用于改善重組蛋白質產生的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于改善重組蛋白質產生的方法和組合物的制作方法
相關申請的交叉參考本申請要求2004年10月5日提交的美國專利申請序號60/616,474的優先權，將其內容完整引入本文作為參考。
背景技術：
至少從20世紀80年代以來就存在用于產生重組蛋白質的表達載體。通常，用于重組蛋白質表達的基于載體的策略已經大量用于基礎研究和小規模實驗，其中蛋白質制備物的絕對純度不是關鍵的。相比，當重組蛋白質用于治療應用時，甚至少量的污染物，例如，存在錯誤剪接或者內含子連讀副產物可以降低所得治療性蛋白質的活性和產率。對患者施用具有錯誤剪接或者連讀蛋白質序列的治療性蛋白質可以增加不希望的副作用的概率。
這種副產物在生產中也是麻煩的。副產物的存在可以損害純化過程，因為此類副產物通常在大小、親和性或者生物活性方面類似于目的蛋白質。此外，已經觀察到使用重組宿主細胞進行的放大蛋白質表達通常導致與目的產物相比，副產物的量增加，尤其在亞最佳的細胞培養條件下培養細胞的時候。此類亞最佳細胞培養條件通常在大規模蛋白質生產中發生，例如，在生物發酵罐運行結束時，或者當由于其他原因，當大規模培養物的健康惡化時。
因此，需要改善重組蛋白質生產，尤其改善治療性蛋白質的大規模生產的方法。
發明概述本發明提供了用于改善重組蛋白質或者肽表達和/或生產的方法和組合物。在一個實施方案中，提供了核酸分子，其經修飾以減小或者消除錯誤剪接和/或內含子連讀副產物，和/或增強重組蛋白質表達。在一些實施方案中，核酸編碼重組抗體(在本文中也稱作免疫球蛋白)，或者其片段。本發明還包括經修飾以減小或者消除錯誤剪接和/或內含子連讀副產物和/或增強重組蛋白質表達的載體(例如，表達載體)；包括此類核酸分子和載體的宿主細胞，例如，哺乳動物宿主細胞；和培養此類細胞以例如大規模產生重組蛋白質或者肽的方法。還公開了基本上無錯誤剪接和/或內含子連讀產物的重組蛋白質或者肽(例如，抗體)的組合物，例如，藥物組合物。這些組合物適于治療用途，包括，例如，治療神經變性和惡性病癥。
因此，一方面，本發明描述了包括具有一個或多個內含子和外顯子序列的核苷酸序列的核酸分子(例如，經修飾或者重組的核酸分子)，其中與天然發生的序列相比，至少一種內含子序列已經經修飾以增強蛋白質表達和/或減小或者消除錯誤剪接或內含子連讀(IRT)副產物。在一個實施方案中，核酸分子指導目的蛋白質或者肽，例如抗體或者其片段(例如，免疫球蛋白重鏈)相對于天然發生的序列(例如，基因組序列)的增強的表達和/或減小或消除內含子連讀(IRT)副產物。蛋白質或者肽可以是哺乳動物來源，例如，人或者鼠來源，通常人來源。本文描述的核酸分子被理解為指天然發生的序列的修飾形式。在一些實施方案中，核酸分子是分離或者純化的。在其他實施方案中，它是重組分子。
在一個實施方案中，核酸分子與天然發生的序列(例如，基因組序列)相比，缺失至少一個、兩個、三個內含子，或者高達除一個以外的全部內含子。例如，可以從天然發生的序列缺失促進內含子連讀(IRT)的內含子。在其他實施方案中，核酸分子通過如下一種或多種方法修飾內含子/外顯子構型的重排(例如，內含子/外顯子5’到3’順序)；缺失一個或多個內含子的一部分；或者將內含子或者其部分用異源內含子序列置換，從而發生增強的蛋白質表達和/或錯誤剪接和/或內含子連讀(IRT)副產物的減少或者消除。
在相關實施方案中，核酸分子包括編碼抗體重鏈或者其片段的核苷酸序列(例如，人基因組序列)。例如，核苷酸序列可以包括編碼重鏈可變區、鉸鏈區和免疫球蛋白亞型，例如，免疫球蛋白G亞型(例如，IgG1、IgG2、IgG3，或IgG4抗體亞型)的第一、第二和第三個恒定區的一個或多個核苷酸(例如，外顯子)序列。通常，免疫球蛋白亞型來自哺乳動物來源，例如，鼠或者人來源。在一個實施方案中，選擇人IgG1或者IgG4，或者其突變形式。例如，可以突變免疫球蛋白的恒定區以導致一種或多種下面的增強的穩定性、減小的效應子功能，或者減小的補體結合。在一個實施方案中，突變人IgG4以增加穩定性，例如，在殘基241處從絲氨酸替換成脯氨酸以增加鉸鏈區的穩定性。在其他實施方案中，突變恒定區以減小糖基化。
在一個實施方案中，修飾核酸分子以缺失促進序列的內含子連讀的至少一個內含子。例如，可以缺失免疫球蛋白重鏈恒定區的CH2和CH3之間的內含子。可以單獨或者組合缺失的其他重鏈免疫球蛋白內含子的實例包括重鏈可變區和CH1之間的內含子、CH1和鉸鏈區之間的內含子，和免疫球蛋白重鏈恒定區的鉸鏈區和CH2之間的內含子。可以缺失前面的內含子的任何組合，包括前述內含子的兩個、三個內含子，或者高達除一個以外的全部內含子的組合。在一些實施方案中，缺失重鏈恒定區的三個內含子，例如，CH1和鉸鏈區之間的內含子、鉸鏈區和CH2之間的內含子，和CH2和CH3之間的內含子。下面重鏈免疫球蛋白的內含子缺失的示例性組合也在本發明的范圍內CH1和鉸鏈區之間的內含子，和CH2和CH3之間的內含子；CH1和鉸鏈區之間的內含子，和鉸鏈區和CH2之間的內含子；和鉸鏈區和CH2之間的內含子和免疫球蛋白重鏈恒定區的CH2和CH3之間的內含子。
在一些實施方案中，核酸分子包括下式代表的核苷酸序列VH-Int1-CH1-Int2-鉸鏈-Int3-CH2-Int4-CH3，其中VH是編碼重鏈可變區的核苷酸序列；CH1、CH2和CH3是編碼對應的重鏈恒定區，例如，人IgG1或者IgG4重鏈基因的天然發生的或者突變形式的核苷酸序列；鉸鏈是編碼重鏈恒定區(例如，人IgG1或者IgG4重鏈基因的天然發生的或者突變形式)的鉸鏈區的核苷酸序列；和Int1、Int2、Int3和Int4是來自重鏈基因組序列的內含子。在一個實施方案中，缺失CH2和CH3之間的內含子，其在本文以Int4表示。在其他實施方案中，缺失CH1和鉸鏈區之間、鉸鏈區和CH2、和/或CH2和CH3之間的內含子的一個、兩個或者通常三個，它們在本文表示為Int2、Int3和Int4。

圖1、5和7中顯示了重鏈基因組序列的內含子/外顯子排列的額外的圖示。
通常，在核酸分子中存在至少一個內含子，例如，重鏈可變區和CH1之間的內含子，其在本文以Int1表示。可以單獨或者組合存在的其他重鏈免疫球蛋白內含子的實例包括CH1和鉸鏈區之間的內含子；鉸鏈區和CH2之間的內含子；免疫球蛋白恒定區的CH2和CH3之間的內含子。通常希望在修飾的核酸分子中包括至少一個內含子。不被理論束縛，認為內含子影響蛋白質產生過程中的許多事件，包括轉錄速率、多聚腺苷酸化作用、mRNA輸出、翻譯效率，和mRNA衰變。
在一個實施方案中，核酸分子包括下式代表的核苷酸序列VH-Int1-CH1-Int2-鉸鏈-Int3-CH2-CH3，其中VH是編碼重鏈可變區的核苷酸序列；CH1、CH2和CH3是編碼對應的重鏈恒定區，例如，人IgG1或者IgG4重鏈基因的天然發生的或者突變形式的核苷酸序列；鉸鏈是編碼重鏈恒定區，例如，人IgG1或者IgG4重鏈基因的天然發生的或者突變形式的鉸鏈區的核苷酸序列；和Int1、Int2和Int3是來自重鏈基因組序列的內含子。在一個實施方案中，核苷酸序列基本上由上述組分組成，例如，沒有改變結構或者功能的間插序列。
在其他實施方案中，核酸分子包括下式代表的核苷酸序列VH-Int1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，
其中VH是編碼重鏈可變區的核苷酸序列；CH1、CH2和CH3是編碼對應的重鏈恒定區，例如，人IgG1或者IgG4重鏈基因的天然發生或者突變形式的核苷酸序列；鉸鏈是編碼重鏈恒定區，例如，人IgG1或者IgG4重鏈基因的天然發生或者突變形式的鉸鏈區的核苷酸序列；和Int1是來自重鏈基因組序列的內含子。在一個實施方案中，核苷酸序列基本上由上述組分組成，例如，沒有改變結構或者功能的間插序列。
在圖8中顯示了人IgG1的基因組核苷酸或者對應的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。編碼CH1、鉸鏈區、CH2和CH3的外顯子分別位于圖8(SEQ ID NO1)的約核苷酸231到524、916到960、1079到1408，和1506到1829。Int1、Int2、Int3和Int4對應于圖8(SEQ ID NO1)的來自人IgG1重鏈基因組序列的分別約核苷酸1到230、約核苷酸525到915、約核苷酸961到1078，和約核苷酸1409和1505的位置。
突變的IgG4的基因組核苷酸和對應的氨基酸序列在圖9中顯示(分別SEQ ID NO3和4)。編碼CH1、鉸鏈區、CH2和CH3的外顯子分別位于圖9(SEQ ID NO3)的約核苷酸231到524、916到952、1071到1400，和1498到1820。Int1、Int2、Int3和Int4對應于人IgG4重鏈基因組序列的內含子，分別位于圖9(SEQ ID NO3)的約核苷酸1到230、約核苷酸525到916、約核苷酸953到1070、和約核苷酸1401到1497。
本發明的經修飾的核酸分子的實例包括人基因組重鏈恒定區序列，其具有人IgG1的CH2和CH3之間的內含子的缺失，對應于圖8(SEQ IDNO1)的約核苷酸1409到1505，或者具有突變的人IgG4的CH2和CH3之間的內含子的缺失，對應于圖9(SEQ ID NO3)的約核苷酸1401到1497。可以單獨或者組合缺失的其他重鏈免疫球蛋白內含子的實例包括人IgG1的重鏈可變區和CH1之間的內含子，對應于圖8(SEQ ID NO1)的約核苷酸1到230，或者突變的人IgG4的重鏈可變區和CH1之間的內含子，對應于圖9(SEQ ID NO3)的約核苷酸1到230；人IgG1的CH1和鉸鏈區之間的內含子，對應于圖8(SEQ ID NO1)的約核苷酸525到915，或者突變的人IgG4的CH1和鉸鏈區之間的內含子，對應于圖9(SEQ ID NO3)的約核苷酸525到916；和人IgG1的鉸鏈區和CH2之間的內含子，對應于圖8(SEQ ID NO1)的約核苷酸961到1078，或者突變的人IgG4的鉸鏈區和CH2之間的內含子，對應于圖9(SEQ ID NO3)的約核苷酸953到1070。可以缺失前面內含子的任一組合，包括2、3、4個內含子的組合，或者可以缺失前述內含子的高達除一個以外的全部內含子。在一些實施方案中，缺失重鏈恒定區的三個內含子，例如，CH1和鉸鏈區之間的內含子、鉸鏈區和CH2之間的內含子，和CH2和CH3之間的內含子。在一些實施方案中，對于本文公開的人IgG1或者IgG4，或者基本上與其同一的序列，核酸分子包括外顯子核苷酸序列的一個或多個，和內含子核苷酸序列的一個或多個(但不是全部)。在相關實施方案中，對于本文公開的人IgG1或者IgG4，或者基本上與其同一的序列，核酸分子缺失一個或多個(但不是全部)內含子核苷酸序列。
在一個實施方案中，經修飾的核酸分子包括編碼如圖10(SEQ IDNO5)所示的人IgG1的核苷酸序列或者與其基本上同一的序列(例如，與SEQ ID NO5具有至少85％、90％、95％或者99％同一性的序列，或者與SEQ ID NO5的核苷酸序列相比具有1、5、10、50或者更多核苷酸改變的序列)。
在另一實施方案中，修飾的核酸分子包括如圖11(SEQ ID NO6)所示的經修飾的人IgG4的核苷酸序列，或者與其基本上同一的序列(例如，與SEQ ID NO6具有至少85％、90％、95％或者99％同一性的序列，或者與SEQ ID NO6的核苷酸序列相比具有1、5、10、50或者更多核苷酸改變)。
經修飾的核酸分子可以包括編碼輕鏈和重鏈抗體或者免疫球蛋白序列的核苷酸序列。此類序列可以存在于相同的核酸分子(例如，同一表達載體)或者備選地，可以從分離的核酸分子(例如，分離的表達載體)表達。通常，所編碼的抗體或者免疫球蛋白或者其片段可以包括至少一條，優選兩條全長重鏈，和至少一條，優選兩條輕鏈。備選地，所編碼的免疫球蛋白或者其片段可以包括僅一條抗原結合片段(例如，Fab、F(ab′)2、Fv或者單鏈Fv片段)。抗體或者其片段可以是單克隆或單特異性抗體。抗體或其片段還可以是人的、人源化的、嵌合的、CDR移植的、或者體外產生的抗體。在再一個實施方案中，抗體具有選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD；更具體地選自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重鏈恒定區。在另一實施方案中，抗體具有選自例如κ或λ的輕鏈。
在另一實施方案中，核酸分子包括可變區，例如，人源化、嵌合、CDR移植的、或者體外產生的可變區。通常，可變區特異結合預定抗原，例如，與病癥，例如，神經變性或者惡性病癥有關的抗原。
在一個實施方案中，病癥是神經變性病癥并且抗體結合淀粉狀蛋白，例如，Aβ肽(例如，人Aβ肽)。例如，抗體可以是針對Aβ肽的人源化抗體，其具有含有來自鼠抗體(例如，鼠抗Aβ3D6抗體)的一個或多個互補決定區(CDR)的重鏈和輕鏈可變區。人源化抗體的可變區通常包括人或者實質上的人構架區。在一個實施方案中，核酸分子包括人源化抗Aβ肽抗體的重鏈和輕鏈可變區。
在另一實施方案中，所述病癥是惡性或者癌性病癥，并且抗體結合與惡性細胞(例如，實體瘤細胞)結合的細胞表面蛋白質，例如，5T4蛋白質。5T4蛋白質是在癌，特別是結腸和胃轉移性癌癥中廣泛表達的72 kDa糖蛋白。在一些實施方案中，抗體是針對5T4蛋白質的人源化抗體，其具有含有來自鼠抗體的一個或多個互補決定區(CDR)的重鏈和輕鏈可變區。在一個實施方案中，核酸分子包括人源化抗5T4抗體的重鏈和輕鏈可變區。
在另一方面，本發明描述了包括一個或多個前面修飾的核酸分子的載體(例如，表達載體)。載體可以額外包括增強宿主細胞中復制、選擇、mRNA轉錄、mRNA穩定性、蛋白質表達或者蛋白質分泌的一種或多種核苷酸序列。例如，載體可以包括負責復制或者增強子表達的核苷酸序列、增強子啟動子元件、編碼前導序列的核苷酸序列，編碼選擇標記(例如，DHFR)的基因、內部核糖體進入位點序列(IRES)，和聚腺苷酸化序列)。
在另一方面，本發明提供了細胞，例如，真核宿主細胞，例如，哺乳動物宿主細胞(例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)，其包括一種前面的核酸分子和/或載體，例如，表達載體。載體可以用本發明的核酸序列瞬時或者穩定轉染。
另一方面，本發明提供了與參考，例如天然發生的基因組序列相比，增強重組蛋白質或者肽(例如抗體)的表達，或者表達具有降低水平(或者基本上無)的錯誤剪接和/或內含子連讀產生的重組蛋白質或者肽(例如抗體)的方法。方法包括將如本文描述的核酸分子導入宿主細胞，例如，哺乳動物宿主細胞(例如，CHO細胞)；在允許重組蛋白或者肽表達的條件下培養所述宿主細胞以產生宿主細胞培養物；并任選地從宿主細胞的培養物(例如，宿主細胞上清液)得到，例如，純化重組蛋白或者肽。
該方法還包括鑒定(例如，檢測和/或測定水平)核酸樣品(例如，來自宿主細胞的mRNA樣品)中IRT或者IRT產物的步驟，其包括將所述樣品和與內含子和相鄰外顯子序列互補、或者備選地，與相鄰外顯子序列互補的核酸探針在允許核酸樣品與所述探針雜交的條件下接觸；例如，通過探針序列的PCR擴增檢測所得復合體。含有與內含子序列互補的核酸探針的樣品中復合體(例如，PCR擴增的產物)的檢測表明發生IRT或者IRT產物。可以如在實施例1中描述的定量IRT產物的水平。
在另一方面，提供了與標準參考，例如，天然發生的基因組序列相比，產生具有減少(例如，基本上無)的內含子連讀(IRT)重鏈副產物的抗體或者其片段的方法。該方法包括在一定條件下培養含有如本文描述的核酸分子和任選地，編碼抗體輕鏈的核酸的細胞，例如，哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)，從而重鏈和輕鏈表達并且任選地，有效結合。任選從細胞培養物純化抗體或其片段。通常，抗體或者其片段具有減小的錯誤剪接或者內含子連讀(IRT)重鏈副產物。
該方法還包括檢測和/或測定樣品(例如，來自宿主細胞的mRNA樣品)中IRT或者IRT產物的水平；將所述樣品和與內含子和相鄰外顯子序列互補的或者備選地，與相鄰外顯子序列互補的核酸探針，在允許核酸樣品和探針雜交的條件下接觸；例如，通過探針序列的PCR擴增檢測所得復合體。含有與內含子序列互補的核酸探針的樣品中復合體(例如，PCR擴增的產物)的檢測表明發生IRT或者IRT產物。可以如在實施例1中描述的定量IRT產物的水平。
另一方面，本發明提供了通過缺失來自所述序列的至少一種內含子，減少從基因組重鏈序列表達的內含子連讀(IRT)抗體重鏈副產物的方法，其中所述內含子促進IRT。
在另一方面，本發明描述了鑒定(例如，檢測和/或測定水平)樣品(例如，核酸樣品)中IRT或者IRT產物的方法。該方法包括從細胞，例如重組細胞(例如，如本文描述的宿主細胞)得到核酸樣品，例如，mRNA樣品；將所述核酸樣品和與內含子和相鄰外顯子序列互補、或者備選地，與相鄰外顯子序列互補的核酸探針在允許核酸樣品與所述探針雜交的條件下接觸；例如，通過探針序列的PCR擴增檢測所得復合體。含有與內含子序列互補的核酸探針的樣品中復合體(例如，PCR擴增的產物)的檢測表明發生IRT或者IRT產物。可以如在實施例1中描述的定量IRT產物的水平。
在另一方面，本發明描述了根據本文公開的方法產生的抗體(例如，重組抗體)或者其片段，其與參考，例如，天然發生的基因組序列相比，具有減少(例如，基本上無)的錯誤剪接和/或內含子連讀產物。在一個實施方案中，抗體或其片段是嵌合的、人源化的、CDR移植的、或者體外產生的抗體。通常，抗體或者其片段具有可變區，其特異結合預定抗原，例如，與病癥，例如，神經變性或者惡性病癥有關的抗原。
在另一方面，本發明提供了組合物(例如，藥物組合物)，其含有重組蛋白或者肽(例如，抗體)和藥學上可接受的載體，所述重組蛋白或者肽與參考，例如，天然發生的基因組序列相比，具有減少(例如，基本上無)的錯誤剪接和/或內含子連讀產物。這些組合物適于治療用途，包括例如，治療神經變性和惡性病癥。
本發明的其他特征和優點將從下面詳述的描述和權利要求顯而易見。
附圖簡述圖1描繪了從含有3D6 IgG基因(頂部)的表達載體轉錄的預期的前-mRNA以及正確剪接的mRNA(中間)和內含子連讀mRNA(底部)。
圖2顯示了跨越3D6重鏈表達載體的CH2和CH3恒定區之間的內含子(稱作第四個內含子)的核酸序列，其指出基因組5’和3’剪接點(SEQ IDNO7)。還顯示了從正確(SEQ ID NO8)和錯誤(SEQ ID NO9)剪接的mRNA得到的多肽的預測的部分氨基酸序列。RNA剪接點通過雙實線指出。
圖3是用于評估3D6重鏈基因轉錄總水平(含有mRNA轉錄物的CH2的水平)和內含子4連讀轉錄水平的定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)探針的圖示。
圖4是條形圖，其圖解了應答培養時間和蛋白質表達誘導，含有內含子4的轉錄物的增加的積累。
圖5提供了3D6內含子和外顯子的基因組排列和用于表達載體中的修飾的排列，開發所述表達載體用于解決內含子連讀轉錄。
圖6顯示了反相高效液相層析(RP-HPLC)層析圖，其圖解了在用修飾的表達載體轉化的細胞系中缺少內含子連讀重鏈副產物。
圖7描繪了重鏈基因組構建體最后三個內含子序列缺失的構建體和不合有內含子的cDNA構建體中內含子和外顯子的排列。
圖8顯示了人IgG1的基因組核苷酸和對應的氨基酸序列(分別在SEQID NO1和2中顯示)。編碼CH1、鉸鏈區、CH2和CH3的外顯子分別位于約核苷酸231到524、916到960、1079到1408和1506到1829(SEQ IDNO1)。Int1、Int2、Int3和Int4對應于來自人IgG1重鏈基因組序列的內含子，分別位于約核苷酸1到230、約核苷酸525到915、約核苷酸961到1078，和約核苷酸1409和1505(SEQ ID NO1)。
圖9顯示了人IgG4的基因組核苷酸和對應的氨基酸序列(分別在SEQID NO3和4中顯示)。編碼CH1、鉸鏈區、CH2和CH3的外顯子分別位于(SEQ ID NO3的)約核苷酸231到524、916到952、1071到1400，和1498到1820。Int1、Int2、Int3和Int4對應于來自人IgG4重鏈基因組序列內含子，分別位于(SEQ ID NO3的)約核苷酸1到230、約核苷酸525到916、約核苷酸953到1070，和約核苷酸1401到1497。
圖10顯示了人IgG1的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO5)，其缺失恒定區的CH2和CH3之間的內含子。
圖11顯示了修飾的人IgG4的基因組核苷酸序列(SEQ ID NO6)，其具有下面的內含子缺失CH1和鉸鏈之間的內含子、鉸鏈和CH2之間的內含子，和CH2和CH3之間的內含子。
發明詳述在表達載體的設計和構建中可以采用多種方法，并且在產生合理水平的蛋白質之前，方法通常需要大量的試驗與誤差實驗。設計過程中的一個重要考慮涉及在載體的構建中使用內含子序列。在一種方法中，可以利用天然發生的完整基因序列-含有內含子和外顯子序列的完整互補序列。在這種情況中，預期細胞內的轉錄后剪接機器將切除內含子序列，產生含有僅該基因的外顯子序列的成熟mRNA。第二種方法是利用僅對應于基因的cDNA的序列。在該情況中，預期不發生剪接事件并且前-mRNA序列與蛋白質編碼內容物中mRNA序列基本上相同。在第三種情況中，載體構建涉及選擇和放置不通常與初始基因序列結合的內含子。
在載體背景中內含子序列對基因表達的影響還沒有完全了解。已經報導內含子可以影響蛋白質生產過程中的許多事件，包括轉錄速率、聚腺苷酸化、mRNA輸出、翻譯效率、和mRNA衰變(Nott等人(2003)RNA9607-617)。在mRNA表達背景中，關于內含子對蛋白質從載體的產生的結果還不能清楚地預測。例如，有多種報導，其包括多種內含子序列可以導致表達的大量增加、沒有影響或者降低的mRNA表達(Berg等人(1988)Mol.Cell.Biol.84395-4405；Bourdon等人(2001)EMBO Rep.2394-398)。因為多數高等真核基因含有內含子，所以開發可以用于以高水平可預測地表達含有內含子的基因并且對基因的外顯子序列具有密切的保真性、并且不存在不希望的連讀副產物的系統明顯有助于可預測地開發蛋白質表達系統。
盡管與內含子序列有關的不可預測性對可靠的表達載體設計造成了障礙，但是當目的蛋白質具有順從基因工程技術的模塊形式時，可以實現重要的設計益處。抗體提供了一種這樣的實例，其中內含子序列的包括方便了表達載體設計。
在下文定義用于說明書和權利要求書中的一些術語。
短語“內含子連讀”(“IRT”)指前-mRNA轉錄的異常剪接借以產生備選大小或者氨基酸組成的蛋白質或者肽的過程。關于從錯誤剪接的轉錄物產生的最終蛋白質，可以發生不同的結果。例如，可以發生大于所預測的蛋白質或者具有錯誤終止密碼子的蛋白質，在該情況中，蛋白質分別比所預測的更長或者更短。此外，蛋白質還可以具有錯誤的或者額外的殘基，其促進蛋白質修飾以糖基化、豆蔻酰化、磷酸化、泛蛋白化或者其他翻譯后修飾。
術語“內含子連讀副產物”指從內含子連讀導致的異常剪接的mRNA翻譯的蛋白質或者肽，例如，未預期的大小或者氨基酸組成的蛋白質。內含子連讀副產物可以比已知氨基酸序列的基因預測的和/或該基因的cDNA預測的多肽更短或者更長。內含子連讀副產物還可以具有與基因的正確剪接的mRNA產生的蛋白質的公認分子量不同的表觀分子量。此外，術語“內含子連讀副產物”包括從通常不與目的蛋白質有關的蛋白酶解加工產生的蛋白質，所述蛋白酶解加工可能是由于內含子-外顯子-接點的連讀引起的移碼蛋白質產物所引起。
術語“重鏈副產物”指從內含子連讀導致的異常剪接的免疫球蛋白重鏈mRNA翻譯的多肽，例如，具有未預期的大小或者氨基酸組成的重鏈蛋白質。重鏈副產物可以比免疫球蛋白基因的已知氨基酸序列預測的和/或基因的cDNA預測的多肽更短或者更長。重鏈副產物還可以具有與重鏈基因的正確剪接的mRNA產生的蛋白質的公認分子量不同的表觀分子量。此外，術語“重鏈副產物”包括從通常不與該蛋白質有關的蛋白酶解加工產生的多肽。
短語“天然發生的序列”或者“天然發生的基因組序列”指在其天然或者自然狀態發現的基因的內含子和外顯子組織。天然發生的序列可以見于例如，它的天然染色體位置或者克隆到載體中，只要保留該序列的內含子和外顯子組織。
術語“免疫球蛋白”或者“抗體”(在本文中可互換使用)指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四條多肽鏈結構域的蛋白質，所述鏈例如通過鏈間二硫鍵穩定，其中該免疫球蛋白或者抗體具有特異結合抗原的能力。
術語“單鏈免疫球蛋白”或者“單鏈抗體”(在本文中可互換使用)指具有由重和輕鏈組成的兩條多肽鏈結構的蛋白質，所述鏈例如通過鏈間肽接頭穩定，其中該免疫球蛋白或者抗體具有特異結合抗原的能力。
術語“免疫球蛋白或者抗體結構域”指重鏈或者重鏈多肽內的球形區，包括例如通過β折疊和/或鏈內二硫鍵穩定的肽環(例如，包括3到4個肽環)。結構域還在本文中稱作“恒定的”或者“可變的”，其中術語“恒定的”指對于“恒定”結構域的情況，在多種類別成員的結構域內相對缺少序列變異，并且其中術語“可變的”指對于“可變”結構域的情況，在多種類別成員的結構域內顯著的變異。抗體或者多肽“結構域”通常在本領域中可互換地指抗體或者多肽“區域”。抗體輕鏈的“恒定”結構域可互換地指“輕鏈恒定區”、“輕鏈恒定結構域”、“CL”區或者“CL”結構域。抗體重鏈的“恒定”結構域可互換地指“重鏈恒定區”、“重鏈恒定結構域”、“CH”區或者“CH”結構域。抗體輕鏈的“可變”結構域可互換地指“輕鏈可變區”、“輕鏈可變結構域”、“VL”區或者“VL”結構域。抗體重鏈的“可變”結構域可互換地指“重鏈可變區”、“重鏈可變結構域”、“VH”區或者“VH”結構域。
術語“區”還指抗體鏈或者抗體鏈結構域的一部分(例如，重鏈或者輕鏈的一部分或者恒定或者可變結構域的一部分，如本文定義)，以及所述鏈或者結構域的更離散的部分。例如，輕鏈和重鏈或者輕鏈和重鏈可變結構域包括散布在如本文定義的“構架區”或者“FR”中的“互補決定區”或者“CDR”。
免疫球蛋白或者抗體可以以單體或者多聚體形式存在，例如，IgM抗體，其以五聚體形式存在，和/或IgA抗體，其以單體、二聚體或者多聚體形式存在。術語“片段”指抗體或抗體鏈的部分，其包括比完整或者完全的抗體或者抗體鏈更少的氨基酸殘基。通過化學或者酶促處理完整或者完全的抗體或者抗體鏈可以得到片段。通過重組方法也可以得到片段。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、和/或Fv片段。術語“抗原結合片段”指免疫球蛋白或者抗體的多肽片段，其結合抗原或者與完整抗體(即，它們所來自的完整抗體)競爭抗原結合(即，特異結合)。
術語“構象”指蛋白質或者多肽(例如，抗體、抗體鏈、其結構域或者區域)的三級結構。例如，短語“輕(或者重)鏈構象”指輕(或者重)鏈可變區的三級結構，短語“抗體構象”或者“抗體片段構象”指抗體或者其片段的三級結構。術語“構象”還可以指從一條或者幾條蛋白質或者肽鏈的三維關系產生的四級結構。關于抗原決定簇，短語“構象表位”指抗原決定簇，其包括一個或幾個蛋白質內密切接近的氨基酸的特定空間排列。考慮抗體的多功能性質(即，IgG分子能夠同時結合一個以上的蛋白質分子上的幾個表位)，可以認為抗體具有結合幾條氨基酸鏈包含的構象表位的固有能力。例如，Aβ沉積形成斑塊提供了構象表位，其中抗體可以結合幾個位置接近的Aβ肽。
通過重組DNA技術，或者通過完整免疫球蛋白的酶促或者化學切割產生結合片段。結合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、單鏈，和單鏈抗體。不同于“雙特異性”或者“雙功能”免疫球蛋白或者抗體，將免疫球蛋白或者抗體理解為其每個結合位點是相同的。“雙特異性”或者“雙功能抗體”是人工的雜種抗體，其具有兩個不同的重/輕鏈對和兩個不同的結合位點。通過包括雜交瘤融合或者Fab’片段的連接可以產生雙特異性抗體。見，例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol. 79315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
術語“顯著同一性”指當諸如通過程序GAP或者BESTFIT，使用默認缺口權重最佳比對時，兩種序列，例如，兩種多肽序列共有至少50-60％序列同一性，優選至少60-70％序列同一性，更優選至少70-80％序列同一性，更優選至少80-90％序列同一性，甚至更優選至少90-95％同一性，甚至更優選至少95％序列同一性或者更高(例如，99％序列同一性或者更高)。術語“實質同一性”或者“實質上同一的”指當諸如通過程序GAP或者BESTFIT，使用默認缺口權重最佳比對時，兩種序列，例如，兩種多肽序列共有至少80-90％序列同一性，優選至少90-95％序列同一性，更優選至少95％序列同一性或者更高(例如，99％序列同一性或者更高)。對于序列比較，通常一種序列作為參考序列，測試序列與其比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，如果必要，指定子序列坐標，并指定序列算法比較參數。序列比較算法然后基于所指定的程序參數，計算測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性。
可以進行用于比較的序列的最佳比對，例如，通過Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，通過Needleman &Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson &Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性檢索方法，通過這些算法的計算機實現(Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT，FASTA和TFASTA)，或者通過視覺檢查(一般見Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology)。適于確定百分數序列同一性和序列相似性的算法的一個實例是BLAST算法，其在Altschul等人，J.Mol.Biol.215403(1990)中描述。用于進行BLAST分析的軟件可以通過National Center forBiotechnology Information(可以通過National Institutes of Health NCBI因特網服務器公開獲得)公開獲得。通常，可以用默認程序參數進行序列比較，盡管還可以使用定制的參數。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認字長(W)3、期望值(E)10，和BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
通常，不相同的殘基位置差別是保守氨基酸替代。為了將氨基酸替代分類為保守或者非保守的，如下將氨基酸分組組I(疏水側鏈)leu、met、ala、val、leu、ile；組II(中性親水側鏈)cys、ser、thr；組III(酸性側鏈)asp、glu；組IV(堿性側鏈)asn、gln、his、lys、arg；組V(影響鏈取向的殘基)gly、pro；和組VI(芳香側鏈)trp、tyr、phe。保守替代包括相同類別中氨基酸之間的替代。非保守替代組成了將這些類別之一的成員與另一組的成員交換。
抗體本發明的方法學可以應用于多種抗體生產方法，其中檢測不想要的或者不希望的副產物。具體地，所述方法學可以用于產生重組抗體，如嵌合和人源化的單克隆抗體，其中產生的抗體的序列是已知的。
術語“人源化免疫球蛋白”或者“人源化抗體”指包括至少一條人源化免疫球蛋白或者抗體鏈(即，至少一條人源化輕鏈或重鏈)的免疫球蛋白或者抗體。術語“人源化免疫球蛋白鏈”或者“人源化抗體鏈”(即，“人源化免疫球蛋白輕鏈”或者“人源化免疫球蛋白重鏈”)指免疫球蛋白或者抗體鏈(即，分別為輕鏈或重鏈)，其具有包括基本上來自人免疫球蛋白或者抗體的可變構架區和基本上來自非人免疫球蛋白或者抗體的互補決定區(CDR)(例如，至少一個CDR，優選兩個CDR，更優選三個CDR)的可變區，并且還包括恒定區(例如，對于輕鏈，至少一個恒定區或者其部分，對于重鏈的情況，優選三個恒定區)。術語“人源化可變區”(例如，“人源化輕鏈可變區”或者“人源化重鏈可變區”)指可變區，其包括基本上來自人免疫球蛋白或者抗體的可變構架區和基本上來自非人免疫球蛋白或者抗體的互補決定區(CDR)。
短語“基本上來自人免疫球蛋白或者抗體”或者“基本上人”指當為了比較目的與人免疫球蛋白或者抗體氨基酸序列比對時，該區域與人構架或者恒定區序列共有至少80-90％、90-95％或95-99％同一性(即，局部序列同一性)，允許例如，保守替代、共有序列替代、種系替代、回復突變，等等。保守替代、共有序列替代、種系替代、回復突變，等等的引入通常稱作人源化抗體或者鏈的“優化”。短語“基本上來自非人免疫球蛋白或者抗體”或者“基本上非人”指與非人生物，例如，非人哺乳動物的具有至少80-95％、優選至少90-95％、更優選96％、97％、98％或99％同一性的免疫球蛋白或者抗體序列。
因此，人源化免疫球蛋白或者抗體或者人源化免疫球蛋白或者抗體鏈的所有區域或者殘基(除了可能的CDR外)與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的對應區域或者殘基實質上同一。術語“對應區域”或者“對應殘基”指當第一條和第二條序列為了比較目的進行最佳比對時，第二條氨基酸或者核苷酸序列上占據與第一條氨基酸或者核苷酸序列上的區域或者殘基相同(即等同)的區域或者殘基。
優選地，人源化免疫球蛋白或者抗體結合抗原的親和力是對應的非人源化抗體的3、4或者5倍以內。例如，如果非人源化抗體具有109M-1的結合親和力，那么人源化抗體將具有至少3×109M-1、4×109M-1或5×109M-1的結合親和力。當描述免疫球蛋白或者抗體鏈的結合性質時，該鏈可以基于其“指導抗原(例如，Aβ或者5T4)結合”的能力描述。當鏈賦予完整免疫球蛋白或者抗體(或者其抗原結合片段)特異結合性質或者結合親和力時，說該鏈“指導抗原結合”。如果突變對包含所述鏈的完整免疫球蛋白或者抗體(或者其抗原結合片段)的影響(例如，降低)與包含缺少所述突變的等同鏈的抗體(或者其抗原結合片段)的影響相差至少一個數量級，那么說所述突變(例如，回復突變)實質上影響重鏈或者輕鏈指導抗原結合的能力。如果突變對包含所述鏈的完整免疫球蛋白或者抗體(或者其抗原結合片段)的影響(例如，降低)與包含缺少所述突變的等同鏈的抗體(或者其抗原結合片段)的影響相差僅2、3或者4倍，那么說所述突變“不實質上影響(例如降低)鏈指導抗原結合的能力”。
術語“嵌合免疫球蛋白”或者抗體指免疫球蛋白或者抗體，其可變區來自第一種物種，其恒定區來自另一物種。例如，通過基因工程，從屬于不同物種的免疫球蛋白基因區段構建嵌合免疫球蛋白或者抗體。術語“人源化免疫球蛋白”或者“人源化抗體”不意在包括如本文定義的嵌合免疫球蛋白或者抗體。盡管人源化免疫球蛋白或者抗體在它們的構建中是嵌合的(即，包含來自一種以上蛋白質的區域)，但是它們包括在如本文定義的嵌合免疫球蛋白或者抗體中沒有發現的額外特征(即，包含供體CDR殘基和受體構架殘基的可變區)。
通過本領域已知的重組DNA技術可以產生此類嵌合和人源化單克隆抗體，例如，使用Robinson等人國際申請號PCT/US86/02269；Akira，等人歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等人歐洲專利申請173,494；Neuberger等人PCT國際公布號WO86/01533；Cabilly等人美國專利號4,816,567；Cabilly等人歐洲專利申請125,023；Better等人(1988)Science 2401041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84214-218；Nishimura等人(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等人(1985)Nature314446-449；和Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559)；Morrison，S.L.(1985)Science 2291202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4214；Winter美國專利5,225,539；Jones等人(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 2391534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.1414053-4060中描述的方法。
已經例如，通過缺失、添加或者替代抗體的其他部分，例如，恒定區進行修飾的單克隆、嵌合和人源化抗體也在本發明范圍內。例如，可以如下修飾抗體(i)通過將恒定區用另一恒定區(例如，意在增加抗體的半壽期、穩定性或者親和力的恒定區，或者來自另一物種或者抗體類別的恒定區)置換；或者(ii)通過修飾恒定區中一個或多個氨基酸以改變，例如，糖基化位點數目、效應細胞功能、Fc受體(FcR)結合、補體結合，等等。改變抗體恒定區的方法是本領域已知的。具有改變的功能，例如，對細胞上效應子配體，如FcR，或者補體的C1組分具有改變的親和力的抗體可以通過將抗體恒定部分中的至少一個氨基酸殘基用不同殘基替換來產生(見，例如，EP 388,151 A1、美國專利號5,624,821和美國專利號5,648,260，將它們所有的內容引入本文作為參考)。可以描述相似類型的改變，其如果應用于鼠，或者其他物種免疫球蛋白將降低或者消除這些功能。
例如，通過將特定殘基用在其側鏈具有合適的功能性的殘基替換，或者導入帶電的官能團，如谷氨酸或者天冬氨酸，或者可能芳香族非極性殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或者丙氨酸(見例如，美國專利號5,624,821)，可能改變抗體(例如，IgG，如人IgG)的Fc區對FcR(例如，FcγR1)，或者對C1q結合的親和力。
來自轉基因動物和噬菌體展示的人抗體備選地，現在可能產生轉基因動物(例如小鼠)，其在免疫時，能夠產生人抗體的完整所有組成成分，而不產生內源免疫球蛋白。例如，已經描述純合缺失嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈結合區(JH)基因導致內源抗體產生的完全抑制。這種種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉移導致當進行抗原刺激時產生人抗體。見例如，美國專利號6,150,584；6,114,598；和5,770,429。
完全人抗體還可以來自噬菌體展示文庫(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991))。
雙特異性抗體、抗體融合多肽和單鏈抗體雙特異性抗體(BsAbs)是對至少兩個不同的表位具有結合特異性的抗體。此類抗體可以來自全長抗體或者抗體片段(例如，F(ab)’2雙特異性抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的常規產生是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等人，Nature，305537-539(1983))。因為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機組合，這些雜交瘤(細胞雜交瘤)產生不同抗體分子的潛在混合物(見，WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.，103655-3659(1991))。
雙特異性抗體還包括交聯或者“雜綴合物”(heteroconjugate)抗體。例如，雜綴合物中的抗體之一可以偶聯到抗生物素蛋白，另一個偶聯到生物素或者其他戰斗部。使用任何常規交聯方法可以制備雜綴合物抗體。合適的交聯劑是本領域公知的，并且公開在美國專利號4,676,980，以及許多交聯技術中。
在再一個實施方案中，抗體可以化學或者遺傳融合到戰斗部結構域，例如，免疫毒素，以產生抗體融合多肽。此類戰斗部包括例如，免疫毒素、化學治療劑、和放射性同位素，它們都是本領域公知的。
單鏈抗體也適于根據本發明的穩定化。片段包含用接頭連接到輕鏈可變結構域(VL)的重鏈可變結構域(VH)，所述接頭允許每個可變區相互形成界面并且再造VL和VH區所來源的親本抗體的抗原結合口袋。見Gruber等人，J.Immunol.，1525368(1994)。
抗-Aβ抗體通常，本發明的抗體包括通過靶定Aβ肽，用于治療促淀粉狀變疾病，尤其阿爾茨海默氏病的抗體。
術語“促淀粉狀變疾病”包括與形成或者沉積不溶性淀粉狀蛋白纖絲有關(或者由其導致)的任何疾病。示例性促淀粉狀變疾病包括但不限于，系統性淀粉狀蛋白病、阿爾茨海默氏病、成年發作糖尿病、帕金森病、亨廷頓病、額顳癡呆、和朊病毒相關的傳染性海綿狀腦病(分別為人中的庫魯病和克-雅二氏病和綿羊和牛中的綿羊瘙癢病和BSE)。不同的促淀粉狀變疾病通過所沉積的纖絲的多肽組分的性質定義或者表征。例如，在具有阿爾茨海默氏病的受試者或者患者中，β-淀粉狀蛋白(例如，野生型、變異的或者截短的β-淀粉狀蛋白)是淀粉狀蛋白沉積物特征性多肽組分。因此，阿爾茨海默氏病是例如患者或者受試者的腦中“特征為Aβ沉積的疾病”或者“與Aβ沉積有關的疾病”的實例。術語“β-淀粉狀蛋白”、“β-淀粉狀肽”、“β-淀粉狀蛋白”，和“Aβ”和“Aβ肽”在本文中可互換使用。
“免疫原性劑”或者“免疫原”在施用于哺乳動物，任選與佐劑結合施用時，能夠誘導針對它自身的免疫學應答。
術語“Aβ抗體”、“抗Aβ抗體”和“抗Aβ”在本文中可互換使用，指結合APP、Aβ蛋白或者兩者的一個或多個表位或者抗原決定簇的抗體。示例性表位或者抗原決定簇可見于人淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)中，但是優選見于APP的Aβ肽內。存在APP的多種同種型，例如，APP695、APP751和APP770。APP內的氨基酸根據APP770同種型的序列分配編號(見例如，GenBank檢索號P05067)。Aβ(也在本文中稱作β-淀粉狀蛋白肽和A beta)肽是APP的39-43個氨基酸的～4-kDa內部片段(Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43)。Aβ40例如由APP的殘基672-711組成，Aβ42由APP的殘基672-713組成。由于不同分泌酶在體內或者原位對APP的蛋白酶解加工的結果，Aβ以長為40個氨基酸的“短形式”和長為42-43個氨基酸的“長形式”被發現。表位或者抗原決定簇可以位于Aβ肽的N末端并且可以包括Aβ的氨基酸1-10內的殘基，優選Aβ42的殘基1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-7、3-6或3-7或者Aβ的殘基2-4、5、6、7或8，Aβ的殘基3-5、6、7、8或9或者Aβ42的殘基4-7、8、9或10。“中心”表位或者抗原決定簇位于Aβ肽的中心或者中間部分，并且包括Aβ的氨基酸16-24、16-23、16-22、16-21、19-21、19-22、19-23或19-24內的殘基。“C-末端”表位或者抗原決定簇位于Aβ肽的C-末端內并且包括Aβ的氨基酸33-40、33-41或33-42內的殘基。
在多種實施方案中，Aβ抗體是末端特異的。本文使用的術語“末端特異的”指這樣的抗體，其特異結合Aβ肽的N-末端或者C-末端殘基，但是當相同殘基存在于包含所述殘基的更長的Aβ種類或者存在于APP中時，所述抗體不識別所述殘基。
在多種實施方案中，Aβ抗體是“C-末端特異的”。本文使用的術語“C-末端特異的”指抗體特異識別Aβ肽的游離C-末端。C末端特異性Aβ抗體的實例包括識別在殘基40結束的Aβ肽，但是不識別在殘基41、42和/或43結束的Aβ肽；識別在殘基42結束的Aβ肽，但是不識別在殘基40、41和/或43結束的Aβ肽；等等的抗體。
在一個實施方案中，抗體可以是3D6抗體或者其變體，或者10D5抗體或者其變體，它們都在美國專利公布號2003/0165496A1、美國專利公布號2004/0087777A1、國際專利公布號WO02/46237A3中描述。3D6和10D5的描述也可以見于例如國際專利公布號WO02/088306A2和國際專利公布號WO02/088307A2中。3D6是單克隆抗體(mAb)，其特異結合位于人β-淀粉狀蛋白肽中的N-末端表位，特別是殘基1-5。通過比較，10D5是特異結合位于人β-淀粉狀蛋白肽中的N-末端表位，特別是殘基3-6的mAb。在另一實施方案中，抗體可以是12B4抗體或者其變體，如美國專利公布號20040082762A1和國際專利公布號WO03/077858A2中描述。12B4是特異結合位于人β-淀粉狀蛋白肽中的N-末端表位，特別是殘基3-7的mAb。在再一個實施方案中，抗體可以是12A11抗體或者其變體，如美國專利申請號10/858,855和國際專利申請號PCT/US04/17514中描述。12A11是特異結合位于人β-淀粉狀蛋白肽中的N-末端表位，特別是殘基3-7的mAb。在再一個實施方案中，抗體可以是如美國專利申請號10/789,273和國際專利申請號WO01/62801A2中描述的266抗體。用于本發明的設計用于特異結合人β-淀粉狀蛋白肽中的C-末端表位的抗體包括，但不限于，如美國專利號5,786,160中描述的369.2B。
在示例性實施方案中，抗體是選擇性結合Aβ肽的人源化抗Aβ肽3D6抗體。更特別地，設計人源化抗Aβ肽3D6抗體使得特異結合位于在(例如患有阿爾茨海默氏病的患者的)腦的斑塊沉積物中發現的人β-淀粉狀蛋白1-40或者1-42肽中的NH2-末端表位。
抗5T4抗體以前已經表征了5T4抗原(見例如，WO 89/07947)。人5T4的全長核酸序列是已知的(Myers等人(1994)J Biol Chem 1699319-24和GenBank檢索號Z29083)。來自其他物種的5T4抗原的序列是已知的，例如，鼠5T4(WO00/29428)、犬5T4(WO01/36486)或貓5T4(US 05/0100958)。
人5T4是在癌中廣泛表達的約72kDa的糖蛋白，但是在正常成年組織中具有高度受限的表達模式。它似乎與結腸癌和胃癌中轉移強烈相關。5T4抗原的表達也在乳腺癌和卵巢癌中高頻率地發現(Starzynska等人(1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10479-84；Starzynska等人(1994)Br.J.Cancer 69899-902；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer 66867-9)。已經提出5T4作為腫瘤發展和轉移潛力的標記物(具有可能的機械涉及)(Carsberg等人(1996)Int J Cancer 6884-92)。還已經提出5T4用作免疫治療劑(見WO 00/29428)。5T4的抗原肽公開在例如US 05/0100958，將其內容引入本文作為參考。
一些待決申請一般涉及編碼抗5T4單克隆抗體的核酸，其載體和宿主細胞，例如，美國申請公布號2003/0018004和2005/0032216和美國申請序列號10/016,686。一般涉及人源化抗5T3 H8單克隆抗體和其加利車霉素綴合物，以及使用這些加利車霉素綴合物的治療方法的臨時專利申請已經提交(美國臨時申請序列號60/608,494)。將所有這些申請的內容完整引入本文作為參考。
Fc融合在一些實施方案中，本發明的核酸分子編碼融合或者嵌合蛋白。融合蛋白可以包括靶定部分，例如，可溶性受體片段或者配體，和免疫球蛋白鏈、Fc片段、多種同種型(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE)的重鏈恒定區。例如，融合蛋白可以包括受體的細胞外結構域，并且例如，融合到人免疫球蛋白Fc鏈(例如，人IgG，例如，人IgG1或人IgG4，或者其突變形式)。在一個實施方案中，人Fc序列已經在一個或多個氨基酸突變，例如，從野生型序列的殘基254和257處突變以減小Fc受體結合。融合蛋白可以額外包括接頭序列，其連接第一個部分與第二個部分，例如，免疫球蛋白片段。例如，融合蛋白可以包括肽接頭，例如，約4到20，更優選5到10個氨基酸長的肽接頭；肽接頭為8個氨基酸長。例如，融合蛋白可以包括具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽接頭，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。在其他實施方案中，可以在融合蛋白的N-或者C-末端加入額外的氨基酸序列以促進表達、立體柔性、檢測和/或分離或純化。
通過標準重組DNA技術可以產生本發明的嵌合或融合蛋白。例如，根據常規技術將編碼不同多肽序列的DNA片段一起連接在框內，例如，通過使用平端或者交錯端末端用于連接，限制酶消化以提供合適的末端，如合適，補平粘性末端，堿性磷酸酶處理以避免不希望的連接，和酶促連接。在另一實施方案中，通過常規技術(包括自動化DNA合成儀)合成融合基因。備選地，基因片段的PCR擴增可以用錨定引物進行，所述引物在兩個連續基因片段之間引起互補突出端，其可以隨后退火和再擴增以產生嵌合基因序列(見，例如，Ausubel等人(eds.)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，1992)。此外，可以通過商業途徑獲得編碼融合部分(例如，免疫球蛋白重鏈的Fc區)的許多表達載體。免疫球蛋白融合多肽是本領域已知的并且描述于例如，美國專利號5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和5,455,165。
核酸分子、構建體和載體本發明的示例性實施方案描述了設計用來消除不想要或者不希望的副產物，尤其不想要或者不希望的抗體(或者免疫球蛋白)副產物的工程化構建體。在一些方面，構建體包括天然發生的抗體基因序列的組分，其中組分已經經遺傳改變、修飾或者工程化(例如，基因工程化)，使得所得構建體表達所希望的目的蛋白質(例如抗體)，并且不存在不想要或不希望的副產物。使用用于產生如下文詳細描述的重組核酸分子(例如，包含免疫球蛋白鏈基因的組分)的本領域公認的技術可以產生構建體。
抗體基因序列編碼多種同種型的抗體，包括IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。優選地，抗體基因序列編碼IgG同種型的抗體。所編碼的免疫球蛋白或者抗體分子可以包括全長(例如，IgG1或者IgG4免疫球蛋白)或者備選地，可以包括僅片段(例如，Fc片段)。
本領域技術人員將明白的是，使用遺傳密碼和標準分子生物學技術，編碼本發明的抗體的核苷酸序列可以來自本申請中描述的核苷酸和氨基酸序列，或者來自本領域已知的免疫球蛋白基因的序列的額外來源。本發明的核酸組合物可以來自已知的免疫球蛋白DNA(例如，cDNA序列)。具體地，核苷酸序列與天然V、D、J或者恒定cDNA序列實質上同一或者來自天然V、D、J或者恒定cDNA序列。重鏈和輕鏈恒定區基因的序列是本領域已知的。優選地，恒定區是人的，但是也可以使用來自其他物種，如嚙齒動物(例如，小鼠或大鼠)、靈長類(獼猴)、駱駝或者兔的恒定區。來自這些物種的恒定區是本領域已知的(見，例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且，通過標準PCR擴增可以得到包含這些區域的DNA片段。重鏈恒定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區。重鏈恒定區的序列是本領域已知的并且可以見例如NCBI NG_001019。在典型實施方案中，恒定區是IgG1或者IgG4恒定區。對于Fc片段重鏈基因，編碼Fc的DNA可以有效連接用于定向表達的重鏈前導序列(例如，重鏈可變鏈前導序列)。
本發明的額外方面包括經裝配的免疫球蛋白DNA盒序列。經裝配的免疫球蛋白盒序列包括核苷酸序列以及免疫球蛋白DNA盒核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
這里提供示例性人IgG1恒定區基因組序列GTGAGTCCTGTCGACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC
GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO1)這里提供示例性IgG4恒定區基因組序列GTGAGTCCTGTCGACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCCCTCCTGCCTGGACGCACCCCGGCTGTGCAGCCCCAGCCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCATCTGTCTCCTCACCTGGAGGCCTCTGACCACCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGATTTTTCCACCAGGCTCCGGGCAGCCACAGGCTGGATGCCCCTACCCCAGGCCCTGCGCATACAGGGGCAGGTGCTGCGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCAGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGGTAAGCCAACCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACGCATCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCACGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGTCAGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG
CTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA(SEQ ID NO3)抗體產生通常通過重組表達產生本發明的抗體。編碼輕鏈和重鏈的核酸可以插入到表達載體中。可以在相同或者不同表達載體中克隆輕鏈和重鏈。編碼免疫球蛋白鏈的DNA區段有效連接表達載體中的控制序列，其確保免疫球蛋白多肽的表達。表達控制序列包括，但不限于啟動子(例如，天然結合的或者異源啟動子)、信號序列、增強子元件，和轉錄終止序列。優選地，表達控制序列是適于轉化或者轉染真核宿主細胞(例如，COS或CHO細胞)的載體中的真核啟動子系統。
操作分離的遺傳物質以提供如上述的本發明多肽后，通常將基因插入到表達載體中以導入宿主細胞，宿主細胞可以用于產生所希望量的經修飾的抗體，其又提供了要求保護的多肽。術語“載體”包括核酸構建體，其通常包括核酸，例如，基因，還包括核酸復制、轉錄、穩定性和/或蛋白質表達或者從宿主細胞分泌必要的最低限度的元件。此類構建體可以作為染色體外元件存在或者可以整合到宿主細胞的基因組中。
術語“表達載體”包括特定類型的載體，其中核酸構建體被優化用于高水平表達所希望的蛋白質產物。表達載體通常具有轉錄調節劑，如啟動子和增強子元件，其經優化以在特定細胞類型中高水平轉錄和/或經優化使得基于特定誘導劑的使用，表達是組成性的。表達載體還具有提供蛋白質的正確和/或增強的翻譯的序列。如本領域技術人員已知的，此類載體可以容易地選自質粒、噬菌體、病毒和逆轉錄病毒。術語“表達盒”包括核酸構建體，其除了允許基因在宿主細胞中正確和/或增強表達的基因外，還含有基因并且具有元件。
術語“有效連接”包括并列，其中組分處于允許它們以它們預期的方式(例如，功能連接)發揮功能的關系中。作為實例，有效連接目的多核苷酸的啟動子/增強子連接所述多核苷酸使得在激活通過該啟動子/增強子指導的表達的條件下實現目的多核苷酸的表達。關于本文描述的本發明，有效連接還包括在目的基因的初級轉錄物(前-mRNA)中發現的剪接供體和剪接受體位點的關系。通常，剪接受體和供體位點有效連接，因為需要這兩個序列并且一起發生功能用于發生剪接事件，產生成熟的信使RNA。
表達載體通常可以在宿主生物中復制，作為附加體或者宿主染色體DNA的整合部分。通常，表達載體含有選擇標記(例如，氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環素抗性、卡那霉素抗性或者新霉素抗性)以允許檢測用所希望的DNA序列轉化的那些細胞(見，例如，Itakura等人，美國專利號4,704,362)。除了免疫球蛋白DNA盒序列、插入序列、和調節序列外，本發明的重組表達載體還可以攜帶額外的序列，如調節宿主細胞中載體的復制的序列(例如，復制起點)和選擇標記基因。選擇標記基因方便選擇已經導入載體的宿主細胞的選擇(見，例如，Axel等人的美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常選擇標記基因對已經導入所述載體的宿主細胞賦予對藥物(如G418、潮霉素或者氨甲蝶呤)的抗性。優選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細胞，用氨甲蝶呤選擇/擴增)和neo基因(用于G418選擇)。
一旦載體已經摻入到合適的宿主，宿主就可以在適于高水平表達所述核苷酸序列的條件下保持，并收集和純化所希望的抗體。優選哺乳動物細胞用于表達和產生本發明的抗體。見，例如，Winnacker，From Genes toClones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。真核細胞是優選的，因為本領域已經開發了許多能夠分泌異源蛋白質(例如，完整的免疫球蛋白)的合適的宿主細胞系，包括CHO細胞系、多種COS細胞系、HeLa細胞，優選地，骨髓瘤細胞系或者轉化的B細胞或雜交瘤。優選地，細胞是非人的。用于表達本發明的抗體的優選的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220中描述，使用DHFR選擇標記，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621中描述)、淋巴細胞細胞系，例如，NSO骨髓瘤細胞和SP2細胞、COS細胞，和來自轉基因動物的細胞，例如，哺乳動物上皮細胞。其他合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。
這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，如復制起點、啟動子，和增強子(Queen等人，Immunol.Rev.8949(1986))，和必要的加工信息位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點，和轉錄終止序列。優選的表達控制序列是來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等等的啟動子。見例如，Co等人，(1992)J.Immunol.1481149。哺乳動物宿主細胞表達的優選調節序列包括指導哺乳動物細胞中高水平蛋白質表達的病毒元件，如來自如下的啟動子和/或增強子FF-1a啟動子和BGH多聚A、巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))，和多形瘤。關于病毒調節元件和其序列的進一步描述，見例如，Stinski的美國專利號5,168,062、Bell等人的美國專利號4,510,245，和Schaffner等人的美國專利號4,968,615。在示例性實施方案中，抗體重鏈和輕鏈基因有效連接到增強子/啟動子調節元件(例如來自SV40、CMV、腺病毒等等，如CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件或者SV40增強子/AdMLP啟動子調節元件)以驅動基因的高水平轉錄。在本發明的示例性實施方案中，構建體包括內部核糖體進入位點(IRES)以在真核宿主細胞中提供相對高水平的本發明多肽。相容的IRES序列公開在也引入本文作為參考的美國專利號6,193,980中。
備選地，可以將抗體編碼序列摻入轉基因以導入轉基因動物的基因組中和隨后在轉基因動物的奶中表達(見例如，Deboer等人，US 5,741,957，Rosen，US 5,304,489，和Meade等人，US 5,849,992)。合適的轉基因包括與來自乳腺特異基因(如酪蛋白或者β乳球蛋白)的啟動子和增強子有效連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。
原核宿主細胞可以也適于產生本發明的抗體。大腸桿菌(E.coli)是尤其可用于克隆本發明的多核苷酸(例如，DNA序列)的一種原核宿主。適于使用的其他微生物宿主包括芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、腸桿菌科，如埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和沙雷氏菌(Serratia)，和多種假單胞菌(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以制備表達載體，其將通常含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如，復制起點)。此外，將存在任一數目的多種公知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、β-內酰胺酶啟動子系統，或者來自λ噬菌體的啟動子系統。啟動子將通常任選與操縱基因序列一起控制表達，并且具有核糖體結合部位序列等等，用于啟動子和完成轉錄和翻譯。
最通常在大腸桿菌中用載體進行原核生物中蛋白質的表達，所述載體含有指導融合或者非融合蛋白的表達的組成型或者誘導型啟動子。融合載體將許多氨基酸加到其中編碼的抗體，通常加到重組抗體的恒定區，而不影響抗體的特異性或者抗原識別。融合肽的氨基酸的加入可以對抗體加入額外功能，例如，作為標記(例如，表位標記，如myc或者flag)。
其他微生物，如酵母也可以用于表達。酵母屬(Saccharomyces)是優選的酵母宿主，使用具有所希望的表達控制序列(例如，啟動子)、復制起點、終止序列等等的合適載體。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導型酵母啟動子包括來自醇脫氫酶、異細胞色素(isocytochrome)C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
備選地，可以在轉基因植物(例如，煙草、玉米、大豆和苜蓿)中產生本發明的抗體。改進的“植物產抗體”載體(Hendy等人(1999)J.Immunol.Methods 231137-146)和純化策略以及可轉化的植物物種的增加使得此類方法是產生不僅用于人和動物治療，而且用于工業應用(例如，催化性抗體)的重組免疫球蛋白的實際和有效的手段。此外，已經表明植物產生的抗體是安全和有效的，并且避免了使用動物來源的材料，并且因此避免了可傳染的海綿狀腦病(TSE)病原體的污染。此外，植物和哺乳動物細胞產生的抗體的糖基化模式的差異對抗原結合或者特異性有很小影響或者沒有影響。此外，在接受局部經口應用植物來源的分泌性二聚體IgA抗體的患者中，沒有觀察到細胞毒性或者HAMA的證據(見例如，Larrick等人(1998)Res.Immunol.149603-608)。
多種方法可以用于在轉基因植物中表達重組抗體。例如，抗體重鏈和輕鏈可以獨立地克隆到表達載體(例如，根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)載體)中，然后用重組細菌或者直接轉化在體外轉化植物組織，該轉化使用例如用載體包被的顆粒，然后用例如生物射彈法將該顆粒通過物理方法導入植物組織。隨后，重建表達個體鏈的完整植物，然后將它們有性雜交，最終導致產生完整裝配的和功能的抗體。類似的方案已經用于向煙草植物中表達功能抗體(見，例如，Hiatt等人(1989)Nature34276-87)。在多種實施方案中，信號序列可以通過將鏈導向合適的植物環境(例如，apoplasm的水性環境或者其他特異性植物組織，包括塊莖、果實或種子)用于促進表達、未裝配的抗體鏈的結合和折疊(見Fiedler等人(1995)Bio/Technology 131090-1093)。植物生物反應器也可以用于增加抗體產率和顯著降低成本。
合適的宿主細胞在Goeddel(1990)Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif中進一步討論。備選地，可以在體外轉錄和翻譯重組表達載體，例如，使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。
取決于細胞宿主的類型，通過公知的方法可以將含有目的多核苷酸序列(例如，重鏈和輕鏈編碼序列和表達控制序列)的載體轉移到宿主細胞中。例如，氯化鈣轉染通常用于原核細胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂轉染、生物射彈或者基于病毒的轉染可以用于其他細胞宿主。(一般見Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，2nd ed.，1989)，將其內容為了所有目的完整引入本文作為參考)。用于轉化哺乳動物細胞的其他方法包括使用1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射(一般見，Sambrook等人，上文)。為了產生轉基因動物，可以將轉基因顯微注射到受精卵母細胞中，或者可以摻入到胚胎干細胞的基因組中，并且將此類細胞的細胞核轉移到去核的卵母細胞中。
當在分開的表達載體上克隆重鏈和輕鏈時，將載體共轉染以得到完整免疫球蛋白的表達和裝配。一旦表達，可以將完整抗體、它們的二聚體、個體輕鏈和重鏈，或者本發明的其他免疫球蛋白形式根據本領域的標準方法純化，所述方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等等(一般見，Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。對于制藥用途，優選至少約90到95％同質性的基本上純的免疫球蛋白，最優選98到99％或者更高的同質性。
根據本發明分子產生的免疫球蛋白或者抗體可以衍生化或者連接到另一功能分子(例如，另一種肽或者蛋白質)。因此，本文公開的本發明的抗體和抗體部分或者抗體的修飾形式可以進一步衍生化以用于研究、診斷和/或治療背景中。例如，本發明的抗體或者抗體部分可以功能連接(通過化學偶聯、基因融合、非共價結合或者其他方法)到一個或多個其他分子實體，如另一種抗體(例如，雙特異性抗體或者雙抗體)、可檢測試劑、細胞毒性劑、藥學活性劑、和/或可以介導抗體或者抗體部分與另一種分子的融合的蛋白質或者肽(如鏈霉抗生物素蛋白核心區和聚組氨酸標記)。
通過交聯兩種或者多種抗體(相同類型或不同類型，例如，以產生雙特異性抗體)，產生一種類型的衍生化抗體。合適的交聯劑包括異雙功能的交聯劑、具有通過合適的間隔臂分開的兩種不同的反應基的交聯劑(例如，間-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或者同雙功能的交聯劑(例如，辛二酸二琥珀酰亞胺酯)。此類交聯劑可以從Pierce Chemical Company，Rockford，IL得到。
示例性熒光可檢測的試劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰基氯、藻紅蛋白等等。抗體可以用可檢測的酶衍生，所述酶為如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶等等。當抗體用可檢測的酶衍生時，可以加入額外的試劑來檢測，酶用所述試劑來產生可檢測的反應產物。例如，當存在可檢測試劑辣根過氧化物酶時，加入過氧化氫和二氨基聯苯胺導致可檢測的有色反應產物。抗體還可以用輔基(例如，鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素)衍生。例如，抗體可以用生物素衍生化，并通過間接測量抗生物素蛋白或者鏈霉抗生物素蛋白結合來檢測。合適的熒光物質的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或者藻紅蛋白；發光物質的實例包括魯米諾；生物發光物質的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白，合適的放射性物質的實例包括125I、131I、35S或3H。抗體(或者其片段)可以綴合到治療部分，如細胞毒素或者其他治療性蛋白質。備選地，可以將抗體綴合到第二種抗體，形成如Segal在美國專利號4,676,980中描述的抗體雜綴合物(heteroconjugate)。
用于減少或者消除不想要的多肽副產物的表達載體在開發治療性蛋白質的蛋白質表達系統中，所純化的靶標產物的HPLC分析鑒定了未預期的低分子量(LMW)種類的肽。更特別地，在開發用于表達3D6抗體的CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系中觀察到不希望的多肽副產物。該抗體已經在別處描述并且是開發用于治療阿爾茨海默氏病的免疫治療劑的努力的結果。它對Aβ肽具有特異性并且已經表明在清除Aβ斑塊中有效。使用公認的方法開發了CHO細胞系并且其除了用于選擇性培養含有表達盒的細胞的基因外，還含有3D6抗體的重鏈和輕鏈的拷貝。
對該細胞系的許多克隆分離物的檢查表明LMW種類的產生不是所利用的克隆的特有的現象，即，在測試的所有細胞系中產生的總蛋白質的小級分是未預期的LMW種類的級分。還觀察到當誘導蛋白質表達時，LMW種類的級分相對于總蛋白質增加了。使用質譜法對多肽的進一步評估表明LMW種類含有通過基因的外顯子序列沒有預測到的氨基酸。
圖1的上圖概略表示了3D6重鏈表達盒，顯示了內含子和外顯子以及內部核糖體進入位點(IRES)和二氫葉酸還原酶(DHFR)選擇標記基因的位置的關系。所顯示的外顯子是可變重鏈(VH1)、鉸鏈和恒定重鏈1、2、3(CH1，CH2，CH3)。表達盒的內含子表示為Int1、Int2、Int3和Int4。圖1還圖解了來自表達盒的mRNA的預期正確的剪接事件。中圖顯示了僅含有雙順反子轉錄物的內含子序列的正確剪接的mRNA。
對表達載體中內含子和外顯子序列和質譜數據的細察指向特異剪接位點接點的RNA聚合酶內含子連讀(IRT)。因為表達載體中所含內含子和外顯子和剪接位點供體和受體位點的組織與它們以該基因的最初基因組形式存在的基本相同，所以錯剪接事件是不可預測的。
圖1的下解了通過第四個內含子的內含子連讀產生的預測產物。圖2提供了序列信息，顯示了在36D抗體表達載體的基因組序列的第四個內含子的區域中DNA序列的有義和反義鏈。剪接點(剪接供體和受體位點)通過垂直于核酸序列的垂線指出。對應于內含子序列的DNA以下劃線和斜體顯示。所希望的和連讀副產物多肽的預測的氨基酸在基因組DNA的反義鏈下面顯示。來自正確剪接的RNA的多肽的氨基酸序列以粗體大寫字母顯示；來自錯誤剪接的RNA的多肽副產物以小寫字體顯示。
本發明描述了用于設計蛋白質表達盒和載體使得內含子連讀(IRT)和不想要的多肽副產物實質上減少或者完全消除的材料和方法。本發明部分提供了載體的新穎設計，其中改變了編碼目的蛋白質的分離的核酸中內含子和外顯子的天然的有效結合，使得IRT被減小或者消除，從而減少或者消除不想要的IRT多肽種類。該獨特改變尤其適于IgG1或IgG4抗體，但是可以用于任何目的基因。此外，內含子和外顯子的天然有效結合發生改變的本發明載體不僅證明了相對于使用標準的本領域公認技術設計的載體，具有減少或者消除的IRT副產物，而且具有增加的蛋白質表達水平。
實施例材料和方法在實施例全文中，除非另外陳述，在下面的文本中例示材料和方法通常，本發明的實踐使用分子生物學、重組DNA技術和免疫學中的公認的技術，特別是例如抗體技術。見，例如，Sambrook，Fritsch andManiatis，Molecular CloningCold Spring Harbor laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Human Press(1996)；Antibody EngineeringA PracticalApproach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed IRL Press(1996)；AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow等人Cold SpringHarbor Press，(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology eds.Ausubel等人John Wiley & Sons(1992)。
實施例1.內含子連讀轉錄的定量為了定量由于內含子連讀形成的異常轉錄物的相對量，設計定量PCR測定法。評估IRT轉錄的方法在圖3中圖解。特別地，用TaqManTM系統設計定量PCR測定法，其中用PCR擴增定量目的核酸種類。設計三個探針-引物組以確定所產生的內含子連讀mRNA的級分。設計第一個探針-引物組用來定量與目的內含子天然有效結合的外顯子序列的轉錄水平。對于3D6重鏈表達盒，靶定含有3D6第二條恒定重鏈(CH2)外顯子的mRNA種類。這提供了對總的3D6 mRNA產生的量度。第二個探針引物組橋接有效結合的內含子和外顯子，這里為CH2外顯子-3D6表達盒的第四個內含子界面。從該探針引物組得到的擴增表明存在內含子連讀轉錄物，其含有5’剪接供體序列以及橋接CH2外顯子和內含子4的序列。第三個探針-引物組靶定第四個內含子的序列。該探針組提供了包含內部內含子4序列的錯誤剪接的RNA的級分的定量。
圖4顯示了使用所描述的探針引物組進行Q-PCR測定的結果。簡言之，將含有穩定整合的表達載體的CHO細胞接種并保持培養兩周。在第七天，誘導培養物增加蛋白質表達。在實驗過程中，將細胞培養物的樣品裂解并且評估測定中的RNA含量，該評估使用對CH2外顯子特異或者對如前面段落中描述的內含子特異的探針和引物組。該解了誘導前錯誤剪接的RNA產物的低水平和隨著誘導后時間的過去，含有內含子4的RNA的百分數增加。本文描述的Q-PCR的該方法預測含有天然有效結合的內含子和外顯子的特定表達盒將產生內含子連讀副產物的可能性。
盡管明確提供了定量3D6抗體表達系統的IRT的細節，但是可以在其中存在IRT的可能的任何蛋白質表達系統中實現該技術。因此，該新方法特別可用于評估本發明的載體(在下文中詳細描述)是否將為特定目的蛋白質所采用，從而避免產生不想要的IRT多肽副產物。當IRT轉錄的豐度大于約0.1％-1％時，使用改變的天然有效結合的載體可以用于表達所希望的蛋白質。本領域技術人員將容易明白的是，用于檢測內含子連讀mRNA并且因此預測內含子連讀多肽的方法可以應用于其中發生剪接事件的任何蛋白質表達系統。例如，該系統可以使用任何真核細胞系統，例如，基于酵母、果蠅、小鼠、猴、兔、大鼠或者人細胞的系統。
實施例2.具有經修飾的天然有效結合的內含子和外顯子的載體設計表達載體，其中內含子和外顯子的天然有效結合被修飾。在圖5中顯示了兩種示例性載體序列。該解了為了解決內含子連讀副產物的問題所開發的表達構建體。上示描述了通用抗體重鏈的基因組、內含子-外顯子組織，所述重鏈含有可變區(VH)的外顯子、三個恒定區(CH1，CH2，CH3)和鉸鏈區。中間和下方附圖描繪了摻入表達載體的基因組序列的修飾，其消除了內含子連讀重鏈副產物。
將表達3D6輕鏈的CHO細胞用3D6抗體的完整基因組重鏈序列轉化或者用經修飾的3D6重鏈表達載體轉化，在經修飾的3D6重鏈表達載體中，內含子和外顯子的天然有效結合被修飾。用如材料和方法中描述的用于蛋白質表達的標準技術培養細胞。從條件上清液純化抗體并隨后用變性反相(RP)HPLC分級分離(圖6)。運行層析柱使得抗體的重鏈和輕鏈組分分離。
在代表3D6基因組克隆蛋白質制備物的分級分離的上方跡線中，重鏈和輕鏈峰非常明顯。此外，可以分辨出在重鏈和輕鏈之間分級分離的小峰，其對應于重鏈內含子連讀產物。
下方跡線是已經減輕了內含子連讀問題的表達系統的實例。如在上方跡線中，輕鏈和重鏈峰明顯存在，然而，IRT的水平已經下降到檢測極限以下。該發現已經延伸到其他載體，其中外顯子和內含子的天然有效結合已經改變。例如，圖5中描述的HCΔ內含子4序列類似地將IRT降低到檢測不到的水平。
實施例3.抗5T4編碼序列的來源和描述抗5T4 H8作為針對可溶性5T4的小鼠單克隆抗體得到。通過CDR移植(VH，DP75種系構架；VL DPK24種系構架)人源化抗5T4 H8抗體，并且如果合適，將可變區亞克隆到含有人IgG4重鏈恒定結構域(對于VH結構域)或者人κ輕鏈恒定結構域(VL結構域)的載體中。該人源化的抗體稱作huH8。將鉸鏈穩定突變(Ser 241到Pro)引入人IgG4。將編碼huH8重鏈和輕鏈的序列連接到表達載體中，該表達載體由小鼠CMV增強子/啟動子驅動并且含有選擇標記基因二氫葉酸還原酶(重鏈表達載體)或者新霉素抗性(輕鏈表達載體)。
實施例4.內含子去除增加了蛋白質表達為了確定內含子去除對抗體表達的影響，用不同數目的內含子產生了一些抗體的表達構建體。三種不同抗體12A11v3.1、356A11和huH8的可變區每種在CHO細胞中穩定表達，使用含有基因組序列、cDNA序列，和缺失三個內含子(即，CH1和鉸鏈區之間的內含子、鉸鏈區和CH2之間的內含子，和CH2和CH3之間的內含子)的基因組序列的三種恒定區表達構建體。對于得到弱表達的構建體，如12A11v3.1和huH8，除去三個內含子或者所有內含子(即cDNA)引起抗體表達的顯著增加。更具體地，與基因組序列相比，12A11v3.1的三個內含子缺失的構建體中檢測到表達增加約5倍。相對于基因組序列，具有cDNA序列的12A11v3.1構建體的表達增加6倍。與基因組序列相比，CHO細胞中huH8抗體的表達的增加對于缺失三個內含子的構建體和cDNA構建體分別為約4倍和9倍。通常，在內含子缺失的序列和基因組序列之間，良好表達的抗體不顯示出CHO細胞表達中的顯著改變。
盡管為了清楚理解的目的已經詳細描述了前面的發明，但是顯然在所附權利要求的范圍內可以做出一些改變。本文引用的所有出版物和專利文件以及在附圖和序列表中出現的文本都為了所有目的完整引入本文作為參考，就好像每個被單獨指出作為參考文獻一樣。
權利要求
1.包含具有一個或多個內含子和外顯子序列的核苷酸序列的核酸分子，其中與天然發生的基因組序列相比，缺失至少一個內含子序列以減少錯誤剪接的或者內含子連讀(IRT)副產物。
2.包含核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序列包含一個或多個內含子和外顯子序列，其中與天然發生的基因組序列相比，缺失至少一個內含子序列以增強蛋白質表達。
3.權利要求2的核酸，其中缺失至少三個內含子序列。
4.權利要求1-3任一項的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼抗體重鏈或者其片段。
5.權利要求4的核酸分子，其中所述抗體重鏈或者其片段包含人免疫球蛋白G亞型的重鏈可變區、鉸鏈區、第一個恒定區(CH1)、第二個恒定區(CH2)、和第三個恒定區(CH3)。
6.權利要求5的核酸分子，其中所述免疫球蛋白G亞型是人IgG1或者人IgG4。
7.權利要求6的核酸分子，其中所述人IgG1或者人IgG4是突變的。
8.權利要求5的核酸分子，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區的CH2區和CH3區之間的內含子被缺失。
9.權利要求8的核酸分子，其還包含缺失CH1區和鉸鏈區之間的內含子。
10.權利要求8的核酸分子，其還包含缺失鉸鏈區和CH2區之間的內含子。
11.權利要求5的核酸分子，其具有包含重鏈可變區和CH1區之間的一個內含子的重鏈。
12.權利要求5的核酸分子，其中編碼重鏈鉸鏈區、和第一個、第二個和第三個恒定區的核苷酸序列包含與圖8(SEQ ID NO1)中所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的序列。
13.權利要求5的核酸分子，其中編碼重鏈鉸鏈區、和第一個、第二個和第三個恒定區的核苷酸序列包含與圖9(SEQ ID NO3)中所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的序列。
14.權利要求8的核酸分子，其中CH2和CH3之間內含子的缺失對應于如圖8(SEQ ID NO1)所示的人IgG1的約核苷酸1409到1505。
15.權利要求8的核酸分子，其中CH2和CH3之間內含子的缺失對應于如圖9(SEQ ID NO3)所示的人IgG4的約核苷酸1401到1497。
16.權利要求9的核酸分子，其中CH1和鉸鏈區之間內含子的缺失對應于如圖8(SEQ ID NO1)所示的人IgG1的約核苷酸525到915。
17.權利要求9的核酸分子，其中CH1和鉸鏈區之間內含子的缺失對應于如圖9(SEQ ID NO3)所示的人IgG4的約核苷酸525到916。
18.權利要求10的核酸分子，其中鉸鏈區和CH2之間內含子的缺失對應于如圖8(SEQ ID NO1)所示的人IgG1的約核苷酸961到1078。
19.權利要求10的核酸分子，其中鉸鏈區和CH2之間內含子的缺失對應于如圖9(SEQ ID NO3)所示的人IgG4的約核苷酸953到1070。
20.包含編碼人IgG1的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列與圖10(SEQ ID NO5)中所示的序列具有至少90％同一性。
21.包含編碼人IgG4的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列與圖11(SEQ ID NO6)中所示的序列具有至少90％同一性。
22.編碼人重鏈恒定區的基因組核苷酸序列或者其突變形式，其中所述核苷酸序列缺少天然發生的基因組序列中存在的至少一個內含子，并且其中所述內含子促進內含子連讀。
23.編碼人IgG1的基因組核苷酸序列或者其突變形式，其中所述核苷酸序列缺少天然發生的基因組序列中存在的至少一個內含子，并且其中所述內含子促進內含子連讀。
24.權利要求22或23任一項的核苷酸序列，其中所述至少一個內含子是恒定區的CH2和CH3之間的內含子。
25.編碼人IgG4的基因組核苷酸序列或者其突變形式，其中所述基因組序列缺少天然發生的基因組序列中存在的三個內含子。
26.權利要求25的核苷酸序列，其中所述內含子是CH1和鉸鏈區之間的內含子、鉸鏈區和CH2之間的內含子，和CH2和CH3之間的內含子。
27.核酸分子，其包含下式表示的核苷酸序列VH-Int1-CH1-Int2-鉸鏈-Int3-CH2-CH3，其中VH是編碼重鏈可變區的核苷酸序列；CH1、CH2和CH3是編碼對應的重鏈恒定區的核苷酸序列；鉸鏈是編碼重鏈恒定區的鉸鏈區的核苷酸序列；和Int1、Int2和Int3是來自重鏈基因組序列的內含子。
28.權利要求27的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼人免疫球蛋白G重鏈。
29.核酸分子，其包含下式表示的核苷酸序列VH-Int1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中VH是編碼重鏈可變區的核苷酸序列；CH1、CH2和CH3是編碼對應的重鏈恒定區的核苷酸序列；鉸鏈是編碼重鏈恒定區的鉸鏈區的核苷酸序列；和Int1是來自重鏈基因組序列的內含子。
30.權利要求29的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼人免疫球蛋白G重鏈。
31.表達盒，其包含權利要求5的核酸分子。
32.表達載體，其包含權利要求5的核酸分子。
33.權利要求32的表達載體，其還包含增強宿主細胞中復制、選擇、mRNA轉錄、mRNA穩定性、蛋白質表達或者蛋白質分泌的一種或多種核苷酸序列。
34.包含權利要求5的核酸分子的宿主細胞。
35.包含權利要求31的表達載體的宿主細胞。
36.包含權利要求32的表達載體的宿主細胞。
37.權利要求36的宿主細胞，其是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
38.表達基本上無內含子連讀(IRT)產物的重組抗體或者其片段的方法，其包括將權利要求5的核酸分子導入哺乳動物宿主細胞；在允許所述重組抗體或者其片段表達的條件下培養所述宿主細胞，從而產生宿主細胞培養物；和從宿主細胞培養物得到重組抗體或者其片段。
39.權利要求38的方法，其還包括鑒定來自宿主細胞的核酸樣品中的IRT產物的步驟。
40.權利要求39的方法，其中鑒定步驟包括從宿主細胞培養物得到核酸樣品；將所述核酸樣品與互補于內含子和相鄰外顯子序列的核酸探針在允許該核酸樣品和探針雜交的條件下接觸；檢測所得復合體，其中使用與所述內含子序列互補的核酸探針在所述樣品中檢測到復合體表明存在IRT產物。
41.權利要求38的方法，其中所述宿主細胞包含編碼輕鏈可變區和恒定區的核苷酸序列。
42.增強重組抗體或者其片段的表達的方法，其包括將權利要求5的核酸分子導入哺乳動物宿主細胞；在允許重組抗體表達的條件下培養所述宿主細胞，從而產生宿主細胞培養物；和從宿主細胞培養物得到重組抗體。
43.權利要求42的方法，其中所述宿主細胞包含編碼輕鏈可變區和恒定區的核苷酸序列。
44.產生基本上沒有內含子連讀(IRT)重鏈副產物的重組抗體或者其片段的方法，其包括在使得表達重鏈和輕鏈的條件下，培養包含權利要求5的核酸分子和編碼抗體輕鏈的核酸的哺乳動物宿主細胞。
45.權利要求44的方法，其還包括從培養物純化重鏈和輕鏈。
46.增強重組抗體或者其片段的表達的方法，其包括在使得表達重鏈和輕鏈的條件下，培養包含權利要求5的核酸分子和編碼抗體輕鏈的核酸的哺乳動物宿主細胞。
47.權利要求46的方法，其還包括從培養物純化重鏈和輕鏈。
48.檢測樣品中IRT產物的方法，其包括從重組細胞得到核酸樣品；將所述核酸樣品與互補于內含子和相鄰外顯子序列的核酸探針在允許該核酸樣品和探針雜交的條件下接觸；檢測所得復合體，其中使用與所述內含子序列互補的核酸探針在所述樣品中檢測到復合體表明存在IRT產物。
49.抗體或者其抗原結合片段，其通過包括權利要求38或者40任一項的步驟的方法在允許表達和裝配該抗體或者其片段的適宜條件下制備。
50.權利要求49的抗體，其是嵌合的、人源化的、CDR移植的或者體外產生的抗體。
51.權利要求50的抗體，其是人源化抗體。
52.權利要求51的抗體，其結合人5T4。
53.藥物組合物，其包含權利要求49的抗體和藥學上可接受的載體。
全文摘要
公開了經修飾以增強重組蛋白質(例如，抗體)表達和/或減少或者消除錯誤剪接的和/或內含子連讀(IRT)副產物的核酸分子。本發明還提供了通過在宿主細胞中使用此類載體，在適于重組蛋白質表達的細胞培養條件下，產生缺少錯誤剪接和/或內含子連讀副產物的蛋白質的方法。
文檔編號C07K16/00GK101027391SQ200580031940
公開日2007年8月29日 申請日期2005年10月5日 優先權日2004年10月5日
發明者M·S·西納科雷, M·倫納德, H·A·拉肯, J·勞斯 申請人:惠氏公司