用于從固相結合材料釋放核酸的組合物和方法

專利名稱：用于從固相結合材料釋放核酸的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及新型組合物在釋放結合在固相材料上的核酸中的應用，該固相材料用于結合、分離或純化核酸。
背景技術：
分子診斷學和分子生物學中的現代技術(包括反轉錄、克隆、限制性分析、擴增和序列分析)，要求在這些技術中使用的核酸基本上不含污染物和干擾物質。不期望的污染物包括大分子物質例如酶、其它類型的蛋白質、多糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、脂類、低分子量酶抑制劑、或非目標核酸、酶輔因子、鹽、離液劑、染料、金屬鹽、緩沖鹽和有機溶劑。
獲得用于分子生物學應用的基本上無污染物的目標核酸是困難的，原因在于目標核酸被發現于其中的復雜樣品基質。此類樣品包括例如來自組織的細胞、來自體液的細胞、血液、培養物中的細菌細胞、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、或從目標核酸擴增得到的溶液。樣品基質經常含有顯著量的污染物，在感興趣的核酸被用于分子生物學或診斷技術之前所述污染物必須從所述核酸去除。
從上述細胞和組織產生的混合物中分離目標核酸的常規技術，需要使用有害化學品例如酚、氯仿以及溴化乙錠。酚/氯仿提取被用于此類步驟以從目標核酸和多種污染物的混合物中抽提掉污染物。可選地，根據本領域中熟知的方法，使用氯化銫-溴化乙錠梯度。參見例如Molecular Cloning，由Sambrook等編著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，在后面的方法之后，通過將乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸來沉淀保留在抽提的水相中的核酸物質。通常，通過離心從溶液中移出沉淀物，并且在水或緩沖溶液中重懸以作進一步使用之前，允許干燥所得到的沉淀物小球。
已經開發出更簡單和更快的方法，其采用各種類型的固相，以從細胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分離核酸。此類固相包括各種形狀和形式例如纖維的層析樹脂、聚合物和二氧化硅或玻璃基物質、過濾器以及包被的容器。當為小顆粒的形式時，有時提供磁芯，以幫助實現分離。
在分離核酸中使用的一種類型的固相包括設計用于高效液相色譜(HPLC)的多孔硅膠顆粒。用陰離子交換劑對多孔硅膠顆粒的表面進行官能化，以在某一鹽和pH條件下與質粒DNA交換。參見，例如美國專利4,699,717和5,057,426。在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結合到這些固相材料的質粒DNA。從那里洗脫的核酸溶液在其被用于下游過程之前必須被進一步處理，以除去鹽。
其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(CPG)、包埋有二氧化硅顆粒的濾器、硅膠顆粒、硅藻土、玻璃纖維或上述的混合物。在存在離液劑例如碘化鈉(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情況下，在含有核酸的樣品中，每一硅基固相材料可逆地結合核酸。此類固相結合并保持核酸物質，同時該固相經受離心或真空過濾以從殘余樣品成分中分離出基質和結合于其上的核酸物質。然后，通過用水或低鹽洗脫緩沖液洗脫，從固相釋放出該核酸物質。商業上可得的用于核酸分離的硅基固相材料包括例如WizardTMDNA純化系統產品(Promega，Madison，WI)、QiaPrepTMDNA分離系統(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFXMicro Plasmid Kit(Amersham)。
顆粒形式的聚合樹脂也被廣泛用于核酸的分離和純化。羧酸鹽改性的聚合顆粒(Bangs，Agencourt)是已知的。在歐洲專利申請公開第EP 1243694A1中公開了含有季銨首基(head group)的聚合物。該聚合物是具有共價連接的線型非交聯聚合物的惰性載體顆粒。該類型的聚合固相一般是指觸角樹脂(tentacle resin)。線型聚合物摻入四烷基季銨基團。該烷基集團被指定為甲基或乙基基團(第4欄，第52-55行)。較長的烷基被認為是不期望的。
基于陰離子交換原理的其它用于結合核酸的固相材料目前正在使用中。這些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(BectonDickinson，Roche-Genopure)的硅基材料，這基于在EP0496822B1中描述的層析載體。具有聚合的三烷基銨基團的聚合物樹脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分離的羧基改性聚合物可以從眾多的供應商獲得。在高鹽條件下核酸被吸引，而在低離子強度條件下核酸被釋放。具有陽離子三甲胺外部的聚合微載體珠被描述在美國6,214,618中。該珠具有相對大的直徑并且作為培養中細胞粘附和生長的支持物是有用的。
含有三丁基磷_(_，phosphonium)首基的聚合珠已經被描述用于三相體系中的相轉移催化劑。由交聯的聚苯乙烯制備該珠。(J.Chem.Soc.Perkin Trans.II，1827-1830，(1983))。具有通過亞烷基鏈和亞烷基醚鏈(alkylene ether chain)連接至交聯的聚苯乙烯樹脂的側鏈三烷基磷_基的聚合物珠也已被描述(Tomoi，et al.，Makromolekulare Chemie，187(2)，357-65(1986)；Tomoi，et al.，Reactive Polymers，IonExchangers，Sorbents，3(4)，341-9(1985))。基于交聯的聚苯乙烯樹脂的混合季銨/磷_不溶性聚合物作為催化劑和抗微生物劑被公開(Davidescu，et al.，Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara，40(54)，63-72(1995)；Parvulescu，et al，.Reactive&FunctionalPolymers，33(2，3)，329-36(1997)。
磁響應性顆粒也已經被開發用作核酸分離中的固相。設計用于核酸分離的若干種不同類型的磁響應性顆粒在本領域中是已知的，并且可以從若干來源商業獲得。可逆地直接結合核酸材料的磁性顆粒包括MagneSilTM顆粒(Promega)。也已知，磁性顆粒通過共價連接的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白可逆地結合mRNA，其中抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白具有用于與mRNA的聚腺苷酸尾雜交的連接的寡dT尾。
已知多種類型的磁響應性硅基顆粒被用作核酸結合分離法中的固相。一個這樣的顆粒類型是磁響應性玻璃珠，優選具有受控孔尺寸的磁響應性玻璃珠，其作為Magnetic Porous Glass(MPG)顆粒可以從CPG，Inc.(Lincon Park，NJ)獲得；或者在美國專利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337號中描述的多孔磁玻璃顆粒。在核酸的結合和分離中有用的磁性顆粒的另一類型是通過將磁性材料摻入聚合的二氧化硅化合物基質中而產生的。(德國專利DE4307262A1)。包含包埋在具有季銨基的纖維素基質中的氧化鐵納米顆粒的磁顆粒由Cortex Biochem(San Leandro，CA)作為MagaCell-QTM商業化生產。
具有可誘導磁性性質的顆粒或珠包括小顆粒的過渡金屬，例如鐵、鎳、銅、鈷和錳，以形成金屬氧化物，在磁體存在下可以使該金屬氧化物具有暫時的磁性。這些顆粒被稱為順磁性的或超順磁性的。為形成順磁或超順磁珠，已用在水中相對穩定的聚合物包被金屬氧化物。美國專利4,554,088公開了順磁顆粒，其包括被高分子硅烷包被包圍的金屬氧化物芯。美國專利5,356,713公開了可磁化的微球體，其包括被疏水乙烯基芳族單體外殼包圍的可磁化顆粒芯。美國專利5,395,688公開了已經用混合的順磁金屬氧化物-聚合物層包被的聚合物芯。另一種方法采用聚合物芯以吸收金屬氧化物，例如諸如在美國專利第4,774,265號中。包含用順磁金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒的磁性顆粒被公開于美國專利5,091,206中。然后，用另外的聚合層進一步包被該顆粒，以保護金屬氧化物層并提供反應性包被。美國專利5,866,099公開了在用于配位金屬鹽并俘獲混合的金屬氧化物顆粒的蛋白存在的情況下，通過兩種金屬鹽的混合物共沉淀制備磁性顆粒。許多示例性金屬鹽對被描述。美國專利5,411,730描述了相似的方法，其中沉淀的混合的金屬氧化物顆粒被俘獲在葡聚糖——一種寡糖中。
用于不可逆地捕獲DNA和RNA的氧化鋁(氧化鋁(aluminum oxide))顆粒被公開于美國專利6,291,166中。用于固相擴增法例如PCR的結合的核酸是可得的。
在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結合到這些固相材料的DNA。從那里洗脫的核酸溶液在其可以被用在下游過程之前必須被進一步處理以除去鹽。相反，通過用水或低鹽洗脫緩沖液洗脫，從固相釋放結合至硅基材料的核酸。美國專利5,792,651描述了用于核酸的色譜分離的組合物，其增強核酸在細胞中轉染的能力。該組合物包括含有2-丙醇和任選地含有鹽和緩沖液物質的水溶液。
據報道，又一種包括含有磁微粒芯的瓊脂糖或纖維素顆粒的磁性固相材料在用含有高濃度鹽和聚亞烷基二醇的組合物處理后結合并保持核酸(例如美國專利5,898,071，和PCT公開WO02066993)。隨后，通過用水或低離子強度緩沖液處理釋放核酸。
發明概述 本發明的目標是提供使用固相核酸結合材料和本發明的試劑組合物分離核酸的方法。本發明的另一個目標是提供用本發明的試劑組合物從固相材料結合和釋放核酸的方法。
本發明的另一個目標是提供使用固相核酸結合材料、通過用本發明的試劑組合物釋放結合的核酸而分離核酸的方法，所述本發明的試劑組合物含有堿性胺緩沖液和親水性有機溶劑以及任選含有鹽。
在本發明的另一個目標中，提供了用于從固相材料釋放結合的核酸的試劑組合物。本發明的組合物起著從本可裂解固相材料和從其它常規固相材料釋放或洗脫結合的核酸的作用，其中所述其它常規固相材料包括具有陽離子、陰離子或中性表面的那些材料。
發明詳述定義 烷基——含有1-20個碳原子的支鏈、直鏈或環狀烴基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。本文中所使用的低級烷基是指那些含有高達8個碳的烷基基團。
芳烷基——用芳基取代的烷基基團。
芳基——含有1至5個碳環芳香環的含芳香環的基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。
磁性顆粒——顆粒、微粒或珠，其對外部的磁場有響應。該顆粒本身可以是磁性的、順磁性的或超順磁性的。如當使用鐵磁材料時，其可以被吸引到外部磁體或施用的磁場。顆粒可以具有固體芯部分，該固體芯部分是磁響應性的，并且被一層或多層非磁響應性層包圍。可選地，磁響應性部分可以是周圍的層或者可以是分散在非磁響應性芯內的顆粒。
寡聚物、寡核苷酸——如本文所使用的，將是指含有磷酸二酯核苷酸間鍵和5′-端單磷酸酯基團的化合物。核苷酸可以是正常發生的核糖核苷酸A、C、G和U或脫氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
多核苷酸——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA類似物例如PNA。任何這三種類型的鏈組成的雙鏈雜合子也可以在本術語的范圍內。
引物——指用于定向連接位位點并且為起始連接過程所必需的寡核苷酸。引物的長度足以穩定地與模板雜交，并且代表模板中的獨特序列。引物的長度通常為約15-30個堿基。含有可檢測標記或允許固相捕獲的標記的標記的引物在如本文中所使用的術語的范圍內。
釋放、洗脫——通過與溶液或組合物接觸，除去結合至固相材料的表面或孔的大部分材料。
樣品——含有或疑似含有核酸的流體。可以用在本發明的方法中的典型的樣品包括體液，例如血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞裂解液、組織提取液和類似物。其它類型的樣品包括溶劑、海水、工業水樣、食物樣品和環境樣品例如土壤或水、植物材料、原核生物、真核生物來源的細胞、細菌、質粒和病毒。
固相材料——具有可以將核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。
取代的——是指用非氫原子置換基團上的至少一個氫原子。應該注意到的是，關于取代的基團，其意圖是可以存在多點取代，除非明確另外指出。
模板、試驗多核苷酸以及靶被互換使用，并且是指其長度將被復制的核酸。
通過各種技術，從不同的樣品類型提取、分離并另外純化核酸。這些技術的許多依賴于選擇性吸附到對核酸具有一些親和力的材料的表面上。在除去其它較弱結合的成分的洗滌步驟之后，用溶液處理固相，以除去或洗脫結合的核酸(多種核酸)。申請人已經開發出新型的試劑組合物，其可用于洗脫已結合在固相結合材料上的核酸。本組合物與之有用的固相結合材料包括常規的硅基材料，官能化二氧化硅——承載共價結合的表面官能團例如羧基、氨基和羥基，碳水化合物基材料和聚合材料以及下面和在申請人的共同未決美國申請序列第10/714,763和10/715,284號中描述的四元和三元_鹽型材料，所述申請的公開內容被引入于此作為參考。
與本發明的組合物和方法一起使用的用于結合核酸的固相材料可以是顆粒、微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。該材料進一步包括核酸結合表面，其允許捕獲和結合不同長度的核酸分子。用表面不但指固相材料的外圍，而且指固相材料內任何可及的多孔區的表面。
本組合物包括中性至堿性pH的一類含水緩沖液。一個組包括pH7-9的胺緩沖液的水溶液，其中胺濃度為至少0.1M并優選至少0.4M以及更優選至少1M。該類型的緩沖液不含有其它添加鹽例如NaCl或KCl，這取決于達到洗脫效率的緩沖組分。可用作緩沖組分的胺包括脂族胺、脂族氨基醇和磺化脂族胺。實例性的胺包括二乙胺、三乙胺、咪唑、氨基酸(例如甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、N-(氨基甲酰基甲基(Carbamoylmethyl))亞氨基二乙酸(ADA))。
示例性的氨基醇化合物包括三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、三(羥甲基)甲基氨基丙烷(Bis-TRIS)、2-甲基-2-氨基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。
示例性的磺化脂族胺包括3-N-嗎啉代丙磺酸(MOPS)、3-N-(三羥甲基)甲基氨基丙磺酸(TAPS)、3-N-(三羥甲基)甲基氨基-2-羥基丙磺酸(TAPSO)、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、1，4-哌嗪雙(乙磺酸)(PIPES)、4-嗎啉代乙磺酸(MES)、2-(三-(羥甲基)甲氨基)乙磺酸(TES)、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-環己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(氨基甲酰基甲基氨基)-乙磺酸(ACES)、N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine))、3-(環己氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-羥基丙磺酸)(HEPPSO)、哌嗪-N，N′-雙(2-羥基丙磺酸)(POPSO)和N-三(羥甲基)-甲基甘氨酸(tricine)。
在優選的組合物中，緩沖液還含有0.1-50％的親水性有機助溶劑，更優選1-20％的所述溶劑。關于親水性有機溶劑意欲于包括在水中或水溶液中具有至少0.1％的溶解度的有機化合物，優選至少1％并且更優選至少10％。示例性的親水性有機助溶劑包括C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及對二_烷。優選的實施方式采用含有2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇的組合物作為親水性有機助溶劑。
另一組組合物包括pH7-9的胺緩沖液的水溶液，其中胺濃度為至少0.01M并且至少一種一價或二價鹵化物鹽或乙酸鹽的濃度為0.1-3M。代表性的鹽包括NH4以及金屬Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的鹵化物和乙酸鹽。優選的鹵化物是氯化物。緩沖液和鹽的組合濃度為至少0.1M。該類型的示例性緩沖液——作為PCR緩沖20×濃縮液出售，含有0.4M tris-HCl，pH8.4，1M KCl和0.05M MgCl2。該組組合物的成員可以任選地進一步包括0.01-50％的親水性有機助溶劑。示例性的有機助溶劑包括C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及對二_烷。優選的實施方式采用含有2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇的組合物作為親水性有機助溶劑。在另一個優選的組合物中，親水性有機助溶劑的量為該組合物的0.1-50％。更優選地，親水性有機助溶劑的量為溶劑的1-20％。
該新型組合物的益處是能夠在許多下游分子生物學過程中直接使用洗脫的核酸的溶液，而不必首先沉淀和收集該核酸。作為從樣品分離或純化核酸的方法的一部分，使用該組合物洗脫或釋放結合的核酸的方法也形成本發明的另一部分并在下面更詳細地公開。
已經發現所有公開的組合物在從具有結合核酸的季_基的固相材料除去結合的核酸中都是有效的。在使用此類固相材料的核酸分離方法中的這些組合物的任何一種的使用構成本發明的一個方面。
也已經發現，通過使其與本發明的新型試劑組合物接觸，結合至其它已知的核酸結合支持物的核酸可以從這些固體支持物上被釋放，所述新型試劑組合物包括pH約7-9的緩沖液，其中所述緩沖組分以至少0.1M并優選至少0.4M的濃度存在，并任選地包括0.1-50％的親水性有機助溶劑。
在本發明的一個方面中，提供了從樣品分離核酸的方法，所述方法包括a)提供固相，所述固相包括基質，其選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，和b)混合所述固相與含有所述核酸的樣品，以使所述核酸結合至所述固相；c)從所述固相分離所述樣品；和d)通過使所述固相與含有pH7-9的含水緩沖液的試劑組合物接觸，從所述固相釋放所述核酸，其中所述緩沖液的濃度為至少0.1M，并且親水性有機助溶劑為0.1-50％。
在可以與本洗脫組合物結合使用的常規固相材料中有二氧化硅顆粒、二氧化硅包被的表面包括膜、具有表面官能化的二氧化硅例如胺官能化和羧基官能化的二氧化硅、在核酸純化領域中已知的合成聚合物珠和顆粒、瓊脂糖或纖維素顆粒、和瓊脂糖或纖維素包被的二氧化硅顆粒。用任一種前述材料包被的磁顆粒類似地起作用，并且也可以與本發明的組合物和方法結合使用。
本發明的組合物在與固相結合材料結合時特別有用，所述固相結合材料具有連接在基質表面上的式QR2+X-或QR3+X-的季_基，其中所述季_基選自三元锍基(ternary sulfonium)、季銨、和_基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且X是陰離子。優選地，所述_基選自季_基+PR3X-，其中R如上所定義。
在本發明的另一個方面中，提供了從樣品分離核酸的方法，所述方法包括a)提供固相，所述固相包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質，和結合至所述基質表面上的_基，所述_基選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季_基PR3+X-，并且其中X是陰離子；b)混合所述固相和含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結合到所述固相上；c)從所述固相分離所述樣品；和d)通過接觸所述固相和試劑組合物從所述固相釋放所述核酸，所述試劑組合物包括pH為7-9的水溶液、0.1-3M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及0.1-50％的親水性有機助溶劑。
代表性的鹽包括NH4以及金屬Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的鹵化物和乙酸鹽。優選的鹵化物是氯化物。
示例性的親水性有機助溶劑包括C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及對二_烷。在優選的方法中，所述固相上的_基選自季_基+PR3X-，其中R如上所定義。
如在前述的共同未決美國申請序列第10/714,763和10/715,284中所公開，申請人已經開發出固相材料，其結合核酸并具有可裂解連接體(cleavable linker)部分，所述可裂解連接體部分可以被裂解，以釋放結合的核酸。通過與本發明的組合物接觸而不裂解連接體基團，這些可裂解固相材料還允許結合至其上的核酸的洗脫。該材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式，它們具有足夠的表面積以允許進行有效結合。可用于本發明方法的微粒形式的固相材料可以進一步包括磁芯部分。通常，顆粒以及磁響應性微粒在本發明中是優選的。
在本發明的方法中有用的所有固相核酸結合材料包括限制其大小、形狀、孔隙率和機械性能的基質，和共價連接的核酸結合基團。三種最常用類型的基質是二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。固相可以進一步包括磁響應性部分。
聚合物是一種或多種烯鍵式不飽和單體單元的均聚物或共聚物，并且可以是交聯的或非交聯的。優選的聚合物是聚烯烴包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多種取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸單體在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
包含在可用于本發明的方法中的可裂解和不可裂解固相結合材料中的核酸結合基團吸引并結合具有各種長度和堿基組成或順序的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。核酸結合基團包括羧基、胺和三元或四元_基(ternary or quaternary oniumgroups)。胺基團可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基團。三元或四元_基包括三烷基季銨基團(-QR3+)、_基(-QR3+)包括三烷基_或三芳基_或混合的烷基芳基_基、以及三元锍基(-QR2+)。固相可以含有一種以上類型的核酸結合基團，如本文中所述。含有其中R基團是具有至少4個碳的烷基的三元或四元_基-QR2+或-QR3+的固相材料在結合核酸中特別有效，但少如1個碳的烷基基團也如芳基那樣有用。此類固相材料以高的韌度保持結合的核酸并在現有技術中已知用于洗脫的大多數條件下阻止核酸的去除或洗脫。大部分已知的高和低離子強度的洗脫條件對于除去結合的核酸是無效的。不同于含有DEAE和PEI基團的傳統陰離子交換樹脂，三元或四元_固相材料保持正電荷，無論反應介質的pH如何。
可裂解固相材料包括固體支持部分(solid support portion)，所述固體支持部分包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶多糖的基質，在其表面上連接有核酸結合部分，用于吸引和結合核酸，所述核酸結合部分(nucleicacid binding portion，NAB)由可裂解的連接體部分連接到固體支持部分。
或 在一個實施方式中，NAB是其中Q為S原子的式QR2+X-的三元_基或其中Q為N或P原子的式QR3+X-的四元_基，R選自烷基、芳烷基和芳基而X為陰離子。當Q是氮原子時，R基團可以每一個都含有4-20個碳原子。當Q是硫或磷原子時，R基團可以具有1-20個碳原子。
或 優選的可裂解固相來源于商業可得的聚苯乙烯型聚合物例如被稱為Merrifield樹脂(交聯的)的那些類型。在這些聚合物中，一定百分比的苯乙烯單元含有反應性基團，通常為氯甲基或羥甲基，作為共價連接的工具。通過與硫化物(R2S)或三元胺或膦反應，置換一些氯，產生本發明的固相材料。當所有的反應性氯甲基基團已經被轉化成三元或四元_基時，根據本定義制備的聚合物可以用下面的式(1)描繪。對于所有此類基團，不必須都被轉化，使得本發明的聚合固相將經常含有_基和氯甲基基團的混合物。
在上式中，m、n和o表示聚合物中每一單體單元的摩爾百分比，并可以取值為m從0.1％至100％、n從0至99％、以及o從0至10％。更優選地，m從1％至20％、n從80至99％、以及o從0至10％。
在另一個實施方式中，可裂解固相來源于商業可得的交聯的Merrifield樹脂，其一定百分比的苯乙烯單元含有反應性氯乙酰基或氯丙酰基，用于共價連接。從這些起始聚合物制備的本發明的三元或四元_聚合物具有下式 其中Q、R、X、m、n和o如上定義。
許多其它本領域已知的聚合樹脂可以被用作制備可裂解固相材料中的固體基質。聚合樹脂可以從商業供應商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)和NovaBiochem獲得。該樹脂通常基于具有反應性官能團的交聯的聚合顆粒。用在如Advanced ChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固體支持的肽合成中的許多合適的聚合樹脂是合適的原材料。具有反應性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亞胺酯基團的聚合物每一個都是商業可得的，用于制備本發明的聚合固相。如在下面的多個例子所示，提供將前體聚合樹脂共價接合到三元或四元_基的方法有時是必需或期望的。這將通常包括選自亞烷基、亞芳基或亞芳烷基(aralkylene)基團的1-20個原子的鏈或環基團。該鏈或環還可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黃原酸酯、脲、亞胺、肟、亞砜和硫酮形式的羰基基團。
如本文所使用，磁性微粒是可以被磁場吸引和操作的顆粒。用在本發明的方法中的磁性顆粒包括磁性金屬氧化物芯，其通常被吸附性結合或共價結合的層包圍，核酸結合層通過選擇的偶聯化學術被共價結合到所述層，從而用三元锍、季銨或四元磷_官能團包被微粒的表面。磁性金屬氧化物芯優選是氧化鐵，其中鐵是Fe2+和Fe3+的混合物。無硅烷包被的上述含有氧化鐵芯的磁性微粒也可以被用于本發明的方法中。如美國4,654,267所述，磁性顆粒也可以通過在多孔聚合物存在下沉淀金屬顆粒以捕獲磁響應性金屬顆粒而形成。可制備的磁性金屬氧化物從而包括Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性顆粒也可以如美國5,411,730所述通過在寡糖葡聚糖存在下沉淀金屬氧化物顆粒以捕獲磁響應性金屬顆粒而形成。前述的美國專利5,091,206公開了另一種磁性顆粒。該顆粒包括用順磁性金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒以及另外的聚合層，以保護金屬氧化物層并提供反應性包被層。含有氯甲基化的Merrifield樹脂的磁鐵礦(四氧化三鐵銹層，magnetite)的制備被描述于出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。
商業可得的磁性二氧化硅或磁性聚合顆粒可以被用作制備根據本發明的可裂解磁性顆粒中的原材料。具有表面羧基基團的聚合顆粒的合適類型已知為商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性顆粒的合適類型已知為商品名MagneSilTM(Promega)。在表面上具有羧基或氨基的二氧化硅磁性顆粒可以從Chemicell GmbH(Berlin)獲得。
可裂解連接體部分優選選自直鏈、支鏈和環的有機基團，并包括1至100個原子并更優選1至約50個原子。該原子優選選白C、H、B、N、O、S、Si、P、鹵素和堿金屬。示例性的連接體基團是通過水解裂解的水解可裂解基團。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亞胺、磺酰胺和磺酰亞胺是代表性的，磺酸酯也是代表性。連接體基團的另一個示例性類別是經受還原性裂解的那些基團。一個代表性基團是含有二硫(S-S)鍵的有機基團，所述二硫鍵通過硫醇例如乙硫醇、巰基乙醇和DTT被裂解。另一個代表性基團是含有過氧化物(O-O)鍵的有機基團。過氧化物鍵可以通過硫醇、胺和膦裂解。
盡管許多具體的結構圖為方便起見僅代表四元_基，但應當理解類似的四元锍基也同樣欲被表示。
示例性的光化學可裂解連接體基團包括式
的硝基取代的芳族醚和酯，其中Rd為H、烷基或苯基，并且更具體地 鄰硝基芐基酯根據熟知的反應通過紫外光被裂解。
示例性的可酶切連接體基團包括通過酯酶和水解酶裂解的酯、通過蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通過糖苷酶裂解的糖苷基。
具有包含可裂解的1，2-二氧雜環丁烷(dioxetane)部分的連接體基團的固相材料也在發明的核酸結合材料的范圍之內。此類材料包含可以由化學劑或酶劑引發成片段的二氧雜環丁烷部分。除去保護基以產生氧陰離子，促進二氧雜環丁烷環的分解。根據熟知的方法，通過裂解過氧化物的O-O鍵以及C-C鍵而發生斷裂。
可選地，連接的_基可以被結合到芳基Ar或結合到可裂解的基團Y。進一步可選地，與固相和三元或四元_基的連接從所示出的方向被顛倒。
在前述的示例性反應中，基團A表示穩定取代基，其選自烷基、環烷基、聚環烷基、聚環烯基、芳基、芳氧基和烷氧基。Ar代表芳環基團。優選的芳環基團是苯基和萘基。該芳環可以包含另外的取代基，具體而言，是鹵素、烷氧基和胺基。Y基團是通過化學劑或酶可去除的基團或原子。合適的OY基團包括OH、其中R3選自烷基和芳基基團的OSiR33、羧基、磷酸鹽、硫酸鹽以及糖苷基。許多可引發的二氧雜環丁烷結構在本領域中是已知的并且已經是大量專利的主題。示例性的可裂解二氧雜環丁烷連接體和其裂解被如下描繪。
保護基Y的去除引發了二氧雜環丁烷環的斷裂，并從而分開固體基質和_基。在堿性反應條件下，所得到的芳基酯經受進一步水解。
具有包含多電子的C-C雙鍵的連接體基團的固相材料是另一組可裂解核酸結合材料，所述多電子的C-C雙鍵可以轉化成不穩定的1，2-二氧雜環丁烷部分。在該雙鍵上的至少一個取代基(A′)利用O、S或N原子被結合到雙鍵上。多電子雙鍵與單態氧的反應產生不穩定的1，2-二氧雜環丁烷基團，其在環境溫度下自發斷裂，以產生兩個羰基片段。
具有可裂解連接體基團的另一組固相材料具有乙烯酮二硫縮醛(ketenedithioacetal)作為可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公開。乙烯酮二硫縮醛經受通過與過氧化物酶和過氧化氫的酶氧化導致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的結構，包括在9，10-二氫化吖啶環上具有取代的類似物，其中Ra、Rb和Rc每一個都是有機基團，該有機基團含有1至約50個選自C、N、O、S、P、Si和鹵素原子的非氫原子，并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成環。
具有乙烯酮二硫縮醛可裂解連接體基團的固相材料具有下式中的任何一個 或 以及類似的結構，其中固體基質和_基結合到可裂解連接體部分的次序被從示出的次序顛倒過來。
具有可裂解連接體基團的另一組固相材料具有亞烷基作為可裂解部分，所述亞烷基具有至少一個結合到三烷基或三芳基磷_基的碳原子。

這組的材料通過與酮或醛的Wittig反應是可裂解的。在有機溶劑中季磷_化合物(季_化合物)與強堿的反應使結合到磷的碳原子脫質子化，產生磷葉立德(phosphorus ylide)。該葉立德與含羰基化合物例如酮或醛的反應形成雙鍵和氧化膦。在該過程中磷_基和固相之間的連接斷裂。
本發明進一步的方面包括使用可裂解固相結合材料分離和純化核酸的方法。在一個實施方式中，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，其包括包含基質的固體支持部分，所述基質選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結合核酸的核酸結合部分，和可裂解連接體部分；b)混合固相和含有核酸的樣品，以將核酸結合到固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)任選地，裂解所述可裂解連接體；和e)通過將所述固相和試劑組合物接觸從所述固相釋放所述核酸，所述試劑組合物包括pH7-9的水溶液、0.1-3M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及0.1-50％的親水性有機助溶劑。
在具有可裂解連接體的固相的優選的實施方式中，核酸結合部分是連接于基質表面的式QR2+X-或QR3+X-的四元_基，其中四元_基選自三元锍基、季銨和_基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，而X是陰離子。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成，例如過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、當例如使液體通過多孔膜或過濾氈片(filter mat)時過壓空氣或其它氣體。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。就其它組分的除去不完全而言，可以進行另外的洗滌，以幫助它們完全被去除。
裂解可裂解連接體的步驟，包括用裂解劑處理在其上結合有核酸的固相一段時間，該時間足以斷裂可裂解連接體部分中的共價鍵但不破壞核酸。裂解劑的選擇由可裂解連接體的性質決定。當可裂解連接體是水解可裂解的基團時，裂解劑是水或低級醇或它們的混合物。裂解劑優選包含當加入到水中提高pH的堿。
當可裂解連接體是還原性可裂解基團例如二硫化物或過氧化物基團時，裂解劑是選自硫醇、胺和膦的還原劑。示例性的還原劑包括乙硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、三烷基胺和三苯基膦。
光化學可裂解連接體基團要求使用光作為裂解劑，典型為紫外區或可見區的光。
如上所述的酶促可裂解連接體基團通過選自酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、過氧化物酶和糖苷酶的酶裂解。
當可裂解連接體基團是可引發的二氧雜環丁烷時，裂解劑起作用，裂解引發OY基團中的O-Y鍵，如上所解釋。裂解O-Y鍵使二氧雜環丁烷環基團不穩定并通過C-C和O-O鍵的斷裂導致二氧環雜丁烷斷裂成兩部分。引發劑包括有機或無機堿、氟化物離子、酶、水解酯的化學劑和過氧化氫。
當可裂解連接體是用至少一個O、S或N原子取代的多電子C-C雙鍵時，裂解劑是單態氧。該雙鍵基團與單態氧的反應產生不穩定的1，2-二氧雜環丁烷基團，其在環境溫度或以上溫度下自發斷裂。根據單態氧化領域中已知的方法，單態氧可以通過染料增感作用或通過熱分解亞磷酸三苯酯臭氧化物或蒽內過氧化物(anthracene endoperoxide)而產生。
當可裂解連接體是如上所述的乙烯酮二硫縮醛時，裂解劑是過氧化物酶和過氧化氫。
當可裂解連接體通過與酮或醛的Wittig反應進行裂解時，優選的形成葉立德的堿是醇鹽和氫化物鹽，尤其是堿金屬鹽。優選的用于與葉立德反應的羰基化合物是脂族和芳族醛和脂族和芳族酮。丙酮是最優選的。優選的溶劑是非質子有機溶劑，其可以溶解反應物而不消耗堿，包括THF、二乙醚、對二_烷、DMF和DMSO。
特別令人驚奇的是這樣的發現結合至本發明的固體支持物的核酸可以被制備，以通過與本發明的新型試劑組合物接觸而釋放所述核酸，所述固體支持物具有作為可裂解連接體的亞烷基，所述亞烷基的至少一個碳原子結合至三烷基或三芳基磷_基，(即，那些通過它們由與酮或醛的Wittig反應而進行裂解的固體支持物)或結合至三烷基銨基。由于通過與本領域已知的、用于洗脫結合的核酸的許多其它試劑和組合物接觸，結合的核酸并未從這些固相結合材料除去，因此該結果是意料不到的，所述本領域已知的試劑和組合物例如去離子水H2O1M磷酸鹽緩沖液，pH6.7
0.1％十二烷基硫酸鈉0.1％十二烷基磷酸鈉3M乙酸鉀，pH5.5TE(tris EDTA)緩沖液50mM tris，pH8.5+1.25M NaCl0.3M NaOH+1M NaCl1M NaOH或1M NaOH+1M H2O2 在本發明的方法中，裂解后從固相釋放核酸的步驟包括，用溶解和充分保護釋放的核酸的溶液洗脫。該溶液是反應物組合物，其包括含水緩沖液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物或醋酸鹽以及0.1-50％的親水有機助溶劑。可選地，溶液可以包括pH為約7-9的緩沖溶液，其中緩沖組分以至少0.1M的濃度存在，并且還包括0.1-50％的親水性有機助溶劑。更優選地，該親水有機溶劑占約1-20％。金屬鹵化物鹽包括堿金屬鹽、堿土金屬鹽。優選的鹽是乙酸鈉、NaCl、KCl和MgCl2。親水有機助溶劑包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對二_烷。釋放捕獲的核酸的步驟可以是在裂解步驟之后或者與其同時發生。在后一種情況中，裂解劑也可以作為洗脫溶液起作用。
裂解反應和釋放(洗脫)步驟每一個都可以在室溫下進行，但水的凝固點以上和水的沸點以下的任何溫度都可以被使用。洗脫溫度對于本分離核酸的方法的成功似乎并不是關鍵的。優選環境溫度，但水的凝固點以上和水的沸點以下的任何溫度都可以被使用。在一些情況下，升高的溫度可以增加洗脫速率或允許使用含有較低數量的鹽或親水性有機助溶劑的組合物。釋放或洗脫步驟可以進行一次，或者如果必要的話可以被重復1次或多次，以提高所釋放核酸的量。
通過使用單獨且不同的溶液來完成每一步驟，裂解反應和洗脫步驟可以作為連續的步驟實施。可選地，裂解和洗脫步驟可以在同一步驟中一起進行。當裂解反應條件采用了與洗脫的核酸的下游用途相容的試劑時，后者——同時發生的方法是優選的。例子是使用中度堿性的反應緩沖液以及甚至更強的氫氧化鈉堿性溶液的裂解反應。前者——連續的方法在這樣的情況下可以是期望的其中裂解反應的試劑或溶劑的存在與核酸是不相容或是不期望的。該情況的例子是Wittig釋放化學術。當裂解反應條件基本上不釋放DNA到溶液中時，使用單獨的裂解和洗脫溶液是可能的。
該方法可以進—步包括這樣的步驟用洗滌液洗滌具有結合到其上的、捕獲的核酸的固相，以從固相中除去樣品的其它組分。這些不期望的物質包括酶、其它類型的蛋白質、多糖、較低分子量的物質例如脂和酶抑制劑。通過上述的方法捕獲在本發明的固相上的核酸，可以以捕獲的形式用在雜交反應中，以雜交到標記或未標記的互補核酸。雜交反應在診斷測試中是有用的，用于檢測捕獲的核酸的存在或數量。雜交反應在固相核酸擴增過程中也是有用的。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成例如過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、對空氣或其它氣體過壓處理以使液體通過多孔膜或過濾氈片。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。如果其它組分的除去是不完全的，可以進行另外的洗滌，以幫助它們的完全去除。
洗脫組合物有利地允許在隨后的下游過程中直接使用洗脫的核酸，而不需要在使用前蒸發溶劑或沉淀核酸。
當使用如上所述的本發明試劑組合物洗脫核酸時，洗脫溫度對于本分離核酸的方法的成功似乎不是關鍵的。優選環境溫度，但水的凝固點以上和水的沸點以下的任何溫度都可以使用。在一些情況下，升高的溫度可以增加洗脫的速率。此外，已認識到，用不同的設備洗脫不同的核酸。
下游使用 這些試劑組合物的重要優勢是它們與許多下游的分子生物學過程相容。在很多情況下，洗脫入如上所述的試劑組合物的核酸可以在進一步的過程中被直接使用。擴增反應例如PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(Ligation of Multiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以采用此類核酸洗脫液。通過常規技術、尤其是從細菌培養物或從血樣中分離的核酸，采用沉淀步驟。加入高體積百分比的低分子量醇，以從水溶液中沉淀核酸。然后，在使用前，沉淀的物質必須被分離、收集并重溶于合適的介質中。通過使用上述的試劑組合物，從本發明的固相結合材料洗脫核酸，這些步驟可以被免除。
樣品——通過本發明的方法可以從其中分離核酸——包括含有一種或更多的核酸以及任選地含有其它物質的水溶液。代表性的例子包括核酸、擴增反應產物以及測序反應產物的水溶液。從細菌培養物、體液、血液和血液組分、組織提取物、植物材料以及環境樣品得到的材料在使用前同樣地被置于含水的溶液——優選緩沖的溶液中。
固相核酸捕獲的方法可以被用于許多用途。如下面的具體例子所示，可以捕獲和釋放單鏈和雙鏈核酸。可以捕獲和釋放DNA、RNA和PNA。第一用途是從細菌培養物中純化質粒DNA。質粒DNA被用作克隆載體，以將含有具體基因或基因片段的重組DNA片段導入宿主，用于克隆。
第二用途是純化擴增反應的擴增產物。這些反應可以是在交替的高溫和低溫之間進行熱循環，例如LMO或PCR，或者它們可以在單一的溫度下進行，例如核酸序列基擴增法(nucleic acid sequence-based amplication，NASBA)。所述反應可以使用各種擴增試劑和酶，包括DNA連接酶、RNA聚合酶和/或逆轉錄酶。可以使用本發明的方法純化的多核苷酸擴增反應混合物包括多寡聚體連接(LMO)、自動維持序列擴增(3SR)、鏈置換擴增(SDA)、“支鏈”DNA擴增(“branched chain”DNA amplication)、連接酶鏈反應(LCR)、QB復制酶擴增(QB replicase amplication，QBR)、連接激活轉錄(ligation activated transcription，LAT)、核酸序列基擴增(NASBA)、修復鏈反應(repair chain reaction，RCR)、循環探針反應(CRP)和滾環擴增(RCA)。
第三用途是測序反應凈化(sequencing reaction cleanup)。雙脫氧終止測序反應產生多核苷酸序列梯度，所述序列梯度由用dNTPs和四種反應混合物的每一種中的一種ddNTP的混合物延伸引物而產生。標記每一種中的ddNTP，通常用不同的熒光染料標記。反應混合物包含過量的dNTPs和標記的ddNTP、聚合酶和輔因子例如ATP。序列分析之前除去在后的物質是有利的。
第四用途是從全血中分離DNA。用通常使用的技術從白細胞提取DNA。通常，處理血液，以選擇性溶解紅細胞，并且在沉淀或離心步驟之后，單獨溶解完整的白細胞以暴露核酸內容物。消化蛋白質，并且得到的DNA用固相分離，隨后用于序列多態性的測定、序列分析、RFLP分析、突變檢測或其它類型的診斷試驗。
第五用途是從DNA和RNA的混合物中分離DNA。涉及強堿性洗脫條件的本發明的方法，尤其是使用高溫的那些方法，可以降解或破壞存在的RNA同時保持DNA的完整性。涉及強堿性裂解反應的方法將類似地起作用。
另外的用途包括從其它樣品——土壤、植物、細菌和廢水中提取核酸物質，以及為了存檔的目的對核酸材料進行長期保存。
因此，本發明的又一方面包括使用固相結合材料分離和純化核酸的方法。在一個實施方式中，提供了從樣品分離核酸的方法包括a)提供固相，其包括包含基質的固體支持部分，所述基質選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結合核酸的核酸結合部分；b)混合所述固相和含有核酸的樣品，以將核酸結合到固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)通過使所述固相和試劑組合物接觸，將所述核酸從所述固相釋放進入溶液，所述試劑組合物包括pH為7-9的含水緩沖液，其中所述緩沖液的濃度為至少0.1M，親水性有機助溶劑為0.1-50％；和e)在下游過程中直接使用含有所述釋放的核酸的溶液。
在核酸擴增反應中直接使用含有所釋放的核酸的溶液是優選的實踐，由此，使用聚合酶或連接酶介導的反應，核酸或它們的片段的數量得以擴增。
實施例 當存在于下面的實施例中時，結構圖旨在僅僅說明固相材料的可裂解部分。所述圖不代表固相材料的完整定義。
實施例1.含三丁基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞(argon pad)下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其為交聯的氯甲基化聚苯乙烯。加入過量的三丁基膦(48.1g，10當量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(21.5g)。元素分析觀察到的(Found)P 2.52％，Cl 3.08％；期望的(Expected)P2.79％，Cl 3.19％P/Cl比率為0.94。
實施例2.含三辛基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Sigma，1.1meq/g，20.0g)。加入過量的三辛基膦(92.4g，10當量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體3次。在真空下干燥樹脂(21.3g)。元素分析觀察到的P 2.28％，Cl 2.77％；期望的P 2.77％，Cl 2.42％P/Cl比率為0.94。
實施例3.含三甲基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在50mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入1.0M在THF中的三甲基膦(Aldrich，12mL)溶液，并在室溫下攪拌漿液7天。加入另外的100mL CH2Cl2和1.2mL在THF中的1.0M三甲基膦溶液，并攪拌該漿液3天。過濾該漿液，并用125mL CH2Cl2洗滌所得到的固體，隨后用375mL甲醇洗滌。在真空下干燥樹脂(5g)。在使用前將該樹脂研磨成細粉。
實施例4.含三苯基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在40mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入三苯基膦(Aldrich，3.2g)，并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌所得到的固體。在真空下干燥樹脂(5.4g)。
實施例5.含三丁基銨基團的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在150mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入過量的三丁基胺(25.6g，4當量)，并在室溫下攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用250mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(28.9g)。元素分析觀察到的N 1.18％，Cl 3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％N/Cl比率為0.88。
實施例6.含2-(三丁基磷_)乙酰基基團的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，將氯乙酰基聚苯乙烯珠(Advanced Chemtech，3.0g，3.4meq/g)加入到50mL CH2Cl2中的三丁基膦(4.1g，2當量)的溶液中。攪拌漿液1周。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2(4×25mL)、MeOH(2×25mL)和丙酮(4×25mL)洗滌所得到的固體。然后，風干該樹脂。
實施例7.具有含聚乙烯基苯基三丁基磷_基團的聚合物層的磁性顆粒的合成。
在玻璃瓶中，將磁性Merrifield肽樹脂(Chemicell，SiMag Chloromethyl，100mg)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL)，并在室溫下搖動漿液3天。在該瓶下放置磁體，并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗滌固體4次(洗滌液也通過磁體/移液管步驟除去)。風干該樹脂(93mg)。
實施例8-Br.含三丁基磷_基團和溴化物陰離子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
用35mL SOCl2回流聚甲基丙烯酸樹脂4小時，以形成酰基氯。在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(4.8g)和三乙胺(11.1g)。加入3-溴丙醇(9.0g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用40mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(8.7g)。
在氬下，于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(8.5g)。加入三丁基膦(16.2g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。然后，風干該樹脂(5.0g)。
實施例8-Cl.含三丁基磷_基團和氯化物陰離子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(12.2g)和三乙胺(23.2g)。加入3-氯丙醇(12.8g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(12.8g)。
在氬下，于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(12.8g)。加入三丁基膦(27.8g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用2×100mL CH2Cl2和2×100mLMeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(9.8g)。
實施例8-S.含三丁基磷_基團和烷基硫酯(alkylthioester)鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成 在氬下，在冰水浴中，于20mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(3.6g)和三乙胺(8.9g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2的3-巰基-1-丙醇(5.8g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用CH2Cl2、水和甲醇洗滌該樹脂。風干該樹脂(3.5g)。
在氬下，于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.3g)。加入四溴化碳(14.9g)和三苯基膦(11.8g)。回流該混合物5小時。過濾該漿液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.2g)。
在氬下，于40mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(4.2g)。加入三丁基膦(6.7g)并攪拌該漿液8天。過濾該漿液，并用90mL CH2Cl2以及隨后用50mLMeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.0g)。
實施例9.含三丁基磷_基團和酯鍵的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于50mL乙腈中，攪拌聚苯乙烯丙烯酸羥甲酯樹脂(polystyrene hydroxymethyl acrylate resin)(5.0g)。在氬下攪拌三丁基膦(2.1g)和4.0M HCl(2.5mL)15分鐘。在1小時內，以4等份將此溶液加入到該樹脂漿液中。除去冰水浴并在室溫下攪拌漿液3小時。過濾漿液，并用50mL乙腈隨后用2個50mL份的CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(6.24g)。
實施例10.含三丁基磷_基團和酯鍵的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中攪拌羥甲基化聚苯乙烯(Aldrich，2.0meq/g，5.0g)和三乙胺(2.3g)。加入氯乙酰氯(1.9g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾漿液，并用40mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(5.8g)。加入三丁基膦(3.2g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。然后，風干該樹脂(5.9g)。
實施例11.含三丁基磷_基團和芳基硫酯(arylthioester)鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于25mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.7g)和三乙胺(8.6g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2中的2-巰基芐醇(5.0g)，并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。用50mL CH2Cl2稀釋漿液，并在6000rpm下離心10分鐘。丟棄上清。用100mL MeOH洗滌該樹脂3次(在6000rpm下離心每一洗滌液10分鐘)。在最后一次洗滌后，過濾該樹脂并風干(4.2g)。
在氬下于100mL干乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(3.4g)。加入四溴化碳(10.2g)和三苯基膦(8.0g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(2.8g)。
在氬下于40mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(2.8g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2隨后用125mL MeOH洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(2.7g)。
實施例12.含三甲基磷_基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巰基芐醇(9.3g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.8g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(1.04g)。加入于THF中的1.0M三甲基膦溶液(7.3mL)，并攪拌漿液10天。過濾該漿液，并用100mLCH2Cl2、100mL THF、50mL MeOH和100mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(1.1g)。
實施例13.含三辛基磷_基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巰基芐醇(9.3g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.8g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(1.68g)。加入三辛基膦(4.4g)并攪拌漿液10天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2、100mL THF、50mLMeOH和100mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(1.67g)。
實施例14.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、并含有三丁基磷_基團和芳基硫酯鍵的磁性二氧化硅顆粒的合成。
將磁性的羧酸官能化的二氧化硅顆粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，0.6g)置于6mL亞硫酰氯中并回流3小時。減壓下除去過量的亞硫酰氯。在氬下，在冰水浴中，將樹脂重懸于40mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入2-巰基芐醇(0.7g)并除去冰水浴。在室溫下過夜搖動該漿液。過濾該漿液，并用35mL MeOH以5000rpm離心樹脂10分鐘。棄上清液。橙黃色的樹脂被風干(335mg)。
在氬下于45mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(335mg)。加入四溴化碳(2.0g)和三苯基膦(1.6g)。回流混合物3小時。以5000rpm離心該樹脂10分鐘，并丟棄上清。用50mL乙腈以5000rpm離心該樹脂10分鐘，2次，并丟棄上清。然后，風干該樹脂(328mg)。
在氬下于40mL CH2Cl2中重懸該樹脂(328mg)。加入三丁基膦(280mg)并搖動漿液10天。通過在瓶的外部放置磁體沉降磁性樹脂，并傾析上清。用30mLCH2Cl2洗滌該樹脂3次，隨后用25mL MeOH洗滌3次。然后，風干該樹脂(328mg)。
實施例15.含有三丁基磷_基團和芳基硫酯鍵的磁性聚合甲基丙烯酸酯顆粒的合成。
Sera-MagTM磁性羧酸酯微粒(Seradyn)被用于形成可裂解磁性顆粒。Sera-Mag顆粒包括聚苯乙烯-丙烯酸聚合物芯，其被用專用聚合物包封的磁鐵礦包覆層包圍。羧酸酯基團在表面上是可及的。顆粒(0.52meq/g，0.50g)被懸浮于15mL水和25mL 0.1M MES緩沖液中(pH4.0)。在加入126mg EDC(1-[3-二甲氨基]丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物)和110mg 2-巰基芐醇之前，對該反應混合物超聲處理5分鐘。搖動該反應混合物7天。過濾該反應混合物。用50mL水和100mLMeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(0.53g)。
在氬下于20mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(0.53g)。加入四溴化碳(174mg)和三苯基膦(138mg)。在65℃下超聲處理該混合物5小時。將反應混合物置于大磁體上并傾析上清。用乙腈洗滌該樹脂4次，用磁體沉淀該樹脂，并丟棄洗滌液。將該樹脂重懸于MeOH中并搖動過夜。用MeOH洗滌該樹脂4次，用磁體沉淀該樹脂，并丟棄洗滌液。然后，風干該樹脂(0.52g)。
將該樹脂(0.52g)重懸于10mL乙腈中。加入三丁基膦(106mg)并搖動該反應7天。用磁體沉淀該磁性樹脂并傾析上清。用乙腈洗滌該樹脂4次并用MeOH洗滌4次。然后，風干該樹脂(0.51g)。
實施例16.含三丁基磷_基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于30mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(0.6g)和三乙胺(1.5g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2中的4-巰基芐醇(1.0g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2、100mL水、50mL MeOH和25mL CH2Cl2洗滌該樹脂。風干該樹脂(0.7g)。
在氬下于20mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(0.6g)。加入四溴化碳(1.8g)和三苯基膦(1.4g)。回流該混合物3小時。過濾該漿液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(0.6g)。
在氬下于15mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(0.6g)。加入三丁基膦(0.85g)并攪拌漿液6天。過濾該漿液，并用75mL CH2Cl2隨后用150mL MeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(0.6g)。
實施例17.含三丁基磷_基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，于100mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(0.71g)和三乙胺(2.2g)。加入4-羥苯基4-溴硫代丁酸酯(2.55g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌。風干該樹脂(0.85g)。
在氬下于20mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(0.85g)。加入三丁基膦(2.7g)并攪拌漿液3天。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂。
實施例18.含三丁基磷_基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，于20mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(1.0g)和吡啶(1.9mL)。加入1，4-苯二硫醇(1.85g)并在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌。風干該樹脂(1.08g)。
在氬下于20mL CH2Cl2中攪拌該樹脂(1.08g)和三乙胺(3.0mL)。加入4-溴丁酰氯(1.8mL)并攪拌反應混合物2天。過濾該漿液并用CH2Cl2洗滌。風干該樹脂(1.10g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(1.10g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌漿液5天。過濾該漿液并用CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(1.0g)。
實施例19.含三丁基磷_基團的交聯的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物的合成。
在30mL亞硫酰氯中回流TentaGel S COOH珠(Advanced Chemtech，3.0g)——交聯的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物90分鐘。在減壓下除去殘余的亞硫酰氯。該樹脂重懸于30mL氯仿中并再濃縮。
在氬下，在冰水浴中，于60mL CH2Cl2中攪拌該樹脂和三乙胺(0.14g)。加入2-巰基芐醇(0.11g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。過濾該漿液，并用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。過濾并風干該樹脂(2.9g)。
在氬下于60mL干燥的乙腈中重懸并攪拌該樹脂(2.8g)。加入四溴化碳(0.36g)和三苯基膦(0.29g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(2.8g)。
在氬下于50mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(2.7g)。加入三丁基膦(0.21g)并攪拌漿液6天。過濾該漿液，并用50mLCH2C]2隨后用175mL MeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(2.8g)。
實施例20.含有琥珀酸酯連接的三丁基磷_基團和硫酯鍵的可控多孔玻璃珠的合成。
將Millipore LCAA玻璃(1.0g，38.5微摩爾/克)懸浮于10mL干燥的吡啶中。加入琥珀酸酐(40mg)并在室溫下搖動反應混合物4天。用20mL MeOH稀釋該反應混合物，并過濾該混合物。用20mL MeOH洗滌固體5次，并用20mLCH2Cl2洗滌5次。風干該固體(1.0g)。
將該固體(0.50g)懸浮于10mL干燥的CH2Cl2中。加入二環己基碳二亞胺(10mg)和2-巰基芐醇，并在室溫下搖動反應混合物6天。用CH2Cl2稀釋該反應混合物并過濾該混合物。用MeOH洗滌固體3次并用CH2Cl2洗滌3次。風干該固體(0.50g)。
在氬下于10mL干燥的乙腈中重懸該固體(400mg)。加入4-溴化碳(14mg)和三苯基膦(11mg)。回流該混合物3小時。過濾該混合物，并用50mLMeOH洗滌固體5次，以及用50mL CH2Cl2洗滌5次。風干該固體(360mg)。
在氬下于10mL CH2Cl2中重懸該固體(300mg)。加入三丁基膦(5滴)并搖動反應混合物5天。用CH2Cl2稀釋該反應混合物并過濾。用50mL CH2Cl2洗滌該固體5次并風干(300mg)。
實施例21.含吖啶_酯(acridinium ester)基團的聚乙烯基芐基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于40mL CH2Cl2中攪拌吖啶9-羧酸氯化物(Acridine 9-carboxylic acid chloride)(1.25g)和三乙胺(1.3g)。加入羥基苯硫酚樹脂(Polymer Laboratories，1.67meq/g，3.0g)，并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(4.4g)。
在氬下于40mL CH2Cl2中攪拌該樹脂(4.3g)。加入三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)(6.1g)并攪拌反應混合物2天。過濾該漿液并用200mL CH2Cl2和1L MeOH洗滌該樹脂。真空干燥該樹脂(4.7g)。
實施例22.含9，10-二氧化吖啶乙烯酮二硫縮醛(acridan ketene dithioacetal)基團的聚乙烯基芐基聚合物的合成。
在氬下，在-78℃下，于20mL無水THF中攪拌N-苯基9，10-二氫化吖啶(0.62g)。加入丁基鋰(2.5M，在己烷中，0.93mL)并于-78℃攪拌反應混合物2小時。加入二硫化碳(0.16mL)并于-78℃攪拌反應混合物1小時。將反應混合物溫熱至室溫。加入Merrifield’s肽樹脂(1.6meq/g，1.0g)并在室溫下過夜攪拌該混合物。過濾該混合物。用10mL丙酮洗滌樹脂5次，用10mL水洗滌3次以及用10mL丙酮洗滌2次。風干該樹脂(1.21g)。
在氬下于20mL無水DMF中攪拌該樹脂(1.21g)和NaH(60％，在油中，0.003g)4小時。加入1，3-二溴丙烷(0.07mL)并攪拌混合物3天。過濾該混合物。用10mL丙酮洗滌樹脂3次，用10mL水洗滌5次以及用10mL丙酮洗滌5次。風干該樹脂(1.22g)。
在氬下于20mL DMF中重懸并攪拌該樹脂(1.22g)。加入三丁基膦(1.18g)并攪拌漿液7天。過濾該漿液并用20mL CH2Cl2洗滌該樹脂4次以及用20mL丙酮洗滌4次。然后，風干該樹脂(1.07g)。
實施例23.從可水解裂解顆粒結合并洗脫DNA的一般步驟 在管中用500μL THF漂洗10mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用200μL水重復漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL含水NaOH于37℃溫育5分鐘洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于分析。
實施例24.熒光測定步驟 通過熒光測定，使用PicoGreenTM對DNA進行染色而分析上清液和洗脫劑中DNA含量。簡要地，將10μL含有或疑似含有DNA的溶液等分試樣與190μL熒光DNA“染色”液溫育。熒光染色劑為在0.1M tris，pH7.5，1mM EDTA中以1∶400稀釋的PicoGreen(Molecular Probes)。在溫育樣品至少15分鐘后，在微量板熒光分析儀(microplate fiuorometer)(Fluoroskan，LabSystems)中測量熒光。濾片組為480nm和535nm。含有已知量的相同DNA的陽性對照以及陰性對照被同時進行。
實施例25.從不同的pH溶液將DNA結合至實施例11的珠上，顯示出在寬范圍的pH內的有效捕獲。
制備pH跨度為4.5至9.0的緩沖液。具有pH4.5至6.5的緩沖液為10mM乙酸鹽緩沖液。具有pH7.0至9.0的緩沖液為10mM tris乙酸鹽緩沖液。在室溫下，將2μg線性化pUC18 DNA在200μL每一緩沖液中的溶液加至10mg實施例11的可裂解珠30-45秒。在每一緩沖液中，平行運行陰性對照溶液，其不含DNA。在將珠樣品離心后除去上清，并用UV和熒光分析。
緩沖液pH結合％(通過UV)結合％(通過熒光)4.556735.064685.558646.061716.557747.049617.544608.045558.537399.03133
單獨地，發現在pH8.0下使用20mg珠結合5分鐘導致100％的DNA捕獲。
實施例26.從實施例11的可裂解珠洗脫的DNA在LMO擴增中的使用。
將在200μL水中的、含有0.1或1μg pUC18 DNA的溶液加至先前用400μLTHF洗滌、然后用水洗滌2次的10mg珠。在溫育30分鐘之后，離心樣品管30秒并收集上清。用2×400μL水洗滌所述珠并丟棄洗滌液。通過在室溫下用100μL 1M NaOH洗滌所述珠15分鐘、離心30秒并收集洗脫液而洗脫DNA。用40μL 1M乙酸中和每一洗脫液的80μL的部分。
如美國專利5,998,175所述，使用本發明的聚合珠分離的質粒DNA通過LMO進行擴增，其直接使用洗脫液而未沉淀DNA。簡要地，通過熱循環方案，使用一對引物和一組跨越68個堿基區域的八聚體，擴增68 bp的區域。將一組12個八聚體-5′-磷酸鹽(每條鏈6個)、引物和模板(1μL)溶解在Ampligase緩沖液中。用50μL礦物油覆蓋反應管并加熱至94℃5分鐘。在約2分鐘之后，將100 UAmpligase加入每一管中。樣品被循環35次94℃，30秒；55℃，30秒；35℃，30秒。擴增反應物的凝膠電泳揭示了具有期望分子量的條帶。
實施例27.DNA結合至實施例9的聚合物珠 在管中用1mL THF漂洗100mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用1mL水重復漂洗過程兩次。將80μg pUC18 DNA在1mL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清，用于UV分析。該上清液含有66μg DNA。因此結合容量被測定為0.14μg/mg。
實施例28.從實施例11的可裂解珠結合和釋放RNA 在2個管中，使2μg熒光素酶(Luciferase)RNA結合至10mg珠。1×反轉錄酶緩沖液(50mM tris-HCl，pH8.5，8mM MgCl2，30mM KCl，1mM DTT(0.015％)))被用于洗脫。將一個管在94℃下加熱5分鐘，而另一個管在94℃下加熱30分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上對洗脫液和對照跑膠，并用SYBR GreenTM染色。5分鐘的加熱顯示了～50％的RNA從所述珠洗脫，但30分鐘的加熱似乎使RNA變性。
實施例29.用不同的裂解/洗脫緩沖液從實施例11的可裂解珠結合和釋放RNA。
在3個管中，使1μg Luciferase RNA結合至10mg珠。在一個管中，3M乙酸鉀被用于在室溫下洗脫RNA 30分鐘。在另一個管中，1×反轉錄酶緩沖液(RT)被用于在94℃下洗脫1分鐘。第三管具有RNA提取緩沖液并被加熱至94℃1分鐘。RNA提取緩沖液由pH8.8的10mM tris-HCl、0.14 MNaCl、1.5M MgCl2、0.5％NP-40、1mM DTT組成。在1％瓊脂糖凝膠上對所有洗脫液和對照跑膠，并用SYBR GreenTM染色。3M乙酸鉀未產生可識別的RNA。1×反轉錄酶緩沖液和RNA提取緩沖液都顯示出條帶，該條帶被估計包含相應于大約50％洗脫的RNA。
實施例30.從實施例11的可裂解珠結合和釋放RNA，并通過化學發光印跡試驗檢測。
在4個管中，使1μg Luciferase RNA結合至10mg珠。2個管使用1×反轉錄酶緩沖液進行洗脫，而另2個管使用RNA提取緩沖液。將每一種類的緩沖液的一個管加熱至94℃1分鐘。其它兩個管被加熱至94℃5分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上對所有洗脫液和對照跑膠，并用SYBR Green染色。使用任一種緩沖液，加熱1分鐘的洗脫液比加熱5分鐘的洗脫液都含有更多的RNA。RNA提取緩沖液比1×RT緩沖液洗脫出更多的RNA。采用過夜的毛細轉移，將RNA轉移至尼龍膜。然后，用HF-1生物素標記的引物過夜雜交RNA。用抗生物素HRP以及作為化學發光底物的Lumigen PS-3進行檢測。5分鐘的暴露驗證了凝膠結果。
實施例31.在不同溫度下從實施例11的可裂解珠結合和釋放RNA。
在6個管中，使1μg Luciferase RNA結合至10mg珠。RNA提取緩沖液被用于在若干個不同的溫度下洗脫RNA 5分鐘40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。在1％瓊脂糖凝膠上對所有洗脫液和對照進行跑膠，并用SYBR Green染色。所有的溫度似乎都100％洗脫。
實施例32.用實施例1的三丁基磷_珠結合線性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脫組合物釋放。
在管中用500μL THF漂洗10mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用200μL水重復漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下表所述的各種試劑組合物在室溫下溫育20分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于如實施例24所述的熒光分析。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％糠醇 5850mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％聚蔗糖 1950mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％HOCH2CH2SH 5250mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％DTT5250mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％丙三醇 1550mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％2-丙醇 5050mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％乙醇 3750mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％CF3CH2OH 3850mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％丙酮 4250mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％THF4150mM tris，pH8.5 1.25M NaCl15％對二_烷 33
實施例33. 用下表描述的試劑組合物重復實施例32的結合和釋放方案。檢測改變DTT或2-巰基乙醇的濃度的效應。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.51.25M NaCl0.1％DTT 050mM tris，pH8.51.25M NaCl1％DTT 050mM tris，pH8.51.25M NaCl3％DTT 3650mM tris，pH8.51.25M NaCl4％DTT 4150mM tris，pH8.51.25M NaCl0.1％HOCH2CH2SH 050mM tris，pH8.51.25M NaCl1％HOCH2CH2SH050mM tris，pH8.51.25M NaCl3％HOCH2CH2SH3950mM tris，pH8.51.25M NaCl4％HOCH2CH2SH38實施例34. 用下表描述的試劑組合物重復實施例32的結合和釋放方案。檢測改變鹽NaCl和KCl的濃度的效應。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.50.1M NaCl 5％DTT 150mM tris，pH8.50.25M NaCl 5％DTT 050mM tris，pH8.50.5M NaCl 5％DTT 2750mM tris，pH8.50.75M NaCl 5％DTT 2950mM tris，pH8.51.0M NaCl 5％DTT 2950mM tris，pH8.51.25M NaCl 5％DTT 2650mM tris，pH8.50.75M KCl 5％DTT 6450mM tris，pH8.51.25M KCl 5％DTT 60實施例35. 用下表描述的試劑組合物重復實施例32的結合和釋放步驟。洗脫珠60分鐘。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.50.1M NaCl 0％2-丙醇 350mM tris，pH8.50.1M NaCl 15％2-丙醇 6850mM tris，pH8.50.25M NaCl 30％2-丙醇 6450mM tris，pH8.50.5M NaCl 50％2-丙醇 4實施例36. 用下表描述的試劑組合物重復實施例32的結合和釋放步驟。評價相對效應。
緩沖液鹽有機溶劑
50mM tris，pH8.5 1.0M乙酸鈉 15％2-丙醇++50mM tris，pH8.5 1.5M乙酸鈉 15％2-丙醇++50mM tris，pH8.5 1.25M乙酸鈉 15％2-丙醇++50mM tris，pH8.5 0.75M乙酸鈉 15％2-丙醇+50mM tris，pH8.5 0.5M乙酸鈉 15％2-丙醇+50mM tris，pH8.5 0.1M乙酸鈉 15％2-丙醇+實施例37. 用實施例1的三丁基磷_珠結合不同長度的寡核苷酸并用試劑組合物釋放。
對范圍為20堿基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸進行實施例32的結合和釋放方案。洗脫組合物是pH8.5的50mM tris、0.75M NaCl、5％DTT。使用ssDNA的熒光染色劑——OliGreenTM，熒光測定DNA的量。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％2039304350366834181 33424 33753 322.7kb 20實施例38.用實施例1的三丁基磷_珠結合線性化pUC18 DNA并用不同洗脫體積釋放。
將2μg線性化的pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的10mg珠。在溫育20分鐘后，離心該柱并收集上清。用2×200μL水洗滌所述珠并丟棄洗液。如下洗脫DNA通過用5×200μL的50mM tris，pH8.5、0.75M NaCl、5％DTT在室溫下洗滌所述珠5分鐘，離心并收集洗脫液，用于在每次洗脫后進行熒光和凝膠電泳分析。
以類似的方式，用5×40μL相同的緩沖液洗脫含有結合DNA的珠。
洗脫百分比200μL洗脫液40μL洗脫液洗脫163 47洗脫210 11洗脫35.5 10洗脫43.5 5洗脫52.1 4總量 84 77
實施例39.用實施例5的三丁基銨珠結合和釋放核酸。
將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg的珠中，并輕輕搖動該混合物30分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH8.5、0.75M NaCl、5％DTT于室溫下溫育30分鐘洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實施例26中所述。DNA結合為50％，洗脫為結合部分的69％。
實施例40.用實施例7的磁性三丁基磷_珠結合和釋放核酸。
在管中用500μL THF漂洗10mg珠樣品。磁法分離內容物并除去液體。用200μL水重復漂洗過程。將在200μL水中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至所述珠中，并輕輕搖動該混合物20分鐘。磁分離該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇于室溫下溫育30分鐘而洗脫DNA。磁分離該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實施例26中所述。DNA結合為100％，洗脫為18％。
實施例41.用實施例1的三丁基磷_珠結合線性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脫溫度釋放。
將在200μL水中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至10mg的珠中，并輕輕搖動該混合物30分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇在不同溫度下溫育5分鐘而洗脫DNA37℃、46℃、65℃和94℃。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實施例26中所述。在所有溫度下，DNA結合為100％，～65-70％的結合的DNA被洗脫。
實施例42.含有三丁基磷_基和和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在室溫下，于100mL CH2Cl2中，攪拌如上所述制備的聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.96g)、5.07g 4-(甲硫基)苯硫酚和三乙胺(8.8mL)5天。過濾出該固體，并用100mL CH2Cl2和100mL水洗滌，然后在125mL甲醇中攪拌若干天。過濾并干燥所產生的3.76g硫酯產物。
將100mL CH2Cl2中的2.89g部分的固體與4.1mL三氟甲基磺酸甲酯一起攪拌7天。過濾該固體，并依次用200mL CH2Cl2、300mL甲醇和300mLCH2Cl2洗滌，然后風干。
實施例43.使用具有二甲基锍基的可裂解珠結合和釋放DNA。
將在200μL 10mM pH為8的tris中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至10mg實施例42的珠樣品中，并輕輕搖動該混合物5分鐘。離心該混合物并收集上清液。用2×200μL水漂洗所述珠并丟棄水。通過用200μL 50mM tris，pH8.5，0.75M NaCl，5％DTT于37℃溫育5分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于熒光分析。該上清液不含有DNA。洗脫液含有37％初始結合的DNA。
實施例44.用實施例1的三丁基磷_珠結合線性化的pUC18 DNA并用不同的洗脫組合物釋放 用200μL水漂洗10mg珠樣品。將在200μL水中的2μg線性化pUC18DNA溶液加至10mg珠，并輕輕搖動該混合物25分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下表所述的各種試劑組合物在室溫下溫育25分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析和凝膠電泳分析。
緩沖液[MgCl2]有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.5 2.0M 5％DTT7.350mM tris，pH8.5 1.5M 5％DTT10.350mM tris，pH8.5 1.25M 5％DTT11.550mM tris，pH8.5 1.0M 5％DTT13.350mM tris，pH8.5 0.75M 5％DTT17.650mM tris，pH8.5 0.5M 5％DTT23.750mM tris，pH8.5 0.25M 5％DTT32.5實施例45.用實施例1的三丁基磷_珠結合線性化的pUC18 DNA并用含有Na、K或Mg離子的不同的洗脫組合物釋放。
用200μL水漂洗10mg珠樣品。將在200μL水中的2μg線性化pUC18DNA溶液加至10mg珠，并輕輕搖動該混合物25分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下表所述的各種試劑組合物在室溫下溫育25分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光和凝膠電泳分析。
緩沖液[鹽]有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.5 1.25M NaCl 5％DTT 53.650mM tris，pH8.5 1.25M KCl 5％DTT 60.050mM tris，pH8.5 1.25M MgCl25％DTT 11.550mM tris，pH8.5 0.75M NaCl 5％DTT 67.850mM tris，pH8.5 0.75M KCl 5％DTT 64.450mM tris，pH8.5 0.75M MgCl25％DTT 17.6
50mM tris，pH8.50.1M MgCl25％DTT25.650mM tris，pH8.5無5％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5無無N.D.
(N.D.—未檢測)實施例46.用實施例1的三丁基磷_珠結合線性化的pUC18 DNA并用含有各種離子的不同的洗脫組合物釋放。
用200μL水漂洗10mg珠樣品。將在200μL水中的2μg線性化pUC18DNA溶液加至10mg珠，并輕輕搖動該混合物25分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下表所述的各種試劑組合物在室溫下溫育30分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于凝膠電泳分析。
緩沖液[鹽]有機溶劑洗脫％50mM tris，pH8.5 0.75M LiCl 5％DTT77.050mM tris，pH8.5 0.75M CaCl25％DTT76.350mM tris，pH8.5 0.75M CsCl 5％DTT73.950mM tris，pH8.5 0.75M ZnCl25％DTT47.250mM tris，pH8.5 0.75M NH4Cl 5％DTT49.650mM tris，pH8.5 0.1M LiCl 5％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5 0.1M CaCl25％DTT62.350mM tris，pH8.5 0.1M CsCl 5％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5 0.1M ZnCl25％DTTN.D.
50mM tris，pH8.5 0.1M NH4Cl 5％DTTN.D.
實施例47.用直接被用于PCR的緩沖液組合物從實施例52的可裂解磁性三丁基磷_珠釋放結合的pUC18 DNA。
用400μLTHF，隨后用2×100μL水漂洗10mg實施例52的磁性磷_珠樣品。將在200μL裂解液中的2μg未切割的pUC18 DNA溶液加至10mg珠，并輕輕搖動該混合物5分鐘。裂解緩沖液包括三種緩沖液的1∶1∶1混合物；S150mM tris，pH8.0，10mM EDTA；S2含1％SDS的0.2M NaOH溶液；S30.3MKOAc，0.2M HCl。磁法分離該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和含有400mM tris，pH8.4，1M KCl和50mM MgCl2的200μL濃緩沖液在37℃下溫育5分鐘而洗脫DNA。熒光測定顯示100％的質粒DNA結合至所述珠；41％被洗脫。
用水以各種比例1∶10和1∶20稀釋含有DNA的洗脫液，并用30個循環進行PCR擴增94℃-1分鐘、60℃-1分鐘、72℃-1分鐘。通過PCR成功擴增了1∶10和1∶20稀釋液。
實施例48.采用不同的緩沖液組合物，用實施例1的聚合物珠從細菌培養物分離質粒DNA。
使大腸桿菌(E.coli)培養物過夜生長。在4℃，以6000×g離心20mL的部分15分鐘，以沉淀細胞。該沉淀被重懸于4mL 50mM tris，pH8.0，10mMEDTA中，其含有100μg/mL RNase A。然后，將4mL含有1％SDS的0.2M NaOH溶液加至該混合物，其被輕輕混合并在室溫下保持4分鐘。接下來，加入4mL冷卻至4℃的、含有0.2M HCl的0.3M KOAc，混合該溶液并使其保持10分鐘，以沉淀SDS。過濾掉沉淀物并收集濾液。
將裂解物(200μL)和10mg實施例1的珠混合并溫育5分鐘。結合后，離心該珠并除去上清。用2×200μL水洗滌該珠樣品，然后用下表中詳細描述的組合物洗脫。
緩沖液有機溶劑產量(μg)1.25M tris，pH8.5 15％2-丙醇 3.51.25M tris，pH8.5 5％DTT 2.10.05M tris，pH8.5 5％DTT 1.5(+0.1M MgCl2)實施例49.含二甲基磷_基的聚苯乙烯聚合物的合成。
將Merrifield肽樹脂(Sigma，1.1meq/g，2.0g)和硫代甲醇鈉(sodiumthiomethylate)(2.24g，10當量)與60mL無水DMF一起加入250mL燒瓶中。將混合物置于氬下并在室溫下攪拌15天。過濾漿液，并用50mL DMF、200mL水、200mL甲醇和200mL CH2Cl2洗滌得到的固體。風干該樹脂(2.12g)。
將在100mL CH2Cl2中的硫甲基化的聚合物(thiomethylated polymer，0.637g)置于氬下，并與1.6mL三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)反應。攪拌13天后，過濾混合物并用200mL CH2Cl2、200mL甲醇和200mL CH2Cl2洗滌固體。風干，得到2.09g白色固體。
實施例50.使用不同的緩沖液組合物釋放結合到實施例49的聚合物珠上的pUC18DNA。
用300μL THF，隨后用2×100μL水漂洗10mg實施例49的锍珠樣品。將在200μL水中的2μg線性化的pUC18 DNA溶液加至10mg珠并輕輕搖動該混合物15分鐘。離心該珠并棄上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下面的緩沖液在室溫下溫育15分鐘而洗脫DNA。熒光測定顯示100％的質粒DNA結合至所述珠；56％被洗脫。
緩沖液有機溶劑鹽洗脫％50mM tris，pH8.55％DTT 0.75M NaCl 56實施例51.4′-羥苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(thiobenzoate)的合成。
將100.9g 4-氯甲基-苯甲酸和1.2L亞硫酰氯裝載入3L瓶中。回流反應4小時，之后，在減壓下除去亞硫酰氯。通過加入CH2Cl2和減壓下蒸發，除去殘留的亞硫酰氯。
向含有113.1g 4-氯甲基苯甲酸氯化物的3L瓶中裝載入98.17g 4-羥基-苯硫酚和1.5L CH2Cl2。吹掃入(purged in)氬，并加入67.75mL吡啶。在攪拌過夜后，用1L CH2Cl2稀釋反應混合物并用5L水萃取。水層用CH2Cl2反萃取。合并的CH2Cl2溶液經硫酸鈉干燥，并濃縮至固體。用500mL CH2Cl2洗滌該固體，過濾并風干。1H NMR(丙酮-d6)δ4.809(s，2H)，6.946-6.968(d，2H)，7.323-7.346(d，2H)，7.643-7.664(d，2H)，8.004-8.025(d，2H)。
實施例52.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、并含有三丁基磷_基和可裂解芳基硫酯鍵的磁性二氧化硅顆粒的合成。
將磁性的羧酸官能化的二氧化硅顆粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，1.5g)置于20mL亞硫酰氯中并回流4小時。減壓下除去過量的亞硫酰氯。將該樹脂重懸于25mL CHCl3中并通過超聲分散該懸浮液。蒸發溶劑并重復超聲洗滌處理。真空下干燥該顆粒，待進一步使用。
酰基氯官能化的顆粒與388mg二異丙基乙胺一起被懸于38mLCH2Cl2中。加入4′-羥苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(524mg)并將密封的反應瓶置于搖床上過夜。將顆粒轉移至50mL塑料管，并用若干份CH2Cl2、CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH，然后用CH2Cl2反復洗滌，伴隨以磁分離。通過TLC監測洗滌溶液中未反應的可溶性原材料的除去。在進一步使用前風干該固體。
在氬下，將該樹脂(1.233g)懸于20mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(395mg)并搖動該漿液7天。將顆粒轉移至50mL塑料管，并用40mL CH2Cl2洗滌4次，隨后用40mL MeOH洗滌4次以及用40mL CH2Cl2洗滌4次。然后，風干該樹脂，得到1.17g淺棕色固體。
實施例53.含三丁基磷_基團和可裂解芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物顆粒的合成。
將聚(甲基丙烯酰氯)顆粒(1.0meq/g，1.5g)置于含2.45g二異丙基乙胺的75mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。4′-羥苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(4.5g)，并將密封的反應混合物在室溫下攪拌過夜。過濾該漿液，并用10mL CH2Cl2、200mL丙酮、200mL MeOH、2×100mL 1∶1的THF/CH2Cl2、250mL THF、250mLCH2Cl2、250mL己烷洗滌樹脂。風干該樹脂，待進一步使用。
在氬下，將該樹脂(1.525g)懸于25mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(1.7g)并攪拌該漿液4天。過濾該樹脂，并用225mL CH2Cl2，隨后用175mL己烷洗滌4次。然后，風干該樹脂，得到1.68g固體。
以類似的方式，還制備含有三甲基磷_基的聚合物顆粒。
實施例54.用緩沖液組合物從實施例53的可裂解三丁基磷_珠釋放結合的pUC18 DNA。
根據實施例49描述的方案，將質粒DNA結合至實施例56的顆粒上。通過將該顆粒在100μL含有5％DTT的1.25M tris，pH8.5緩沖液中、于37℃下溫育5分鐘而洗脫DNA。
熒光測定顯示100％的質粒DNA結合至所述珠；55％被洗脫。
權利要求
1.從樣品分離核酸的方法，所述核酸選自寡核苷酸、DNA、RNA或合成的DNA類似物，所述方法包括a)提供固相結合材料；b)混合所述固相與含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結合至所述固相結合材料；c)從所述固相結合材料分離所述樣品；和d)通過用組合物洗脫，從所述固相釋放所述核酸，所述組合物包含pH 7-9的含水胺緩沖溶液，其中所述胺的濃度為至少0.01M，0.1-3M的一價或二價鹵化物鹽或乙酸鹽，和0.01-50％的親水性有機助溶劑，所述親水性有機助溶劑選自乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及對-二_烷。
2.權利要求1所述的方法，其中所述固相選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。
3.權利要求1所述的方法，其中所述固相具有核酸結合部分，所述核酸結合部分包括季磷_基PR3+X-，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是陰離子。
4.權利要求1所述的方法，其中所述固相具有核酸結合部分，所述核酸結合部分包括式SR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是陰離子。
5.權利要求1所述的方法，其中所述固相具有核酸結合部分，所述核酸結合部分包括季銨基NR3+X-，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是陰離子。
6.權利要求1所述的方法，其中所述固相材料進一步包括磁芯部分。
7.權利要求1所述的方法，其中所述鹽選自NH4、Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的鹵化物鹽和乙酸鹽。
8.權利要求7所述的方法，其中所述鹽以至少0.1M的濃度存在。
9.權利要求1所述的方法，其中所述親水性有機助溶劑選自2-巰基乙醇和二硫蘇糖醇。
10.權利要求1所述的方法，其中所述胺選自脂族胺、脂族氨基酸、脂族氨基醇和磺化的脂族胺。
11.權利要求1所述的方法，其中所述核酸是人基因組DNA，所述樣品為體液。
12.權利要求1所述的方法，其中所述核酸是質粒DNA，所述樣品是細胞培養物。
13.權利要求1所述的方法，其中所述固相進一步包括可裂解連接體部分，所述可裂解連接體部分將所述固體支持部分連接至所述核酸結合部分。
14.從樣品分離核酸的方法，所述核酸選自寡核苷酸、DNA、RNA或合成的DNA類似物，所述方法包括a)提供固相結合材料；b)混合所述固相與含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結合至所述固相結合材料；c)從所述固相結合材料分離所述樣品；和d)通過用組合物洗脫，從所述固相釋放所述核酸，所述組合物包含pH 7-9的含水胺緩沖液，其中所述胺的濃度為至少0.1M，和0-50％的親水性有機助溶劑，所述親水性有機助溶劑選自C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及對-二_烷。
15.權利要求14所述的方法，其中所述緩沖液的濃度為至少0.4M。
16.權利要求14所述的方法，其中所述緩沖液的濃度為至少1M。
17.權利要求14所述的方法，其中所述胺選自脂族胺、脂族氨基酸、脂族氨基醇和磺化的脂族胺。
18.權利要求14所述的方法，其中所述親水性有機助溶劑選自2-巰基乙醇和二硫蘇糖醇。
19.權利要求14所述的方法，其中所述固相具有核酸結合部分，所述核酸結合部分包括四元_基，選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季磷_基團PR3+X-，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式SR2+X-的三元锍基，和其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季銨基NR3+X-，并且其中X是陰離子。
20.權利要求14所述的方法，其中所述固相材料進一步包括磁芯部分。
21.權利要求14所述的方法，其中所述核酸是人基因組DNA，所述樣品為體液。
22.權利要求14所述的方法，其中所述核酸是質粒DNA，所述樣品是細胞培養物。
23.從樣品分離核酸的方法，所述核酸選自寡核苷酸、DNA、RNA或合成的DNA類似物，所述方法包括a)提供固相結合材料，所述固相結合材料具有核酸結合部分，所述核酸結合部分包括或者季磷_基PR3+X-，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基并且其中X是陰離子；或者式SR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基并且其中X是陰離子；b)混合所述固相與含有所述核酸的所述樣品，以將所述核酸結合至所述固相結合材料；c)從所述固相分離所述樣品；和d)通過用組合物洗脫，從所述固相釋放所述核酸，所述組合物包含pH 7-9的含水胺緩沖液，其中所述胺的濃度為至少0.01M，0.1-3M的一價或二價鹵化物鹽或乙酸鹽，和0.01-50％的親水性有機助溶劑，所述親水性有機助溶劑選自C1-C4醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、水溶性硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF以及對-二_烷。
24.權利要求23所述的方法，其中所述固相材料進一步包括磁芯部分。
25.權利要求23所述的方法，其中所述胺選自脂族胺、脂族氨基酸、脂族氨基醇和磺化的脂族胺。
26.權利要求23所述的方法，其中所述鹽選自NH4、Li、Na、K、Rb、Cs、Ca、Mg和Zn的鹵化物鹽和乙酸鹽。
27.權利要求23所述的方法，其中所述親水性有機助溶劑選自2-巰基乙醇和二硫蘇糖醇。
28.權利要求27所述的方法，其中所述親水性有機助溶劑的濃度為至少1％。
29.權利要求23所述的方法，其中所述核酸是人基因組DNA，所述樣品為體液。
30.權利要求23所述的方法，其中所述核酸是質粒DNA，所述樣品是細胞培養物。
31.權利要求23所述的方法，其中所述固相進一步包括可裂解連接體部分，所述可裂解連接體部分將所述固體支持部分連接至所述核酸結合部分。
全文摘要
公開了分離核酸的方法，該方法包括將核酸結合至固相結合材料并通過用新型試劑組合物洗脫從所述固相釋放結合的核酸。組合物特征在于高離子強度緩沖液或添加的親水性有機助溶劑或兩者。用于本發明的方法和組合物的優選的固相材料包括季核酸結合部分。
文檔編號C07H21/02GK101027411SQ200580029851
公開日2007年8月29日 申請日期2005年6月30日 優先權日2004年7月15日
發明者H·阿哈萬－塔夫帝, R·德西瓦, S·西利普拉普, R·漢德利 申請人:魯米根公司