專利名稱：使用電催化嵌入劑測定核酸的制作方法
技術領域：
本申請一般地涉及用電催化嵌入劑(intercalator)檢測核酸的生物傳感器。
背景技術：
基于核酸的生物傳感器具有從基因分型到分子診斷范圍的潛在應用。基于熒光的技術提供高密度核酸陣列用于分析特異性核酸序列和基因表達。雖然被廣泛應用，但是這些陣列需要標記靶核酸樣品。因此，已經建議將電化學傳導法用于核酸雜交事件的超靈敏檢測。使用電化學技術代替熒光可以允許檢測器更簡易更小。選擇性地并靈敏性地直接檢測核酸的能力已經成為電化學研究的重要目標。
發明內容
因此，本發明人成功地設計了用于檢測樣品中核酸的生物傳感器的新策略。這種策略基于用于超靈敏核酸檢測的新的核酸嵌入劑的合成和分析應用。
在多種實施方案中，本發明提供式I的核心化合物L1-D-L2(I)其中D是二價環狀基團。L1和L2各自獨立地是連接基團，所述連接基團包含具有約3到約20個非氫原子的有機胺、脂肪族氨基和含氮部分。
在進一步的實施方案中，本發明還提供包含式I的核心化合物的電催化嵌入劑，所述式I的核心化合物與式II的過渡金屬化合物相結合
其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素。R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機部分。Z是鹵素原子和m是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是平衡m的陰離子或陰離子組合。在一個優選的實施方案中，金屬元素是釕。
在多種進一步的實施方案中，本發明還提供用于制備上述電催化嵌入劑的方法。所述方法包括使式I的核心化合物與式II的過渡金屬化合物相接觸以在核心化合物和過渡金屬化合物之間形成金屬-氮配位鍵。
本發明還提供利用上述電催化嵌入劑進行核酸電催化檢測的方法。在多個實施方案中，所述電催化嵌入劑與包含靶核酸的復合物相接觸以將所述電催化嵌入劑嵌入該復合物中。
在進一步的實施方案中，本發明還涉及包含電催化嵌入劑的試劑盒，以及利用這種電催化嵌入劑進行核酸電催化檢測的生物傳感器。
技術人員應當理解下述附圖僅僅是為了舉例說明的目的。所述附圖不希望以任何方式限制本發明教導的范圍。
圖1舉例說明PIND在CDCl3中的質子核磁共振(1H NMR)譜(300MHz)。
圖2舉例說明用電噴霧離子化模式對PIND進行質譜檢測。
圖3舉例說明Ru(bpy)2Cl2(跡線1)、PIND在乙二醇中回流30分鐘后的Ru(bpy)2Cl2(跡線2)、和純化的PIND-Ru(跡線3)的循環伏安圖，其中(跡線3)的支持電介質是PBS并且電勢掃描速率是100mV/s。
圖4舉例說明純化的PIND-Ru在PBS中的循環伏安圖，其中從伏安圖最內部到最外部的電勢掃描速率是100(跡線1)、200(跡線2)、300(跡線3)、400(跡線4)和500(跡線5)mV/s。
圖5舉例說明(A)作為0(跡線1)、25(跡線2)、50(跡線3)和100(跡線4)μM的增加濃度的鮭精DNA(堿基對)的函數，25μMPIND-Ru的紫外-可見光譜；(B)PIND-Ru對包含序列5′-AATTT-CCCCC-AAATT的發夾寡核苷酸的熒光嵌入劑置換滴定曲線。
圖6舉例說明(A)200nM聚(T)40(跡線1)、和分別與其互補CP包被電極雜交的200nM聚(AT)20(跡線2)、聚(AG)20(跡線3)和聚(G)40(跡線4)的循環伏安圖；(B)p53核酸雜交的生物傳感器在PBS中的第一(跡線1)和第五(跡線2)電勢循環，其中電勢掃描速率是100mV/s。
具體實施例方式
根據本發明，申請人已發現新的電催化嵌入劑，其插入核酸的堿基對之間并在加電化學勢差之后催化核苷酸的氧化。本發明的嵌入劑包含有助于嵌入劑電催化性質的多種部分。申請人已經發現本發明的電催化嵌入劑選擇性摻入雙鏈核酸中并且高效電催化作用提供靈敏的非標記測定或檢測靶核酸的通用平臺。
例如，穿線型(threading)嵌入劑是一組與雙鏈核酸可逆性相互作用的重要化合物。穿線型嵌入劑具有共同的結構特征，例如，存在平面多芳香體系，其結合插入雙鏈DNA的堿基對之間。不受任何具體理論約束，在本發明的電催化嵌入劑嵌入雙鏈核酸中之后，在電極處檢測到電子流，其中所述電催化嵌入劑氧化核苷酸并且電子從核苷酸轉移到生物傳感器/電極。不限制本發明的應用、功能或組合物，所述電催化嵌入劑在電化學勢差現象后氧化核苷酸。在催化循環中，嵌入劑被電極氧化，其能從核苷酸移除電子而形成自由基陽離子，所述自由基陽離子脫質子并經歷進一步反應。因此該反應是催化性的并通過一系列反應消耗核酸，這些反應直接從核酸移除電子并將它們轉移到電極，產生可檢測的電流。
在一個實施方案中，本發明提供具有對應于式(I)的結構的核心化合物L1-D-L2(I)式(I)中，D代表可具有一個或多個取代基的二價環狀基團。該二價環狀基團優選包含平面環狀基團。二價環狀基團的非限定性實例包括在其兩個氮原子上具有兩個鍵合位點的萘二酰亞胺基、在2-和6-位或1-和5-位(優選2-和6-位)具有兩個鍵合位點的蒽基、以與蒽基中相同方式具有兩個鍵合位點的蒽醌基、在2-和6-位具有兩個鍵合位點的芴基、在2-和6-位具有兩個鍵合位點的亞聯苯基、在2-和7-位具有兩個鍵合位點的菲(phenantholene)基、和在2-和7-位具有兩個鍵合位點的芘基。優選的環狀基團是在其兩個氮原子上具有兩個鍵合位點的萘二酰亞胺基。二價環狀基團的取代基的非限定性實例包括鹵原子(例如氯(Cl)或溴(Br)，或具有1到6個碳原子的烷基如甲基、乙基或正丙基)。
在一個優選實施方案中，D是核酸嵌入劑。嵌入劑是可以在雙鏈核酸例如DNA/DNA或DNA/RNA雜合體的堿基對之間滑動的分子。優選地，所述嵌入劑包含萘二酰亞胺基。在一個優選實施方案中，所述嵌入劑包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
上述的式(I)中，L1和L2各自獨立地是連接基團，所述連接基團包含具有約3到約20個非氫原子的有機胺、脂肪族氨基，還包含可提供金屬-氮配位鍵的含氮部分。在一個優選實施方案中，含氮部分是含有至少一個氮原子的雜環。適宜的含氮部分的非限定性實例包括咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、三唑、苯并三唑、吡啶、噠嗪、吡嗪、嘧啶和三嗪。所述雜環的一個氮可以與金屬形成配位鍵。優選的含氮部分是咪唑。當含氮部分是雜環時，所述脂肪族氨基優選在附著至所述環的烷基上。所述烷基可以是直鏈或支鏈的并通常含有約1到約20個碳原子，優選約2到約12個碳原子，更優選約3到約6個碳原子。優選的連接基是3-氨基丙基咪唑。
在另一個實施方案中，具有對應于上述式(I)的結構的化合物是電催化嵌入劑的一部分。在一個優選實施方案中，所述電催化嵌入劑包含鍵合到式(II)的過渡金屬化合物的式(I)的化合物 其中M是與氮形成配位鍵的金屬元素。R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機部分。Z是鹵原子和m是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是平衡m的陰離子或陰離子組合。
式II中，適于用作M的金屬元素包括，例如釕(Ru)、鋨(Os)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、銠(Rh)、錸(Re)、鉑(Pt)、鈧(Sc)、鈦(Ti)、釩(V)、鎘(Cd)、鎂(Mg)、銅(Cu)、鈷(Co)、鈀(Pd)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鎳(Ni)、鉬(Mo)、鎢(W)、銥(Ir)及其混合物。在一個優選的實施方案中，金屬元素M是過渡金屬釕(Ru)。
式II的R和R’可以相同或不同，并且在其氮原子上與金屬元素配位。R、R’或兩者同時可以是例如2，2’-聯吡啶基；用一或多個取代基取代的2，2’-聯吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一或多個C1-C4烷基取代的苯基。優選地，R和R’中至少一個是2，2’-聯吡啶基。
在另一個實施方案中，R和R’中至少一個并優選都是2，2’-聯吡啶基或1，10-菲咯啉基，其中任一個任選地可以被取代。當聯吡啶基或菲咯啉基被取代時，取代基優選地選自C1至C4烷基、苯基和進一步用C1-C4烷基取代的苯基，更優選C1-C2烷基。取代的聯吡啶基或菲咯啉基配基可以是單取代的、二取代的或更高取代的。在多個實施方案中，可以使用二取代的配基，包括例如4，4’-二取代-2，2’-聯吡啶基、5，5’-二取代-2，2’-聯吡啶基、1，10-菲咯啉基、4，7-二取代-1，10-菲咯啉基和5，6-二取代-1，10-菲咯啉基。
當R和R’中僅一個是聯吡啶基或菲咯啉基、或者以上討論的任選取代基團之一時，另一個優選地選自含有兩個能與金屬M形成配位鍵的氮原子的脂肪族配基。非限定性實例包括1，3-丙二胺、1，4-丁二胺及其衍生物，其中所述衍生物基于1，3-丙二胺或1，4-丁二胺骨架，所述骨架任選地用烷基、芳基或其它基團取代，這些基團不干擾氮元素與金屬M的配位鍵合或者不干擾所述配合物的電化學活性。
式II中，Z是鹵原子。在一個優選的實施方案中，Z是氯或溴，并且更優選氯。上標m是+1、+2、+3、+4、+5或+6，取決于M的氧化態。在一個優選的實施方案中，例如，當M是+4氧化態的釕時，Z是氯并且m是+3。X是平衡所述陽離子的形式電荷m的陰離子或陰離子組合。例如，X可以是，但不限于，氯、溴、碘、氟、四氟硼酸、高氯酸、硝酸、硫酸、碳酸或亞硫酸。
在一個優選的實施方案中，本發明的電催化嵌入劑包含鍵合到式(II)化合物的式(I)化合物，其中D是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，L1和L2各自是3-氨基丙基咪唑，M是釕，R和R’各自是2，2’-聯吡啶基，并且Z是氯。更優選地本發明的電催化嵌入劑包含式
本發明還提供制備上述電催化嵌入劑的方法。在本發明的一種優選方法中，通過通式(I)的核心化合物與通式(II)的過渡金屬化合物之間的配基交換來制備所述電催化嵌入劑。本文描述的過渡金屬化合物包含填充配基Z，在配基交換條件下，所述填充配基Z幫助形成與金屬的穩定配合物并且可被所述連接基置換。優選的連接基包含提供與金屬的金屬-氮配位鍵的含氮部分。在一個優選的實施方案中，金屬是釕，Z是氯，并且連接基是3-氨基丙基咪唑。
本發明的電催化嵌入劑可以用于檢測樣品中的靶核酸。在非限定性實例中，在固相載體如電極的表面形成包含核酸和電催化嵌入劑的配合物并檢測電子轉移。根據本發明，電催化嵌入劑插入到包含與互補探針分子雜交的靶核酸的雙鏈核酸的堿基對之間。不限制本發明的機理、功能或應用，這些方法利用核苷酸的電化學氧化。在插入雙鏈核酸中并在適當的電化學勢差時，所述電催化嵌入劑可以氧化核苷酸，優選鳥嘌呤。不受特定的理論約束，在催化循環中，嵌入劑被電極氧化，其能從核苷酸移除電子以形成自由基陽離子，所述自由基陽離子脫質子并經歷進一步反應。該反應是催化性的并通過一系列反應導致核酸的消耗，所述反應直接從核酸移除電子并將它們轉移到電極，從而產生可檢測的電流。
在一個實施方案中，通過靶核酸與探針雜交，其中所述探針或被固定在電極表面或能結合到電極表面，在所述電極表面形成包含靶核酸和電催化嵌入劑的配合物。適宜的探針可以包含核酸，所述核酸包含與靶核酸的特定序列互補的單鏈區。待檢測的靶核酸可以包含核酸，如所指出，其可以是單鏈或雙鏈核酸，或含有雙鏈或單鏈序列的部分。如果靶核酸僅包含雙鏈核酸，應當理解在靶核酸與互補探針雜交之前需要變性。
靶核酸可以是DNA(或基因組或eDNA)、RNA或雜合體，其中核酸含有脫氧核糖-和核糖-核苷酸的任意組合和堿基的任意組合，包括例如，尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷(inosine)、黃嘌呤(xathanine)、次黃嘌呤(hypoxathanine)等等。靶核酸與探針例如可以通過雜交結合。
通常，探針可以包含，例如，寡核苷酸，包括DNA、mRNA、rRNA、tRNA、肽核酸(PNAs)或表達序列標簽(ESTs)。可以從DNA或其片段得到探針，可以通過從活體提取、限制酶切割、電泳分離和熱處理或堿處理變性得到所述DNA或其片段。所述探針也可以化學合成。還可以用替代性堿基合成所述探針，所述替代性堿基取代探針鏈中的鳥嘌呤(即，如鳥嘌呤一樣，與核酸雙鏈中胞嘧啶的親和力大于與其它堿基的親和力的堿基)，但在合適反應條件下不被所述電催化嵌入劑氧化。替代性堿基的實例是肌苷(inosine)和7-去氮雜-鳥嘌呤。
適于制備所述探針的堿基可選自天然或非天然或“合成”核苷酸堿基。天然核苷酸堿基可以是，例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。探針還可以從非天然或“合成”核苷酸堿基制備，例如7-去氮雜-鳥嘌呤、8-氧-鳥嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羥乙基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基-甲基-2-硫代尿苷(thioridine)、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷(queosine)、2’-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷(thioridine)、β，D-甘露糖Q核苷(queosine)、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰)蘇氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷(queosine)、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。可以利用任意寡核苷酸骨架，包括DNA、RNA、修飾糖如碳環、和含有2’取代例如氟和甲氧基的糖。所述寡核苷酸可以是這樣的寡核苷酸，其中至少一個或全部核苷酸間橋連磷酸殘基是修飾磷酸酯，如甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、嗎啉代磷酸酯(phosphoromorpholidates)、哌嗪代磷酸酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯(例如，每隔一個核苷酸間橋連磷酸酯殘基可以是所述修飾殘基)。所述寡核苷酸可以是“肽核酸”如P.Nielsen et al.，Science 254，1497-1500(1991)中描述，其內容通過引用并入本文。唯一的要求是寡核苷酸探針應該具有這種序列，其至少一部分能結合到DNA樣品序列的已知部分上。在一些應用中，可能需要將靶核酸樣品與許多具有不同堿基序列的寡核苷酸探針相接觸(例如，樣品中有兩種或多種靶核酸，或者在“三明治”測試中單一靶核酸雜交到兩個或多個探針上)探針分子可以固定在電極上。在一個優選的實施方案中，探針附著在金電極上。然而，本領域技術人員應當理解可以通過許多本領域公知的技術將探針固定在電極上。使用文獻方法，有多種技術可以應用并且是本領域技術人員已知的，用于將探針固定在根據本發明使用的電極表面上。
在非限定性實例中，可以將巰基附著到探針分子例如寡核苷酸或多聚核苷酸的5’-或3’-末端(優選5’-末端)，并且附著的巰基與電極的金原子配位。M.Maeda et al.，Chem.Lett.，1805-1806(1994)和A.Connolly，Nucleic Acids Res.，13，4484(1985)描述了將巰基結合至DNA的方法，其內容通過引用并入本文。在所述固定方法中，將具有巰基末端的探針分子滴到金電極上，然后使之在低溫放置幾小時以后期望的探針分子就被固定在電極上。
在另一個非限定性實例中，例如使用玻璃碳電極，電極被高錳酸鉀氧化而在電極表面產生羧基。在具有羧基的表面上滴加含巰基末端的探針分子，使得形成酰胺鍵以將探針分子固定在玻璃碳電極的表面上。K.M.Millan et al.，Analytical Chemistry，65，2317-2323(1993)中描述了這種方法的細節，其內容通過引用并入本文。
還可以使用識別對將探針結合到電極上。在此方面，探針可以被修飾以包含識別對的第一成員而電極表面包被第二成員。因此，通過識別對的第一和第二成員的相互作用可以在電極表面形成包含探針/靶核酸雜合體的雙鏈核酸。識別對及其對多種分子的附著是本領域中已知的。在非限定性實例中，識別對由生物素和親合素組成。
可以在添加嵌入劑之前或嵌入劑存在下進行靶核酸與探針的雜交，優選使用嵌入劑的濃度是幾nM到幾mM。可以通過本領域技術人員已知的任意合適的方式使靶核酸樣品與探針相接觸。例如，靶樣品可以溶解在溶液中，并通過在允許雜交的條件下將探針溶解在含有靶樣品的溶液中來與探針相接觸。適宜的條件是本領域技術人員公知的并且包括多種鹽濃度條件。作為替代，可以將靶樣品溶解在溶液中，而探針固定在在固相載體上，由此通過將具有固定于其上的寡核苷酸探針的固相載體浸在含有靶樣品的溶液中，而可以使得靶樣品與探針相接觸。通過向電極施加電勢并檢測電流來測定靶核酸與探針的雜交。
本發明的電催化嵌入劑還可以用于檢測與探針分子部分地互補的靶核酸片段樣品。這種片段樣品通常稱為“錯配片段”。通過比較可能錯配的靶核酸片段的檢測中得到的峰電流強度與完全互補的靶核酸片段(即完全匹配的片段)的檢測中得到的相應峰電流強度，可進行錯配片段的檢測。
可以根據本領域技術人員已知的任意合適方法檢測包括氧化和還原的催化循環。檢測與氧化和還原反應相關的電信號允許確定是否存在雜交的探針/靶核酸。可以通過任意適宜的方法進行反應速率測量的步驟。例如，通過比較作為掃描速率、探針濃度、靶濃度、介質、緩沖劑、溫度和/或電化學方法的函數的電流來測定相對反應速率。
可以根據本領域技術人員已知的任意適宜的方法檢測氧化-還原反應速率。典型地，通過檢測與發生氧化-還原反應相關的電信號來檢測氧化-還原反應速率。例如，可以通過提供與檢測電極電子通訊的合適設備來檢測與氧化和還原反應相關的電信號。合適的設備可以檢測所產生的電信號，從而提供雜交的探針/靶核酸與電催化嵌入劑反應的氧化-還原反應速率的測量。所述電信號可以具有任意電化學方法的特征，包括循環伏安法、常規脈沖伏安法、計時電流法和方波伏安法，其中循環伏安法是目前優選的形式。
在優選的實施方案中，所述方法用于遺傳診斷。例如，寡核苷酸探針可以用于測定靶分析物序列，例如與多種癌癥相關的p53基因。另一些非限定性實例包括非息肉性結腸癌基因、BRCAl乳癌基因、ApoE4基因(該基因指示阿爾茨海默病的較大風險，允許容易的癥狀前篩查患者)、囊性纖維化基因的突變或本領域公知的任意其它基因。
在多個另外的實施方案中，可以用本發明的電催化嵌入劑進行病毒和細菌檢測。在該實施方案中，設計探針以檢測來自多種細菌和病毒的靶序列。本文公開的方法允許直接篩選臨床樣品以檢測例如HIV核酸序列。此外，作為一種改進的評價抗病毒治療療效的方法，這允許直接監測患者內的循環中的病毒。相似地，以此方式可以檢測白血病相關病毒、HTLV-I和HTLV-II。還可以檢測細菌感染例如結核。
在另一些實施方案中，在例如水和食物樣品篩選中有毒細菌的探針。例如，可以處理樣品以裂解細菌使得細菌釋放其核酸，然后設計探針來識別菌株，包括但不限于致病菌株，如沙門氏菌、彎曲桿菌、霍亂弧菌、大腸桿菌的腸毒性株和軍團病細菌。相似地，可以用本發明組合物評價生物治療策略。
在另一些實施方案中，所述探針可以用于法醫學，其中DNA指紋分析用于匹配犯罪現場的靶核酸如DNA來對比從受害者和嫌疑者取得的樣品。
靶核酸的來源可以包括例如人、動物、植物或環境。
在另一些實施方案中，本發明還涉及包含電催化嵌入劑的試劑盒。所述試劑盒還可以包含探針，例如本文描述的那些，其可以識別并結合待檢測的靶核酸。
在很多另一些實施方案中，本發明還涉及使用本文所述電催化嵌入劑的生物傳感器。所述生物傳感器可包含一種設備或用于系統中，所述設備或系統包括必要的組件，用于檢測和測量一或多種電催化嵌入劑產生的信號。設備可包含包括生物傳感器陣列的集成電路，并與電源和檢測器相組合。這種集成電路是本領域技術人員已知的。包括所述生物傳感器陣列的系統還可以包括在施加跨工作電極的電勢之后測量電化學信號的裝置。
本文描述的方法和設備使用技術人員公知的實驗技術，并可以在實驗手冊中發現，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Spector，D.L.et al，CellsALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1998；和Harlow，E.，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
本文描述的方法和設備使用技術人員公知的實驗技術，并可以在實驗手冊中發現，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Spector，D.L.et al，CellsALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1998；和Harlow，E.，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
本文使用的標題(例如“背景技術”和“發明內容”)僅僅是為了大致組織本發明公開內的主題，而不是為了限制本發明的公開內容或其任何方面。具體而言，“背景技術”中公開的主題可以包括本發明范圍內的技術方面但并不構成現有技術。“發明內容”中公開的主題并不是本發明全部范圍或其任意實施方案的窮盡的或全部公開。
本文的參考引用不等于承認那些參考是現有技術或與本文公開的發明的專利性有任何相關性。因此說明書中引用的所有參考以其全部內容經引用并入本文。
說明書和具體實施例，盡管展示了本發明的實施方案，但是僅是為了舉例說明的目的，而不是為了限制本發明的范圍。然而，具有所列特征的多種實施方案的敘述不是為了排除具有另外特征的其它實施方案、或合并所列特征的不同組合的其它實施方案。具體實施例是為了舉例說明如何制備、使用和實施本發明的組合物和方法的目的而提供的；除非另外明確指出，它們不是意圖代表已經或未曾實施或測試本發明的所給實施方案。
本文所用的單詞“優選”是指在某些情況下提供某些利益的本發明的實施方案。然而，在相同的或另外的情況下，另外的實施方案也可以是優選的。而且，提到一個或多個優選的實施方案并不意味著另外的實施方案不可用，并且沒有意圖將另外的實施方案排除在本發明范圍以外。
本文所用的單詞“包括”及其變體意思是非限定性的，例如列表中提到的項目并不排除可以其它類似的項目也可用于本發明的材料、組合物、設備和方法中。
以下描述中，術語“測定”或“檢測”將用于表示定性和定量地測定或檢測樣品中核酸。例如，當以下定義的方法和系統用于測定或檢測介質中核酸時，這意味著表示確定介質中核酸的存在和任選地其濃度。因此，短語“確定是否存在”意思包括定性測定和定量測定是否存在所檢測事件(例如，DNA雜交、RNA雜交、檢測靶核酸等)。
本文所用的術語“嵌入劑”是指能插入和/或堆疊在核酸堿基對之間的平面芳香或雜芳基結構。
本文所用的術語“穿線型(threading)嵌入劑”是指具有取代基或側鏈的嵌入劑。
本文所用的術語“電催化嵌入劑”是指可以被電極氧化并且在電化學勢差現象之后可以氧化核苷酸的嵌入劑。
本文所用的術語“核酸”是指任意核酸，包括DNA和RNA。本發明的核酸典型地是多聚核苷酸；也就是說，是通過3’，5’磷酸二酯鍵共價連接的單個核苷酸的聚合物。盡管本發明的方法和設備在本文中有時用DNA來解釋，但是這是為了清楚的目的，并且應當理解，本發明的方法和設備可以用于其它核酸例如RNA。
本文所用的術語“互補核酸”是指特異性結合另一個核酸而形成雜交核酸的任意核酸，包括寡核苷酸探針。
本文所用的術語“雜交”是指相互結合的至少兩個核酸鏈，其可以是或不是全部堿基配對。
本文所用的術語“變性”是指一種過程，通過所述過程寡核苷酸雙鏈不再通過氫鍵堿基配對而是被分成單鏈分子。變性方法是本領域技術人員公知的并包括熱變性和堿變性。
本文所用的術語“電極”是指傳導電流進出導電介質的電導體。兩個電極，陽極和陰極，分別接受和發射電子。電極通常用于描述導體。在本發明中，電極還可以是很多分離可尋址的電極組成的微陣列，或是超微電極。
本文所用的術語“核苷”是指連接戊糖如核糖、脫氧核糖或其衍生物或類似物的含氮雜環堿基。術語“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，包含含氮雜環堿基、戊糖和一或多個磷酸酯或其它骨架形成基團；它是寡核苷酸的單體單元。核苷酸單元可以包括常見堿基如鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、或其衍生物。戊糖可以是脫氧核糖、核糖或由此取代的基團。
本文所用的術語“核苷酸類似物”、“修飾堿基”、“堿基類似物”或“修飾核苷酸”是指功能與其天然對應物相似但是結構已被改變的部分。
本文所用的術語“寡核苷酸”或“核苷酸序列”是指從天然雜環堿基和呋喃戊糖等價基團通過磷酸二酯鍵或其它骨架形成基團連接、并以特定序列形成的多個相連的核苷酸單元。
本文所用的術語“寡核苷酸類似物”或“修飾寡核苷酸”是指功能與天然寡核苷酸相似但具有非天然部分的組合物。寡核苷酸類似物或修飾寡核苷酸可以具有改變的糖部分、改變的堿基、同時具有改變的糖和堿基或者改變的糖間連接，這些已知用于本領域中。
本文所用的術語“生物傳感器”是指包含檢測或測量在氧化或還原反應中所產生電子遷移而產生的信號的必要組件的設備或系統。術語“生物傳感器”包括用于測定物質濃度和生物學感興趣的其它參數的設備，即使并不直接利用生物學系統。
實施例以下實施例是為了舉例說明而不是為了限制本發明的范圍。
實施例1該實施例舉例說明電催化嵌入劑的合成(用Ru(bpy)2Cl2接枝的N，N’-雙[1(3-丙基)-咪唑]-1，4，5，8-萘二酰亞胺(PIND)(“PIND-Ru”))。
PIND-Ru的合成如下所述
按1，4，5，8-萘四羧酸二酐(ND)合成的一般步驟制備PIND。將0.30g1，4，5，8-萘四羧酸二酐緩慢加入到3.0ml 3-氨丙基咪唑(AI)和3.0ml四氫呋喃的磁力攪拌的混合物中。控制添加速率使得很少結渣。回流反應混合物24h，然后冷卻至室溫。接下來，將該反應分散在10ml丙酮/水(3/1)混合物中，然后倒入500ml快速攪拌的無水醚中沉淀所述化合物。通過精細燒結漏斗抽濾來收集沉淀，并用乙醇簡單洗滌。從氯仿/乙醇(1/1體積)中結晶進行純化并在真空和40℃過夜干燥得到0.46g黃色結晶(收率85％)。
通過一步配基交換反應合成PIND-Ru。向Ru(bpy)2Cl2(0.52mmol)在8.0ml新鮮蒸餾的乙二醇溶液中在10分鐘時間以小份添加PIND(0.25mmol)，回流所得混合物30到40分鐘。通過循環伏安法監測配基交換反應的完成。然后將紫色反應混合物緩慢倒入100ml快速攪拌的KCl飽和的乙醇中。通過精細燒結漏斗抽濾來收集沉淀，并用乙醇簡單洗滌。粗產物用PBS洗滌，溶解在3.0-5.0ml乙醇中并再次從KCl飽和的乙醇中沉淀。通過乙醇重結晶進一步純化沉淀得到78％收率的純產物。該產物在PBS中在E1/2為0.63V的金電極上顯示單對可逆氧化還原波。為了保證在PIND的兩個咪唑末端的徹底的雙配基交換，需要稍過量的Ru(bpy)2(10-15％)。
用Finnigan/MAT LCQ質譜儀(ThermoFinnigan，San Jose，CA)進行質譜試驗。除非另外指出，所有譜圖在室溫下記錄。
質子核磁共振(1H NMR)譜(300MHz CDCl3)δ8.76(4H)，7.54(2H)，7.26(2H)，4.27(4H)，4.12(4H)，2.31(4H)和1.83 9(2H)(圖1)。
使用電噴霧離子化質譜(ESI-MS)對PIND進行的質譜試驗顯示在m/z 483.3和242.3的主峰，對應于PIND+H+，(和(PIND+2H+)/2(圖2)，其與期望化合物的分子量具有良好一致性。由于在ESI-MS譜中沒有觀察到單接枝的PIND，因此我們可以排除任何不完全接枝的PIND。
實施例2該實施例舉例說明電活性PIND-Ru嵌入劑的形成和使用循環伏安法的其電化學性質。
在乙二醇中回流期間，每5分鐘進行循環伏安試驗。圖3顯示在開始30分鐘得到的兩個典型的伏安圖。由圖3中跡線1可見，向Ru(bpy)2Cl2中添加PIND之前，獲得中心在0.40V的一對可逆伏安峰，對應公知的Ru(bpy)2Cl2的氧化還原過程。添加PIND時，一對新的伏安峰出現在0.63V，顯示PIND-Ru的形成(圖3，跡線2)。兩個電子轉移過程都被清楚地分辨并且具有可逆過程的所有特征，除了稍大的峰-峰電勢分離，這主要是由于反應介質的較高iR降。0.63V的伏安峰強度隨反應時間逐漸增加。同時，0.40V的峰逐漸變小。回流30到40分鐘后，兩個氧化還原對都達到穩態。0.40V的小伏安峰指示過量的Ru(bpy)2Cl2。分離并純化后，如此純化的PIND-Ru的伏安試驗僅顯示一對伏安峰，意味著純化過程是非常有效的(圖3，跡線3)。
如圖3中跡線3舉例說明，PIND-Ru如預期準確地表現溶液中高度可逆的氧化還原對。在0.0和+0.90V之間多次重復電勢循環后觀察到的變化很小，顯示PIND-Ru在溶液中的良好穩定性。低掃描速率下，＜500mV/s，記錄了典型的擴散控制的伏安圖，正如預期表現理想能斯特行為的單電子交換系統峰電流與電勢掃描速率的平方根成比例，峰-峰電勢分離非常接近于59mV的理論值并且不依賴于電勢掃描速率(圖4)。這些結果明確了所有釕氧化還原中心都允許到達電極表面并且進行可逆的非均勻電子轉移。
實施例3該實施例舉例說明通過PIND-Ru的UV-可見分光光度法測定的PIND-Ru和ds-DNA的相互作用。
研究了在增加量的鮭精DNA存在下，通過PIND-Ru的UV-可見分光光度法測定PIND-Ru和ds-DNA的相互作用模式(圖5A)。在Agilent 8453UV-可見分光光度計上記錄UV-可見光譜。在UV-可見光譜中，當穿線型嵌入劑的稠環平面芳香體系自身插入到ds-DNA的堿基對之間時，嵌入結合的信號有減色效應并紅移。如圖5A所示，以DNA堿基對/PIND-Ru比4.0向ds-DNA添加PIND-Ru導致366和387nm處ND吸收帶降低40％并紅移2-nm。之前觀察到具有脂肪族叔胺側鏈的萘二酰亞胺(ND)具有類似現象。在DNA堿基對/PIND-Ru比大于4.0時，ND吸收帶減色效應達到穩態，并且觀察到恒定的減色效應，顯示通過優先嵌入ND發生PIND-Ru和ds-DNA的結合。
使用與Boger建議相似的短發夾寡核苷酸，通過競爭試驗估計嵌入的穩定性。PIND-Ru的熒光變化對比等價物的分析提供了滴定曲線，從中確定化學計量為1∶1(圖5B)。發現通過競爭試驗測定的穩定性常數是3.0×107，對應于與ND相比增強約75-倍。穩定性常數增強的似乎合理的解釋將是ND基團嵌入ds-DNA后，PIND-Ru中兩個陽離子Ru(bpy)2Cl基團與ds-DNA每側的磷酸形成離子對，使得ND更緊緊地固定在ds-DNA的堿基對之間。
實施例4
該實施例舉例說明PIND-Ru在DNA生物傳感器中應用。
之前Xie et al.，Anal.Chem.761611-1617(2004)、Xie et.al.Nucelic Acids Res.32，el5(2004)、Xie et al.Anal Chem.764023-4029(2004)和Gao et al.Synth.Met.755-10(1995)中描述了金電極的制備和預處理，所有內容通過引用并入本文。簡而言之，捕獲探針(CP)吸附之前，將金電極在氧等離子體中暴露5到10分鐘，然后立即在無水乙醇中浸20分鐘以還原氧化物層。通過將金電極在100μg/ml CP的PBS溶液中浸16到24小時吸附CP單層。吸附之后，用PBS充分漂洗電極并在PBS中浸泡20分鐘，再次漂洗，并用空氣流吹干。根據steel建議的程序，使用陽離子氧化還原探針進行電化學評價，發現CP的表面密度在1.13-1.30×10-11mol/cm2之間。為了使非-DNA相關的PIND-Ru吸收最小化并提高CP單層的質量和穩定性，將CP-包被的金電極在2.0mg/ml 1-巰基十二烷(MD)的乙醇溶液中浸沒4到6小時。漂洗掉未反應的MD分子，將電極在攪拌的乙醇中浸沒10分鐘來洗滌該電極，隨后用乙醇和水徹底漂洗。所述電極經空氣干燥后備用。
分三步進行靶DNA的雜交及其電化學檢測。首先，將2.5μl份的含有靶DNA的雜交溶液均勻鋪展在電極上，并且將該電極在水飽和環境的室中在60℃(低于鹽調節熔鏈溫度27℃的低嚴謹度)維持30分鐘。然后在60℃用空白雜交溶液徹底漂洗，并與5.0μl份在雜交溶液中的100μg/ml PIND-Ru在35℃下一起孵育10分鐘。PIND-Ru通過穿線型嵌入附著到雜交的靶DNA上。所述電極經空氣冷卻并在室溫下放置10分鐘之后，用含10％乙醇的NaCl-飽和磷酸緩沖液(pH7.4)徹底漂洗。伏安法測量電催化氧化電流。低DNA濃度下，每次檢測后進行平滑處理以消除隨機噪音和電磁干擾。
使用配備低電流模塊的CH Instruments model 660A電化學工作站(CH Instruments，Austin，TX)進行電化學試驗。該三電極系統由3.0mm-直徑的金工作電極、無滲漏-微型Ag/AgCl參比電極(CypressSystems，Lawrence，KS)和鉑絲計數電極組成。為了避免樣品小滴鋪展到3.0-mm直徑的工作區以外，將CP固定后在金電極施加圖案化的疏水膜。參照Ag/AgCl電極，記錄該工作中所有電勢。
在第一個雜交試驗中，分別將5.0μL份在TE中的200nM聚(AT)20、聚(AG)20和聚(G)40與其對應的互補CP-包被電極雜交。為了對比，用5.0μL份的200nM聚(T)40處理相同組的電極。經雜交，寡核苷酸選擇性結合到其互補CP上并固定在電極表面。用雜交緩沖液徹底漂洗，將所有的非雜交相關的寡核苷酸洗掉。在隨后與5.0μl份的在雜交溶液中的100μg/ml PIND-Ru一起孵育期間PIND-Ru被帶到電極表面。發現用含10％乙醇的NaCl-飽和磷酸緩沖液(pH7.4)進行徹底沖洗除去大多數非-DNA相關的PIND-Ru吸收。
圖6A顯示雜交后電極的循環伏安圖。對于非互補的聚(T)40，雜交后在PIND-Ru氧化還原電勢(0.63V)觀察到一對小伏安峰(圖6A跡線1)，這主要是由于PIND-Ru與電極表面CP的純靜電相互作用。對于互補性聚(AT)20、聚(AG)20和聚(G)40，觀察到氧化還原電勢的輕微正向遷移并且峰電流大大增加100倍(圖6A跡線2、3和4)。與200nM聚(AT)20雜交后觀察到的電流0.30μA，因此來自1.3pmol活性和嵌入的PIND-Ru。該數值代表包含在測試小滴內的＜0.50％的PIND-Ru。將1.2×10-11mol/cm2(估計值的中范圍)作為表面CP覆蓋率并且假設最大PIND-Ru/堿基比率為1/4，則1.3pmol靶DNA被雜交。因此，13％靶DNA和15％的表面結合CP被實際上雜交，這與文獻中發現的那些相當。有趣地是，當聚(AG)20和聚(G)40與其對應的互補CP包被的電極雜交時，觀察到陽極電流顯著增加而陰極電流稍微降低(圖6A跡線3和4)。并且隨鳥嘌呤含量增加，增加幾乎接近線性，顯示寡核苷酸中的鳥嘌呤被嵌入的PIND-Ru在0.63V催化氧化。這些結果證明PIND-Ru與ds-DNA選擇性相互作用并且PIND-Ru-ds-DNA加合物具有非常慢的解離速率以及高效電催化鳥嘌呤氧化，這為開發超敏DNA生物傳感器鋪平了道路。
接下來，以mRNA中的全長腫瘤蛋白p53(TP53)基因作為我們的靶基因，評價了PIND-Ru作為電活性指示劑用于直接檢測mRNA中癌癥易感基因。雜交之前，在70℃將mRNA混合物變性10分鐘。具有與TP53互補序列的寡核苷酸被固定在電極表面并作為CP。經過53℃雜交30分鐘，混合物中TP53mRNA選擇性結合到電極表面。用雜交緩沖液進行徹底漂洗，洗掉所有非-雜交相關的mRNA。
由圖6B可見，施加PIND-Ru后電極的典型循環伏安圖，在陽極法中觀察到相當高的峰電流，顯示較多量的電子參與氧化過程，最可能由于捕獲的長TP53mRNA分子向電極表面提供了非常大量的鳥氨酸。在接下來的電勢循環期間峰電流顯著下降，并且在0到0.90V之間5個循環后得到穩態伏安圖(圖5B跡線2)。對慢掃描速率≤10mV/s下氧化或還原電流峰進行積分，對于電活性Ru2+/Ru3+位點得到3.8pmol的表面覆蓋。PIND-Ru總量，1.9×10-11摩爾/cm2，相當于32％的CP被雜交并完全嵌入。為了更好地理解雜交效率和PIND-Ru負載水平，對雜交后以及PIND-Ru嵌入后的TP53進行一系列石英晶體微量天平(QCM)測量。表1總結了該結果
表1.與1.0μg mRNA中TP53雜交后、以及PIND-Ru嵌入后，CP包被的石英晶體振蕩器的QCM數據。
如表1所示，約40飛摩爾TP53被雜交。該數值代表約1.6％的表面結合的CP被實際雜交，這比文獻中報道的那些短寡核苷酸(20-50聚體)低得多。雜交效率隨分析基因長度的增加顯著降低，這并不令人驚奇。此外，QCM試驗顯示TP53的每11到14個堿基嵌入一個PIND-Ru，提示一些PIND-Ru分子嵌入到TP53的二級結構中，這進一步提高該方法的靈敏度。發現PIND-Ru負載密度在1.5-2.2×10-11摩爾/em2范圍內，這與在伏安試驗中得到的具有良好一致性。
使用從TP53的mRNA轉錄的純化的cDNA，并在使用前用TE緩沖液稀釋成不同濃度，確立TP53基因定量的動態范圍。對于對照試驗，在電極準備時使用非互補性CP。發現隨cDNA濃度從2.5到350pM，電流呈線性增加，檢測限是1.5pM，對應0.60ng/ml。考慮到樣品體積，使用建議的方法能成功地檢測到甚至少到7.5阿托摩爾的TP53cDNA。對比先前的直接核酸氧化分析的結果，通過使用本發明的催化性穿線型嵌入劑方案，基因組核酸分析的靈敏度大大提高。非標記電化學方法用于直接檢測核酸的吸引力在于來自真實世界樣品的基因表現出高靈敏度，所述真實世界樣品包含許多氧化還原活性單元(鳥嘌呤和嵌入的PIND-Ru)。本文描述的PIND-Ru催化體系的優點是鳥嘌呤和PIND-Ru都在低至0.63V的電勢被氧化，此時存在的背景電流很小。而且，具有越多鳥嘌呤的基因給出越敏感的信號。兩者的組合實現了皮摩爾檢測限并且動態范圍達到350pM。由于不脫離本教導的范圍對上述方法和組合物可以進行多種改變，其意思是以上描述中包含的所有材料應解釋為舉例說明而非限制性含義。除非明確聲明敘述已經進行的活動(即使用過去時態)，舉例說明和實施例不應理解為代表本教導給定的實施方案已經或未曾實施。
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權利要求
1.下式的化合物L1-D-L2其中D是二價環狀基團；和L1和L2各自獨立地是連接基團，所述連接基團包含具有約3到約20個非氫原子的有機胺、脂肪族氨基和含氮部分。
2.權利要求1的化合物，其中所述二價環狀基團包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
3.權利要求2的化合物，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
4.權利要求1的化合物，其中所述含氮部分提供金屬-氮配位鍵。
5.權利要求1的化合物，其中所述有機胺是3-氨丙基咪唑。
6.包含下式的化合物
7.包含下式的核心化合物的電催化嵌入劑L1-D-L2其中D是二價環狀基團；和L1和L2各自獨立地是連接基團，所述連接基團包含具有約3到約20個非氫原子的有機胺、脂肪族氨基和含氮部分，所述核心化合物鍵合到下式的過渡金屬化合物上 其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R’是在其氮原子處與M配位的含氮有機部分，其中R和R’獨立地選自2，2’-聯吡啶基；用一個或多個取代基取代的2，2’-聯吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；Z是鹵原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的陰離子或陰離子組合。
8.權利要求7的電催化嵌入劑，其中所述核心化合物通過金屬-氮配位鍵鍵合到所述過渡金屬化合物上。
9.權利要求8的電催化嵌入劑，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
10.權利要求8的電催化嵌入劑，其中M是釕。
11.權利要求7的電催化嵌入劑，其中所述有機胺包含3-氨丙基咪唑。
12.權利要求8的電催化嵌入劑，其中Z是氯或溴。
13.權利要求8的電催化嵌入劑，其中所述二價環狀基團包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
14.權利要求13的電催化嵌入劑，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
15.權利要求8的電催化嵌入劑，其中R和R’獨立地選自2，2’-聯吡啶基、4，4’-甲基-2，2’-聯吡啶基、4，4’-乙基-2，2’-聯吡啶基、4，4’-苯基-2，2’-聯吡啶基、5，5’-甲基-2，2’-聯吡啶基、5，5’-乙基-2，2’-聯吡啶基和5，5’-苯基-2，2’-聯吡啶基。
16.權利要求15的電催化嵌入劑，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
17.權利要求16的電催化嵌入劑，其中M是釕。
18.權利要求15的電催化嵌入劑，其中所述有機胺包含3-氨丙基咪唑。
19.權利要求15的電催化嵌入劑，其中Z是氯或溴。
20.權利要求15的電催化嵌入劑，其中所述二價環狀基團包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
21.權利要求20的電催化嵌入劑，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
22.權利要求7的電催化嵌入劑，其中I是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，所述有機胺是3-氨丙基咪唑，R和R’中至少一個是2，2’-聯吡啶基，M是釕，和Z是氯。
23.包含下式的電催化嵌入劑
24.一種制備電催化嵌入劑的方法，所述方法包括使下式的核心化合物L1-D-L2其中D是二價環狀基團；和L1和L2各自獨立地是連接基團，所述連接基團包含具有約3到約20個非氫原子的有機胺、脂肪族氨基和含氮部分，與下式的過渡金屬化合物相接觸 其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機部分，其中R和R’獨立地選自2，2’-聯吡啶基；用一個或多個取代基取代的2，2’-聯吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；Z是鹵原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的陰離子或陰離子組合，以在所述核心化合物和過渡金屬化合物之間形成金屬-氮配位鍵。
25.權利要求24的方法，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
26.權利要求25的方法，其中M是釕。
27.權利要求24的方法，其中所述有機胺包含3-氨丙基咪唑。
28.權利要求24的方法，其中Z是氯或溴。
29.權利要求24的方法，其中所述二價環狀基團包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
30.權利要求29的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
31.權利要求24的方法，其中R和R’獨立地選自2，2’-聯吡啶基、4，4’-甲基-2，2’-聯吡啶基、4，4’-乙基-2，2’-聯吡啶基、4，4’-苯基-2，2’-聯吡啶基、5，5’-甲基-2，2’-聯吡啶基、5，5’-乙基-2，2’-聯吡啶基和5，5’-苯基-2，2’-聯吡啶基。
32.權利要求31的方法，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
33.權利要求32的方法，其中M是釕。
34.權利要求31的方法，其中所述有機胺包含3-氨丙基咪唑。
35.權利要求31的方法，其中Z是氯或溴。
36.權利要求31的方法，其中所述二價環狀基團包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
37.權利要求36的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
38.權利要求24的方法，其中I是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，所述有機胺是3-氨丙基咪唑，R和R’中至少一個是2，2’-聯吡啶基，M是釕，和Z是氯。
39.一種檢測核酸的方法，所述方法包括在水性介質中使包含下式核心化合物的電催化嵌入劑L1-D-L2其中D是二價環狀基團；和L1和L2各自獨立地是連接基團，所述連接基團包含具有約3到約20個非氫原子的有機胺、脂肪族氨基和含氮部分，所述核心化合物鍵合至下式的過渡金屬化合物 其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機部分，其中R和R’獨立地選自2，2’-聯吡啶基；用一個或多個取代基取代的2，2’-聯吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；Z是鹵原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的陰離子或陰離子組合，與包含所述核酸的復合物相結合以將所述電催化嵌入劑嵌入所述復合物中；和檢測電流，其中所述電催化嵌入劑氧化核苷酸。
40.權利要求39的方法，其中所述核苷酸是鳥嘌呤。
41.權利要求39的方法，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
42.權利要求41的方法，其中M是釕。
43.權利要求39的方法，其中所述有機胺包含3-氨丙基咪唑。
44.權利要求39的方法，其中Z是氯或溴。
45.權利要求39的方法，其中所述二價環狀基團包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
46.權利要求45的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
47.權利要求39的方法，其中所述方法還包括將探針固定在所述電極上；和提供溶液中所述核酸與電極相接觸，其中所述探針和核酸互相雜交。
48.權利要求39的方法，其中所述方法還包括將識別對的第一成員固定在所述電極上；用所述識別對的第二成員標記探針；組合溶液中所述標記探針與所述電極相接觸，其中所述探針和核酸雜交形成結合到電極表面的復合物。
49.權利要求39的方法，其中所述電催化嵌入劑是包含下式的化合物
全文摘要
本發明公開了電化學檢測核酸的組合物和方法。所述組合物包含與雙鏈核酸結合并氧化核酸的電催化嵌入劑。檢測樣品中核酸的方法包括形成被電催化嵌入劑結合的雙鏈核酸，其中嵌入劑在電極表面催化核酸的氧化。
文檔編號C07F15/00GK101068813SQ200580033568
公開日2007年11月7日 申請日期2005年7月19日 優先權日2004年9月2日
發明者謝虹, 高志強, 謝芳 申請人:新加坡科技研究局