血管生成素樣4蛋白抑制劑，組合，以及其用途的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：3475851閱讀：2508來(lái)源：國(guó)知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：血管生成素樣4蛋白抑制劑，組合，以及其用途的制作方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明總體涉及人疾病和病理狀況諸如癌癥的治療。本發(fā)明涉及血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)抑制物以及ANGPTL4抑制物與其它治療劑的組合，以及利用所述組合物進(jìn)行疾病或病理狀況的診斷和治療的方法。
            
背景技術(shù)：
             癌癥是美國(guó)的首要死亡原因。已經(jīng)采用各種類型的治療來(lái)治療癌癥。例如，采用手術(shù)方法去除癌性或死亡組織。通過(guò)減小固體腫瘤起作用的放射治療以及殺滅快速分裂細(xì)胞的化療用作癌癥治療。
            
1971年，F(xiàn)olkman提出抗血管生成可能是有效的抗癌策略。Folkman，N.Engl.J.Med.285，1182-1186(1971)。血管生成是從已經(jīng)存在的血管和/或循環(huán)的內(nèi)皮干細(xì)胞形成新血管的發(fā)展過(guò)程(見(jiàn)例如，F(xiàn)errara & Alitalo，NatureMedicine 5(12)1359-1364(1999))。血管生成是以下過(guò)程組成的級(jí)聯(lián)1)蛋白酶釋放后局部位點(diǎn)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解，2)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，和3)毛細(xì)小血管向血管生成性刺激的遷移。Ferrara et al.Endocrine Rev.1318-32(1992)。
            
心血管的生長(zhǎng)是胚胎和出生后發(fā)育的正常生理過(guò)程如胚胎形成，傷口愈合以及月經(jīng)的先決條件。見(jiàn)例如Folkman and Klagsbrun Science 235442-447(1987)。心血管從預(yù)存在的毛細(xì)血管的這種增殖還在各種疾病的病理發(fā)展中起重要作用，包括但不限于，例如腫瘤，增殖性視網(wǎng)膜疾病，年齡相關(guān)的黃斑變性，銀屑病，炎癥，糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。見(jiàn)例如，F(xiàn)errara，RecentProg.Horm.Res.5515-35(2000)，discussion 35-6。
            
由于血管生成的重要的生理和病理重要性，進(jìn)行大量工作說(shuō)明能調(diào)節(jié)該過(guò)程的因素。提示血管生成過(guò)程受到促-和抗-血管生成分子之間平衡的調(diào)節(jié)，并且在各種疾病具體是癌癥中出現(xiàn)異常。見(jiàn)例如Carmeliet and Jain Nature407249-257(2000)。
            
例如，血管生成有賴于分泌的因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VEGF，也已知為血管通透性因子(VPF))以及纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。見(jiàn)例如，F(xiàn)erraraand Davis-Smyth Endocrine Rev.184-25(1997)；和，F(xiàn)errara J.Mol.Med.77527-543(1999)。除了作為血管生成和脈管形成中的生血管因子以外，VEGF作為多向性生長(zhǎng)因子，在其它生理過(guò)程中顯示多重生物作用，諸如內(nèi)皮細(xì)胞存活，血管通透性和血管擴(kuò)張，單核細(xì)胞趨化以及鈣內(nèi)流。Ferrara andDavis-Smyth(1997)，supra。此外，研究報(bào)道了VEGF對(duì)少數(shù)非內(nèi)皮細(xì)胞類型的促有絲分裂效應(yīng)，諸如視網(wǎng)膜色素內(nèi)皮細(xì)胞，胰導(dǎo)管細(xì)胞和雪旺細(xì)胞。見(jiàn)例如，Guerrin et al.J.Cell Physiol.164385-394(1995)；Oberg-Welsh et al.Mol.Cell.Endocrinol.126125-132(1997)；和，Sondell et al.J.Neurosci.195731-5740(1999)。
            
VEGF屬于包括胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PlGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E的基因家族。這些配體結(jié)合并連接于內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的酪氨酸激酶受體。例如，VEGF酪氨酸激酶受體家族包括Flt1(VEGF-R1)(VEGF，VEGF-B和PlGF)，F(xiàn)lk1/KDR(VEGF-R2)(其結(jié)合VEGF，VEGF-C，VEGF-D，和VEGF-E)，和Flt4(VEGF-R3)(其結(jié)合VEGF-C和VEGF-D)。見(jiàn)例如，F(xiàn)erraraet al.，Nature Medicine 9(6)669-676(2003)；和Robinson & Stringer，Journal ofCell Science，114(5)853-65(2001)。
            
血管生成素是另一組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。見(jiàn)例如，Davis et al.，Cell，871161-1169(1996)；Suri et al.，Cell，871171-1180(1996)；Maisonpierre et al.Science 27755-60(1997)；和Valenzuela et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA961904-1909(1999)。血管生成素與VEGF的作用互補(bǔ)且協(xié)同，其中VEGF在血管發(fā)育中起作用而血管生成素可通過(guò)調(diào)節(jié)血管的重構(gòu)、成熟以及穩(wěn)定化起作用。見(jiàn)例如，Holash et al.，Oncogene 185356-5362(1999)。血管生成素1，血管生成素2，血管生成素3和血管生成素4結(jié)合酪氨酸激酶Tie2(也稱為T(mén)ek)受體，其是見(jiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞上的受體。見(jiàn)例如，Ward & Dumont，Seminars inCell & Developmental Biology，1319-27(2002)。還有Tie1孤兒受體。
            
血管生成不僅有賴于生長(zhǎng)因子，還受細(xì)胞粘附分子(CAM)的影響，其中包括整合素，它們結(jié)合細(xì)胞基質(zhì)中存在的配體。見(jiàn)例如，F(xiàn)errara & Alitalo，Nature Medicine 5(12)1359-1364(1999)；和Carmeliet，Nature Medicine，6(3)389-395(2000)。整合素促進(jìn)細(xì)胞粘附并遷移到見(jiàn)于細(xì)胞間隙以及基底膜的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。細(xì)胞粘附蛋白的整合素家族由至少18α和8β亞基構(gòu)成，所述亞基在至少22個(gè)αβ異源二聚體組合中表達(dá)。見(jiàn)例如，Byzova et al.，Mol.Cell.，6(4)851-860(2000)；和Hood and Cheresh，Nature Reviews，291-99(2002)。其中，至少6種(αVβ3，αVβ5，α5β1，α2β1，αvβ1和α1β1)組合見(jiàn)于血管生成(見(jiàn)例如，Hynes and Bader，Thromb.Haemost.，78(1)83-87(1997)；以及，Hynes et al.，Braz.J.Med.Biol.Res.，32(5)501-510(1999))。發(fā)現(xiàn)編碼特異性粘附受體的各種基因的滅活或在動(dòng)物模型中給藥封閉型抗體對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成反應(yīng)有影響。見(jiàn)例如，Elicieri and Cheresh，Mol.Med，4741-750(1998)。
            
這些分子已經(jīng)成為癌癥治療的靶。例如，認(rèn)識(shí)到VEGF是病理疾病中血管生成的主要調(diào)節(jié)物導(dǎo)致封閉VEGF活性的多種嘗試。抑制性抗-VEGF受體抗體，可溶受體構(gòu)建體，反義策略，針對(duì)VEGF的RNA適體以及低分子量VEGF受體酪氨酸激酶(RTK)抑制物均可用于干擾VEGF信號(hào)。見(jiàn)例如，Siemeister et al.Cancer Metastasis Rev.17241-248(1998)?？?VEGF中和抗體已經(jīng)顯示可抑制裸小鼠中多種人腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Kim et al.Nature362841-844(1993)；Warren et al.J.Clin.Invest.951789-1797(1995)；Borgstrm et al.Cancer Res.564032-4039(1996)；和Melnyk et al.Cancer Res.56921-924(1996))，并且也抑制缺血視網(wǎng)膜疾病中的眼內(nèi)血管生成(Adamis etal.Arch.Ophthalmol.11466-71(1996))。事實(shí)上，人源化的抗-VEGF抗體，bevacizumab(AVASTIN，Genentech)已經(jīng)得到US FDA的證實(shí)可作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。見(jiàn)例如，F(xiàn)errara et al.，Nature Reviews DrugDiscovery，3391-400(2004)。
            
然而，目前的癌癥治療方法不總是最優(yōu)化的。通常，單一類型的治療不能完全抑制病理疾病。例如，外科手術(shù)通常不能去除所有癌性生長(zhǎng)物。其它癌癥療法，諸如化療，有許多副作用，和/或治療由于例如癌癥對(duì)于藥物或治療產(chǎn)生抗性而變得無(wú)效。VEGF或VEGR受體或Tie2受體系統(tǒng)的抑制有時(shí)不能完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。見(jiàn)例如，Gerber et al.，Cancer Research，606253-6258(2000)；Ferrara et al.，Nature ReviewsDrug Discovery，3391-400(2004)；Millauer et al.，Nature 367，576-579(1994)；Kim et al.，Nature 362841-844(1993)；Millauer et al.，Cancer Res.561615-1620(1996)；Goldman etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 958795-8800(1998)；Asano et al.，CancerResearch，555296-5301(1995)；Warren et al.，J.Clin.Invest.，951789-1797(1995)；Fong et al.，Cancer Res.5999-106(1999)；Wedge et al.，Cancer Res.60970-975(2000)；Wood et al.Cancer Res.602178-2189(2000)；Siemeister etal.，Cancer Res.593185-3191(1999)；Lin et al.，J.Clin.Invest.103159-165(1999)；Lin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA958829-8834(1998)；and，Siemeister et al.，Cancer Res.59，3185-3191，(1999)。
            
因此，迫切需要新的且更為有效的調(diào)節(jié)癌癥的療法。本發(fā)明強(qiáng)調(diào)這些以及其它需要，其從以下公開(kāi)中顯而易見(jiàn)。
            

            發(fā)明內(nèi)容
            
本發(fā)明涉及血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)的抑制劑以及利用所述抑制劑治療疾病和病理情況的方法，例如阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)，阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)等。本發(fā)明提供ANGPTL4抑制劑與抗癌藥劑的組合，以及利用所述組合抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或涉及血管生成的疾病例如腫瘤形成(例如腫瘤生長(zhǎng))和非腫瘤形成疾病的方法。
            
ANGPTL4的調(diào)節(jié)物，例如ANGPTL4拮抗劑或激動(dòng)劑也在本發(fā)明提供。本發(fā)明的ANGPTL4拮抗劑是抑制或降低ANGPTL4活性的分子。ANGPTL4抑制劑包括小分子量物質(zhì)，多核苷酸，反義分子，RNA適體，針對(duì)ANGPTL4或其受體多肽的核酶，多肽，ANGPTL4的拮抗劑變體，分離的蛋白，重組蛋白，抗體，或其偶聯(lián)物或融合蛋白，所述抑制劑可直接或間接抑制ANGPTL4活性。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，拮抗劑ANGPTL4抗體是通過(guò)與ANGPTL4蛋白的特異性亞序列或區(qū)域結(jié)合來(lái)抑制或降低ANGPTL4活性的抗體，所述特異性亞序列活區(qū)域例如人ANGPTL4的N末端，N末端螺旋區(qū)，C末端，C末端纖維蛋白原樣區(qū)，或ANGPTL4(1-183)，ANGPTL4(23-183)，ANGPTL4(1到約162)，ANGPTL4(約162-406)，ANGPTL4(23-406)，或ANGPTL4(184-406)氨基酸亞序列，和/或鼠ANGPTL4的mANGPTL4(1-183)，mANGPTL4(23-183)，mANGPTL4(1到約165)，mANGPTL4(23到約165)，mANGPTL4(23-410)或mANGPTL4(184-410)氨基酸亞序列。其他序列還包括但不限于例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，和例如mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑包括抗-αVβ5抗體，例如拮抗劑抗-αVβ5抗體。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化抗體。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑是SiRNA分子。一個(gè)實(shí)施方案中，SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子，該分子靶向編碼ANGPTL4的核酸的DNA序列(例如，GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA)(SEQ ID NO3)。
            
提供了阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給藥腫瘤或癌細(xì)胞有效量的血管生成素4樣(ANGPTL4)拮抗劑。另一實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑是拮抗劑抗-αVβ5抗體。有效量阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。抑制腫瘤細(xì)胞遷移的方法也在本發(fā)明提供。例如，這樣的方法，包括將有效量的ANGPTL4拮抗劑給藥腫瘤細(xì)胞，由此抑制它們的遷移。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑的給藥抑制轉(zhuǎn)移。
            
其它治療劑，例如一或多種抗癌藥劑，針對(duì)相同或不同抗原的多重抗體，一或多種抗血管生成藥劑或抑制劑，疼痛藥物等可與ANGPTL4拮抗劑聯(lián)用和/或一起給藥。其它治療方法，例如手術(shù)方法，放射療法等也可在本發(fā)明的方法中或與本發(fā)明的組合物一起聯(lián)用和/或給藥腫瘤和/或癌細(xì)胞。本發(fā)明還提供聯(lián)用組合物，例如包括抗癌藥劑(例如，抗血管生成藥劑，等)，ANGPTL4拮抗劑，和載體(例如可藥用載體)的組合物。
            
抗癌藥劑包括但不限于，例如本領(lǐng)域抑制的抗癌藥劑以及本文描述的那些。一些實(shí)施方案中，抗癌藥劑包括一或多種抗血管生成藥劑，例如VEGF拮抗劑和抑制物等。一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑包括抗-VEGF抗體或其活性片段(例如人源化的A4.6.1，Avastin，等)。一些實(shí)施方案中，抗癌藥劑包括一或多種化療劑。
            
也提供了阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的聯(lián)用療法。一些實(shí)施方案中，所述方法包括給藥腫瘤或癌細(xì)胞有效量的抗癌藥劑，以及給藥腫瘤或癌細(xì)胞有效量的tANGPTL4拮抗劑?？蛇x或此外，可給藥包含有效量抗癌藥劑(例如抗血管生成藥劑等)和有效量ANGPTL4拮抗劑的聯(lián)用組合物。聯(lián)用的有效量阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
            
阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法也在本發(fā)明提供。本發(fā)明一些實(shí)施方案中，受試者曾經(jīng)或正在接受利用至少一種抗癌藥劑進(jìn)行的癌癥療法，并且給藥受試者有效量的ANGPTL4拮抗劑。給藥有效量的ANGPTL4拮抗劑阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。一些實(shí)施方案中，受試者曾經(jīng)或正在接受利用ANGPTL4拮抗劑進(jìn)行的癌癥療法，并且給藥受試者有效量的抗癌藥劑(例如抗血管生成藥劑)，給藥有效量的抗癌藥劑阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
            
通常，腫瘤或癌細(xì)胞在受試者內(nèi)。一些實(shí)施方案中，受試者曾經(jīng)或正在接受利用至少一種抗癌藥劑進(jìn)行的癌癥療法。通常，受試者是哺乳動(dòng)物(例如人)。一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥劑給藥受試者。給藥或方法步驟可以任何順序進(jìn)行。一個(gè)實(shí)施方案中，它們依次進(jìn)行。另一實(shí)施方案中，它們同時(shí)進(jìn)行?？蛇x或此外，所述步驟作為依次和同時(shí)的組合，以任何順序進(jìn)行。
            
還提供了ANGPTL4調(diào)節(jié)物的試劑盒。一些實(shí)施方案中，試劑盒包含ANGPTL4拮抗劑，可藥用載體，遞送物或稀釋劑和容器。一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含第一量的抗癌藥劑(例如抗血管生成藥劑等)，第二量的ANGPTL4拮抗劑以及可藥用載體、遞送物或稀釋劑，和容器。另一實(shí)施方案中，試劑盒包含一定量的抗癌藥劑(例如抗血管生成藥劑等)，以及可藥用載體、遞送物或稀釋劑，上述物質(zhì)為第一單位劑量形式；一定量的ANGPTL4拮抗劑以及可藥用載體、遞送物或稀釋劑，上述物質(zhì)為第二單位劑量形式；和容器。它們的使用說(shuō)明也包含在其中。
            
附圖簡(jiǎn)述
            

            
圖1顯示人ANGPTL4的核酸序列(SEQ ID NO1)。
            
圖2顯示人ANGPTL4的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
            
圖3，圖A顯示純化的重組鼠ANGPTL4(23-410)，其在存在(10mM)或缺失二硫蘇糖醇(DTT)的條件下在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(4-20％)上分離。圖3，圖B顯示野生型(泳道1)和變體hANGPTL4(泳道2)，其在SDS凝膠上分離并通過(guò)western印跡檢出，其中變體hANGPTL4具有取代R162G和R164E。
            
圖4，圖A，B，和C圖示通過(guò)利用ANGPTL4表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，以及通過(guò)ANGPTL4表達(dá)構(gòu)建體(2)轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS細(xì)胞(C)的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(圖C)，ANGPTL4刺激A673腫瘤細(xì)胞(圖A和B)以及U87MG腫瘤細(xì)胞(圖B)增殖。圖B中，腫瘤細(xì)胞利用(1)AdLacZ表達(dá)構(gòu)建體對(duì)照，(2)Ad-ANGPTL4表達(dá)構(gòu)建體或(3)Ad-SiRNA ANGPTL4構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖C中，A673腫瘤細(xì)胞增殖通過(guò)來(lái)自Hepa(A)，HMVEC(B)或利用(1)LacZ表達(dá)構(gòu)建體，(2)ANGPTL4表達(dá)構(gòu)建體或(3)ANGPTL3表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS細(xì)胞(C)的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基進(jìn)行。
            
圖5圖示了mANGPTL4涂覆于培養(yǎng)皿時(shí)促進(jìn)A673增殖。
            
圖6，圖A和B圖示了結(jié)合A673腫瘤細(xì)胞的ANGPTL4的各種形式(圖A)以及各種條件下的情況(圖B)。
            
圖7，圖A和B圖示了利用含有ANGPTL4的培養(yǎng)基，生長(zhǎng)7天(圖A)或4天(圖B)時(shí)，A673的增殖。圖A中，(1)是AdLacZ表達(dá)構(gòu)建體對(duì)照，(2)是Ad-hANGPTL4表達(dá)構(gòu)建體，(3)是AdLacZ表達(dá)構(gòu)建體和rmANGPTL4。圖B中，(1)是沒(méi)有添加，(2)是緩沖液對(duì)照，(3)mANGPTL4(2.5μg/ml)，(4)是hANGPTL4(2.5μg/ml)，(5)是hIgG-hANGPTL4(2.5μg/ml)，(6)hIgG-mANGPTL4(2.5μg/ml)。
            
圖8，圖A，B和C圖示了ANGPTL4促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)(圖A和圖B)，以及逃離抗腫瘤治療的趨勢(shì)，例如利用抗-VEGF抗體(AVASTIN(Genentech，South San Francisco))，在腫瘤中利用腺病毒-Angptl4構(gòu)建體腫瘤內(nèi)給藥(圖C)。圖A和C顯示腫瘤植入后腫瘤體積(cm3)相對(duì)于天數(shù)的變化。圖B顯示植入20天后，異種移植的A673腫瘤的重量。
            
圖9顯示ANGPTL4誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，A673和4T-1的細(xì)胞遷移，其中(1)沒(méi)有添加血清，(2)10％胎牛血清(FCS)，(3)PDGF-BB，和(4)ANGPTL4。
            
圖10，圖A和B顯示抗-hANGPTL4抗體抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，例如圖A(HeLa-S3和Caki細(xì)胞)以及圖B(U87M G，293和A673 cells)，其中(1)抗-hANGPTL4抗體，(2)抗-down綜合征(anti-down syndrome)關(guān)鍵區(qū)1蛋白(Dscr)抗體對(duì)照，和(3)沒(méi)有添加物質(zhì)，其中條狀圖下方的數(shù)目表示抗體濃度(μg/ml)。
            
圖11顯示293-1953(αVβ5)細(xì)胞粘附于ANGPTL4或玻連蛋白包被的板，其濃度在下方表示(μg/ml)，BSA用作對(duì)照。
            
圖12顯示抗-αVβ5和抗-hANGPTL4抗體消除ANGPTL4細(xì)胞粘附活性，其中(1)BSA，(2)玻連蛋白，(3)ANGPTL4。
            
圖13，圖A，B，C，D和E顯示ANGPTL4與整合素αVβ5的結(jié)合。圖A顯示利用說(shuō)明的量的蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)結(jié)合αVβ5包被的板。圖B顯示抗-hANGPTL4抗體抑制蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)與αVβ5包被的板的結(jié)合。消除ANGPTL4細(xì)胞粘附活性，其中(1)是BSA，(2)是玻連蛋白，(c)是m ANGPTL4。圖C顯示ANGPTL4與αVβ的結(jié)合，其中(1)包被在板上的hANGPTL4-C末端，(2)包被在板上并與抗hANGPTL4一起保溫的hANGPTL4-C末端，(3)包被在板上并與抗-Dscr一起保溫的hANGPTL4-C末端，(4)包被在板上的玻連蛋白，(5)包被在板上的BSA，所述情況為添加αVβ5之前的情況。
            
詳細(xì)描述定義具體描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體的組合物或生物系統(tǒng)，其當(dāng)然可變化。也應(yīng)理解本文術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述具體的實(shí)施方案，并不用作限制。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，單數(shù)形式“一”，“一種”，“該”包括復(fù)數(shù)含義，除非另外明確說(shuō)明。因此，例如“一種分子”可選包括兩或多個(gè)所述分子的組合。除非另有定義，所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為與它們所述技術(shù)領(lǐng)域所用的常見(jiàn)含義相同。為了本發(fā)明的目的，在下文描述了以下術(shù)語(yǔ)。
            
術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4或“Angptl4”指血管生成素-樣4多肽或蛋白，以及其天然存在的等位基因形式、分泌的形式以及加工的形式。例如，人ANGPTL4是406氨基酸的蛋白，而小鼠ANGPTL4是410氨基酸的蛋白。術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4”也指該多肽的片段(例如亞序列，截?cái)嗟男问降?，包括例如N末端片段，螺旋區(qū)，C末端片段，纖維蛋白原樣區(qū)，人血管生成素樣4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到約162，23到約162，23-406，184-406，約162-406，或23-184，以及鼠血管生成素樣4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到約165，23到約165，23-410，或184-410。其他片段包括但不限于，例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，和例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。ANGPTL4的任何所述形式的參考也可在本申請(qǐng)中鑒定，例如，通過(guò)“ANGPTL4(23-406)，”“ANGPTL4(184-406)，”“ANGPTL4(23-183)，”“mANGPTL4(23-410)，”“mANGPTL4(184-410)，”等，其中m表示鼠序列。天然ANGPTL4片段的氨基酸位置根據(jù)在其天然ANGPTL4中的位置編號(hào)。例如，ANGPTL4片段中的氨基酸位置22(Ser)也是天然人ANGPTL4中的位置22(Ser)。例如參見(jiàn)圖2?？傮w來(lái)看，天然ANGPTL4片段具有生物活性。
            
術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4調(diào)節(jié)物”指可活化ANGPTL4或其表達(dá)的分子例如激動(dòng)劑或者可抑制ANGPTL4的活性或其表達(dá)的分子例如拮抗劑(或抑制劑)。ANGPTL4激動(dòng)劑包括抗體和活性片段。ANGPTL4拮抗劑指能中和、阻斷、抑制、消除，降低或干擾ANGPTL4活性(例如細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)、遷移、粘附或代謝例如脂質(zhì))，調(diào)節(jié)或其表達(dá)包括其與ANGPTL4受體例如，αVβ5的結(jié)合的分子。ANGPTL4拮抗劑包括例如抗ANGPTL4抗體和其抗原結(jié)合片段，受體分子以及特異性結(jié)合ANGPTL4由此隔絕其與一或多個(gè)受體的結(jié)合的衍生物，抗-ANGPTL4受體抗體和ANGPTL4受體拮抗劑諸如受體的小分子抑制物。其他ANGPTL4拮抗劑也包括ANGPTL4的拮抗劑變體，反義分子(例如ANGPTL4-SiRNA)，RNA適體，以及針對(duì)ANGPTL4或其受體的核酶。一些實(shí)施方案中，拮抗劑ANGPTL4抗體是通過(guò)與ANGPTL4的特異性亞序列或區(qū)域結(jié)合而抑制或降低ANGPTL4活性的抗體，所述亞序列或區(qū)域例如N末端片段，螺旋區(qū)，C末端片段，纖維蛋白原樣區(qū)，人血管生成素樣4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到約162，23到約162，23-406，184-406，約162-406或23-184，鼠血管生成素樣4蛋白的1-183，23-183，1到約165，23到約165，23-410，或184-410。其他亞序列還包括但不限于，例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。
            
術(shù)語(yǔ)“抗-ANGPTL4抗體”是以足夠的親和力和特異性結(jié)合ANGPTL4的抗體。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-ANGPTL4抗體可用作靶向和干預(yù)與ANGPTL4活性有關(guān)的疾病和病癥的治療劑。通常，抗-ANGPTL4抗體不結(jié)合其他ANGPTL4同系物，例如，ANGPTL3。
            
術(shù)語(yǔ)″VEGF″和“VEGF-A”可互換使用，意指165個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞因子和相關(guān)的121-，145-，183-，189-，和206-氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如Leung et al.Science，2461306(1989)，Houck et al.Mol.Endocrin.，51806(1991)，和Robinson & Stringer，Journal of Cell Science，144(5)853-865(2001)所述，以及其天然存在的等位基因和加工的形式。術(shù)語(yǔ)“VEGF”也指多肽的片段，例如包含165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸8-109的片段。任何所述形式的VEGF在本發(fā)明中可稱為例如“VEGF(8-109)，”“VEGF(1-109)”或“VEGF165”。“片段”天然VEGF的氨基酸位置根據(jù)天然VEGF序列中所示的進(jìn)行編號(hào)。例如，片段活性VEGF的氨基酸位置17(蛋氨酸)也是天然VEGF中的位置17(蛋氨酸)。片段活性VEGF與天然VEGF相比對(duì)KDR和/或Flt-1具有結(jié)合親和力。
            
“抗-VEGF抗體”是以足夠的親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。本發(fā)明的抗-VEGF抗體可用作靶向并干擾與VEGF活性有關(guān)的疾病或病癥的治療劑。抗-VEGF抗體通常不結(jié)合其它VEGF同系物諸如VEGF-B或VEGF-C，也不結(jié)合其它生長(zhǎng)因子諸如PlGF，PDGF或bFGF。見(jiàn)例如，U.S.Patents6,582,959，6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP0666868B1；美國(guó)專利申請(qǐng)20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288149-164(2004)；以及Attorney Docket number P2072R1。抗-VEGF抗體“Bevacizumab(BV)”也已知為“rhuMAb VEGF”或“AvastinTM”，其為重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，根據(jù)Presta et al.Cancer Res.574593-4599(1997)產(chǎn)生。其包括突變的人IgG1框架區(qū)以及阻斷人VEGF與其受體的結(jié)合的小鼠抗-hVEGF單克隆抗體A4.6.1的抗原結(jié)合互補(bǔ)決定區(qū)。Bevacizumab大約9.3％的氨基酸序列包括大部分框架區(qū)，源自人IgG1，大約7％的序列源自鼠抗體A4.6.1。Bevacizumab的分子量為大約149,000并且是糖基化的。Bevacizumab以及其它人源化的抗-VEGF抗體在2005-2-26提交的美國(guó)專利6,884,879中進(jìn)一步描述。
            
“VEGF拮抗劑”指能中和、封閉、抑制、消除、減小或干擾VEGF活性包括其與一或多種VEGF受體的結(jié)合的分子。VEGF拮抗劑包括抗-VEGF抗體和其抗原結(jié)合片段，受體分子以及特異性集合阿VEGF由此鎖定與一或多種受體的結(jié)合的衍生物，抗-VEGF受體抗體以及VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制物，以及融合蛋白，例如VEGF-Trap(Regeneron)，VEGF121-gelonin(Peregine)。VEGF拮抗劑還包括VEGF的拮抗劑變體，針對(duì)VEGF的反義分子，RNA適體，以及針對(duì)VEGF或VEGF受體的核酶。
            
“天然序列”多肽包括具有與源自自然的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽具有來(lái)自任何哺乳動(dòng)物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可分離自自然或可通過(guò)重組或合成手段產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列”多肽具體包括該多肽的天然存在的截短或分泌的形式(例如細(xì)胞外區(qū)序列)，天然存在的變體形式(例如可選拼接的形式)，以及天然存在的等位基因變體。
            
“多肽鏈”是其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域都通過(guò)肽鍵(與共價(jià)作用或二硫鍵不同)與其他結(jié)構(gòu)域相連的多肽。
            
多肽“變體”指與相應(yīng)的天然序列多肽具有至少約80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽或其片段。所述變體包括例如，在所述多肽的N和/或C末端添加或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸)的多肽。通常，變體與天然序列多肽或其片段具有至少約80％氨基酸序列同一性，或至少約90％氨基酸序列同一性，或至少約95％或更高的氨基酸序列同一性。變體也包括天然序列的多肽片段(例如亞序列，截短等)，通常具有生物活性。
            
本文的“氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)(％)”定義為對(duì)位排列該序列且按需要導(dǎo)入間隔以達(dá)到最大序列相同性百分?jǐn)?shù)后與所選序列中氨基酸殘基相同的候選序列氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，且任何保守取代都不作為該序列相同性的一部分。以測(cè)定氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)為目的的序列對(duì)比可按本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法完成，例如，使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測(cè)量序列對(duì)比的合適參數(shù)，包括在所比較的序列全長(zhǎng)上達(dá)到最大對(duì)位排列所需的任何算法。然而，為達(dá)到本文目的，氨基酸序列相同性值％可通過(guò)使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2按下文所述獲得，其中圖4A-Q提供了ALIGN-2程序的全部源代碼。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech，Inc.創(chuàng)作且圖4A-Q所示的源代碼在美國(guó)版權(quán)局，華盛頓區(qū)，20559以用戶文件存檔，以美國(guó)版權(quán)登記號(hào)TXU510087登記。ALIGN-2程序通過(guò)Genentech，Inc.，South San Francisco，California可公開(kāi)得到或者可從圖4A-Q提供的源代碼編譯。編譯ALIGN-2程序應(yīng)基于UNIX操作系統(tǒng)平臺(tái)，優(yōu)選數(shù)字UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不改變。
            
為達(dá)到本文目的，給定氨基酸序列A與，和，或者對(duì)給定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(任選可表述為具有或者包含與，和，或者對(duì)給定氨基酸序列B的某一氨基酸序列相同性％的給定氨基酸序列A)計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是通過(guò)序列對(duì)比程序ALIGN-2在A和B經(jīng)該程序進(jìn)行序列對(duì)比中評(píng)分為相同性匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。可預(yù)料到如果氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等時(shí)，A與B的氨基酸序列相同性％不等于B與A的氨基酸序列相同性％。
            
術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4變體”在本文中用于指上述變體和/或在天然ANGPTL4序列中包括一或多個(gè)氨基酸突變的ANGPTL4。可選，所述一或多個(gè)氨基酸突變包括一或多個(gè)氨基酸取代。本發(fā)明所用的ANGPTL4及其變體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備。ANGPTL4的氨基酸序列變體可通過(guò)在ANGPTL4DNA中進(jìn)行突變來(lái)制備。所述變體中包括，例如，在ANGPTL4的氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代，例如保藏號(hào)為ATCC 209284的核酸編碼的人氨基酸序列，或如圖2所示?？蛇M(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合以獲得具有所需活性的最終構(gòu)建體。編碼所述變體內(nèi)的突變必需不能位于讀碼框內(nèi)并優(yōu)選不產(chǎn)生可產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。EP 75,444A。
            
ANGPTL4變體可選通過(guò)在編碼天然ANGPTL4的DNA中進(jìn)行定點(diǎn)誘變或噬菌體展示技術(shù)來(lái)制備，由此產(chǎn)生編碼所述變體的DNA，并由此在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA。
            
預(yù)先確定導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)后，所述突變本身無(wú)需預(yù)確定。例如，為優(yōu)化突變?cè)诮o定位點(diǎn)的表現(xiàn)，可在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變并篩選表達(dá)的ANGPTL4變體以獲得所需活性的優(yōu)選組合。在序列已知的DNA中的預(yù)先確定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是已知的，諸如例如定點(diǎn)誘變。本文所述的ANGPTL4變體的制備可通過(guò)噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)，諸如PCT WO00/63380公開(kāi)中描述的那些。
            
選出所述克隆以后，可去除突變的蛋白區(qū)域并置于適宜載體中以產(chǎn)生蛋白，通常可采用可用于轉(zhuǎn)化適宜宿主的表達(dá)載體類型。
            
氨基酸序列缺失通常約1-30個(gè)殘基，優(yōu)選1-10個(gè)殘基，優(yōu)選1-5或更少個(gè)殘基，通常是連續(xù)的。
            
氨基酸序列缺失包括一個(gè)殘基到基本上長(zhǎng)度不受限制的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。序列內(nèi)插入(即天然ANGPTL4序列內(nèi)的插入)可從約1-10個(gè)殘基，可選1-5，或可選1-3個(gè)殘基。末端插入的實(shí)例包括單個(gè)序列與N末端的融合，而無(wú)論該單個(gè)序列是與宿主細(xì)胞異源還是同源，所述融合促進(jìn)自重組宿主的分泌。
            
其他ANGPTL4變體是天然ANGPTL4中的至少一個(gè)氨基酸序列被去除并在其位置插入不同的殘基的那些。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4變體包括ANGPTL4的162和/或164的取代或mANGPTL4的169的取代。所述取代可根據(jù)表1中所示的那些進(jìn)行。ANGPTL4變體也可包括本文描述的非天然氨基酸。
            
氨基酸可根據(jù)它們側(cè)鏈性質(zhì)的相似性分組(在A.L.Lehninger，inBiochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)中)(1)非極性Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)(2)不帶電的極性Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)(3)酸性Asp(D)，Glu(E)(4)堿性Lys(K)，Arg(R)，His(H)可選，天然存在的殘基可根據(jù)共有的側(cè)鏈特性分成幾組(1)疏水型正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水型cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；  
            
(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈方向的殘基gly，pro；和(6)芳香基trp，tyr，phe。
            
表1  
            
     
            
“天然存在的氨基酸殘基”(即遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)可選自下組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢背松厦媪谐龅奶烊淮嬖诘陌被釟埢臍埢?，其能共價(jià)結(jié)合于多肽鏈內(nèi)的相鄰氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸殘基的實(shí)例包括例如正亮氨酸，鳥(niǎo)氨酸，正纈氨酸，同型絲氨酸和其他氨基酸殘基同系物，諸如Ellman et al.Meth.Enzym.202301-336(1991) & US專利申請(qǐng)公開(kāi)20030108885和20030082575中描述的那些。簡(jiǎn)而言之，這些方法涉及利用非天然存在的氨基酸殘基活化阻遏物tRNA然后進(jìn)行RNA的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。見(jiàn)例如，US專利申請(qǐng)公開(kāi)20030108885和20030082575；Noren etal.Science 244182(1989)；和Ellman et al.，supra。
            
“分離的”多肽是指從其天然環(huán)境成份中鑒定和分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染成份是可能干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，且可能包括酶，激素，和其它蛋白型或非蛋白型溶質(zhì)。在一些的實(shí)施方案中，該多肽可純化成(1)按勞里(Lowry)方法測(cè)定的多肽重量超過(guò)95％，且最優(yōu)選重量超過(guò)99％，(2)其純化程度足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列，或(3)在還原型或非還原型條件下進(jìn)行SDS-PAGE并使用考馬斯藍(lán)或者，優(yōu)選銀染測(cè)定具有同質(zhì)性。該分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)樵摱嚯奶烊画h(huán)境中的至少一種成份不存在。然而，一般來(lái)說(shuō)，分離的多肽由至少一個(gè)純化步驟制備。
            
這里的術(shù)語(yǔ)“抗體”用其最廣泛的意義，尤其包含完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及能顯示所需生物學(xué)活性的任何抗體片段。
            
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“多價(jià)抗體”在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中指包含三個(gè)和多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。多價(jià)抗體通常經(jīng)改造具有三個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并通常不是天然序列IgM或IgA抗體。
            
“抗體片段”包括完整抗體的僅僅一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)并由此保持了結(jié)合抗原的能力。本發(fā)明定義包括的抗體片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1區(qū)；(ii)Fab’片段，其為在CH1區(qū)的C末端具有一或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1區(qū)；(iv)Fd’片段，其具有VH和CH1區(qū)并在CH1區(qū)的C末端具有一或多個(gè)半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單個(gè)臂的VL和VH區(qū)；(vi)dAb片段(Ward et al.，Nature 341，544-546(1989))，其含有VH區(qū)；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab′)2片段，包括兩個(gè)通過(guò)鉸鏈區(qū)二硫橋連接的兩個(gè)Fab’片段的二價(jià)片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv；scFv)(Bird et al.，Science242423-426(1988)；and Huston et al.，PNAS(USA)855879-5883(1988))；(x)“二價(jià)抗體”，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，包括連接于位于相同多肽鏈中的輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)(見(jiàn)例如，EP 404,097；WO 93/11161；andHollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))；(xi)“線性抗體”，其包括一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它們與互補(bǔ)輕鏈多肽在一起形成了一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)(Zapata et al.Protein Eng.8(10)1057 1062(1995)；美國(guó)專利5,641,870)。
            
本文中術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從實(shí)質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個(gè)抗體除了可能自然發(fā)生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優(yōu)勢(shì)還在于，它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)而合成的，無(wú)其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)“單克隆的”指抗體獲自實(shí)質(zhì)上均一的抗體群的特征，不應(yīng)理解為需要由任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或用重組DNA法(如美國(guó)專利4,816,567)來(lái)制備?！皢慰寺】贵w”還可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)所述技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離得到。
            
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來(lái)自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，鏈的其余部分等同于或同源于來(lái)自其它物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，只要它們展示所需生物學(xué)活性(見(jiàn)美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，816851-6855(1984))。本文的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)源化(primatized)”抗體，其包含源于非人靈長(zhǎng)類可變區(qū)的抗原結(jié)合序列(如Old World Monkey，如狒狒，獼猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定區(qū)序列(美國(guó)專利5,693,780)。
            
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和容量(capacity)的高變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步改進(jìn)抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)完整可變區(qū)，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白、通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。詳見(jiàn)Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
            
“人抗體”是一種這樣的抗體，其氨基酸序列對(duì)應(yīng)于由人產(chǎn)生的和/或已使用如本文所公開(kāi)的用于制備人抗體的任何方法制備的抗體的氨基酸序列。此人抗體的定義具體地排除了含有非人抗原-結(jié)合殘基的人源化的抗體。可使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體選自噬菌體文庫(kù)，其中該噬菌體文庫(kù)表達(dá)人抗體(Vaughan等，Nature Biotechnology，14309-314(1996)；Sheets等，PNAS(USA)，956157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991))。人抗體也可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備，例如，內(nèi)源的免疫球蛋白基因已被部分地或全部失活的小鼠。一旦激發(fā)，觀察到人抗體產(chǎn)生，這在各個(gè)方面十分類似于在人中所見(jiàn)的情況，包括基因重排、組裝和抗體庫(kù)(antibody repertoire)。此方法在，例如，美國(guó)專利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和在Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-813(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)中描述?？蛇x，人抗體可通過(guò)產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的抗體的人B-淋巴細(xì)胞的無(wú)限增殖(immortalization)來(lái)制備(所述B淋巴細(xì)胞可從個(gè)體回收或可在體外被免疫)。參見(jiàn)，例如，Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；和US Pat No.5,750,373。
            
術(shù)語(yǔ)“可變的”是指不同抗體的可變區(qū)特定部分序列差異很大，且這些部分在每種抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性中有用。然而在抗體整個(gè)可變區(qū)中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個(gè)被稱為高變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)的更高度保守部分被稱為框架區(qū)(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別包含四個(gè)FR，它們大多采用β片層構(gòu)象，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)相連，這些高變區(qū)形成環(huán)狀，有時(shí)形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的高變區(qū)通過(guò)FR緊密連接，并與其他鏈的高變區(qū)共同形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體對(duì)抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)功能，如使抗體參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。
            
本文中術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)含有“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基是除本文所定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
            
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同的類型。有5種主要的免疫球蛋白類型IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，其中的一些可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。相應(yīng)于免疫球蛋白不同類型的重鏈恒定區(qū)分別稱為α，δ，ε，γ和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。
            
來(lái)自任一脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可稱為κ(6)和λ(8)這兩個(gè)明顯不同的類型之一。
            
術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”用于定義可通過(guò)用木瓜蛋白酶消化完整抗體產(chǎn)生的免疫球蛋白重鏈C末端區(qū)。Fc區(qū)可為天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的范圍可變，人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為從大約位置Cys22或大約位置Pro2306的氨基酸殘基到Fc區(qū)的羧基末端。免疫球蛋白的Fc區(qū)通常包括兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，并可選包括CH4結(jié)構(gòu)域。
            
“Fc區(qū)鏈”在本文意指Fc區(qū)的兩個(gè)多肽鏈之一。
            
人IgG Fc區(qū)的“CH2結(jié)構(gòu)域”(也稱為“Cg2″結(jié)構(gòu)域)通常從大約位置231的氨基酸殘基延伸到大約位置340的氨基酸殘基。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特之處在于其與其他結(jié)構(gòu)域并不緊密配對(duì)。兩個(gè)N連接的分支碳水化合物鏈位于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。推測(cè)該碳水化合物提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的取代基并有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。CH2結(jié)構(gòu)域在本文可為天然序列CH2結(jié)構(gòu)域或變體CH2結(jié)構(gòu)域。
            
“CH3結(jié)構(gòu)域”包括Fc區(qū)中C末端殘基到CH2結(jié)構(gòu)域的片段(即從IgG大約位置341的氨基酸殘基到大約位置447的氨基酸殘基)。本文的CH3結(jié)構(gòu)域天然序列CH3結(jié)構(gòu)域或變體CH3結(jié)構(gòu)域(例如在一條鏈中具有導(dǎo)入的“突起(protroberance)”以及位于另一條鏈中的相應(yīng)的導(dǎo)入的”空腔”的CH3，見(jiàn)美國(guó)專利5,821,333，包含在此作為參考)。所述變體CH3結(jié)構(gòu)域可用于如本文所述制備多特異性(例如雙特異性)抗體。
            
“鉸鏈區(qū)”通常被定義為人IgG1中從Glu216到Pro230的區(qū)域(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可與IgG1的序列對(duì)比排列，即對(duì)齊在相同位置形成重鏈之鏈間二硫鍵的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基。本發(fā)明的鉸鏈區(qū)可為天然序列鉸鏈區(qū)或變體鉸鏈區(qū)。變體鉸鏈區(qū)的兩個(gè)多肽鏈通常保持每個(gè)多肽鏈至少一個(gè)半胱氨酸殘基，使得變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈可形成這兩條鏈間的二硫鍵。本發(fā)明優(yōu)選的鉸鏈區(qū)是天然序列人鉸鏈區(qū)，例如天然序列人IgG1鉸鏈區(qū)。
            
“功能Fc區(qū)”具有天然序列Fc區(qū)的至少一種“效應(yīng)功能”。示例性“效應(yīng)功能”包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒(CDC)；Fc受體結(jié)合；抗體-依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體；BCR)等。所述效應(yīng)功能通常需要Fc區(qū)以便與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)結(jié)合并可利用本領(lǐng)域已知用于評(píng)估所述抗體效應(yīng)功能的各種實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估。
            
“天然序列Fc區(qū)”包括與天然Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
            
“變體Fc區(qū)”包括由于至少一種氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)不同的氨基酸序列。優(yōu)選，變體Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)相比在天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)中具有至少一個(gè)氨基酸取代，例如從約1-10個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選約1-5個(gè)氨基酸取代。本文的變體Fc區(qū)通常與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)具有例如至少約80％的序列同一性，或至少約90％的序列同一性，或至少約95％或更高的序列同一性。
            
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγR III，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)，464頁(yè)的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，如美國(guó)專利5,500,362號(hào)或5,821,337號(hào)中所述。這類試驗(yàn)中有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。任選或另外，目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評(píng)估，例如在Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)公開(kāi)的動(dòng)物模型中。
            
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)物的功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞表達(dá)至少FcγR III并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物的功能。例如可介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞包括人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可分離自其天然來(lái)源，例如如本文所述分離自血液和PBMC。
            
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的受體(γ受體)，其包括FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III亞型，以及這些受體的等位基因變體和可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγR IIB(“抑制型受體”)，二者的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在其胞漿結(jié)構(gòu)域。活化型受體FcγR IIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見(jiàn)Daeron，免疫學(xué)年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫學(xué)方法)425-34(1994)；和de Haas等，實(shí)驗(yàn)室及臨床醫(yī)學(xué)雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對(duì)FcR進(jìn)行了綜述。其它FcR，包括將來(lái)被確定的，均被包含在術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)也包括新生期的受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志24249(1994))。
            
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”是指在補(bǔ)體存在時(shí)分子裂解標(biāo)靶的能力。補(bǔ)體活化途徑由補(bǔ)體系統(tǒng)第一個(gè)成分(C1q)結(jié)合至一個(gè)與同源抗原形成化合物的分子(如抗體)來(lái)啟動(dòng)。為評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法雜志202163(1996)所述進(jìn)行CDC試驗(yàn)。
            
“親和性-成熟的”抗體是在其一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一或多種變化的抗體，所述變化導(dǎo)致所述抗體與對(duì)應(yīng)的不具有那些變化的親代抗體相比，前者對(duì)于抗原的親和性改進(jìn)。優(yōu)選的親和性-成熟的抗體將具有納摩爾的或甚至皮摩爾的靶抗原親和性。通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生親和性-成熟的抗體。Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)描述了通過(guò)VH和VL域重排的親和性成熟(affinity maturation)。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)突變由Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，913809-3813(1994)；Schier等，Gene，169147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.，1551994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)3310-3319(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)描述。
            
本發(fā)明中“柔性接頭”指包含通過(guò)肽鍵相連并由此提供的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽，這為所連接的兩個(gè)肽(諸如兩個(gè)Fd區(qū))提供了更多的旋轉(zhuǎn)自由度。所述旋轉(zhuǎn)自由度允許該柔性接頭連接的兩個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)更有效地接近靶抗原。適宜的柔性接頭肽序列包括gly-ser，gly-ser-gly-ser，ala-ser，和gly-gly-gly-ser。
            
“二聚化結(jié)構(gòu)域”通過(guò)將至少兩個(gè)氨基酸殘基(通常為半胱氨酸殘基)或至少兩個(gè)肽或多肽(其可具有相同或不同的氨基酸序列)相連而形成。所述肽或多肽可通過(guò)共價(jià)和/或非共價(jià)結(jié)合相互作用。本發(fā)明二聚化結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括Fc區(qū)；鉸鏈區(qū)；CH3結(jié)構(gòu)域；CH4結(jié)構(gòu)域；CH1-CL對(duì)；具有改造的“把手(knob)和/或突起(protruberance)的“界面”，如美國(guó)專利5,821,333所描述的那樣，該文獻(xiàn)包含在本文作為參考；亮氨酸拉鏈(例如jun/fos亮氨酸拉鏈，見(jiàn)Kostelney et al.，J.Immunol.，1481547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(duì)(例如，白介素-8受體(IL-8R)；以及整合素異源二聚體諸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)，或其二聚化區(qū)；二聚體配體多肽(例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，神經(jīng)生長(zhǎng)蛋白(neurotrophin)-3(NT-3)，白介素-8(IL-8)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，VEGF-C，VEGF-D，PDGF成員，以及腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)；見(jiàn)Arakawa et al.J.Biol.Chem.269(45)27833-27839(1994)和Radziejewski et al.Biochem.32(48)1350(1993))，或其二聚化區(qū)；能形成二硫鍵的半胱氨酸殘基對(duì)；肽或多肽對(duì)，每個(gè)都包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基(例如大約1，2或3到約10個(gè)半胱氨酸殘基)使得肽或多肽之間可形成二硫鍵(此后稱為“合成鉸鏈)；和抗體可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明最優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。
            
抗體的“功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)”是能靶向抗原的位點(diǎn)。抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力不必要和該抗原結(jié)合位點(diǎn)所來(lái)源的親本抗體一樣強(qiáng)，但是結(jié)合抗原的能力必須能夠利用已知用于評(píng)估抗體與抗原的結(jié)合的多種方法之一測(cè)定。此外，本發(fā)明的多價(jià)抗體的每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力無(wú)需在量上相同。對(duì)于本發(fā)明的多體抗體，功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量可利用超速離心分析來(lái)評(píng)估。根據(jù)該分析方法，靶抗原與多體抗體可以不同比例組合并且可推定不同的功能性結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量來(lái)計(jì)算復(fù)合體的平均分子量。將這些理論數(shù)值與獲得的實(shí)際試驗(yàn)數(shù)值相比較以評(píng)估功能性結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。
            
具有規(guī)定抗體的“生物學(xué)特征”的抗體是具有這樣的一或多種抗體生物學(xué)特征之一的抗體，所述特征使得其與其他結(jié)合于相同抗原的抗體相區(qū)分。
            
為了篩選結(jié)合目的抗體所結(jié)合的抗原上的表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)諸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所述。
            
“聯(lián)用”一或多種其他治療劑給藥包括同時(shí)(同時(shí)發(fā)生的)和/或以任何順序序貫給藥。
            
用于治療的“哺乳動(dòng)物”指任何分類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園的動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物或?qū)櫸铮T如狗、馬、貓、牛、羊、豬等。通常，所述哺乳動(dòng)物是人。
            
“疾病”是任何將從利用本發(fā)明的分子的治療受益的疾病。包括慢性和急性疾病或包括使得哺乳動(dòng)物易患目的疾病的那些病理情形的疾病。本發(fā)明待治療的疾病的非限制性實(shí)例包括任何形式的腫瘤，良性和惡性腫瘤；血管化的腫瘤；肥大；白血病和淋巴惡性疾?。簧窠?jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞，下丘腦和其他腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)以及blastocoelic疾病；和炎性、血管生成性和免疫性疾病，由于不適當(dāng)、異常、過(guò)度和/或病理性血管化和/或血管通透性導(dǎo)致的血管疾病。
            
術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”指有效治療哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥的藥物的量。對(duì)于癌癥，有效量的藥物可減少癌細(xì)胞的數(shù)量；減小腫瘤體積；抑制(即在一定程度上減慢并通常停止)癌細(xì)胞對(duì)周圍器官的浸潤(rùn)；在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在一定程度上緩解與所述疾病相關(guān)的一或多種癥狀。就藥物可預(yù)防癌細(xì)胞生長(zhǎng)或殺滅現(xiàn)存的癌細(xì)胞而言，其可為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥治療，體內(nèi)效力可例如通過(guò)評(píng)估存活時(shí)間，疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)，反應(yīng)率(RR)，反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和/或生活重量來(lái)評(píng)估。
            
“治療”是指治療方法和預(yù)防措施。需要治療者包括已經(jīng)患疾病者，以及需要對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防者。
            
與本發(fā)明ANGPTL4分子相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“生物活性”或“生物活性的”指分子特異性結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的能力，所述細(xì)胞反應(yīng)例如增殖，粘附，遷移，制止調(diào)節(jié)等。細(xì)胞反應(yīng)也包括ANGPTL4受體例如αVβ5整合素受體介導(dǎo)的那些，包括但不限于粘附，遷移和/或增殖。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”包括ANGPTL4受體例如αVβ5整合素受體的激動(dòng)劑和拮抗劑。
            
“肥大”在本發(fā)明中意指與腫瘤形成無(wú)關(guān)的、獨(dú)立于自然生長(zhǎng)的器官或結(jié)構(gòu)的體積增加。器官或組織的肥大是由于個(gè)體細(xì)胞的體積增加(真性肥大)和/或構(gòu)成組織的細(xì)胞數(shù)量增加(增生)。
            
術(shù)語(yǔ)“癌”和“癌性的”是指或描述哺乳動(dòng)物中通常以細(xì)胞生長(zhǎng)失控為特點(diǎn)的病理狀態(tài)。癌的實(shí)例包括但不限于癌，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性疾病。所述癌癥的更具體實(shí)例包括腎癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，非癌包括小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌以及肺的鱗狀細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，宮頸癌，卵巢癌，前列腺癌，肝癌，膀胱癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，頭和頸癌，膠母細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，泡膜細(xì)胞瘤，卵巢男性細(xì)胞瘤，肝細(xì)胞瘤，血液惡性疾病包括非何杰金淋巴瘤(NHL)，多發(fā)性骨髓瘤和急性血液惡性疾病，子宮內(nèi)膜或子宮癌，子宮內(nèi)膜異位癥，纖維肉瘤，絨毛膜癌，唾液腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，食管癌，肝癌，肛門(mén)癌，陰莖癌，鼻咽癌，喉癌，卡波奇肉瘤，黑素瘤，皮膚癌，雪旺細(xì)胞瘤，寡突細(xì)胞瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，成骨肉瘤，平滑肌肉瘤，尿道癌，甲狀腺癌，Wilm瘤，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡狀非何杰金淋巴瘤(NHL)；小淋巴細(xì)胞(SL)NHL；中間級(jí)別/濾泡狀NHL；中間級(jí)別彌散性NHL；高級(jí)別免疫母細(xì)胞NHL；高級(jí)小非凹陷的細(xì)胞(high grade small non-cleavedcell)NHL；bulky病NHL；套細(xì)胞淋巴瘤；AIDS-相關(guān)的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血癥)；慢性淋巴母細(xì)胞白血病(CLL)；急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)；毛細(xì)胞白血?。宦猿伤杓?xì)胞白血?。灰浦埠罅馨驮錾约膊?PTLD)，以及與瘢痣病相關(guān)的異常血管增殖，水腫(諸如與腦腫瘤西那嘎關(guān)的)，和Meigs′綜合征。
            
術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤形成組合物”指用于治療癌癥的組合物，包括至少一種活性治療劑，例如“抗癌藥劑”。治療劑(抗癌劑)的實(shí)例包括但不限于，例如化療劑，生長(zhǎng)抑制劑，細(xì)胞毒藥劑，用于放射治療的藥劑，抗血管生成藥劑，凋亡藥劑，抗微管蛋白劑，毒素，以及其它用于治療癌癥的藥劑，，例如抗VEGF中和抗體，VEGF拮抗劑，抗-HER-2，抗-CD20，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)，HER1/EGFR抑制劑，erlotinib，COX-2抑制劑(例如塞來(lái)考昔(celecoxib))，干擾素，細(xì)胞因子，結(jié)合ErbB2，ErbB3，ErbB4，或VEGF受體的一或多種的拮抗劑(例如中和抗體)，血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF)和/或干細(xì)胞因子(SCG)的受體酪氨酸激酶抑制劑(例如imatinib mesylate(GleevecNovartis))，TRAIL/Apo2，以及其它生物活性和有機(jī)化學(xué)藥劑等。其組合也包含在本發(fā)明內(nèi)。
            
本文術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞毒藥劑″指抑制或防止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射活性同位素(例如，211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P和Lu的放射活性同位素)，化療劑例如氨甲蝶呤，阿霉素，長(zhǎng)春花堿(長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，依托泊苷)，多柔比星，美法侖，絲裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔紅霉素或其它嵌入劑，酶及其片段諸如核酸分解酶，抗生素，和毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
            
本文所用″生長(zhǎng)抑制劑″，是指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物，其中所述細(xì)胞的生長(zhǎng)有賴于活化。因此，生長(zhǎng)抑制劑是顯著降低S期細(xì)胞的百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程的試劑(在S期之外的環(huán)節(jié))，譬如，誘導(dǎo)G1期停滯和M-期停滯的試劑。傳統(tǒng)的M-期阻斷劑包括長(zhǎng)春花堿(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)、紫杉烷(taxane)和拓?fù)涿窱I抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊苷和博萊霉素。那些使G1期停滯的試劑也涉及S-期停滯，例如，DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。進(jìn)一步的信息可在下列文獻(xiàn)中找到The Molecular Basis ofCancer，Mendelsohn和Israel編輯，第一章，題目為″Cell cycle regulation，oncogens，and antineoplastic drugs″byMurakami等(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特別是第13頁(yè)。
            
“化療制劑”是在癌的治療中使用的化學(xué)化合物?；熤苿?shí)例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXANTM環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如芐替哌(bezodepa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶(ethylenimine)和甲基蜜胺包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)，三亞乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(具體是bullatacin和bullatacinone)；delta-9-四氫大麻酚(dronabinol，MARINOL)；beta-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙堿；樺木酸；喜樹(shù)堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)，CPT-11(伊立替康，CAMPTOSAR)，acetylcamptothecin，東莨菪亭，和9-氨基喜樹(shù)堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin)，卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；cryptophycins(具體是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosmfaide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；美法侖，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素諸如enediyne抗生素(例如刺孢霉素(calicheamicin)，具體是刺孢霉素γ1和刺孢霉素ω1(見(jiàn)，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括蒽環(huán)類抗生素A；esperamicin；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團(tuán)和相關(guān)色素蛋白enediyne抗生素生色團(tuán))，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin)，authramycin，氮絲氨酸(azaserine)，博萊霉素(bleomycin)，放線菌素C(cactinomycin)，carabicin，去甲柔紅霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，chromomycinis，更生霉素(dactinomycin)，柔紅霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代-多柔比星，氰基嗎啉代-多柔比星，2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素諸如絲裂霉素  C，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，吉西他濱(GEMZAR)，喃氟啶(UFTORAL)，卡培他濱(XELODA)，epothilone，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物例如氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷；雄激素類如卡普睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對(duì)氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑如葉酸(frolinic acid)；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；elliptinium acetate；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登素類(maytansinoids)諸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidanmol)；nitraerine；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖復(fù)合體(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethYlamine)；單端孢霉烯(trichothecene)(具體是T-2毒素，verracurin A，桿孢菌素(roridin)A和anguidine)；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春堿酰胺(ELDISINE，F(xiàn)ILDESIN)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)，紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒配制劑(albumin-engineered nanoparticle formulation ofpaclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和doxetaxel(TAXOTERE)；chloranbucil；6-硫代鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春花堿(VELBAN)；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長(zhǎng)春新堿(ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；leucovovin；；長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；novantrone；依達(dá)曲沙(edatrexate)；柔紅霉素；氨基蝶呤；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；維甲酸類(retinoids)諸如維甲酸；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物；以及兩或多種上述藥物的組合，諸如CHOP，其為環(huán)磷酰胺，阿霉素，長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍的聯(lián)合療法的簡(jiǎn)稱，以及FOLFOX，其為利用奧沙利鉑(ELOXATINTM)以及5-FU和leucovovin的聯(lián)合治療方案的簡(jiǎn)稱。
            
此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(FARESTON)；抑制芳香酶的芳香酶抑制物，該酶調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素生成，諸如，例如4(5)-咪唑，氨魯米特(aminoglutethimide)，MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，AROMASIN依西美坦(exemestane)，formestanie，法倔唑(fadrozole)，RIVISOR伏氯唑(vorozole)，F(xiàn)EMARA來(lái)曲唑(letrozole)，和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，具體是抑制異常細(xì)胞增生所涉及的信號(hào)途徑中的基因表達(dá)的那些反義寡核苷酸，諸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras；以及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R)；疫苗諸如THERATOPE疫苗以及疫苗諸如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN疫苗，LEUVECTIN疫苗，和VAXID疫苗；拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制物(LURTOTECAN)；rmRH(例如ABARELIX)，lapatinibditosylate(ErbB-2 and EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制物，也已知為GW572016)；COX-2抑制物諸如塞來(lái)考昔(celecoxib)(CELEBREX；4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
            
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一個(gè)細(xì)胞群釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白的總稱。這類細(xì)胞因子有淋巴因子，單核因子，和傳統(tǒng)的多肽激素。包括生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素，N-甲二磺酰人生長(zhǎng)激素，和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳激素；胎盤(pán)催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒管(mullerian)-抑制物；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素(activin)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(例如，VEGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E)；胎盤(pán)來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PlGF)；血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF，例如，PDGFA，PDGFB，PDGFC，PDGFD)；整合素；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-alpha；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1，IL-lalpha，IL-1beta，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-1 1，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20-IL-30；促分泌劑/子宮珠蛋白；制瘤素M(OSM)；；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括天然蛋白或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等效物。
            
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“前體藥物”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對(duì)于親本藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)換成更具活性的親本形式。例見(jiàn)Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”BiochemicalSociety Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運(yùn)送的化學(xué)方法”定向藥物運(yùn)送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，可轉(zhuǎn)化為更具細(xì)胞毒活性的游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可衍生為本發(fā)明所用前體藥物形式細(xì)胞毒藥物包括，但不限于上述化療試劑。
            
“血管生成因子或藥劑”是刺激血管形成的生長(zhǎng)因子，例如促進(jìn)血管生成，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，血管穩(wěn)定性和/或脈管形成等。例如，血管生成因子包括但不限于，VEGF和VEGF家族成員，PLGF，PDGF家族，纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)，TIE配體(血管生成素)，ephrins，ANGPTL3，ANGPTL4，等。其也包括促進(jìn)傷口愈合的因子，諸如生長(zhǎng)激素，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)，VIGF，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，CTGF及其家族的成員，以及TGF-α和TGF-β。見(jiàn)例如，Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene，223172-3179(2003)；Ferrara & Alitalo，NatureMedicine 5(12)1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene，226549-6556(2003)(例如Table 1 listing angiogenic factors)；and，Sato Int.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)。
            
″抗血管生成藥劑″或“血管生成抑制劑”指小分子量物質(zhì)，多核苷酸，多肽，分離的蛋白，重組蛋白，抗體，或其偶聯(lián)物或融合蛋白，其抑制血管生成，脈管形成，或不良的血管通透性，無(wú)論是直接還是間接。例如，抗血管生成藥劑是上述血管生成劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF抗體，VEGF受體抗體，阻斷VEGF受體信號(hào)的小分子(例如PTK787/ZK2284，SU6668)。抗血管生成藥劑也包括天然血管生成抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)，內(nèi)皮他丁(endostatin)，等，見(jiàn)例如，Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene，223172-3179(2003)(例如表3列出了惡性黑素瘤中的抗血管生成療法)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine5(12)1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene，226549-6556(2003)(例如表2列出了抗血管生成因子)；和，Sato Int.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)(例如表1列出臨床實(shí)驗(yàn)中使用的抗血管生成藥劑)。
            
本文術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指可檢測(cè)的化合物或組合物，其直接或間接偶聯(lián)于多肽。該標(biāo)記本身可為可檢測(cè)的(例如放射同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或如果是酶標(biāo)記，可催化可檢測(cè)底物化合物或組合物的化學(xué)變化。
            
“分離的”核酸分子，是從在多肽核酸的天然來(lái)源其通常結(jié)合的至少一種污染性核酸分子鑒定并分離出的核酸分子。分離的核酸分子并非其天然形式或在其天然環(huán)境中。分離的核酸分子因此與其存在與天然細(xì)胞中的形式不同。然而，分離的核酸分子包括包含的通常表達(dá)這樣的多肽的細(xì)胞中，其中例如所述核酸分子在染色體中的位置與天然細(xì)胞中的情況不同。
            
術(shù)語(yǔ)“控制序列”指在具體宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所需的DNA序列。適于原核生物的控制序列，例如包括啟動(dòng)子，可選操縱序列，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子，多腺苷化信號(hào)以及增強(qiáng)子。
            
當(dāng)核酸與另一核酸序列發(fā)生功能上的關(guān)系時(shí)，該核酸即為“可操作地連接于”另一核酸。例如，如果DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則編碼前序列或分泌型前導(dǎo)序列(例如，信號(hào)序列或信號(hào)肽)的DNA與編碼多肽的DNA可操作性地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置有利于翻譯，則該核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于編碼序列。一般而言，“可操作地連接于”是指被鄰接的DNA序列是連續(xù)的，并且在例如分泌型前導(dǎo)序列的情況下為鄰接的并處于閱讀相。但是增強(qiáng)子不一定必須是相鄰的。連接(linking)通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行接合(ligation)來(lái)完成。若這樣的位點(diǎn)不存在，可依照常規(guī)實(shí)施方法使用合成的寡核苷酸接頭(adaptor)或連接體。
            
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”，和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有所述名稱包括子代。因此，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞以及來(lái)自其的培養(yǎng)物，而不考慮傳代數(shù)。還應(yīng)理解所有子代的DNA含量可不精確地一致，這是由于有意或無(wú)意突變?cè)斐傻?。?duì)最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行篩選得到的具有相同功能或生物活性的突變體子代包括在本發(fā)明內(nèi)。不同名稱含義不同時(shí)，可從上下文明確看出。
            
ANGPTL4血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)是分泌蛋白并且是血管生成素家族的成員。其還已知為肝纖維蛋白原/血管生成素-相關(guān)蛋白(HFARP)(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))，PGAR(PPARγ血管生成素相關(guān)蛋白)(Yoon，et al.，Mol.Cell Biol.，205343-5349(2000))，禁食誘導(dǎo)的脂肪因子(FIAF)(Kerten et al.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(2000))；血管生成素-相關(guān)蛋白(ARP-4)；NL2(見(jiàn)美國(guó)專利6,348,350；6,372,491；和6,455,496)；以及Ang6。
            
人ANGPTL4蛋白是406氨基酸的蛋白(例如US Patents 6,348,350，6,372,491 & 6,455,496)，小鼠ANGPTL4是410氨基酸蛋白(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))。小鼠和人在氨基酸水平共享大約75％的同一性。Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。ANGPTL4具有單個(gè)多肽，三個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)，以及四個(gè)半胱氨酸，其可參與細(xì)胞內(nèi)二硫鍵形成。例如，ANGPTL4形成更高級(jí)的分子結(jié)構(gòu)，例如圖3，圖A所示。見(jiàn)例如，例如Ge et al.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)；Ge et al.，J.Lipid Res.452071-2079(2004)；和Mandard et al.，J.of Biol.Chem.，279(33)34411-34420(2004)。ANGPTL4也可經(jīng)蛋白水解加工。也見(jiàn)，例如Ge et al.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045 (2004)；和 Mandard et al.，J.of Biol.Chem.，279(33)34411-34420(2004)。如本文所述，ANGPTL4的取代R162G和R164E導(dǎo)致變體ANGPTL4在SDS-凝膠上的分子量高于野生型(或天然)蛋白(見(jiàn)圖3，圖B)。
            
血管生成素家族的保守區(qū)包括螺旋區(qū)以及C末端纖維蛋白原(FBN)樣結(jié)構(gòu)域。見(jiàn)例如，Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。據(jù)提示ANGPTL4以常規(guī)方式蛋白經(jīng)水解加工釋放C末端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。見(jiàn)例如，Ge etal.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)。血管生成素家族的其它成員包括血管生成素1，血管生成素2和血管生成素3/血管生成素4，其結(jié)合Tie2受體。見(jiàn)例如，Davis et al.，Cell87，1161-1169(1996)；Maisonpierre et al.，Science277，55-60(1997)；Valenzuela et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1904-1909(1999)；美國(guó)專利5,521,073；5,650,490；和，5,814,464。血管生成素1和4是Tie2受體的激動(dòng)劑，而血管生成素2和3是Tie2受體的拮抗劑(以及可能的激動(dòng)劑)。見(jiàn)例如，F(xiàn)olkman & D’Amore，Cell，871153-1155(1996)；Suri et al.，Cell，871171-1180(1996)；Masionpierre et al.，Science 27755-60(1997)；and，Ward & Dumont，Seminars in Cell & Developmental Biology，1319-27(2002)。
            
ANGPTL4結(jié)合整合素αvβ5。見(jiàn)例如，圖9，圖A-E。該家族的另一成員，血管生成素-樣3蛋白(ANGPTL3)是結(jié)合整合素αvβ3的血管生成因子。見(jiàn)例如，US專利申請(qǐng)20030215451，其公開(kāi)于2003-11-20，以及Camenisch etal.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002)。ANGPTL3不結(jié)合受體Tie2。Camenish et al.，Journal of Biol.Chem.277(19)17281-17290(2002)。ANGPTL3也是血漿脂質(zhì)水平調(diào)節(jié)物。見(jiàn)例如，Koishi et al.，Nat.Genetics 30151-157(2002)。
            
ANGPTL4結(jié)合整合素αvβ5。見(jiàn)例如，圖11，12和13。整合素αVβ5是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包括玻連蛋白和Del-1的受體(見(jiàn)例如，Stupack and Cheresh，Journal of Cell Science 1153729-3738(2002))。Alpha v-整合素參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。見(jiàn)例如，Marshall，J F and Hart，I R Semin.Cancer Biol.7(3)129-38(1996)。此外，alpha v-整合素在血管生成中的作用也已經(jīng)顯示。見(jiàn)例如，Eliceiri，B P and Cheresh，D A Molecular Medicine 4741-750(1998)。例如，αVβ5的單克隆抗體抑制兔角膜和雞絨毛膜尿囊膜模型中VEGF誘導(dǎo)的血管生成作用。見(jiàn)例如，M.C.Friedlander，et al.，Science 2701500-1502(1995)。αVβ3和αVβ5的拮抗劑以抑制生長(zhǎng)因子和腫瘤誘導(dǎo)的血管生成作用。見(jiàn)例如，Eliceiri and Cheresh，Current Opinion in Cell Biology，13563-568(2001)。
            
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)物的組合物，例如血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)的激動(dòng)劑或拮抗劑以及這些調(diào)節(jié)物與其它治療劑的組合。例如，ANGPTL4的拮抗劑與抗癌藥劑的組合以及它們?cè)谧钄嗷驕p慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的用途在本文提供。本發(fā)明還提供利用ANGPTL4拮抗劑和/或其它抗癌藥劑阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。ANGPTL4的拮抗劑的組合物以及抗血管生成藥物的組合以及它們用于阻斷或減慢腫瘤形成或非腫瘤形成性疾病的新生血管化的用途也在本發(fā)明提供。
            
ANGPTL4調(diào)節(jié)物及其用途ANGPTL4調(diào)節(jié)物是調(diào)節(jié)ANGPTL4活性的分子，例如激動(dòng)劑和拮抗劑。術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指ANGPTL4的肽和非肽類似物，以及特異性結(jié)合所述ANGPTL4分子的抗體，條件是它們具有通過(guò)天然ANGPTL4受體(例如αVβ5整合素)產(chǎn)生信號(hào)的能力。術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”在本發(fā)明根據(jù)ANGPTL4受體(例如αVβ5)的生物作用定義。一些實(shí)施方案中，激動(dòng)劑具有天然ANGPTL4的生物活性，如上所述，諸如促進(jìn)增殖、遷移和/或細(xì)胞粘附，和/或調(diào)節(jié)脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡。
            
術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”用于指能抑制ANGPTL4生物活性的分子，而不考慮它們是否能結(jié)合ANGPTL4或其受體，例如，αVβ5。例如，能結(jié)合ANGPTL4或其受體的拮抗劑包括抗-ANGPTL4和抗-αVβ5抗體。抑制ANGPTL4表達(dá)的拮抗劑包括在內(nèi)，例如，ANGPTL4-SiRNA。拮抗劑 ANGPTL4可通過(guò)例如抑制ANGPTL4的活性，例如粘附、遷移、增殖和/或調(diào)節(jié)ANGPTL4的脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡活性來(lái)評(píng)估。就αVβ5整合素受體活性而言，αVβ5整合素受體的調(diào)節(jié)物可通過(guò)本領(lǐng)域抑制的方法確定。例如，可使用J.W.Smith et al.in J.Biol.Chem.26512267-12271(1990)所用的方法。
            
治療用途ANGPTL4也是癌的靶。在體外或體內(nèi)，ANGPTL4在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖(見(jiàn)例如，圖4，圖5，圖7和圖8，圖A和圖B)。當(dāng)ANGPTL4在正在用抗血管生成因子例如抗-VEGF抗體治療的腫瘤中表達(dá)，腫瘤可保持生長(zhǎng)的能力(見(jiàn)例如，圖8，圖C)。ANGPTL4也導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移(見(jiàn)例如，圖9)。其也在腎癌中上調(diào)。見(jiàn)例如，attorney docket numberP5032R1；WO 02/07941；和Le Jan et al.，American Journal of Pathology，162(5)1521-1528(2003)。此外，ANGPTL4是促血管生成因子(見(jiàn)例如，S.LeJan et al.，Am.J.Pathol.，162(5)1521-1528(2003))，其是癌癥治療的靶。和VEGF一樣(Shweiki et al.，Proc.Natl.Acad Sci，USA 92768-772(1995)，ANGPTL4應(yīng)答于低氧表達(dá)增加。見(jiàn)例如，Le Jan et al.，American Journal ofPathology，162(5)1521-1528(2003)。
            
在各種條件下，ANGPTL4結(jié)合腫瘤細(xì)胞，例如A673細(xì)胞(例如圖6，圖A和B)。如例如圖4，圖A和圖B所示，當(dāng)細(xì)胞用表達(dá)ANGPTL4的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，ANGPTL4刺激一些腫瘤細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)。圖4，圖C也顯示加入ANGPTL4轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS7細(xì)胞的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)A673細(xì)胞的增殖。也見(jiàn)，圖7，圖A和B。ANGPTL4包被在培養(yǎng)皿上時(shí)，ANGPTL4誘導(dǎo)A673細(xì)胞的細(xì)胞增殖(見(jiàn)圖5)，但不誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞的、腎小球系膜細(xì)胞或HUVEC的細(xì)胞增殖。ANGPTL4以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞遷移。見(jiàn)例如，圖9。
            
ANGPTL4主要在脂肪組織，胎盤(pán)，肝和腎中表達(dá)并在ob/ob(leptin敲除)和db/db(leptin受體敲除)小鼠中上調(diào)。見(jiàn)例如，Yoon et al.，Mol.Cell Biol.205343-5349(2000)；Kim et al.，Biochem.J，346603-610(2000)；Kersten et al.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(2000)；和Le Jan et al.，American Journal ofPathology 162(5)1521-1528(2003)。據(jù)報(bào)道ANGPTL4也是脂質(zhì)調(diào)節(jié)物以及脂蛋白酶的抑制物。見(jiàn)例如，Yu et al.，PNAS USA 102(5)1767-1772(2005)；Yoshida et al.，J.Lipid Res.431770-1772(2002)；和Wiesner et al.，J.Endocrinology 180R1-R6(2004)。ANGPTL4表達(dá)在脂肪細(xì)胞中也受PPARgamma和alpha的誘導(dǎo)，并由饑餓誘導(dǎo)。其也調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞增殖，和/或前脂肪細(xì)胞遷移以及調(diào)節(jié)血清甘油三酯和膽固醇水平。見(jiàn)，U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)60/589,875，和同時(shí)提交的Attorney Docket P2156R1，其包含在本文作為參考。研究人員報(bào)道了血管生成和脂肪生成之間的關(guān)系。見(jiàn)例如，Sierra-Honigmann et al.，“Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor”Science 2811683-1686；(1998)；Rupnick et al.，“Adipose tissue mass can beregulated through the vasculature”P(pán)roc. Nat. Acad.Sci. USA，99(16)10730-10735(2002)；和Fukumura et al.，“Paracrine Regulation ofAngiogenesis and Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis.”Circ.Res.93e88-e97(2003)。
            
根據(jù)本發(fā)明，預(yù)計(jì)ANGPTL4調(diào)節(jié)物和/或ANGPTL4調(diào)節(jié)物與其它治療劑的組合可用于治療各種腫瘤或非腫瘤疾病。一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4調(diào)節(jié)物，例如ANGPTL4的拮抗劑用于抑制癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)。例如，如圖10，圖A和圖B所述，抗ANGPTL4多克隆抗體以劑量依賴方式抑制腫瘤生長(zhǎng)。ANGPTL4可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移(見(jiàn)例如圖9)。根據(jù)本發(fā)明，ANGPTL4拮抗劑也可用于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。ANGPTL4也誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的遷移。見(jiàn)，美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/589,875，以及同時(shí)提交的Attorney Docket P2156R1。一些實(shí)施方案中，一或多種抗癌藥劑可與ANGPTL4拮抗劑一起給藥，抑制癌細(xì)胞或腫瘤的生長(zhǎng)。見(jiàn)本發(fā)明題為聯(lián)合治療的部分。
            
待治療的腫瘤疾病的實(shí)例包括但不限于，術(shù)語(yǔ)“癌”或“癌性的”中所述的那些?？衫帽景l(fā)明的拮抗劑治療的非腫瘤形成疾病包括，但不限于，例如不良或異常肥大，關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，銀屑病，銀屑斑塊，肉樣瘤病(sarcoidosis)，動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，心肌梗死造成的水腫，糖尿病和其它增殖性視網(wǎng)膜并包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織增生癥，新生血管性青光眼，與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變，糖尿病性黃斑水腫，角膜新生血管形成，角膜移植物新生血管形成，角膜移植物排斥，視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新生血管形成，眼房角新生血管化(neovascularization of theangle)(發(fā)紅(rubeosis))，眼新生血管疾病，血管在狹窄，動(dòng)靜脈畸形(AVM)，腦膜瘤，血管瘤，甲狀腺肥大(包括Grave’s病)，角膜及其它組織的移植，慢性炎癥，肺部炎癥，急性肺損傷/ARDS，膿毒癥，原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓，惡性肺滲出，大腦水腫(例如與急性發(fā)作綜合征/封閉性頭部損傷/創(chuàng)傷有關(guān))，滑膜炎癥，RA中的血管翳形成，骨化性肌炎，肥厚性骨形成(hypertropic boneformation)，骨關(guān)節(jié)炎(OA)，頑固性腹水，多囊卵巢疾病，子宮內(nèi)膜異位癥，液體第三間隔疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎，間隔綜合征，燒傷，腸疾病)，子宮平滑肌瘤，早產(chǎn)，慢性炎癥諸如IBD(克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)，腎同種異體移植物排斥，炎性腸病，腎病綜合征，不良或異常組織團(tuán)塊生長(zhǎng)(非癌性)，肥胖癥，脂肪組織團(tuán)塊生長(zhǎng)，血友病性關(guān)節(jié)，肥大性瘢，毛發(fā)生長(zhǎng)抑制，Osler-Weber綜合征，膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生癥，硬皮病，沙眼，血管粘附，滑膜炎，皮炎，先兆子癇，腹水，心包滲出液(諸如與心包炎相關(guān))，和胸膜積液。
            
ANGPTL4調(diào)節(jié)物，例如ANGPTL4激動(dòng)劑或活化物，可用于治療病理疾病。ANGPTL4調(diào)節(jié)物，例如ANGPTL4激動(dòng)劑可用于治療需要血管生成或新生血管形成和/或肥大的病理疾病，其包括但不限于例如，血管損傷，創(chuàng)傷，裂傷，切口，燒傷，潰瘍(例如糖尿病，壓力性潰瘍，血友病性潰瘍，靜脈曲張潰瘍)，組織生長(zhǎng)，重量增加，外周動(dòng)脈疾病，分娩的誘導(dǎo)，毛發(fā)生長(zhǎng)，大皰性表皮松解，視網(wǎng)膜萎縮，骨折，骨脊髓融合，半月板撕傷等。也見(jiàn)，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/589,875和同時(shí)提交的Attorney Docket P2156R1。
            
聯(lián)合治療如上所示，本發(fā)明提供聯(lián)合治療，其中ANGPTL4拮抗劑與另一種治療一起給藥。例如，ANGPTL4拮抗劑與抗癌治療劑和抗新生血管形成治療劑聯(lián)合給藥以治療腫瘤形成或非腫瘤形成疾病。一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤形成和非腫瘤形成疾病的特征在于與異?；虿涣佳苌上嚓P(guān)的病理疾病。ANGPTL4拮抗劑可連續(xù)或與另一種對(duì)于所述目的有效的藥劑聯(lián)合給藥，而無(wú)論在相同或分離的組合物中?？蛇x或此外，可給藥ANGPTL4的多重抑制劑。
            
本發(fā)明的拮抗劑和/或藥劑的給藥可同時(shí)進(jìn)行，例如作為單個(gè)組合物或作為兩個(gè)或更多不同的組合物，其中利用相同或不同的給藥途徑?？蛇x或此外，所述給藥可以任何順序依次進(jìn)行。一個(gè)實(shí)施方案中，范圍在數(shù)分鐘到數(shù)天到數(shù)周的間隔可存在兩或多個(gè)組合物的給藥之間。例如，可首先給藥抗癌劑，然后給藥ANGPTL4抑制劑。然而，同時(shí)給藥或先給藥ANGPTL4拮抗劑也可。
            
與ANGPTL4拮抗劑聯(lián)合給藥的有效量的治療劑由醫(yī)師或獸醫(yī)確定。給藥劑量和調(diào)整用于實(shí)現(xiàn)對(duì)待治療疾病的最大化管理。所述劑量還有賴于因素諸如將使用的治療劑的類型以及治療的具體患者?？拱﹦┑倪m宜劑量是目前使用的那些，并且可由于抗癌藥劑和ANGPTL4拮抗劑的聯(lián)用作用(協(xié)同作用)而降低。一些實(shí)施方案中，抑制劑的組合增強(qiáng)單個(gè)抑制物的效力。術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”指常用或規(guī)定劑量的治療劑的效力的提高。也見(jiàn)本發(fā)明的藥物組合物部分。
            
通常，ANGPTL4拮抗劑和抗癌藥劑適于相同或類似的疾病用于阻斷或減慢病理性疾病諸如腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌藥劑是抗血管生成藥劑。
            
與癌相關(guān)的抗血管生成治療是目的在于抑制提供營(yíng)養(yǎng)支持腫瘤生長(zhǎng)的腫瘤血管的發(fā)育的治療策略。由于血管生成與原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都有關(guān)，本發(fā)明提供的抗血管生成治療能抑制原發(fā)位點(diǎn)的腫瘤的腫瘤形成生長(zhǎng)以及預(yù)防繼發(fā)位點(diǎn)的腫瘤轉(zhuǎn)移，由此允許腫瘤被其它治療劑攻擊。
            
許多抗血管生成藥劑已經(jīng)被鑒定并且是本領(lǐng)域已知的，包括本發(fā)明所列出的那些，例如定義部分列出的那些，以及例如Carmeliet and Jain，Nature407249-257(2000)；Ferrara et al.，Nature ReviewsDrug Discovery，3391-400(2004)；and Sato Int.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)中的。也見(jiàn)，美國(guó)專利申請(qǐng)US20030055006。一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑與抗VEGF中和抗體(或片段)和/或其它VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑聯(lián)用，包括但不限于例如，可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，neuropillins(例如NRP1，NRP2))片段，能阻斷VEGF或VEGFR的適體，中和抗-VEGFR抗體，VEGFR酪氨酸激酶(PTK)的低分子量抑制物，VEGF的反義策略，針對(duì)VEGF或VEGF受體的核酶，VEGF的拮抗劑變體；以及其組合?？蛇x或此外，兩或多種血管生成抑制劑可共同給藥抗體。一些實(shí)施方案中，一或多種其它治療劑，例如抗癌藥劑，可與ANGPTL4拮抗劑以及抗血管生成藥劑聯(lián)合給藥。
            
本發(fā)明的一些方面中，用于和本發(fā)明的拮抗劑進(jìn)行聯(lián)合腫瘤治療的其它治療劑包括其它癌癥治療劑，(例如手術(shù)，放射治療(例如與放射有關(guān)或給藥放射活性物質(zhì))，化療，利用本文所列的以及本領(lǐng)域已知的抗癌藥劑治療，以及其組合)。可選或此外，本發(fā)明公開(kāi)的兩或多種結(jié)合相同或兩種或不同抗原的抗體可共同給藥患者。有時(shí)，給藥患者一或多種細(xì)胞因子也是有益的。
            
化療劑一些方面中，本發(fā)明提供阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其通過(guò)給藥還易患或診斷為患有癌癥的患者有效量的ANGPTL4拮抗劑和/或血管生成抑制劑以及一或多種化療劑來(lái)進(jìn)行。多種化療劑可用于本發(fā)明的聯(lián)合療法中。涉及的化療劑的示例性和非限制性列表在本發(fā)明“定義”部分提供。
            
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，適宜劑量的化療劑將通常是大約已經(jīng)用于臨床治療的那些，其中化療劑單獨(dú)或與其它化療劑聯(lián)合給藥。根據(jù)治療的疾病，劑量的變化很可能出現(xiàn)。給予治療的醫(yī)師能確定個(gè)體受試者的適宜劑量。
            
復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)本發(fā)明還提供抑制和預(yù)防復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法和組合物。例如，圖8，圖C圖示了當(dāng)腫瘤也表達(dá)ANGPTL4時(shí)，用抗-VEGF抗體(AVASTIN)治療的腫瘤逃避治療(例如一種類型的復(fù)發(fā))的能力。
            
復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)用于描述這樣的情況，其中患者接受或利用的一或多種目前可用的療法(例如癌癥療法諸如化療，放療，手術(shù)，激素治療和/或生物療法/免疫療法，具體是具體癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案)在臨床上不適合治療患者或者患者不再?gòu)乃鲋委煫@得任何有益效果，從而使得這些患者需要其它有效治療。本文中該術(shù)語(yǔ)也用于描述“非反應(yīng)性/頑固性”患者的情形，例如其描述了對(duì)治療不應(yīng)答并出現(xiàn)副作用，產(chǎn)生抗藥性，對(duì)治療不應(yīng)答，對(duì)治療應(yīng)答不滿意等的患者。各種實(shí)施方案中，癌癥是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其中癌細(xì)胞的數(shù)目沒(méi)有明顯降低，或增加，或沒(méi)能進(jìn)一步減小癌細(xì)胞體積或數(shù)量。癌細(xì)胞是否復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的確定可通過(guò)本領(lǐng)域已知用于評(píng)估癌細(xì)胞治療有效性的體內(nèi)或體外方法，其中在該背景中使用本領(lǐng)域接受的“復(fù)發(fā)”或“頑固性”或“非應(yīng)答性”的含義。
            
本發(fā)明提供阻斷或減慢受試者中復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，通過(guò)給藥本發(fā)明的ANGPTL4拮抗劑阻斷或減慢受試者中的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行。一些實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑可在癌癥治療后給藥。一些實(shí)施方案中，ANGPTL4與癌癥治療同時(shí)給藥。可選或此外，ANGPTL4拮抗劑療法與另一癌癥治療交替給藥，其可以任何順序進(jìn)行。本發(fā)明還包括給藥一或多種ANGPTL4抑制抗體來(lái)防止易患癌癥的患者中癌癥的開(kāi)始或復(fù)發(fā)的方法。通常，受試者曾經(jīng)或正在接受癌癥治療。一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥治療是利用抗血管生成藥劑的治療。抗血管生成藥劑包括本領(lǐng)域已知的那些以及本發(fā)明定義部分中的那些。一個(gè)實(shí)施方案中，抗血管生成藥劑是抗-VEGF中和型抗體或片段(例如人源化的A4.6.1，AVASTIN(Genentech，South San Francisco，CA)，Y0317，M4，G6，B20，2C3，等)。見(jiàn)例如，U.S.Patents 6,582,959，6,884,879，6,703,020；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；US Patent Applications 20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；Popkov et al.，Journal ofImmunological Methods 288149-164(2004)；和Attorney Docket No.PR2072-4。其它藥劑可與ANGPTL4拮抗劑聯(lián)合給藥以阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)，例如參見(jiàn)本發(fā)明聯(lián)合治療的部分。
            
一個(gè)實(shí)施方案中，給藥本發(fā)明的ANGPTL4拮抗劑或其它減少ANGPTL4表達(dá)的治療劑以逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)具體生物、激素、反射和化療藥劑的抗性或減小其敏感性，由此使得癌細(xì)胞對(duì)于一或多種這些藥劑重新敏感化，其可隨后給藥(或繼續(xù)給藥)以治療或管理癌癥，包括防止轉(zhuǎn)移。
            
抗體本發(fā)明的抗體包括抗-ANGPTL4抗體或ANGPTL4的抗原結(jié)合片段，抗-αVβ5抗體或本文所述的其它抗體。示例性抗體包括，例如多克隆，單克隆，人化的，片段，多特異性，異源偶聯(lián)的，多價(jià)的，效應(yīng)功能等抗體。抗體可為激動(dòng)劑或拮抗劑。
            
抗體本發(fā)明的抗體包括抗-ANGPTL4和抗-ANGPTL4片段抗體，作為抗血管生成藥劑或血管生成抑制劑的抗體，作為抗癌藥劑的抗體，ANGPTL4受體的抗體，例如抗-αVβ5抗體，或本發(fā)明所述的其它抗體。示例性抗體包括例如，多克隆，單克隆，人源化的，片段，多特異性，異源偶聯(lián)的，多價(jià)的，效應(yīng)功能等抗體。
            
多克隆抗體本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，抗ANGPTL4的多克隆抗體通過(guò)多次給動(dòng)物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來(lái)酰亞氨苯甲酰基硫代琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，將所述相關(guān)抗原與在所免疫的物種中具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)進(jìn)行偶聯(lián)是有用的。
            
用ANGPTL4、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對(duì)兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液。1個(gè)月后，多位點(diǎn)皮下注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑中的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，測(cè)定血清中的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物的加強(qiáng)免疫直到滴度達(dá)到平臺(tái)期為止。通常給動(dòng)物加強(qiáng)注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過(guò)不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)。偶聯(lián)物還可以是重組細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
            
單克隆抗體例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國(guó)專利4,816,567)。
            
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適合的宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，可體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用適當(dāng)融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
            
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種至適當(dāng)培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
            
通常骨髓瘤細(xì)胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell Distreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細(xì)胞和由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。也有報(bào)道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
            
可在含有生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中分析針對(duì)例如ANGPTL4，αVβ5或血管生成分子的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)分析。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來(lái)測(cè)定。
            
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，將這些克隆通過(guò)有限稀釋法進(jìn)一步克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水中腫瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。
            
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中適宜地分離。
            
單克隆抗體也可卡通過(guò)重組DNA方法制備，諸如美國(guó)專利4,816,567中描述的那些。編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易地分離和測(cè)序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是這類DNA的優(yōu)選來(lái)源。DNA分離后，可將其插入表達(dá)載體中，然后用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體?？贵w的重組產(chǎn)生在下文詳細(xì)描述。
            
在另一實(shí)施方案中，可從用Mccafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體。后來(lái)的文獻(xiàn)描述了通過(guò)鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫(kù)的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來(lái)分離克隆抗體。
            
DNA也可通過(guò)例如用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來(lái)修飾(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)816851(1984))，或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾。
            
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)的可變區(qū)，形成二價(jià)嵌合抗體，其中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于一種抗原而另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于另一種抗原。
            
人源化抗體和人抗體本發(fā)明的抗體可包括人源化的或人抗體。人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進(jìn)的”殘基，它們通常來(lái)自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過(guò)程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
            
對(duì)用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)包括重鏈和輕鏈的選擇，對(duì)降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)”方法，針對(duì)已知人類可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
            
更重要的是，將抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過(guò)用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來(lái)制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過(guò)這種方法，可從受者和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊?，CDR殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
            
可選可制備如下轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它們通過(guò)免疫能產(chǎn)生人類抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報(bào)道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類的抗體產(chǎn)生。見(jiàn)例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；and Duchosal et al.Nature355258(1992).Human antibodies can also be derived from phage-displaylibraries(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J. Mol.Biol.，222581-597(1991)；Vaughan et al.Nature Biotech 14309(1996))。
            
人抗體也可利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，包括噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991))。據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點(diǎn)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對(duì)顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些綜述見(jiàn)Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個(gè)來(lái)源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來(lái)源的V基因的隨機(jī)組合小文庫(kù)中分離了抗-惡唑酮抗體的多樣性陣列?？苫救鏜arks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構(gòu)建未免疫人類供者的V基因所有組成成分，并分離針對(duì)抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見(jiàn)美國(guó)專利5565332和5573905。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan RLiss，p 77(1985)和Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。人類抗體也可通過(guò)體外活化的B細(xì)胞而產(chǎn)生(見(jiàn)美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。
            
抗體片段抗體片段也包括在本發(fā)明中。已開(kāi)發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過(guò)對(duì)完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見(jiàn)Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過(guò)重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫(kù)分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)WO 93/16185；美國(guó)專利5,571,894；和美國(guó)專利5,587,458。Fv和sFv是與缺乏恒定區(qū)的完整結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的唯一種類；因此它們適于降低體內(nèi)使用過(guò)程中的非特異性結(jié)合。SFv融合蛋白可構(gòu)建成在sFv的氨基或羧基末端產(chǎn)生效應(yīng)蛋白的融合。見(jiàn)，Antibody Engineering，cd.Borrebacck，supra。抗體片段也可以是“線性化抗體”，如美國(guó)專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
            
多特異性抗體(例如雙特異性)本發(fā)明的抗體也包括，例如，多特異抗體，其對(duì)至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性。盡管此種分子通常只結(jié)合兩種抗原(即雙特異抗體，BsAbs)，具有附加特異性的抗體例如三特異抗體也包含在文中所用的術(shù)語(yǔ)中。BsAbs的實(shí)例包括具有針對(duì)腫瘤抗原的一條臂和針對(duì)細(xì)胞毒作用觸發(fā)分子(cytotoxic trigger molecule)的另一條臂的那些抗體，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗-惡性B-細(xì)胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-腎細(xì)胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-結(jié)腸癌)，抗-CD3/抗-黑色素細(xì)胞刺激激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一條臂特異地結(jié)合腫瘤抗原而另一條臂結(jié)合毒素的BsAbs例如抗-皂草素/抗-Id-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A鏈，抗-干擾素-α(IFN-α)/抗-雜交瘤獨(dú)特型，抗-CEA/抗-長(zhǎng)春花堿；轉(zhuǎn)化酶活化的前體藥物的BsAbs例如抗-CD30/抗-堿性磷酸酶(催化磷酸絲裂霉素前藥物向絲裂霉素醇的轉(zhuǎn)化)；可用作纖維蛋白溶解劑的例如抗-纖維蛋白/抗-組織纖溶酶原激活物(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(例如FcγRI，F(xiàn)cγRII或FcγRIII)；用于治療感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-cell受體CD3復(fù)合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；體外或體內(nèi)檢測(cè)腫瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-D185HER2/抗-半抗原；作為疫苗佐劑的BsAbs；和作為診斷工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長(zhǎng)抑素/抗-物質(zhì)P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特異抗體的實(shí)例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。雙特異抗體可被制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。
            
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機(jī)分配，這些四交瘤(quadroma)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)所述正確分子的純化(通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見(jiàn)WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
            
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能夠非常靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
            
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開(kāi)于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
            
根據(jù)WO96/27011所述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子的界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過(guò)將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比其它不需要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
            
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab’)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
            
近期的進(jìn)展促進(jìn)了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來(lái)，經(jīng)體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過(guò)表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)人乳腺腫瘤靶的裂解活性。
            
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過(guò)基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，906444-6448(1993))描述的“二價(jià)抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過(guò)接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體的策略。見(jiàn)Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
            
還考慮了二價(jià)以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
            
異源偶聯(lián)的抗體雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與親和素偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類抗體可用于將免疫細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國(guó)專利4676980號(hào)中獲得。
            
多價(jià)抗體本發(fā)明的抗體包括多價(jià)抗體。多價(jià)抗體比二價(jià)抗體可更快地被表達(dá)與該抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)抗體(例如四價(jià)抗體)(它們不是IgM類)，通過(guò)使編碼所述抗體多肽鏈的核酸重組表達(dá)可輕易制備該抗體。多價(jià)抗體可以包含二聚體化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚體化結(jié)構(gòu)域包括Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)，或由它們組成。在本文中，抗體包含一個(gè)Fc區(qū)和三個(gè)或更多個(gè)位于Fc區(qū)氨基端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的多價(jià)抗體在此包括三到約八個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，或由它們組成。多價(jià)抗體包括至少一條多肽鏈(并優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變區(qū)。例如，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽鏈可包括VH-CH1-柔韌接頭(flexiblelinker)-VH-CH1-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少二個(gè)(優(yōu)選四個(gè))輕鏈可變區(qū)多肽。例如本文的多價(jià)抗體可包含從約二個(gè)到約八個(gè)輕鏈可變區(qū)多肽。本文的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)以及可選地進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。
            
效應(yīng)物功能改造也需要修飾本發(fā)明抗體的效應(yīng)物功能，以提高抗體在例如癌癥治療中的有效性。例如，可在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)。見(jiàn)Caron等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的靶向活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，可通過(guò)工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解效應(yīng)及ADCC能力的抗體。見(jiàn)Stevenson等，抗癌藥物的設(shè)計(jì)(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。為了提高拮抗劑的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑(尤其抗體片段)中摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國(guó)專利5,739,277所述。本文中術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。
            
免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，所述免疫偶聯(lián)物包含與細(xì)胞毒性藥劑結(jié)合的抗體，細(xì)胞毒性藥劑例如化學(xué)治療劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射偶聯(lián)物)。多種放射性核素可用于制備放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括但不限于，例如，212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
            
用于產(chǎn)生所述免疫偶聯(lián)物的化療劑已經(jīng)在上文描述。例如，BCNU，鏈脲菌素(streptozoicin)，長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶，美國(guó)專利5,053,394，5,770,710所述的已知統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的藥劑家族，以及esperamicins(美國(guó)專利5,877,296)等(也參見(jiàn)本文的化療劑的定義)可偶聯(lián)于抗-ANGPTL4或抗-血管生成抗體或其片段。
            
為了選擇性破壞細(xì)胞，抗體可包括高度放射活性的原子。多種放射活性同位素可用于產(chǎn)生放射偶聯(lián)的抗-ANGPTL4或其片段。實(shí)例包括但不限于211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P，212Pb，111In以及Lu的放射性同位素等。當(dāng)所述偶聯(lián)物是用于診斷時(shí)，其可以包含用于閃爍成像研究的放射性原子，例如Tc99或I123、或用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標(biāo)記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
            
可以用已知的方法將放射標(biāo)記物或其它標(biāo)記物摻入到所述偶聯(lián)物中。例如，可以利用包含，例如適當(dāng)位置的氟-19或氫的適合的氨基酸前體，通過(guò)化學(xué)的氨基酸合成來(lái)生物合成或化學(xué)合成所述肽。Tc99或I123、Re186、Re188和In111標(biāo)記物可以通過(guò)肽中的半胱氨酸殘基附著上。釔-90可以通過(guò)賴氨酸殘基附著。IODOGEN法(Fraker等，Biohem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978)可用于摻入碘-123。在″Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy″(Chatal，CRC Press1989)中描述了結(jié)合放射性核素的其它方法。
            
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolacca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹(shù)毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹(shù)毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見(jiàn)1993年10月28日公開(kāi)的WO93/21232。
            
抗體與細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過(guò)多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至拮抗劑的示例性偶聯(lián)劑。見(jiàn)WO94/11026。這種接頭可能是有利于細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的“可斷開(kāi)的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
            
可選，可制備包含抗-ANGPTL4，抗αvβ5或抗血管生成抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白，例如通過(guò)重組技術(shù)或肽合成。DNA的長(zhǎng)度可包括編碼偶聯(lián)物的兩個(gè)部分的分別的區(qū)域，其或者相鄰或者通過(guò)編碼不破壞偶聯(lián)物所需性質(zhì)的接頭肽的區(qū)域分隔。
            
在一些實(shí)施方案中，拮抗劑可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，將該拮抗劑-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細(xì)胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如親和素)。一些實(shí)施方案中，抗體和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶諸如脫氧核糖核酸酶；Dnase)形成免疫偶聯(lián)物。
            
美登木素和美登木素生物堿本發(fā)明還提供偶聯(lián)于一或多個(gè)美登木素生物堿分子的本發(fā)明的抗體。美登木素生物堿是有絲分裂抑制物，通過(guò)抑制微管蛋白的聚合起作用。美登素最早自東非灌木齒葉美登木(美國(guó)專利3,896,111)分離。隨后，發(fā)現(xiàn)特定的微生物也可產(chǎn)生美登木素生物堿，例如美登木醇(maytansinol)和C-3美登木醇酯(美國(guó)專利4,151,042)。本領(lǐng)域人員熟悉合成美登木醇和美登木醇類似物，并在例如美國(guó)專利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中公開(kāi)，其公開(kāi)內(nèi)容在此包含作為參考。
            
例如，抗-ANGPTL4抗體或抗-αVβ5抗體或抗血管生成抗體偶聯(lián)物美登木素生物堿分子而不明顯降低抗體或美登木素生物堿分子的生物活性。偶聯(lián)于每個(gè)抗體分子的平均3-4個(gè)美登木素生物堿分子顯示可有效增強(qiáng)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性而不會(huì)對(duì)抗體的功能或溶解性造成不利影響，但預(yù)期即使一個(gè)毒素/抗體分子將相對(duì)于裸抗體的使用提高細(xì)胞毒性。美登木素生物堿是本領(lǐng)域已知的并可通過(guò)已知技術(shù)合成并分離自自然來(lái)源。適宜的美登木素生物堿公開(kāi)于例如美國(guó)專利5,208,020以及上文所述的其他專利和非專利文獻(xiàn)。一個(gè)實(shí)施方案中，美登木素生物堿是美登醇(maytansinol)和在芳香環(huán)或美登醇的其他位置修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇的酯。
            
本領(lǐng)域已知多種制造抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的連接基團(tuán)，包括例如美國(guó)專利5,208,020或歐洲專利EP 0 425 235 B1，和Chari等CancerResearch52127-131(1992)公開(kāi)的那些。連接基團(tuán)包括二硫基，硫醚基，酸不穩(wěn)定基團(tuán)，光不穩(wěn)定基團(tuán)，肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)，或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，如上述專利所公開(kāi)，優(yōu)選二硫基和硫醚基。
            
抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物可通過(guò)多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯(dimethyladipimidate HCl))，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173723-737  )和N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)來(lái)提供二硫連接。
            
接頭可附著于美登木素生物堿分子的不同位點(diǎn)，這取決于連接的類型。例如，使用傳統(tǒng)的偶聯(lián)技術(shù)通過(guò)與羥基反應(yīng)形成酯連接。該反應(yīng)可出現(xiàn)在含有羥基的C-3位置，經(jīng)羥甲基修飾的C-14位置，經(jīng)羥基修飾的C-15位置，以及含羥基的C-20位置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登木醇或美登木醇類似物的C-3位置形成連接。
            
加利車霉素(calicheamicin)另一種目的免疫偶聯(lián)物包括抗-ANGPTL4抗體或偶聯(lián)于一或多個(gè)加利車霉素分子的抗-αVβ5抗體。抗體的加利車霉素家族能在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。加利車霉素家族的偶聯(lián)物的制備見(jiàn)美國(guó)專利5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296均屬于American Cyanamid Company)可使用的加利車霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于，γ1I，α2I，α3I，N-乙酰-γ1I，PSAG和θI1(Hinman et al.，CancerResearch 533336-3342(1993)，Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998)以及前述屬于American Cyanamid的美國(guó)專利)。另一種可與抗體偶聯(lián)的抗腫瘤藥物是QFA，其為抗葉酸素。加利車霉素和QFA具有細(xì)胞內(nèi)作用位點(diǎn)并不容易透過(guò)胞質(zhì)膜。因此，通過(guò)抗體介導(dǎo)的內(nèi)化進(jìn)行的這些藥劑的細(xì)胞吸收大大提高它們的細(xì)胞毒效應(yīng)。
            
其他抗體修飾涉及其他抗體修飾。例如，抗體可連接于各種非蛋白性聚合物，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇以及聚丙二醇的共聚物?？贵w也可包埋在通過(guò)例如凝聚技術(shù)或界面聚合在膠質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳液，納米顆?；蚣{米膠囊)或粗乳液中制備的微膠囊中(例如分別為羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊以及聚-(methylmethacylate)微膠囊。所述技術(shù)公開(kāi)于Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。
            
脂質(zhì)體和納米顆粒本文公開(kāi)的抗體還可在脂質(zhì)體中配制。例如，本發(fā)明的抗體也可配制成免疫脂質(zhì)體。含有所述抗體的脂質(zhì)體可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774030(1980)；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545。在美國(guó)專利5,013,566中公開(kāi)了循環(huán)時(shí)間已增加了的脂質(zhì)體。通常，脂質(zhì)體的配制和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
            
特別有用的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。通過(guò)使脂質(zhì)體在擠壓之下穿過(guò)指定孔徑大小的濾膜，可獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所述，經(jīng)二硫鍵交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。可選，化療劑(諸如Doxorubicin)可包含在脂質(zhì)體內(nèi)。見(jiàn)Gabizon et al.J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
            
其他用途本發(fā)明的抗體具有多種用途。例如，抗-ANGPTL4抗體可用于ANGPTL4或ANGPTL4片段的診斷實(shí)驗(yàn)中，例如，檢測(cè)其在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)，從而檢測(cè)疾病，例如檢測(cè)本發(fā)明所述的疾病等。一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4抗體可用于選擇可利用本發(fā)明提供的方法治療的患者群。本領(lǐng)域已知的各種診斷試驗(yàn)技術(shù)可使用，諸如，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，直接或間接夾心試驗(yàn)以及在異質(zhì)或同質(zhì)期進(jìn)行的免疫沉淀測(cè)定(Zola，Monoclonal AntibodiesAManual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)pp.147-158)。診斷實(shí)驗(yàn)中使用的抗體可用可檢測(cè)部分標(biāo)記。所述可檢測(cè)部分應(yīng)能直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。例如，所述可檢測(cè)部分可為放射同位素，諸如3H，14C，32P，35S，或125I，熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，諸如熒光素異硫氰酸酯，若丹明，或螢光素，或酶，諸如堿性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶。本領(lǐng)域已知的任何將抗體與可檢測(cè)部分偶聯(lián)的方法可使用，包括Hunter et al.，Nature，144945(1962)；David et al.，Biochemistry，131014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；and Nygren，J.Histochem.And Cytochem.，30407(1982)描述的方法。
            
抗-ANGPTL4抗體可用于對(duì)來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來(lái)源的ANGPTL4進(jìn)行親和純化。在該過(guò)程中，使用本領(lǐng)域已知的方法將抗ANGPTL4抗體固定于適宜支持物上，諸如Sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙。然后使該固定的抗體與含有待純化的ANGPTL4的樣品接觸，然后用可基本去除樣品中除外ANGPTL4的所有物質(zhì)的適宜溶劑洗滌支持物，其中的ANGPTL4結(jié)合于固定的抗體。最后，利用另一種適宜的溶劑洗滌支持物，將ANGPTL4從抗體釋放。
            
本發(fā)明多肽的共價(jià)修飾本發(fā)明的多肽例如多肽拮抗劑片段，融合分子(例如免疫融合分子)，本發(fā)明的抗體的共價(jià)修飾包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果可以，它們可通過(guò)化學(xué)合成或酶或化學(xué)裂解所述多肽來(lái)制備。其他類型的多肽共價(jià)修飾通過(guò)使靶向的多肽氨基酸殘基與能與選定的側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化藥劑反應(yīng)或?qū)⑿揎椀陌被峄蚍翘烊话被釗饺肷L(zhǎng)中的多肽鏈來(lái)導(dǎo)入分子，例如，Ellman et al.Meth.Enzym.202301-336(1991)；Noren et al.Science 244182(1989)；和，&US專利申請(qǐng)20030108885和20030082575。
            
半胱氨酰殘基通常與α-鹵代乙酸酯(以及相應(yīng)的胺)諸如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)產(chǎn)生羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酸殘基也通過(guò)與溴代三氟丙酮，α-溴代-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸，氯代乙酰磷酸(chloroacetylphosphate)，N-烷基馬來(lái)酰亞胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，p-對(duì)氯汞苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯代-7-硝基苯基-2-氧雜(oxa)-1，3-二唑。組氨酰殘基通過(guò)在pH 5.5-7.0與焦碳酸二乙酯反應(yīng)衍生化，這是因?yàn)樵撍巹?duì)于組氨酰側(cè)鏈的相對(duì)特異性。對(duì)-溴苯酰甲基溴也有用；該反應(yīng)通常在pH6.0在0.1mM二甲胂酸鈉中進(jìn)行。
            
賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸或其它羧酸酐反應(yīng)。利用這些試劑進(jìn)行衍生化對(duì)于反轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷有效。其它適宜衍生化含有α-氨基的殘基的藥劑包括亞氨酸酯，諸如甲代吡啶基亞氨酸甲酯(methyl picolinimidate)，磷酸吡哆醛，吡哆醛，氯代氫硼化物，三硝基苯磺酸，O-甲基異脲，2，4-戊二酮，和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。
            
精氨酰殘基通過(guò)與一或多種常規(guī)藥劑反應(yīng)來(lái)修飾，其中包括苯乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-肌醇和水合茚三酮。精氨酸殘基的衍生化需要在堿性條件中進(jìn)行反應(yīng)，因?yàn)殡夜δ芑鶊F(tuán)可pKa較高。此外，這些藥劑可與賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸epsilon-氨基基團(tuán)反應(yīng)。
            
酪氨酰殘基的具體修飾具體可通過(guò)與芳香重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)而將光譜標(biāo)記導(dǎo)入酪氨酰殘基。通常，N-乙酰咪唑(acetylimidizole)和四硝基甲烷可使用以分別形成O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。酪氨酰殘基利用125I或131I碘化以制備用于放射免疫測(cè)定的標(biāo)記的蛋白。
            
羧基側(cè)鏈(天冬氨酰或谷氨?；?通過(guò)與碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R’)反應(yīng)選擇性修飾，其中R和R’是不同的烷基基團(tuán)，諸如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-azonia-4，4-甲己胺)碳化二亞胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰殘基通過(guò)與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。
            
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基經(jīng)常被脫去酰胺基分別成為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫去酰胺基。這些殘基的脫酰胺基形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
            
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化形式，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的乙?；约叭我釩末端羧基酰胺化。
            
另一種類型的共價(jià)修飾涉及通過(guò)化學(xué)或酶的方法將苷類偶聯(lián)于本發(fā)明的多肽。這些方法的優(yōu)勢(shì)在于它們不需要在具有N或C-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽。根據(jù)所用偶聯(lián)模式，糖可連接于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如半胱氨酸的，(d)游離羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的那些，(e)芳香殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。這些方法在1987-9-11公開(kāi)的WO 87/05330以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
            
去除本發(fā)明多肽上存在的碳水化物部分可通過(guò)化學(xué)或酶的方法實(shí)現(xiàn)。化學(xué)去糖基化需要將多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。該處理導(dǎo)致除外連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖被裂解，而保持多肽完整。化學(xué)糖基化由Hakimuddin，et al.Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)and by Edge et al.Anal.Biochem.，118131(1981)描述。碳水化合物部分(例如抗體上的)的酶裂解可通過(guò)利用各種內(nèi)切和外切糖苷酶如Thotakura et al.Meth.Enzymol.138350(1987)所述實(shí)現(xiàn)。
            
本發(fā)明多肽的另一種共價(jià)修飾包括將多種非蛋白聚合物中的一種與多肽相連，所述聚合物例如聚乙二醇或聚氧乙烯，其方式如美國(guó)專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。
            
載體，宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明所述多肽可利用輕易可得的技術(shù)和材料重組制備。
            
為進(jìn)行本發(fā)明多肽例如ANGPTL4或抗ANGPTL4抗體，抗αvβ5抗體或抗血管生成抗體例如抗VEGF抗體的重組生產(chǎn)，分離編碼它的核酸并把核酸插入可復(fù)制的載體中進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。編碼糖蛋白的DNA易于利用傳統(tǒng)方法分離和測(cè)序(例如，通過(guò)使用能夠與編碼糖蛋白的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體的組分通常包括，但不限于，以下物質(zhì)中的一種或多種信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。
            
信號(hào)序列成分本發(fā)明的多肽不僅可直接被重組生產(chǎn)，也可以作為與異源多肽的融合蛋白被生產(chǎn)，該異源多肽優(yōu)選是信號(hào)序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位點(diǎn)的其它多肽。選定的異源信號(hào)序列優(yōu)選是可由宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即，由信號(hào)肽酶切割)的序列。對(duì)于不識(shí)別和加工天然多肽信號(hào)序列的原核細(xì)胞，信號(hào)序列由以下原核信號(hào)序列取代，例如選自堿性磷酸酶，青霉素酶，1pp，或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌物，天然信號(hào)序列可由例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)α-因子前導(dǎo)序列)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或WO 90/13646中所述的信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌性前導(dǎo)序列，例如，單純皰疹gD信號(hào)。
            
在閱讀框架中，此種前體區(qū)的DNA連接于編碼所述抗體的DNA。
            
復(fù)制成分的起點(diǎn)表達(dá)載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自我復(fù)制序列。這樣的序列在各種細(xì)菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母菌，多種病毒起點(diǎn)(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。復(fù)制組分的起點(diǎn)一般不是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體所必需的(SV40起點(diǎn)的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動(dòng)子)。
            
選擇基因成分表達(dá)載體和克隆載體應(yīng)該包含選擇基因，也稱選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
            
選擇方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物限制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇可以采用的藥物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。
            
適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的另一例選擇標(biāo)記是允許鑒定能攝取多肽核酸的細(xì)胞的那些標(biāo)記，如DHFR或胸苷激酶，金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等。
            
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞首先通過(guò)將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤(Mtx，為DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來(lái)進(jìn)行鑒定。當(dāng)采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞包括DHFR活性有缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
            
或者，宿主細(xì)胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼本發(fā)明多肽的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標(biāo)記如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后，可以通過(guò)在含有針對(duì)該選擇標(biāo)記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行選擇。參見(jiàn)美國(guó)專利4,965,199。
            
適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。Trp1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)記(Jones，Genetics，8512(1977))。此后，酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1損傷的存在提供了通過(guò)在缺乏色氨酸的條件中生長(zhǎng)而檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒來(lái)補(bǔ)充。
            
此外，源自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12185(1987)?？蛇x地，Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)報(bào)道了一種用于在乳克魯維酵母(K.lactis)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。已公開(kāi)由克魯維酵母的工業(yè)生產(chǎn)菌株產(chǎn)生分泌重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達(dá)載體。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
            
啟動(dòng)子成分表達(dá)載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識(shí)別的啟動(dòng)子，它與多肽核酸可操作相連。適用于原核宿主的啟動(dòng)子，包括phoA啟動(dòng)子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，和雜化啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。然而，也可以使用其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子。適用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還包含與編碼多肽的DNA可操作相連的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
            
真核生物的啟動(dòng)子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游70-80個(gè)堿基處有另一種序列CNCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作為一種信號(hào)用于將poly-A尾添加到編碼序列3’端。所有這些序列都適合于插入真核表達(dá)載體中。
            
適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))的啟動(dòng)子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
            
其它的酵母啟動(dòng)子，即那些還具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進(jìn)一步描述了適用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子聯(lián)合使用也是有利的。
            
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，從載體轉(zhuǎn)錄抗體可以受啟動(dòng)子調(diào)控，所述啟動(dòng)子例如來(lái)自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子，或者來(lái)自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等，來(lái)自熱休克蛋白的啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
            
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以作為還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。美國(guó)專利4,419,446中公開(kāi)了在哺乳動(dòng)物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來(lái)表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利4,601,978中敘述了對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的改進(jìn)。另見(jiàn)Reyes等，Nature，297598-601(1982)中關(guān)于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子控制下在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人β干擾素cDNA。可選地，可將勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。
            
增強(qiáng)子成分編碼本發(fā)明多肽的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體中來(lái)增加。目前已知很多哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。但通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)(late side)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。也可參見(jiàn)Yaniv，Nature，29717-18(1982)所述用于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。所述增強(qiáng)子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5’或3’位置，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’位置。
            
轉(zhuǎn)錄終止成分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體，還包括對(duì)轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通常來(lái)自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止元件是牛生長(zhǎng)激素多腺苷化區(qū)。見(jiàn)WO94/11026和其中公開(kāi)的表達(dá)載體。
            
宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化克隆或表達(dá)本文所述載體中DNA的適宜宿主細(xì)胞，包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬(Proteus)，沙門(mén)菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈霉菌(Streptomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些實(shí)例是用于說(shuō)明，并非限制。
            
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于抗體編碼載體的克隆或表達(dá)的宿主。釀酒酵母或常見(jiàn)的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個(gè)其它屬、種和株已有商品供應(yīng)，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278(1988))；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomycesoANGPTL4identalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉。
            
適合于表達(dá)糖基化多肽的宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的許可型昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛蟲(chóng))、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾(Bombyx mori)等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株公眾可以獲得，例如加利福尼亞Y級(jí)夜蛾(Autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草等的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
            
然而，關(guān)注最多的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或經(jīng)過(guò)再克隆以便能在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細(xì)胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；小鼠骨髓瘤細(xì)胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10169(1992))和SP2/0細(xì)胞(例如SP2/0-Ag14細(xì)胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤細(xì)胞，例如YB2/0細(xì)胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細(xì)胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌細(xì)胞系(HepG2)。
            
利用上述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以進(jìn)行抗體制備并培養(yǎng)在經(jīng)改進(jìn)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
            
培養(yǎng)宿主細(xì)胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞。作為商品提供的培養(yǎng)基例如Ham’s F10(Sigma)，極限必需培養(yǎng)基(Minimal EssentialMedium)((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)適宜培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)，美國(guó)專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國(guó)專利Re.30,985中所述的任何培養(yǎng)基可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。在需要時(shí)均可向這些培養(yǎng)基的任何一種補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(例如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)，微量元素(定義為無(wú)機(jī)化合物，通常終濃度在微摩爾范圍內(nèi))，和葡萄糖或?qū)Φ鹊哪茉础Ｒ部砂ū绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的適當(dāng)濃度的任何其它必需添加劑。培養(yǎng)條件，例如溫度，pH，等是此前選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，并且是本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。培養(yǎng)條件諸如溫度，pH等，是被選用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些條件，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。
            
多肽純化使用重組技術(shù)時(shí)，本發(fā)明的多肽例如ANGPTL4，抗-ANGPTL4抗體或抗-αvβ5抗體，或抗血管生成抗體可在細(xì)胞內(nèi)，壁膜間隙產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的多肽可收集自培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物。如果是膜結(jié)合的，其可利用適宜洗滌溶液(例如Triton-X 100)或通過(guò)酶促裂解釋放自膜。用于表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞可通過(guò)各種物理或化學(xué)方法破壞，諸如凍-干循環(huán)，超聲波降解法，機(jī)械破壞或細(xì)胞裂解劑。
            
需要從重組細(xì)胞蛋白或多肽純化本發(fā)明的多肽。以下步驟是適宜純化步驟的實(shí)例在離子交換柱上分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅膠上層析，在陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(諸如聚天冬氨酸柱，DEAE等)上進(jìn)行肝素SEPHAROSETM層析；色層焦集法；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝膠過(guò)濾；蛋白A瓊脂糖凝膠柱以去除污染物諸如IgG；以及金屬螯合柱以結(jié)合本發(fā)明多肽的表位標(biāo)記的形式。各種蛋白純化方法可使用，諸如本領(lǐng)域已知的那些以及在以下文獻(xiàn)中描述的那些Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrinciplesand Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。所選純化步驟有賴于例如使用的制備過(guò)程的性質(zhì)以及產(chǎn)生的具體的本發(fā)明的多肽。
            
例如，由細(xì)胞制備的抗體組合物可使用例如如下方法純化例如，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析，優(yōu)選親和層析作為常用的純化技術(shù)。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴于存在于糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人(γ1，γ2，或γ4重鏈的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G用于所有小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBO J.515671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)通常是瓊脂糖，但也可用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如孔徑被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用瓊脂糖獲得更快的流率而且加工時(shí)間更短。對(duì)于含有CH3區(qū)的抗體，Bakerbond ABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于純化。根據(jù)待回收的抗體，也可利用其它蛋白純化技術(shù)，例如上文所述那些。也見(jiàn)Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)，其描述用于分離分泌入大腸桿菌胞質(zhì)周隙的抗體的方法。
            
藥物組合物可以制備根據(jù)本發(fā)明使用的本發(fā)明的多肽，本發(fā)明的分子，及其組合的治療配制劑用于保存，方法是將具有適當(dāng)純度的所需分子例如多肽與可選的藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成凍干配制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對(duì)受者無(wú)毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或乙二醇(PEG)。
            
活性組分也可包埋在微膠囊中，所述微膠囊例如通過(guò)凝聚計(jì)數(shù)或通過(guò)界面聚合化，例如羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸酯(methylmethacylate)微膠囊，分別在膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球體，促乳液，納米顆?；蚣{米膠囊)或粗乳液中制備。所述技術(shù)公開(kāi)于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
            
一些實(shí)施方案中，用于體內(nèi)給藥的配制品必須是無(wú)菌的。在凍干和重建之前或之后通過(guò)除菌濾膜過(guò)濾可容易地實(shí)現(xiàn)無(wú)菌。
            
可制備緩釋制備物。緩釋制劑的適當(dāng)實(shí)例包括具有一定形狀且含有本發(fā)明化合物的固體疏水聚合物半通透基質(zhì)，如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實(shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國(guó)專利3773919，EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物諸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥乙酸使得能夠釋放分子100天以上，一些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間持續(xù)較短。當(dāng)包被的抗體在體內(nèi)保持較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，它們由于在37℃暴露于潮濕環(huán)境而發(fā)生變性和聚集，導(dǎo)致生物活性的喪失以及免疫原性的可能的改變?？筛鶕?jù)涉及的機(jī)制設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是細(xì)胞間通過(guò)硫代二硫化物交換形成S-S鍵，穩(wěn)定化可通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制適度含量、使用適宜的添加劑以及開(kāi)發(fā)具體的聚合物基質(zhì)組合物實(shí)現(xiàn)。也見(jiàn)，例如，US Patent No.6,699,501，其描述具有聚合電解質(zhì)覆蓋物的膠囊。
            
還涉及本發(fā)明的藥劑(ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑)可通過(guò)基因治療導(dǎo)入受試者?；蛑委熤竿ㄟ^(guò)將核酸給藥受試者進(jìn)行的治療。在基因治療應(yīng)用中，基因?qū)爰?xì)胞以實(shí)現(xiàn)治療有效的基因產(chǎn)物的體內(nèi)合成，例如通過(guò)取代有缺陷的基因。“基因治療”包括常規(guī)基因治療，其中可通過(guò)單次治療實(shí)現(xiàn)持續(xù)效應(yīng)，還包括給藥基因治療藥劑，其涉及一次或重復(fù)給藥治療有效的DNA或mRNA。反義RNA和DNA可用作阻斷一些基因在體內(nèi)表達(dá)的治療劑。見(jiàn)例如，本文描述的Ad-ANGPTL4-SiRNA。已經(jīng)顯示盡管短的反義寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)低濃度導(dǎo)致其細(xì)胞膜吸收有限，可將它們引入細(xì)胞，它們?cè)诩?xì)胞中作為抑制劑。(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA834143-4146(1986))。可修飾寡核苷酸提高它們的吸收，例如通過(guò)用不帶電的基團(tuán)取代它們帶負(fù)電的磷酸二酯基。基因治療方法的簡(jiǎn)述參見(jiàn)例如Goldspiel et al.Clinical Pharmacy 12488-505(1993)；Wu and Wu Biotherapy387-95(1991)；Tolstoshev Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan Science 260926-932(1993)；Morgan and Anderson Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；and May TIBTECH 11155-215(1993)。本領(lǐng)域通常已知的可用的重組DNA技術(shù)描述于Ausubel et al.eds.(1993)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY；and Kriegler(1990)Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。
            
存在多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入存活細(xì)胞。所述技術(shù)根據(jù)核酸轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，或在體內(nèi)轉(zhuǎn)入目的宿主的細(xì)胞而不同。適合將核酸導(dǎo)入體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)包括脂質(zhì)體，電穿孔，顯微注射，細(xì)胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸鈣沉淀法等。例如，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括但不限于例如，用病毒(通常是逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體的轉(zhuǎn)染和病毒包膜蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau etal.，Trends in Biotechnology 11，205-210(1993))。例如，體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括利用病毒載體(諸如腺病毒，I型單純皰疹病毒，慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺伴隨病毒)以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的有用的脂質(zhì)是例如DOTMA，DOPE和DC-Chol)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在基因治療中使用病毒載體的實(shí)例可見(jiàn)于Clowes et al. J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem et al.Blood 831467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy4129-141(1993)；Grossman and Wilson Curr.Opin.in Genetics and Devel.3110-114(1993)；Bout et a1.Human Gene Therapy 53-10(1994)；Rosenfeld etal.Science 252431-434(1991)；Rosenfeld et al.Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli et al.J.Clin.Invest.91225-234(1993)；and Walsh et al.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)。
            
一些情況中，需要對(duì)核酸來(lái)源提供靶向靶細(xì)胞的藥劑，諸如，特異于細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞的抗體，靶細(xì)胞受體的配體等。使用脂質(zhì)體的情況中，結(jié)合于內(nèi)吞相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白可用于靶向和/或促進(jìn)吸收，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在周期中經(jīng)過(guò)內(nèi)化的蛋白的抗體，靶向細(xì)胞內(nèi)定位并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)半壽期的蛋白。受體介導(dǎo)的胞內(nèi)吞作用的技術(shù)在例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；and Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中描述。基因標(biāo)記和基因治療方案的簡(jiǎn)述參見(jiàn)Anderson et al.，Science 256，808-813(1992)。
            
劑量和給藥本發(fā)明的分子根據(jù)已知方法給藥人患者，諸如作為藥團(tuán)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注，經(jīng)肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑，和/或皮下給藥。
            
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療涉及聯(lián)合給藥ANGPTL4拮抗劑和一或多種抗癌藥劑，例如抗血管生成藥劑。一個(gè)實(shí)施方案中，存在其它抗癌藥劑，例如一或多種不同的抗血管生成藥劑，一或多種化療劑等。本發(fā)明還涉及多重抑制物的給藥，例如相同抗原的多重抗體或不同癌活性分子的多重抗體一個(gè)實(shí)施方案中，不同化療劑的混合物可與ANGPTL4拮抗劑和/或一或多種抗血管生成藥劑一同給藥。聯(lián)合給藥包括共給藥，其利用分離的配制劑或單個(gè)藥物配制劑，和/或以任何順序連續(xù)給藥。例如ANGPTL4拮抗劑可在給藥抗癌藥劑之前、之后、交替給藥，或可同時(shí)給藥。一個(gè)實(shí)施方案中， 一個(gè)實(shí)施方案中，存在兩種(或所有)活性藥劑同時(shí)顯示它們的生物活性的時(shí)間段。
            
為了預(yù)防或治療疾病，適宜劑量的ANGPTL4拮抗劑將有賴于待治療疾病的類型，如上所述，疾病嚴(yán)重性和過(guò)程，抑制物給藥是為了預(yù)防和治療，以前的治療，患者臨床病史以及對(duì)抑制物的反應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷?？稍谝淮魏瓦B續(xù)多次的治療中將抑制物適宜地給藥患者。在聯(lián)用治療方案中，本發(fā)明的組合物以治療有效量或治療協(xié)同量給藥。如本發(fā)明所述，治療有效量是這樣的量，其使得本發(fā)明的組合物和/或ANGPTL4拮抗劑與一或多種其它治療劑的共給藥導(dǎo)致靶疾病或病癥的減輕或抑制。聯(lián)合給藥的效果可以是相加的。一個(gè)實(shí)施方案中，給藥的結(jié)果是協(xié)同效果。治療協(xié)同量是ANGPTL4拮抗劑以及一或多種其它治療劑(例如血管生成抑制劑)協(xié)同或明顯減輕或消除具體疾病相關(guān)的情形或癥狀所需的量。
            
根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度，大約1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑是給藥患者的初始候選劑量，給藥方式可為一或多次分開(kāi)的給藥或連續(xù)輸注。根據(jù)上述的因素，正常的日劑量可根據(jù)給藥途徑從每天大約10ng/kg到高達(dá)100mg/kg或更多，優(yōu)選大約1.g/kg/天到10mg/kg/天。對(duì)于在數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的重復(fù)給藥，治療持續(xù)到對(duì)疾病癥狀的理想的抑制出現(xiàn)。但是，也可采用其它劑量方案。通常，臨床醫(yī)師將給藥本發(fā)明的分子直到達(dá)到提供所需生物效應(yīng)的劑量。本發(fā)明治療的過(guò)程容易通過(guò)常規(guī)技術(shù)或測(cè)定法監(jiān)測(cè)。
            
例如，血管生成抑制劑例如抗-VEGF抗體諸如AVASTIN(Genentech)的制備和劑量方案可根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用或由有經(jīng)驗(yàn)的執(zhí)業(yè)者確定。另一實(shí)施方案中，所述化療劑的制備和劑量可根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用或由有經(jīng)驗(yàn)的執(zhí)業(yè)者確定。?；焺┑闹苽浜蛣┝恳裁枋鲇贑hemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
            
治療效力本發(fā)明治療的效力可通過(guò)用于評(píng)估腫瘤形成或非腫瘤形成疾病中常用的各種端點(diǎn)(endpoint)來(lái)測(cè)定。例如，癌癥治療可通過(guò)例如但不限于腫瘤衰退，腫瘤重量或體積減少，進(jìn)展時(shí)間，存活期，無(wú)進(jìn)展存活，總體反應(yīng)率，反應(yīng)持續(xù)時(shí)間以及生活質(zhì)量來(lái)評(píng)估。由于本發(fā)明描述的抗血管生成藥劑靶向腫瘤脈管系統(tǒng)而不一定是腫瘤細(xì)胞本身，它們是一類獨(dú)特的抗癌藥類型，由此需要獨(dú)特的臨床藥物反應(yīng)的測(cè)定和定義。例如，二維分析中超過(guò)50％的腫瘤縮小是表明反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)截留值。但是，本發(fā)明的抑制物可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的抑制而不減小原發(fā)腫瘤的體積，并且僅僅顯示腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。因此，測(cè)定治療效力的方法可使用，把歐哦例如測(cè)定血漿和尿的血管生成標(biāo)記以及通過(guò)放射影像測(cè)定反應(yīng)。
            
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于增加易患或診斷為患有非腫瘤或腫瘤疾病例如癌癥的人患者的存活時(shí)間。存活時(shí)間定義為首次給藥到死亡的時(shí)間。一方面，本發(fā)明的ANGPTL4拮抗劑于一或多種抗癌藥劑一同給藥人患者，由此與單一類型的治療相比有效增加患者的存活時(shí)間，例如與單一類型的治療相比增加大約5％，或大約10％，或大約20％，或大約30％，或大約40％，或大約50％或更多。
            
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供增加易患或診斷為患有非腫瘤或腫瘤疾病例如癌癥的患者的無(wú)進(jìn)展存活期的方法。疾病進(jìn)展的時(shí)間定義為給藥藥物直到疾病進(jìn)展的時(shí)間。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用ANGPTL4拮抗劑或一或多種抗癌藥劑的聯(lián)合給藥與單獨(dú)的抗癌治療相比明顯增加無(wú)進(jìn)展存活期至少約2個(gè)月，至少約4個(gè)月，至少約6個(gè)月，至少約8個(gè)月，一年以上。
            
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療明顯增加易患或診斷為患有癌癥并用各種治療劑治療的的人患者的組的反應(yīng)率。反應(yīng)率定義為應(yīng)答于治療的被治療患者的百分比。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用ANGPTL4拮抗劑以及一或多種抗癌藥劑的聯(lián)合治療使得與利用單一類型抗癌療法(例如單獨(dú)的化療)的患者的組相比，治療的患者組的反應(yīng)率明顯增加，所述增加具有例如小于0.010，小于0.005，或小于0.001的Chi-square p-值。
            
一方面中，本發(fā)明提供增加易患或診斷為患有癌癥的人患者或人患者的組的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。反應(yīng)持續(xù)時(shí)間定義為初次反應(yīng)到疾病進(jìn)展的時(shí)間。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明利用ANGPTL4拮抗劑以及一或多種抗癌藥劑的聯(lián)合治療可獲得反應(yīng)持續(xù)時(shí)間的例如至少2個(gè)月，至少4個(gè)月，至少6個(gè)月的統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯的增加。
            
制品在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了含有用于所述方法以及疾病治療的上述物質(zhì)的制品。該制品包含容器，標(biāo)簽和包裝插入物。合適的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器等。容器可由諸如玻璃或塑料等各種材料制成。該容器內(nèi)含有有效治療疾病的組合物且可以具有無(wú)菌入口(例如，該容器可以是具有通過(guò)皮下注射針頭可刺入的塞子的靜脈內(nèi)用溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性藥劑是ANGPTL4調(diào)節(jié)物。容器上的或者與其相連的標(biāo)簽指示該組合物用于治療選定的疾病。該產(chǎn)品還可包含第二個(gè)容器，該容器中含有藥用上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液，林格(Ringer′s)溶液和葡萄糖溶液。它還包含從商業(yè)和用戶角度需要的其它材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，過(guò)濾器，針頭，和注射器。
            
材料的保藏如前所述，下列材料保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA.20110-2209，USA(ATCC)  
            
     
            
按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在國(guó)際上認(rèn)可的用于專利程序的微生物保藏機(jī)構(gòu)并按其實(shí)施細(xì)則(布達(dá)佩斯條約)進(jìn)行這些保藏。這樣保證了該保藏物的活培養(yǎng)物從保藏日起維持30年。按布達(dá)佩斯條約的條款該保藏物由ATCC使其可獲得且按Genentech，Inc.與ATCC之間的協(xié)議進(jìn)行，該協(xié)議保證在相關(guān)美國(guó)專利頒發(fā)時(shí)或在任何美國(guó)或外國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)提供給公眾時(shí)，無(wú)論哪一個(gè)在先，該保藏物的培養(yǎng)物后代可持久和無(wú)限制地為公眾獲得，且保證按照35 USC§122和依據(jù)其委員會(huì)規(guī)定(包括具體參考886 OG 683的37 C.F.R.§1.14)對(duì)其授權(quán)的美國(guó)專利和商標(biāo)委員認(rèn)定的個(gè)人獲得其子代。
            
本申請(qǐng)的受讓人同意如果保藏的該材料的培養(yǎng)物在合適條件下培養(yǎng)時(shí)如果死亡導(dǎo)致丟失或破壞時(shí)，該材料將在通知時(shí)用另一相同材料迅速替換。該保藏材料的可獲得性不應(yīng)解釋為允許違反任何政府機(jī)構(gòu)按其專利法批準(zhǔn)的權(quán)利來(lái)實(shí)施本發(fā)明。
            
實(shí)施例應(yīng)理解本發(fā)明所述的保藏物，實(shí)施例以及實(shí)施方案僅僅用于說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解各種修飾或改變并且其包含在本申請(qǐng)及其權(quán)利要求的精神以及范圍內(nèi)。實(shí)施例中商業(yè)可得的藥劑根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明使用，除非另有說(shuō)明。
            
實(shí)施例1ANGPTL4刺激腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移腺病毒載體的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒構(gòu)建體已經(jīng)基本上按照生產(chǎn)商所述，將Not1-Not1 cDNA插入物克隆入Stratagene(LaJolla，CA)的Ad-easy載體構(gòu)建試劑盒的多接頭位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建。見(jiàn)例如，Hesser et al.，Blood，104(1)149-158(2004)。
            
hAngptl4(23-406)(PUR9384)，mAngptl4(184-410)-IgG(PUR9388)和mAngptl4(23-410)(PUR9452)單Flag標(biāo)記的蛋白的產(chǎn)生使收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物液體在抗-flag M2樹(shù)脂(Sigma#A-2220)上過(guò)夜。用PBS洗滌柱子到基線然后用50mM檸檬酸鈉pH3.0洗脫。該體積在Amicon-15 10,000MWCO(Millipore#UFC901024)上濃縮。最后的步驟是透析入1mM HCl/Super Q H2O和0.2um過(guò)濾。利用4-20％tris/甘氨酸(Invitrogen#EC6028box)SDS page凝膠+/-10mM DTT確定純度。通過(guò)質(zhì)譜或Edman’s n-末端測(cè)序鑒定正確的蛋白質(zhì)。
            
hAngptl4(184-406)-IgG(PUR 9441)n-末端標(biāo)記的產(chǎn)生以及隨后的n-末端hu Fc標(biāo)記的產(chǎn)生收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物液體在ProSep A(Amersham#113111835)上過(guò)柱過(guò)夜。用PBS洗滌柱子到基線。然后進(jìn)行四倍柱體積的0.5M TMAC/PBS pH 7.5洗滌步驟，之后利用PBS洗滌到基線。洗脫步驟利用50mM Na Citrate pH3.0泵。該體積在Amicon-15 10,000MWCO(Millipore#UFC901024)上濃縮。最終的步驟是透析入1mM HCl/Super Q H2O以及0.2um過(guò)濾。利用4-20％tris/甘氨酸(Invitrogen#EC6028box)SDS page凝膠+/-10mM DTT確定純度。通過(guò)質(zhì)譜或Edman’s n-末端測(cè)序鑒定正確的蛋白質(zhì)。重組蛋白也可利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
            
Ad-ANGPTL4-SiRNA的產(chǎn)生基于完整長(zhǎng)度hANGPTL4序列，產(chǎn)生4個(gè)可能的ANGPTL4-SiRNA分子(Qiagen)。基于siRNA抑制hANGPTL4表達(dá)的能力選擇一個(gè)ANGPTL4-SiRNA。其靶向ANGPTL4的以下DNA靶序列GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA(SEQ ID NO.3)，例如，r(GGCCAAGCCUGCCCGAAGAUU)(SEQ ID NO4)和/或r(UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC)(SEQ ID NO5)。利用RNA啟動(dòng)子將該SiRNA克隆入CMVpShuttle-H1.1轉(zhuǎn)移載體，所述啟動(dòng)子例如，H1啟動(dòng)子(GenScript)。SiRNA表達(dá)盒隨后被克隆以產(chǎn)生腺病毒AdhANGPTL4-SiRNA構(gòu)建體。腺病毒構(gòu)建體已經(jīng)基本上按照生產(chǎn)商的描述，通過(guò)將Not1-Not1cDNA插入物克隆入Stratagene(LaJolla，CA)的Ad-easy載體構(gòu)建試劑盒的多接頭位點(diǎn)中來(lái)構(gòu)建。見(jiàn)例如，Hesser et al.，Blood，104(1)149-158(2004)。
            
ANGPTL4的表達(dá)通過(guò)利用抗FLAG抗體進(jìn)行Western印跡分析來(lái)確認(rèn)。選擇一個(gè)強(qiáng)表達(dá)的克隆并根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明擴(kuò)大滴度。病毒制備物利用CsCl離心純化并通過(guò)PCR檢測(cè)回復(fù)體。病毒滴度通過(guò)96孔細(xì)胞裂解試驗(yàn)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明測(cè)定。這些載體，以及提供的pShuttleCMV-lacZ在BJ5183 electro感受態(tài)細(xì)菌中利用含有E1和E3區(qū)缺失的Ad5基因組的AdEasy載體進(jìn)行重組。原代病毒母液通過(guò)將重組的AdEasy質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染到宿主HEK293細(xì)胞中制備。腺病毒母液進(jìn)一步在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，并利用CsCl梯度純化方法如生產(chǎn)商所述進(jìn)行純化。腺病毒的工作滴度通過(guò)Elisa測(cè)定法獲得。
            
mANGPTL4的產(chǎn)生293細(xì)胞利用含有編碼全長(zhǎng)mANGPTL4(1-410)的核酸的構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。從上清純化上清并用于試驗(yàn)。
            
腫瘤細(xì)胞體外增殖ANGPTL4刺激人A673橫紋肌肉瘤腫瘤細(xì)胞(HTB1598)的體外增殖。見(jiàn)圖4，圖A。Ad-Angptl4，Ad-LacZ，Ad-Angptl13的腺病毒構(gòu)建體如前述產(chǎn)生(Hesser et al，Blood，104(1)149-158(2004))。A673細(xì)胞利用包含腺病毒-ANGPTL4構(gòu)建體(Ad-Angptl4)，腺病毒-LacZ構(gòu)建體(Ad-LacZ)對(duì)照，或腺病毒-ANGPTL3構(gòu)建體(Ad-Angptl3)的構(gòu)建體在感染復(fù)數(shù)(MOI)100進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。A673細(xì)胞在5％FCS高葡萄糖DMEM中生長(zhǎng)3天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞。如圖4，圖A所示，Ad-Angptl4刺激腫瘤細(xì)胞增殖。與Ad-LacZ對(duì)照相比，用Ad-Angptl4處理的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目增加超過(guò)2倍。與對(duì)照相比，Ad-Angptl4也刺激MCF7細(xì)胞的增殖(人乳腺腺癌)大約3倍，TK10細(xì)胞(腎細(xì)胞癌系)大約2倍，A549細(xì)胞(人肺癌)大約1.5倍。Ad-Angptl4也刺激U87MG細(xì)胞增殖。見(jiàn)，圖4，圖B，其中細(xì)胞(A673，U87M G，4T-1，或Caki)用含有以下構(gòu)建體的構(gòu)建體以感染復(fù)數(shù)(MOI)500感染腺病毒-ANGPTL4構(gòu)建體(Ad-Angptl4(2))，腺病毒-LacZ構(gòu)建體(Ad-LacZ(1))對(duì)照，或腺病毒ANGPTL4-SiRNA構(gòu)建體(3)。細(xì)胞在5％FCS高葡萄糖DMEM中生長(zhǎng)2-3天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞。
            
ANGPTL4轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS細(xì)胞的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基也誘導(dǎo)A673細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖4，圖C。將肝細(xì)胞(Hepa)(A)，人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)(B)，或用腺病毒載體(Ad-Angptl4(2)，Ad-LacZ(1)或Ad-Angptl3(3))轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS7(C)的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(上清)加入A673細(xì)胞。A673細(xì)胞在5％FCS高葡萄糖DMEM中生長(zhǎng)4天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞。如圖4的圖C所示，COS細(xì)胞+Ad-Angptl4的上清與對(duì)照和所用其它細(xì)胞類型例如Hepa細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞的上清相比刺激腫瘤細(xì)胞增殖。
            
包被在培養(yǎng)皿上時(shí)的Angptl4活性Angptl4對(duì)A673細(xì)胞的增殖刺激作用通過(guò)將蛋白包被于培養(yǎng)皿上檢測(cè)。板利用小鼠Angptl4，LZ-hANgptl4，纖連蛋白，NL4對(duì)照蛋白，IgG-hAngptl4(184-406)，mAngptl3，hAngptl3，mAngptl4(23-410)，Lz-hAngptl4(184-406)，F(xiàn)c-hAngptl4(184-406)或BSA，以各種濃度包被，例如無(wú)包被，0.3μg/ml，3.0μg/ml或30μg/ml。96-孔平底板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)在4℃包被過(guò)夜。收獲人A673腫瘤細(xì)胞并在含5％FCS的HG-DMEM培養(yǎng)基中稀釋到105細(xì)胞/ml。將200μl中的細(xì)胞懸液(104細(xì)胞/孔)加入包被的孔并將板在37℃保溫所選時(shí)間。非粘附性細(xì)胞通過(guò)PBS洗滌去除，并利用結(jié)晶紫或Landegren的PNAG法測(cè)定細(xì)胞粘附。見(jiàn)，Landegren，U.(1984)J.Immunol.Methods 67379-388。結(jié)果分別以一式三份的孔的平均OD550或OD405值表示。
            
類似地，收獲分離自人臍帶或人腎(Cambrex)的人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上皮(epi)和系膜(mesa)細(xì)胞并利用相同條件檢測(cè)。對(duì)于增殖實(shí)驗(yàn)，采用生產(chǎn)商(Cambrex)提供的用于每種細(xì)胞類型的培養(yǎng)基。ANGPTL4不誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，但誘導(dǎo)A673細(xì)胞增殖(圖5)。
            
ANGPTL4與A673細(xì)胞結(jié)合的FACS分析ANGPTL4與人A673細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)FACS分析檢測(cè)。將A673細(xì)胞以500,000-1×106細(xì)胞/樣品孔鋪于10cm培養(yǎng)皿中。FACS前細(xì)胞分裂。細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后加入10ml 20mM EDTA的PBS溶液并保溫10-20分鐘。20分鐘后，將細(xì)胞從板刮出。加入10ml 5％FCS的PBS溶液并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml Falcon管中。細(xì)胞在4℃、1.8K rpm離心5分鐘。去除上清并將細(xì)胞重懸于1ml含5％FCS的PBS溶液。將100μl細(xì)胞懸液分配到5ml含有1μg蛋白的試管中并在冰上孵育30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。使用以下蛋白mAngptl4(23-410)，PUR 9452，0.428mg/ml(2μl/樣品)；hAngptl4(23-406)，PUR 9384，+/-90μg/ml(10μl/樣品)；hAngptl4(184-406)-IgG，PUR 9441，1.5mg/ml(1μl/樣品)；和對(duì)照FLAG-BAP(Sigma)0.1mg/ml(2μl/樣品)。保溫后，將管內(nèi)充滿5ml含5％FCS的PBS溶液，置于冰上。細(xì)胞在2K rpm離心5分鐘。去除上清。加入抗-FLAG-FITC抗體(Sigma)(2μl抗體(100μg/ml母液)并在冰上孵育5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。最終的抗體濃度為1μg/ml。加入5ml 5％FCS的PBS溶液并在4℃以1.8K rpm離心細(xì)胞5分鐘。去除上清并將細(xì)胞重懸于含有5％FCS的0.25ml PBS，置于冰上。也可存在0.05％疊氮化鈉以防止受體內(nèi)化。每份樣品中加入1μl 1∶50稀釋的碘化丙啶(PI)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FACS。各種形式的ANGPTL4包括人和小鼠ANGPTL4在各種條件下(圖6，圖B)，常氧，低氧(0％O2，24小時(shí)，或PMA(200nM、24小時(shí))結(jié)合A673細(xì)胞(圖6，圖A)。對(duì)于低氧實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞在37℃、5％CO2，95％N2保溫箱中保溫24小時(shí)。可選，細(xì)胞在200nM佛波醇酯(PMA)存在下，在37℃保溫箱中，5％CO2和常氧條件下活化。
            
來(lái)自表達(dá)ANGPTL4的細(xì)胞的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基檢驗(yàn)A673細(xì)胞在利用表達(dá)Angptl4的細(xì)胞的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基和加入重組Angptl4的條件下的增殖。將來(lái)自用腺病毒構(gòu)建體(Ad-Angptl4(2)，Ad-LacZ(1)或Ad-LacZ+rmAngptl4(23-410)(3)(5μg/ml))轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS7細(xì)胞的500μl經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(上清)加入A673細(xì)胞。細(xì)胞在含有5％FCS、高葡萄糖DMEM的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天后(圖7，圖A)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。A673的增殖也通過(guò)將重組Angptl4加入具有5％FCS的培養(yǎng)基并使細(xì)胞生長(zhǎng)4天來(lái)檢測(cè)。培養(yǎng)基中按照所示的濃度加入沒(méi)有加入物質(zhì)(1)，緩沖液對(duì)照(2)，mAngptl4(23-410)(2.5μg/ml)(3)，hAngptl4(23-406)(2.5μg/ml)(4)，hIgG-hAngptl4(184-406)(2.5μg/ml)(5)或hIgG-mAngptl4(184-410)(2.5μg/ml)(6)。細(xì)胞在含有5％FCS、高葡萄糖DMEM的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4天(圖7，圖B)后，計(jì)數(shù)細(xì)胞。來(lái)自表達(dá)ANGPTL4或加入培養(yǎng)基的重組蛋白的細(xì)胞的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)A673細(xì)胞的增殖的作用可為細(xì)胞密度依賴性的。見(jiàn)圖7圖A(細(xì)胞在所示條件下生長(zhǎng)7天的細(xì)胞增殖)和圖B(細(xì)胞在所示條件下生長(zhǎng)4天的細(xì)胞增殖)。
            
Angptl4誘導(dǎo)細(xì)胞遷移我們檢驗(yàn)了Angptl4誘導(dǎo)小鼠4T-1腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞遷移的能力。細(xì)胞活動(dòng)力如所描述那樣測(cè)定(見(jiàn)例如，Camenisch，et al.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002))，其中利用孔徑為3μm的HTS多孔組織培養(yǎng)插入物(Becton Dickinson，NJ)。將hANGPTL4(1-406)稀釋于50/50/0.1％BSA中使其濃度達(dá)到5，1和0.2μg/ml。作為陽(yáng)性對(duì)照，將膜與含有10％胎牛血清(FCS)或0.1μg/ml重組人PDGF-BB(R&D Systems)的培養(yǎng)基一起溫育。使用50/50/0.1％BSA作為陰性對(duì)照。小鼠4T1腫瘤細(xì)胞利用PBS洗滌三次并以105細(xì)胞/ml大約重懸于50/50/0.1％BSA。檢測(cè)以下細(xì)胞制備物，其中mANGPTL4表示為NL2。
            
     
            
將制備物加入底部小室并將制備物在37℃保溫19小時(shí)。
            
將細(xì)胞懸液(250μl)加入上方小室并允許細(xì)胞在37℃、5％CO2加濕的保溫箱中遷移過(guò)夜。保溫后，從上方和底部小室中吸出培養(yǎng)基，遷移到膜下表面的細(xì)胞用甲醇固定(400μl MeOH4℃固定30分鐘，去除MeOH并風(fēng)干40分鐘)并用YO-PRO-1碘化物(Molecular Probes，OR)(400μl YO-PRO-1碘化物，濃度10μm(1∶100，來(lái)自1mM母液))染色。遷移結(jié)果利用Openlab軟件(Improvision，MA)在20倍放大率下定量為細(xì)胞平均數(shù)/顯微鏡視野。
            
另一實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Angptl4誘導(dǎo)A673細(xì)胞隨4T-1腫瘤細(xì)胞的遷移一起遷移。mANGPTL4在50/50/0.1％BSA中稀釋到6，1.5和0.375μg/ml。作為陽(yáng)性對(duì)照，將膜與含有10％胎牛血清(FCS)或0.1μg/ml重組人PDGF-BB(R&D Systems)的培養(yǎng)基一起溫育。使用50/50/0.1％BSA作為陰性對(duì)照。收獲4T1和A673細(xì)胞并重懸于50/50/0.1％BSA(2×105細(xì)胞/ml)。檢測(cè)以下細(xì)胞制備物，其中mANGPTL4表示為NL2。
            
     
            
將750μl制備物加入底部小室并將制備物在37℃保溫19小時(shí)。
            
將細(xì)胞懸液(250μl)(5×104)加入上方小室并允許細(xì)胞在37℃、5％CO2加濕的保溫箱中遷移過(guò)夜。保溫后，從上方和底部小室中吸出培養(yǎng)基，遷移到膜下表面的細(xì)胞用甲醇固定(400μl MeOH4℃固定30分鐘，去除MeOH并風(fēng)干40分鐘)并用YO-PRO-1碘化物(Molecular Probes，OR)(400μlYO-PRO-1碘化物，濃度10μm(1∶100，來(lái)自1mM母液))染色。遷移結(jié)果利用Openlab軟件(Improvision，MA)在20倍放大率下定量為細(xì)胞平均數(shù)/顯微鏡視野。見(jiàn)，圖9，其中(1)未添加血清，(2)10％胎牛血清(FCS)，(3)PDGF-BB，(4)ANGPTL4。利用ANGPTL4和10％FCS的情況中，A673和4T-1細(xì)胞遷移。因此，Angptl4拮抗劑可用于抑制轉(zhuǎn)移，例如不受任何理論限制，通過(guò)防止腫瘤細(xì)胞遷移進(jìn)行。
            
ANGPTL4在體內(nèi)增加腫瘤體積人A673橫紋肌肉瘤細(xì)胞(HTB 1598)如前所述進(jìn)行培養(yǎng)(Kim et al.，Nature 362841-844(1993)；and，Gerber et al.，Cancer Research，606253-6258(2000))。將0.1ml Matrigel中的5×106A673細(xì)胞s.c.注入淺褐色裸小鼠(Harlan Sprague Dawley)的背側(cè)肋區(qū)以建立異種移植物。腺病毒構(gòu)建體以1×108噬斑形成單位(PFU)，腫瘤內(nèi)(IT)，q7d在第1，7和14天注入?？蓮膫?cè)面和下方利用28-號(hào)(gauge)針和0.5ml結(jié)核菌素注射器直接注入腫瘤體。腺病毒構(gòu)建體可為腺病毒-ANGPTL4構(gòu)建體(Ad-Angptl4)，腺病毒-LacZ構(gòu)建體(Ad-LacZ)對(duì)照或腺病毒-ANGPTL3構(gòu)建體(Ad-Angptl3)。腫瘤大小在腫瘤植入后的各個(gè)天數(shù)測(cè)定。腫瘤體積測(cè)定每隔一天進(jìn)行，并利用橢圓體積公式(π/6×L×W×H，其中L＝長(zhǎng)度，W＝寬度，H＝高度；Tomayko & Reynolds，Cancer Chemother.Pharmacol.，24148-154(1989))計(jì)算腫瘤體積。如圖8中所示，在注入A673細(xì)胞和腺病毒-ANGPTL4構(gòu)建體(Ad-Angptl4)的小鼠中，與注入Ad-LacZ或Ad-Angptl3構(gòu)建體的小鼠相比，腫瘤體積(圖A)和重量(圖B)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上增加(P＜0.0001)。
            
實(shí)施例2利用ANGPTL4治療的腫瘤逃離抗VEGF治療的趨勢(shì)ANGPTL4刺激用抗血管生成藥劑例如抗-VEGF(諸如AVASTIN(Genentech，South San Francisco)治療的腫瘤中的腫瘤細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖8，圖C。人A673橫紋肌肉瘤細(xì)胞(HTB 1598)如前所述培養(yǎng)(Kim et al.，Nature362841-844(1993)；和Gerber et al.，Cancer Research，606253-6258(2000))。0.1ml Matrigel中的5×106A673細(xì)胞s.c.注入淺褐色裸小鼠(Harlan SpragueDawley)的背側(cè)肋區(qū)以建立異種移植物。腺病毒構(gòu)建體以1×108噬斑形成單位(PFU)，腫瘤內(nèi)(IT)，q7d在第1，7和14天注入。腺病毒構(gòu)建體可為腺病毒-ANGPTL4構(gòu)建體(Ad-Angptl4)，腺病毒-LacZ構(gòu)建體(Ad-LacZ)對(duì)照或腺病毒-ANGPTL3構(gòu)建體(Ad-Angptl3)。小鼠也用Avastin(Genentech)以5mg/kgip一周兩次治療。可從側(cè)面和下方利用28-號(hào)(gauge)針和0.5ml結(jié)核菌素注射器直接注入腫瘤體。腫瘤大小在腫瘤植入后的各個(gè)天數(shù)測(cè)定。腫瘤體積測(cè)定每隔一天進(jìn)行，并利用橢圓體積公式(π/6×L×W×H，其中L＝長(zhǎng)度，W＝寬度，H＝高度；Tomayko & Reynolds，Cancer Chemother.Pharmacol.，24148-154(1989))計(jì)算腫瘤體積。如圖8的圖C中所示，聯(lián)用AVASTIN治療的情況下，在注入A673細(xì)胞和腺病毒-ANGPTL4構(gòu)建體(Ad-Angptl4)的小鼠(盡管它們已經(jīng)用AVASTIN處理)中，與注入含有Ad-LacZ或Ad-Angptl3構(gòu)建體的細(xì)胞的小鼠相比，腫瘤體積增加.  
            
實(shí)施例3結(jié)合ANGPTL4的抗體抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)抗-ANGPTL4抗體抑制ANGPTL4生物活性例如腫瘤細(xì)胞增殖能力。將1×104腫瘤細(xì)胞(例如HeLa-S3，Caki，U87MG，293，A673，HM7和Calu6)/孔鋪于12孔板的含10％FCS的培養(yǎng)基中。允許細(xì)胞在37℃、5％CO2加濕的保溫箱中保溫過(guò)夜。培養(yǎng)基換成5％FCS(除了Calu 6細(xì)胞，其在10％FCS中)，并將1，2.5，5，或10μg/ml抗-hANGPTL4抗體或抗-Dscr加入孔或不向孔中加入抗體。板置于37℃、5％CO2加濕的保溫箱中。加入抗-hANGPTL4抗體2或3天后計(jì)數(shù)細(xì)胞?？?ANGPTL4抗體抑制HeLa-S3，CakiU87MG，293，A673，和Calu 6的細(xì)胞生長(zhǎng)，但不抑制HM7細(xì)胞的生長(zhǎng)。見(jiàn)，圖10，圖A和B。
            
實(shí)施例4制備結(jié)合ANGPTL4的抗體產(chǎn)生多克隆抗體和單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在本發(fā)明描述。可使用的抗原(或免疫原)包括純化的本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，包含所述蛋白的融合蛋白，以及在細(xì)胞表面表達(dá)重組蛋白和/或蛋白片段的細(xì)胞?？乖倪x擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)而進(jìn)行。
            
小鼠，諸如Balb/c，利用在完全弗氏佐劑中乳化的抗原免疫，并皮下或腹腔內(nèi)諸如1-100mg的量?？蛇x，抗原在MPL-TDM佐劑(RibiImmunochemical Research，Hamilton，Mont.)中乳化，并注入動(dòng)物后足墊。10-12天后，免疫的小鼠隨后利用所選佐劑中乳化的附加抗原來(lái)增強(qiáng)。數(shù)周后，小鼠也可用附加免疫注射增強(qiáng)。血清樣品可定期通過(guò)眶后取血獲得，用于用來(lái)檢測(cè)抗體的ELISA測(cè)定法。
            
檢測(cè)到適宜抗體滴度以后，可向抗體“陽(yáng)性”動(dòng)物最后靜脈內(nèi)注入給定配體。3-4天后，處死小鼠并收獲脾細(xì)胞。然后將脾細(xì)胞(利用35％聚乙二醇)融合于選定的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系諸如P3X63AgU.1，其可得自ATCC，No.CRL 1597。融合物產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，所述細(xì)胞可隨后鋪于含有用于抑制非融合細(xì)胞、骨髓瘤雜合子以及脾細(xì)胞雜合子的HAT(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)板。
            
在ELISA中篩選雜交瘤細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。本發(fā)明分泌所需抗ANGPTL4的單克隆抗體的“陽(yáng)性”雜交瘤細(xì)胞的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易進(jìn)行的。
            
可將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹腔注入同基因Balb/c小鼠產(chǎn)生含有抗-ANGPTL4單克隆抗體的腹水。可選，雜交瘤細(xì)胞可生長(zhǎng)在組織培養(yǎng)燒瓶或搖瓶中。腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體的純化可利用硫酸銨沉淀，然后通過(guò)凝膠大小排阻層析實(shí)現(xiàn)?？蛇x，基于抗體與蛋白A或蛋白G的結(jié)合的親和層析也可使用。
            
例如，多克隆兔抗體通過(guò)用大腸桿菌中產(chǎn)生的500μg重組人ANGPTL4蛋白(23-406)在第1，40和70天免疫兔子進(jìn)行。第80和120天收獲血清，通過(guò)蛋白A-sephadex柱純化抗體。
            
實(shí)施例5封閉型或中和型抗體本文所述針對(duì)抗原的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)例如ELISA鑒定。例如，板可利用目的多肽例如ANGPTL4或其片段包被，并與針對(duì)該多肽例如，ANGPTL4產(chǎn)生的抗體一起保溫(見(jiàn)例如，美國(guó)專利6,348,350，6,372,491和6,455,496中的描述)。結(jié)合的抗體可通過(guò)各種方法檢測(cè)。
            
拮抗劑(例如封閉或中和型)抗體可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和/或活性測(cè)定來(lái)鑒定。例如，ANGPTL4的表達(dá)刺激腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、粘附或結(jié)合αVβ5整合素。封閉或中和型ANGPTL4抗體的確定可通過(guò)抗體阻斷腫瘤細(xì)胞增殖(見(jiàn)例如，圖10，圖A和B，D和E)、遷移、粘附(見(jiàn)例如圖12)或結(jié)合αVβ5(USBiological，37K，Swampscott，Massachusetts)(見(jiàn)例如，圖13，圖B和C)的能力顯示。例如，A673橫紋肌肉瘤細(xì)胞可鋪板并與來(lái)自用Ad-hAngptl4轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS7細(xì)胞的上清以及抗-ANGPTL4抗體，或?qū)φ湛贵w或PBS一起保溫。數(shù)天后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。減少細(xì)胞數(shù)目的抗體被鑒定為封閉型或中和型抗體。也顯示ANGPTL4誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移并為促血管生成因子。見(jiàn)例如，LeJan et al.，American Journal of Pathology，164(5)1521-1528(2003)。因此，封閉型或中和型抗ANGPTL4抗體可利用抗體和ANGPTL4在腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和/或血管生成實(shí)驗(yàn)例如CAM實(shí)驗(yàn)中測(cè)定。
            
可用于阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或阻斷或減慢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的封閉型或中和型抗ANGPTL4抗體也可通過(guò)使用腫瘤細(xì)胞在上述培養(yǎng)物和/或在Beige/裸小鼠研究中鑒定。例如，可向裸小鼠中注入腫瘤細(xì)胞。腫瘤生長(zhǎng)確定后的各個(gè)時(shí)間，經(jīng)腹腔向小鼠注入各種劑量的封閉型或中和型ANGPTL4抗體，抗體對(duì)照，或PBS，一周依次或兩次。腫瘤大小可每周測(cè)定，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)論得出時(shí)可切除腫瘤并稱重。封閉型或中和型抗ANGPTL4抗體可鑒定為阻斷或減慢小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的抗體。
            
阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或阻斷或減慢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的ANGPTL4抗體與抗血管生成藥劑的組合可通過(guò)利用上述腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物和/或Beige/裸小鼠研究中鑒定。如上所述，可對(duì)裸小鼠注入腫瘤細(xì)胞。腫瘤生長(zhǎng)確定后的各個(gè)時(shí)間，，經(jīng)腹腔向小鼠注入各種劑量的ANGPTL4拮抗劑與抗癌藥劑例如抗血管生成藥劑諸如抗-VEGF抗體的組合，或抗ANGPTL4拮抗劑，或抗癌藥劑，或抗體對(duì)照，或PBS，一周依次或兩次。腫瘤大小可每周測(cè)定，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)論得出時(shí)可切除腫瘤并稱重?？设b定阻斷或減慢小鼠中腫瘤生長(zhǎng)、或與對(duì)照或單獨(dú)的藥劑相比增強(qiáng)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的阻斷或減慢作用的ANGPTL4拮抗劑與抗癌藥劑的組合治療。
            
實(shí)施例6ANGPTL4變體利用標(biāo)準(zhǔn)誘變?cè)噭┖?例如QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen，Carlsbad，California))根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明制備變體ANGPTL4。在人ANGPTL4序列中產(chǎn)生兩個(gè)氨基酸突變(見(jiàn)例如圖2)。所述取代位于位置162和164(R162G和R164E)，導(dǎo)致RKR變?yōu)镚KE。ANGPTL4蛋白(L280質(zhì)粒，aa 1-406)或變體ANGPTL4分離自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的上清。為了純化，將上清加載于鎳柱上。蛋白通過(guò)Western印跡利用抗-FLAG-HRP抗體檢測(cè)。見(jiàn)，圖3，圖B。進(jìn)行取代并將變體ANGPTL4與天然或野生型ANGPTL4蛋白進(jìn)行比較時(shí)，通過(guò)Western印跡發(fā)現(xiàn)變體ANGPTL4具有高于天然ANGPTL4的分子量。天然蛋白的位置162和164的PKR到GKE的取代防止ANGPTL4的蛋白水解降解。
            
實(shí)施例7Angptl4結(jié)合整合素αVβ5血管生成素是分泌型因子，其通過(guò)經(jīng)由它們的纖維蛋白原(FBN)-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體Tie2調(diào)節(jié)血管生成。發(fā)現(xiàn)分泌的配體的家族中存在的螺旋區(qū)對(duì)于配體寡聚化是必需的(見(jiàn)例如，Procopio et al.，J.Biol.Chem.，27430196-201(1999))。
            
類似血管生成素，ANGPTL3和ANGPTL4是分泌型糖蛋白，每種都由N末端信號(hào)肽然后是螺旋區(qū)和C末端FBN樣結(jié)構(gòu)域組成。確定了ANGPTL3通過(guò)FBN樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合αVβ3。我們確定了ANGPTL4結(jié)合αVβ5。檢測(cè)αVβ5整合素穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293-1953細(xì)胞系結(jié)合或粘附ANGPTL4包被的板的能力。收獲細(xì)胞并在不含血清、包含以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中稀釋到105細(xì)胞/mlPBS，1％BSA，1mM CaCl2和1mM MgCl2。細(xì)胞與抗-整合素αVβ5抗體(MAB1961(Chemicon，Temecula，CA))或肽或不與上述物質(zhì)一起37℃預(yù)保溫15分鐘。將重組mANGPTL4，BSA或玻連蛋白(1μg，3μg，10μg，或30μg/ml)包被在Nunc Maxisorp 96-孔平底微量滴定板上，4℃過(guò)夜，并用200μl含3％BSA的磷酸緩沖液(PBS)，pH7.4，37℃封閉1.5小時(shí)。將細(xì)胞懸液(5×104細(xì)胞/100μl/孔(5×105/ml))加入包被的板并將板在37℃保溫5.5小時(shí)。未粘附的細(xì)胞用PBS洗滌去除，通過(guò)加入200μl CyQuant GD Dye(Molecular Probes(Invitrogen detection Technologies(Carlsbad，California))(1∶400)/細(xì)胞裂解緩沖液并保溫2-5分鐘來(lái)測(cè)定細(xì)胞粘附。樣品熒光度利用480nm最大激發(fā)和520nm最大發(fā)射來(lái)測(cè)定?？墒褂肔anndegren的PNAG法(見(jiàn)例如，Landegren，J.Immunol.Methods，67379-388(1984))。與陰性對(duì)照BSA相比，表達(dá)αVβ5的細(xì)胞顯示與ANGPTL4和陽(yáng)性對(duì)照玻連蛋白的粘附(USBiological，Swampscott，Massachusetts。見(jiàn)圖11。
            
為測(cè)定αVβ5整合素是否足以介導(dǎo)ANGPTL4細(xì)胞粘附，在細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)封閉型抗體抑制粘附的能力。將功能性封閉型抗體(抗-αVβ5抗體(MAB1961(Chemicon，Temecula，CA))或抗-hANGPTL4抗體)加入293-1953細(xì)胞然后與蛋白(BSA(1)，玻連蛋白(2)或ANGPTL4(3))包被的孔保溫。見(jiàn)圖12?？?αVβ5和抗-ANGPTL4抗體消除了ANGPTL4細(xì)胞粘附活性。
            
進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)確定ANGPTL4結(jié)合αVβ5。進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(184-406)是否結(jié)合αVβ5(USBiological，37K，Swampscott，Massachusetts)包被的板。100μl/孔整合素αVβ5稀釋液(1μg/ml包被緩沖液(50mM碳酸鹽/重碳酸鹽，pH9.6))和包被緩沖液一起在4℃保溫過(guò)夜。用洗滌緩沖液(PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，并加入100μl/孔封閉緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA)，在室溫輕輕攪拌1小時(shí)。各種量(0，0.070μg，0.22μg，0.66μg，2μg，或6μg)的樣品，mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(184-406)在樣品緩沖液(0.5％BSA，50mM Tris，pH7.4，0.05％Tween 20，1mM MnCl2，50μMCaCl2，50μMMgCl2，100mM NaCl)中進(jìn)行準(zhǔn)備并保溫30分鐘。將樣品加入板(100μl/孔，按照上文所示的量)并在室溫保溫2小時(shí)同時(shí)輕輕攪拌。用緩沖液洗滌板，以100μl/孔加入含有抗-Flag-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)(100ng/ml)(Jackson，#109-036-098)的測(cè)定緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)，并在室溫保溫1小時(shí)同時(shí)輕輕攪拌。洗滌板。加入100μl/孔四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Moss，Inc.)，室溫在板中保溫直到出現(xiàn)好的顏色。加入100μl/孔終止溶液(1M H3PO4)終止反應(yīng)。在630nm讀板。mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端和IgG-hANGPTL4-C-末端結(jié)合αVβ5包被的板，但與板結(jié)合的IgG-hANGPTL4-C末端稍多。見(jiàn)圖13，圖A。
            
抗-ANGPTL4抗體抑制ANGPTL4與αVβ5包被的板結(jié)合。進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。4℃保溫100μl/孔的整合素αVβ5稀釋液(1μg/ml包被型緩沖液(50mM碳酸鹽/重碳酸鹽，pH9.6))和包被緩沖液過(guò)夜。用洗滌緩沖液(PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，并加入100μl/孔的封閉緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA)在室溫輕輕攪動(dòng)1小時(shí)。將0.6μg-6.0μg樣品，mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(183-406)，在樣品緩沖液中(0.5％BSA，50mM Tris，pH7.4，0.05％Tween 20，1mM MnCl2，50μMCaCl2，50μMMgCl2，100mM NaCl)與抗-ANGPTL4抗體(1.5μg)或抗-Dscr(1.5μg)一同保溫30分鐘。保溫后，將100μl/孔樣品+/-抗體與板在室溫一起保溫2小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。板用緩沖液洗滌并加入實(shí)驗(yàn)緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)中的100μl/孔抗-Flag-HRP(100ng/ml)，在室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。洗滌板并加入100μl/孔的TMB，室溫在板中保溫直到出現(xiàn)良好的顏色。加入100μl/孔終止溶液(1M H3PO4)來(lái)終止反應(yīng)。在630nm讀板。與抗-Dscr抗體，5G7單克隆抗體或培養(yǎng)基相比，抗-ANGPTL4抗體降低結(jié)合于αVβ5包被的板的mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端和IgG-hANGPTL4-C末端的量。見(jiàn)，圖13，圖B。
            
另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，ANGPTL4與整合素αVβ5的結(jié)合通過(guò)ELISA顯示。在該實(shí)驗(yàn)中，將80μl/孔的hANGPTL4-C末端，玻連蛋白或BSA(5μg/ml)加入包被緩沖液(50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽，pH9.6)中的板，4℃保溫過(guò)夜。洗滌該板(洗滌緩沖液PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)，加入100μl/孔的封閉緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA)以及培養(yǎng)基或抗-hANGPTL4抗體(15μg/100μl)或抗-Dscr抗體(15μg/100μl)，室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。洗滌板，加入αVβ5100μl(3-9μg/ml)，室溫保溫2小時(shí)同時(shí)輕輕攪動(dòng)。洗滌板，將1μg/ml(1∶1000)抗-αVβ5抗體(Chemicon)(5μg/100μl)加入實(shí)驗(yàn)緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)中，室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。保溫后，洗滌板，將100μl/孔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)抗-小鼠(1∶5000)加入實(shí)驗(yàn)緩沖液。洗滌板，加入100μl/孔四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，室溫保溫直到出現(xiàn)良好的顏色。利用100μl/孔1M H3PO4終止反應(yīng)，在630nm讀板。αVβ5結(jié)合ANGPTL4(泳道1)和玻連蛋白(泳道4)包被的板。結(jié)合被抗-ANGPTL4抗體(泳道2)阻斷，但除外對(duì)照抗體抗-Dscr(泳道3)或?qū)φ盏鞍装辉诎迳?泳道5)的情況。見(jiàn)，圖14，圖C。
            
因此，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)重組ANGPTL4特異性結(jié)合αVβ5整合素。
            
本說(shuō)明書(shū)認(rèn)為足以使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明不限于保藏的構(gòu)建體限定的范圍，因?yàn)楸２匚锏膶?shí)施方案是用作對(duì)本發(fā)明某些方面的單一例證且功能上等同的任何構(gòu)建體都在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文的材料保藏不構(gòu)成承認(rèn)文字形式的描述不足以使得本發(fā)明的任一方面，包括其最佳的更多方面能夠?qū)嵤?，也不?yīng)解釋為將權(quán)利要求書(shū)的范圍局限于所提供的具體例證。事實(shí)上，除了本文所示和所述之外，對(duì)本發(fā)明的各種修飾根據(jù)前面的描述對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的且落在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
            
權(quán)利要求
            
1.阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括a)給藥腫瘤或癌細(xì)胞有效量的抗癌藥劑；和b)給藥腫瘤或癌細(xì)胞有效量的血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)拮抗劑，其中聯(lián)用的有效量阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
            
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗癌藥劑包括抗血管生成藥劑。
            
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗血管生成藥劑是VEGF拮抗劑。
            
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗-VEGF抗體。
            
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化的A4.6.1。
            
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。
            
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗-ANGPTL4抗體結(jié)合ANGPTL4(184-406)。
            
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑是抗-αVβ5抗體。
            
9.權(quán)利要求4，6或8的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。
            
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑包括SiRNA分子。
            
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子。
            
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向編碼ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
            
13.權(quán)利要求1的方法，還包括將第三抗癌藥劑給藥腫瘤或癌細(xì)胞。
            
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述第三抗癌藥劑是化療劑。
            
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述第三抗癌藥劑是其它血管生成抑制劑。
            
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟(a)和(b)依次進(jìn)行。
            
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟(a)和(b)同時(shí)進(jìn)行。
            
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟(a)和(b)以依次和同時(shí)的組合的方式進(jìn)行。
            
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟以任何順序進(jìn)行。
            
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤或癌細(xì)胞在受試者中。
            
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述受試者是人。
            
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述受試者患有復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
            
23.阻斷或減慢受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給藥受試者包含有效量抗血管生成藥劑和有效量血管生成素樣4(ANGPTL4)拮抗劑的聯(lián)用組合物，其中所述聯(lián)用的有效量阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
            
24.權(quán)利要求23的方法，還包括給藥其它藥劑，其中所述其它藥劑是抗癌藥劑。
            
25.阻斷或減慢受試者中的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給藥受試者有效量的血管生成素樣4(ANGPTL4)拮抗劑，其中所述受試者曾經(jīng)或正在接受利用抗癌藥劑進(jìn)行的癌癥治療，其中給藥有效量的ANGPTL4拮抗劑阻斷或減慢復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
            
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗-癌藥劑是一或多種化療劑。
            
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗-癌藥劑包括抗血管生成藥劑。
            
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗血管生成藥劑包括抗-VEGF抑制劑。
            
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗-VEGF抑制劑是抗-VEGF抗體。
            
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化的A4.6.1。
            
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。
            
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑是抗-αVβ5抗體。
            
33.權(quán)利要求29，31，或32的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。
            
34.權(quán)利要求25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑包括SiRNA分子。
            
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子。
            
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向編碼ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
            
37.權(quán)利要求25的方法，還包括給藥其它藥劑，其中所述其它藥劑是抗癌藥劑。
            
38.阻斷或減慢腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給藥腫瘤或癌細(xì)胞有效量的血管生成素樣4(ANGPTL4)拮抗劑，其中所述ANGPTL4拮抗劑是結(jié)合ANGPTL4(184-406)的抗體且其中所述有效量阻斷或減慢腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
            
39.組合物，其包含結(jié)合ANGPTL4(184-406)的抗體和VEGF拮抗劑。
            
40.組合物，其包含ANGPTL4-SiRNA分子，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向編碼ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
            
41.試劑盒，包含第一量的抗血管生成藥劑，第二量的血管生成素樣4(ANGPTL4)藥劑，以及可藥用的載體，遞送物或稀釋劑，以及容器。
            
42.試劑盒，其包含一定量的抗血管生成藥劑以及可藥用的載體，遞送物或稀釋劑，上述物質(zhì)為第一單位劑量形式；一定量的血管生成素樣4(ANGPTL4)拮抗劑以及可藥用的載體，遞送物或稀釋劑，上述物質(zhì)為第二單位劑量形式；以及容器。
            
全文摘要
            
提供了血管生成素樣4蛋白的調(diào)節(jié)物以及它們用于治療疾病和病理情況的方法。也提供了ANGPTL4拮抗劑與其它治療劑例如抗癌藥劑的組合，以及它們用于治療易患或診斷為患有癌癥或復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物的方法。
            
文檔編號(hào)C07K16/00GK101044164SQ200580031689 
            
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
            
發(fā)明者納波利昂·費(fèi)拉拉, 漢斯-彼得·格伯, 梁小浣 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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