將發酵液(12L)與等體積的甲醇一起攪拌2小時，然后離心使細胞沉淀(10min，3500rpm)。將上清液與DiaionHP20樹脂(43g/L)一起攪拌1.5小時，然后過濾。用丙酮(總體積7.5L)分批洗滌樹脂，以洗脫rapalogue，并且在真空中除去溶劑。用水將所得的含水濃縮物(～800mL)稀釋到1L，并且用EtOAc(3×1L)萃取。在真空中除去溶劑，以得到粘稠的褐色提取物。
將所述提取物溶解在丙酮(大約20mL)中，涂在二氧化硅上，加樣到二氧化硅柱(3×6.5cm直徑)上，并且用丙酮/己烷(20％-40％)分步梯度洗脫。合并含有rapalogue的級份，并且在真空中除去溶劑。將殘余物在Sephadex LH20上進一步層析，用10∶10∶1氯仿/庚烷/乙醇洗脫。將半純化的rapalogue溶解在乙腈(2.7mL)中，離心(10min，13200rpm)并且通過反相(C18)制備型HPLC，使用Gilson HPLC，用21mL/min的60％乙腈/水洗脫Phenomenex 21.2×250mmLuna 5μm C18 BDS柱來進行純化。合并大部分純化級份(通過分析HPLC確定)，并且在真空中除去溶劑，以得到17-去甲基雷帕霉素(133mg)。
vi)鑒定對分離的產物進行LCMSn分析，并且碎裂鈉加成物得到了17-去甲基雷帕霉素的預測的離子，該碎裂是基于確定的碎裂途徑(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge，2000)。該質譜碎裂數據將所述新型rapalogue中發生了甲基丟失的區域范圍縮小到了片段C16-C27上。進行了一系列NMR實驗，即1H、13C、APT、COSY、HMQC、HMBC、TOCSY。對上述數據進行全面和深入的檢查，可以得到對17-去甲基雷帕霉素的排布。烯屬甲基共振的缺乏提供了特殊的信息，并且觀察到了重要的相關性，并描述于下表5中。
表517-去甲基雷帕霉素的1H和13C NMR數據




●在CDCl3中獲得的NMR數據，1H-NMR的數據是在500MHz下獲得的，13C-NMR是在125MHz下獲得的。
實施例5通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9來分離9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素i)制備含有雷帕霉素輔助基因rapK，rapN，rapO，rapM和rapL(rapKN/OML)的補償質粒pLL174用SpeI和HindIII消化質粒pSGsetrapKN/OML(WO 04/007709)，分離5.795kbp的片段(包含rap KN/OML)，并且連接到同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150上。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLL174。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL174)菌株用pLL174轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。該貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃以300rpm培養2天。然后使用這些培養物接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃以300rpm培養6天。
通過添加等體積的乙腈從這些培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS評估9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素的生產。
iii)9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素的分析根據LCMS數據，推測觀察到的新型rapalogue是9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素。這些數據表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小42個質量單位，與缺少3個甲基吻合。觀察到的離子[M-H]856.8，[M+Na]+880.7，[M+K]+896.6。
實施例6通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9來分離9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素i)制備包含雷帕霉素輔助基因rapK，rapI，rapN，rapO和rapL(rap KIN/OL)的補償質粒pLL173用SpeI和HindIII消化質粒pSGsetrapKIN/OL(WO 04/007709)，分離5.624kbp的片段(包含rap KIN/OL)，并且與同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLL173。
ii)吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL173)菌株的分離用pLL173轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。所述貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃以300rpm培養2天。然后將這些培養物用于接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培養6天。
通過添加等體積的乙腈從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS評估所述培養物的9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素的產量。
iii)9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素的分析根據LCMS數據，推測觀察到的新型rapalogue是9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素。以上數據表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小42個質量單位，與缺少3個甲基吻合。觀察到的離子[M-H]856.8，[M+Na]+880.7，[M+K]+896.6。
實施例7通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9并且用啟動酸補償生產培養基來分離17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制備包含雷帕霉素輔助基因rapI，rapJ，rapN，rapO，rapM，rapQ和rapL(rap IJN/OMQL)的補償質粒pLL178。
用SpeI和HindIII消化質粒pMG262(WO 04/007709)(表達基因rapI，rapJ，rapN，rapO，rapM，rapQ和rapL)，分離7.259kbp的片段(包括rap IJN/OMQL)，并且與同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLL178。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL178)菌株用pLL178轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。所述貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃，以300rpm培養2天。然后將培養物用于接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃，以300rpm培養6天。在培養基3中生長24小時之后，在培養物中添加環己烷羧酸至最終濃度為1mM。
通過添加等體積的乙腈，從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS評估所述培養物的17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的產量。
iii)17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析根據LCMS數據，推測觀察到的新型rapalogue是17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。以上數據表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小30個質量單位，與缺少1個甲氧基吻合。觀察到的離子[M-H]868.3，[M+Na]+892.3，[M+K]+908.3。觀察到了雷帕霉素的UV三烯特征，但是中央峰的UV最大值發生了偏移(由雷帕霉素的λ＝278nm變為λ＝270nm)。
iv)發酵17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素用于分離通過將0.1mL的冷凍原液接種到裝在250mL燒瓶中的50mL培養基4中來制備初級營養培養物。將培養物在28℃以250rpm搖動培養48小時。然后將培養物在裝于2000mL燒瓶中的400mL培養基4中繼代培養，以提供二級營養培養物。所述培養物在28℃，250rpm培養24小時。
將營養培養物以7.5％v/v接種到裝在20L發酵罐中的15L培養基5中(參見上文)。在26℃，0.5vvm≥30％溶解氧最小端速為1.18ms-1，最大端速為2.75ms-1培養6天。在接種48小時之后，加入200mL水中的9.5g L-賴氨酸。
v)提取和純化將發酵液(12L)與等體積的甲醇一起攪拌2小時，然后離心使細胞沉淀(10min，3500rpm)。上清液與DiaionHP20樹脂(43g/L)一起攪拌1.5小時，然后過濾。用丙酮(總體積7.5L)分批洗滌所述樹脂，以洗脫rapalogue，并且在真空中除去溶劑。用水將所得到的含水濃縮物(～800mL)稀釋到1L，并且用EtOAc萃取(3×1L)。在真空中除去溶劑，以得到粘稠的褐色提取物。
將提取物溶解在丙酮(大約20mL)中，涂在二氧化硅上，加樣到二氧化硅柱(3×6.5cm直徑)上，并且用丙酮/己烷(20％-40％)以分步梯度洗脫。合并含有rapalogue的級份，并且在真空中除去溶劑。殘余物用Sephadex LH20進一步層析，用10∶10∶1的氯仿/庚烷/乙醇洗脫。將半純化的rapalogue溶解在乙腈(2.7mL)中，離心(10min，13200rpm)并使用Gilson HPLC通過反相(C18)制備型HPLC純化，用21mL/分鐘的60％乙腈/水洗脫Phenomenex 21.2×250mm Luna5μm C18 BDS柱。合并大部分純化的級份(通過分析HPLC確定)，并且在真空中除去溶劑，以得到17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素(30mg)。
vi)鑒定對分離的產物進行LCMSn分析，并且碎裂鈉加成物得到17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的推測的離子，該碎裂是基于確定的碎裂途徑(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge，2000)。該質譜碎裂數據將所述新型rapalogue中發生了甲基丟失的區域范圍縮小到了片段C16-C27上，以及發生了甲氧基丟失的區域范圍縮小到了片段C28-C44上。進行多種NMR實驗，即1H、13C、APT、COSY、HMQC、HMBC、TOCSY。對上述數據進行的全面和深入的檢查，可以實現17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的排布。烯屬甲基共振的缺乏提供了特別的信息，并且質子NMR排布如下面的表6所示。
表617-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的1H NMR數據


在CDCl3中在400MHz下測定的NMR數據實施例8-通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9并且用啟動酸補充生長培養基來分離16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制備包含雷帕霉素輔助基因，rapI，rapJ，rap N/O，rapQ和rapL(rapIJN/OQL)的補償質粒pLL184用SpeI和HindIII消化質粒pMG260(WO 04/007709)(表達基因rapI，rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL)，分離6.3kbp的片段(包括rap IJN/OQL)，并且連接到同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150上。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLL184。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL184)菌株用pLL184轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。所述貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃，300rpm培養2天。然后將培養物用于接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培養6天。在培養基3中生長24小時之后，將環己烷羧酸添加到培養物中，至最終濃度為1mM。
通過添加等體積的乙腈，從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS分析所述培養物的16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的產量。
iii)16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析根據LCMS數據，推測觀察到的新型rapalogue是16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。以上數據表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小44個質量單位，與缺少1個甲氧基和1個甲基吻合。觀察到的離子[M-H]854.2，[M+Na]+878.3，[M+K]+894.3。
實施例9-通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9并且用啟動酸補充生產培養基來分離16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制備包含雷帕霉素輔助基因rapJ，rap N/O，rapQ和rapL(rap JN/OQL)的補償質粒pLSS249用EcoRI和BglII消化質粒pSGsetrapKIJN/OQL(WO 04/007709)，分離3.774kbp的片段(包括rap JN/OQL)，并且與用同樣方法消化的pSGsetrapJ連接(WO04/007709)。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定質粒pLSS238。進一步用SpeI和HindIII消化質粒pLSS238，并且分離7.311kbp的片段(包括rap JN/OQL)，并且與同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLSS249。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLSS249)菌株用pLSS249轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。所述貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃，300rpm培養2天。然后將培養物用于接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培養6天。在培養基3中生長24小時之后，在培養物中添加環己烷羧酸，至最終濃度為1mM。
通過添加等體積的乙腈，從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS分析所述培養物的16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的產量。
iii)16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析對所述新型rapalogue進行的LCMS分析表明，其與實施例8所述的rapalogue具有相同的質量和保留時間。
實施例10通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9并且用啟動酸補充生產培養基來分離9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素。
i)制備包含雷帕霉素輔助基因rapM，rap N rapO和rapL(rap MN/OL)的補償質粒pLL191分離質粒pMG237質粒pSGsetrapKJMN/O是pSET152-衍生的質粒，其中將基因rapK，rap J，rapM，rapN和rapO置于actI啟動子之下，該啟動子自身是由同樣存在于所述質粒上的actII-ORF4控制的。這與用于本研究的其他含有盒的質粒的情況類似。用BglII/XbaI消化質粒pSGsetrapKJMN/O，并且將分離的載體片段與pSGLitrapLhis的1kbXbaI/BglII片段連接。分離質粒pMG237(表達rapK，rapJ，rapM，rapN，rapO，和rapL)。
用限制性內切酶SpeI和HindIII消化質粒pMG237(表達基因rapK，rapJ，rapM，rapN，rapO和rapL)，分離6.841kbp的片段，并且與同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定質粒pLL171。用AsiSI和NheI消化質粒pLL171，分離5.293kbp(包含rap MN/OL)，并且與同樣用AsiSI和NheI消化的pSGsetrapM(WO 04/007709)連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定質粒pLL180。質粒pLL180表達基因rapM，rap N/O和rapL。通過用SpeI和HindIII消化，將所述質粒轉入接合載體pLL150。從pLL180分離4.785kbp的SpeI/HindIII片段，并且與以相同方法消化的pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLL191。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL191)菌株用pLL191轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。所述貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃，300rpm培養2天。將培養物用于接種(0.5mL接種到7mL中)培養基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培養6天。在培養基3中生長24小時之后，在培養物中添加環己烷羧酸，至最終濃度為1mM。
通過添加等體積的乙腈，從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS分析所述培養物的9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素的產量。
iii)9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素的分析根據LCMS數據，推測觀察到的新型rapalogue是9-脫氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。以上數據表明，所述新型rapalogue比17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素大30個質量單位，與增加了一個甲基和一個羥基吻合。觀察到的離子[M-H]840.6，[M+Na]+864.6，[M+K]+880.6。
實施例11-通過用輔助基因盒補償吸濕鏈霉菌MG7-9并且用啟動酸補充生產培養基來分離9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制備包含雷帕霉素輔助基因rapI，rap N/O和rapL(rap IN/OL)的補償質粒PLL190用BglII消化質粒pSGsetKIN/OL，分離3.272kbp的片段(包含rap IN/OL)，并且與用BglII消化且用堿性磷酸酶處理的質粒pSGsetrapI(WO 04/007709)連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定質粒pLL177。用SpeI和HindIII進一步消化質粒pLL177，分離5.624kbp的片段(包含rap IN/OL)，并且與同樣用SpeI和HindIII消化的接合載體pLL150連接。在轉化入大腸桿菌DH10B之后，通過限制性內切酶消化鑒定和驗證最終的質粒pLL190。
ii)分離吸濕鏈霉菌MG7-9(pLL190)菌株用pLL190轉化含有質粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567，以制備用于接合的大腸桿菌供體菌株。該菌株用于通過接合轉化吸濕鏈霉菌MG7-9。分離阿泊拉霉素抗性菌落，并且貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培養基1上。這些貼片在28℃生長，然后再次貼在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培養基ISP3上，并且在28℃生長14-21天。使用來自每個貼片的圓柱狀樣本接種裝有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培養基2(RapV7)的獨立falcon管。所述種子培養物在28℃，300rpm培養2天。然后將培養物用于接種(0.5mL接種到7mL)培養基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培養6天。在培養基3中生長24小時之后，在培養物中添加環己烷羧酸，至最終濃度為1mM。
通過添加等體積的乙腈，從所述培養物中提取次級代謝產物。通過離心除去細胞碎片。通過LCMS分析所述培養物的9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的產量。
iii)9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析根據LCMS數據，推測觀察到的新型rapalogue是9-脫氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。這些數據表明，所述新型rapalogue比17-去甲基-39-去羥基前-雷帕霉素大16個質量單位，與增加了一個羥基吻合。觀察到的離子[M-H]826.7，[M+Na]+850.6，[M+K]+866.6。
實施例12抗癌活性的體外生物分析在單層增殖試驗中對一組12個人類腫瘤細胞系的17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素抗癌活性的體外評估，使用改進的碘化丙啶分析方法如上所述進行。
結果如下面的表7所示，每一個結果表示兩次重復實驗的平均值。表8顯示在所有試驗的細胞系中試驗化合物和雷帕霉素的IC50和IC70。
表7

表8

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<223>人工產生的限制位點<400>13gtcctaggtg atgtcccggc aacacg 26<210>14<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>14cacctgcagg cccaactcgg ccagctcgct 30<210>15<211>1596<212>DNA<213>人工的<220>
<223>來自AT10的同源性PCR產物的左區，由吸濕鏈霉菌使用SEQ ID NOs 1和2擴增，其包含附加的限制位點
<400>15cacctgcagg cccaactcgg ccagcccgcr gatcagcgcc ccgtccgggg cgctgcggga 60cagcaacagc agatgacgca caccgcgttc ggccaccagg tgccgggcgg cgatccccgc120cagcacaccc gaaccaccgg tgatcagaac cgtgccatcc ggatcccaga cgccttcagg180ctcaggctca gcgacgcccg tacgagtcag tcgcggtgcc tcgtaccggc cgtcgatgac240ccgcagccgc ggctcatcga gcccgacggt ggcggccagt tggtccgggg tgagggtgtc300gtcgtcactt tccaccagga cgaaccggcc cgggtgctcc gactgagccg aacgcatcaa360ccccgacacc gcggctgcgg ccaaaccagt tccggtccgc acaaccagcg tactgtcagt420gaaacgctcc cccgccagcc acacctgcac cgcctgcaga acctcagcgg tcagccgacg480agtctgtgcc agcgggtcac cgctgtcggg gagtgcggtg aacacaacga catcgggcat540cggcacctcg ccgtccgcga ggtcttcaaa cttgcccacc gtcacgccga cctgctggga600gaccgggatc tccgtccacg tcagggcgaa cagatcatcg acagcagaac cgagcgcatc660ggctgccacc ggacgggtca ccagcgagcc gatggtggcc accggccgac cgatgtcatc720agcgacccgc acaccccagc catccgcgac ccgtgtcatc gcgacccgca gcgtggccga780gccagtgaca tggacctgga cgtggttcca ggagaacggc aaccgcacgg tgtcgcggtc840ggcatcgggt gtgttcagga tcccggcgtg cagggcggca tccaacaccg cagggtggac900ggcgaatcgt gccgcgtcct gggtctgctc ctcagccaga gcaacctcgg cgaagacggt960gtcaccatca cgccacgcgg cctgcaaacc ctggaaggca ggtccgtact cgtaacccgc 1020cctggtcagc tggtcgtaga agcctgccac gtccaccggc ttggcctgcg caggtggcca 1080cgcggtgagg tccgccgttg gcacagtcgt gtcggacacg ctgacggtgg cggaaacgtg 1140
ccggacccag gcatcggcgc tgtccgcccg ggagaagacc gtcaccgcgc ggtgtccgga1200ttcgtcggcc tcgccgacgg atacggacag ttgcacaccg ccggtctgcg gcagcagaag1260cggggtttcg acgatcagct cgtcaacgac gtcgcagccc acctcatcag ccgcgcggac1320aaccagctcc acaaacccgg taccgggcag caggacactg ccccggaccg cgtgatcagc1380cagccacgcg tgggtggcca gtgatacccg cccggtcagc atcacaccat ccgaacccgg1440catcgccagc accgcaccca gcaacggatg gcccaccgca tccagacccg cccccgacac1500atcggcagac cggccggcct cagcccaata ccgctggtgc tggaacgcgt acgtcggaag1560atccagcacc cgtgttgccg ggacatcacc taggac 1596<210>16<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>16cctggccagg aaagacgaac acgatcct 28<210>17<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>17cgaagcttga gccgctggcg atcgtggga29
<210>18<211>1550<212>DNA<213>人工的<220>
<223>來自AT10的同源性PCR產物的右區，由吸濕鏈霉菌使用SEQ ID NOs 1和2擴增，其包含附加的限制位點<400>18cctgccagga aagacgaaca cgatcctggg gtcggacacc gcggtgccgg tgacggtctc 60atctccaagg agtacggcgc ggtgctcgaa caccgaccgt gtcaccgcca gcgtcgatgc120cacagcccgt atatccactc cgggogacgc cgccaggtag gcgcggagcc ggtcttcgtg180ttcggtcagg gcgggctggg tcttggccga tatcaccagc ggcaccagtt ccgaaaccag240tacgggtgta gagccagccg tgtcgcccac agactgtgcc ggtgcactct caaggatgac300gtgggcgtta gtgccactga tcccgaacga cgacacacct gcccgacggg gtcggccggt360ctccggccac ggctggttct ccgccaccag ctcgaccgca cccgccgacc agtccacatg420ccgcgacggc tcatccacat gcaacgtgcg cggcaccatg ctgtgctgca gggccatcac480catcttgatg acacccgaca cacctgcggc agcctgggta tggccgacgt tcgacttcag540cgatcccagc agcagcggct ccccgcggcc ctggccgtaa gtagcgatca ccgcctgggc600ctcgatcggg tcacccagcg tcgtacccgt gccgtgcgcc tcgaccacat ccacctcgtg660cggcgccagg cccgcgttgc tgagagcggc ccggatcacc cgctgctgcg aaggaccgtt720cggcgcggac aggccgttcg acgcaccgtc ctggttcacc gccgagctac ggaccaccgc780caatatctgg tgaccgttgg cctgagcatc cgacaaacgc tccaccaata ggacgccgac840gccctcagcc caccccgtgc cgtccgcggc gtcagcgaac gccttgcacc ggccatcggc900
tgacaagcct cgctgccgcg agaactccac gaaagtctgc ggcgtggcca tcacggtcac 960gccgccgscc agggccagcg aacacccacc ctgtcgcagg gcataccccg cctgatgcaa1020cgccaccagc gacgacgaac acgccgtgtc caccgtgaac gcgggacctt cgagaccgaa1080gaagtacgac acccggcccg acaacacact cgccgcacca gcagttgtcc cgaagccgcc1140gaggtcggca ccgatgccgt agccaccggg gtaagcacot atgaagacgc cggtgtcgct1200gccgcgtacg gaaccgggct cgatcccggc ccgctcgaac gcctcccagg acacctcaag1260catcaaccgc tgctgcggat ccatcgccaa cgcctcacgc ggactgatcc cgaagaacga1320ggcgtcgaaa ccggccgcgg catccaggaa gccgccctgc acgctgtagg acttcccggg1380cgcgtccggg tccggatcgt acaggttctc gacgtcccag ccgcggtcgg ttgggaagcc1440ggaaatcgcg tccgtaccgg actcgaccaa gcgccacaga tcctccggcg acgagactcc1500accgggtagg cggcaggcca ttcccacgat cgccagcggc tcaagcttcg 1550
權利要求
1.17-去甲基雷帕霉素及其類似物。
2.如權利要求1的化合物，它具有以下結構式 其中x表示直接鍵，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-x-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示選自下組的結構片段A，B，C，D，E和F， 其中，波形線表示片段結合位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，鹵基，硫醇或C1-4烷基；或R4還可以表示5-7-元雜環，包括選自下組的一個或多個雜原子O，S和N，所述雜環任選地用選自C1-4烷基，OH，F和Cl的一個或多個取代基取代；和R5和R6各自獨立地為H或OH，或其可以藥用的衍生物。
3.如權利要求1的化合物，其中，R4表示選自下組的結構片段如權利要求1中限定的A，B，C，E和F，其中，R7表示H，OH或Ome，和R8表示H，OH，OMe，Cl或F。
4.如權利要求3的化合物，其中，R4表示選自下組的結構片段A(i)，C(i)，E(i)和F(i) 其中，R7表示H或OH，而R8表示H，OH或OMe。
5.根據前述權利要求中任意一項的化合物，其中當R5表示OH時，R6表示H，而當R6表示OH時，R5表示H。
6.根據前述權利要求中任意一項的化合物，其中x表示直接鍵或CH2。
7.根據前述權利要求中任意一項的化合物，其中x表示CH2。
8.根據前述權利要求中任意一項的化合物，其中R2表示OH。
9.根據前述權利要求中任意一項的化合物，其中R1表示(H，H)，R2表示OH，R3表示H，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7和R8都表示OH，而x表示CH2。
10.根據權利要求2的化合物，其中R1表示(H，H)，R2表示OH，R3表示H，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，而x表示CH2。
11.根據權利要求2的化合物，其中R1表示(H，H)或＝O，R2表示OH或OMe，R3表示OH或OMe，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，OH或OMe，而x表示CH2。
12.根據權利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH或OMe，R3表示H，OH或OMe，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示F或Cl，而x表示CH2。
13.根據權利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH，R3表示OMe，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，而x表示CH2。
14.根據權利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH，R3表示OH，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，而x表示CH2。
15.根據權利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH，R3表示OMe，R4表示如權利要求4中限定的結構片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示OMe，而x表示CH2。
16.如權利要求1-15中任意一項限定的化合物在醫藥中的用途。
17.根據權利要求1-15中任意一項的化合物在制備用于誘導或維持免疫抑制作用，刺激神經元再生或治療癌癥、B-細胞惡性腫瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病和血管疾病的藥品中的用途。
18.藥物組合物，其包含根據權利要求1-15中任意一項的化合物或其可以藥用的鹽和可以藥用的載體。
19.用于產生根據權利要求1或2所述的17-去甲基雷帕霉素或其類似物的方法，所述方法包括(a)用丙二酰-CoA-特異性AT結構域取代雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域，(b)在合適的宿主細胞中表達工程改造的雷帕霉素PKS，(c)在產生17-去甲基雷帕霉素或其類似物的條件下培養所述宿主細胞，包括任選地提供外源前體，(d)任選地分離由此產生的化合物。
20.用于制備包括編碼工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇的重組菌株的方法，其中，模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代。
21.根據權利要求19或20的方法，其中所述模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域被來自下列簇中的一種的丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代雷帕霉素，莫能菌素，FK506，紅霉素，FK520，兩性霉素，安哥拉霉素，泰樂菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。
22.根據權利要求21的方法，其中所述丙二酰-CoA特異性AT結構域選自下列簇中的一種雷帕霉素，莫能菌素和FK506。
23.根據權利要求22的方法，其中所述AT結構域選自下組來自雷帕霉素模塊2的AT結構域，來自莫能菌素模塊3的AT結構域，來自莫能菌素模塊6的AT結構域，來自莫能菌素模塊8的AT結構域，來自FK506模塊3的AT結構域和來自FK506模塊7的AT結構域。
24.根據權利要求23的方法，其中所述丙二酰-CoA特異性AT結構域來自雷帕霉素的模塊2。
25.根據權利要求19-24中任意一項的方法，其中所述方法包括以下附加步驟(a)分離作為具有合適的側翼限制位點的單一DNA片段要導入的AT，(b)利用合適的限制位點擴增并且分離與目標AT的側翼序列同源的DNA序列的區域，(c)將步驟(a)和(b)所述三種DNA片段連接在一起，以得到LHS同源性，隨后是供體AT結構域，隨后是RHS同源性的框內序列，(d)將來自步驟(c)的完整序列導入用于導入宿主菌株的載體，以得到最終質粒，所述質粒包括i)用于接合的oriT，ii)一種或多種抗性標記，iii)溫度敏感型復制起點，從而可通過在37℃培養來選擇整合體，和iv)大腸桿菌復制起點，(e)使用上面(d)中所述的最終質粒通過接合來轉化所述宿主菌株，(f)通過對相關抗生素的抗性選擇轉化體，(g)通過在37℃培養，用抗生素選擇來產生初級整合體，(h)同樣在37℃，通過在不進行抗生素選擇的條件下的生長來篩選次級重組體，(i)通過產生目標產物的能力鑒定需要的菌株，和(j)通過標準方法任選地驗證所述菌株的遺傳學。
26.制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)根據權利要求20制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，和；(b)在適合聚酮化合物產生的條件下將非天然啟動酸供給所述重組菌株。
27.制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)根據權利要求20制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)另外，將選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，和(c)培養由此獲得的菌株，如果需要的話，任選地在存在外源前體的條件下培養，以產生17-去甲基雷帕霉素類似物。
28.制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)根據權利要求20制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)另外將選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)沿反式方向重新導入所述雷帕霉素輔助基因的全部或亞組，以補充或部分補充所述缺失，和(d)培養由此獲得的菌株，如果需要的話，任選地在存在外源前體的條件下培養，以產生17-去甲基雷帕霉素類似物。
29.制備17-去甲基雷帕霉素類似物的方法，所述方法包括(a)根據權利要求20制備重組菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結構域已經被丙二酰-CoA特異性AT結構域所取代，(b)另外將選自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一個或多個雷帕霉素輔助基因缺失或失活，(c)任選地沿反式方向重新導入所述雷帕霉素輔助基因的全部或亞組，從而補充或部分補充所述缺失，和，(d)在適合聚酮化合物生產的條件下將非天然啟動酸供給所述重組菌株。
全文摘要
本發明涉及聚酮化合物和其他天然產物的生產，并且涉及化合物文庫和單個的新型化合物。因此，一方面，本發明提供了17－去甲基雷帕霉素及其類似物，它們的生產方法，包括重組菌株，以及本發明的化合物的分離和用途。另一方面，本發明提供了17－去甲基雷帕霉素及其類似物在誘導或維持免疫抑制，刺激神經元再生或治療癌癥、B－細胞惡性腫瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纖維變性疾病，和調控傷口愈合中的用途。
文檔編號C07D273/00GK101056880SQ200580034633
公開日2007年10月17日 申請日期2005年8月11日 優先權日2004年8月11日
發明者馬修·A·格雷戈里, 克里斯蒂娜·J·馬丁 申請人:比奧蒂卡科技有限公司