乙酰輔酶a羧化酶剪接變體及其用途的制作方法

專利名稱：乙酰輔酶a羧化酶剪接變體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體的核苷酸序列。還涉及由所述核酸編碼的對應多肽，和鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定該化合物調節ACC2剪接變體復合物或其復合物的活性或量的能力。
背景技術：
許多最近的發現已經指向可變的信使RNA前體剪接，所述剪接作為蛋白多樣性的發生器，在有些情況下，其在由單基因產生的多樣性的程度上與免疫系統相匹敵。基于可變剪接的全基因組分析，已經預測多達40-60％人基因具有可變剪接形式。該過程允許在由組成型外顯子提供的恒定構架中任選地包含或取代一些外顯子。得到的蛋白同種型通常在特定的功能結構域存在不同，同時具有共同的功能(Lopez AJ.Annu Rev Genet，32279-305，1998；Graveley.TrendsGenet.17100-107，2001)。可變剪接也可以導致可讀框的過早終止，或甚至在2個不同的讀框中使用相同的mRNA序列(Quelle等，Cell.83993-1000，1995)。因此，可變剪接對蛋白具有重要的功能后果，且它在產生蛋白多樣性中的總體重要性，是由于它的普及和有些基因的極端組合輸出。
最近25年已經表現出肥胖癥的發病率和嚴重性的令人擔憂的增加。這發生在發達國家和發展中的第三世界國家。例如，超過半數的美國人口受到超重的影響。過度的體重(在西方社會，BMI＞27，在亞洲，＞25)與2型糖尿病、高血壓、血脂異常(dyslipidaemia)、心血管疾病、骨關節炎和一些癌癥的高危險有關。體重減輕可以對許多這樣的發病具有深遠的影響，例如，幾乎可以預防2型糖尿病的進展。但是，盡管可以容易地實現顯著的且有益的體重減輕，但最大的挑戰是維持；體重復得對絕大多數人而言是不可避免的。因此，能具體地解決該問題的抗肥胖劑會滿足重要的未得到滿足的臨床需要。
骨骼肌負責全部身體脂質氧化的較大比例，且送遞給肌肉的脂質的主要命運是用作氧化燃料。在禁食或輕度鍛煉的過程中，血漿未酯化的游離脂肪酸(NEFA)占肌肉燃料需要的80-90％，而當燃料需求長期維持時，循環的細胞間的或細胞內的三酰基甘油酯(triacylglyceride)(TAG)-衍生的脂肪酸負責大多數的脂質氧化。肌肉脂質代謝的調節，依賴于底物可用性和隨后的細胞內的游離脂肪酸的運輸。游離脂肪酸底物向肌肉的送遞，依賴于以TAG的形式原始酯化的游離脂肪酸的動員和運輸。在肥胖癥中，游離脂肪酸的過度供應驅動向TAG合成的代謝和在肌肉中的儲存。現在已經明確，胰島素抗性與骨骼肌中的過量的肌細胞內(intramyocellular)的TAG密切相關(Krssak等，Diabetologia 42113-6，1999)。
在臨床上，難以維持體重減輕，與脂肪酸氧化的損傷緊密相關(Valtuena等，Int J.Obes.Relat.Metab.Disord.21811-7，1997a；Valtuena等，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.21267-732，1997b)，且代表著肥胖癥的藥物療法的主要障礙。在概念上，預期減少由乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)在氧化組織(例如骨骼肌)中生成的丙二酸單酰輔酶A，會提高脂肪酸氧化速度，并降低呼吸商(RQ)。因此，這可以提高體重減輕后的肥胖患者中的氧化電勢。相應地，已經將ACC2視作有前途的抗-肥胖癥靶，因為ACC2的缺失導致小鼠的瘦表型(Abu-Elheiga等Science 2912613-2664，2001)，且它的抑制是苗條蛋白-誘導的通過降低丙二酸單酰輔酶A來增加脂肪酸氧化的最后步驟。
存在2種已知的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)同種型，ACC1(ACCα)，它是胞質的，且主要在肝和脂肪組織中表達，和ACC2(ACCβ)，認為它與線粒體有關，且主要在骨骼肌和心臟中表達。乙酰輔酶A羧化酶催化ATP-驅動的乙酰輔酶A的羧化，以形成丙二酸單酰輔酶A。在脂肪酸合成中使用由ACC1生成的丙二酸單酰輔酶A，而推測由ACC2在線粒體表面上局部地形成的丙二酸單酰輔酶A調節棕櫚酰輔酶A穿梭系統(CPT-1)。丙二酸單酰輔酶A是肉堿棕櫚酰轉移酶1(CPT-1)的有效抑制劑，且結果它降低向線粒體中的脂肪酸流量。因而，ACC2活性的降低，會降低局部的丙二酸單酰輔酶A水平，并增加脂肪酸β-氧化，并伴隨著減少三酰基甘油(TAG)合成(Munday.Biochem Soc Trans.301059-64，2001)。
因而，乙酰輔酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)屬于碳鍵形成性連接酶的酶家族。使用生物素作為輔因子，ACC在ATP-驅動的多步反應中羧化乙酰輔酶A，以形成丙二酸單酰輔酶A(1)ATP+HCO3-+ACC-生物素→ADP+P1+ACC-生物素-CO2(2)ACC-生物素-CO2+乙酰輔酶A→ACC-生物素+丙二酸單酰輔酶A認為人乙酰輔酶A羧化酶2被疏水的N-末端錨定在線粒體外膜中(Abu-Elheiga等，Proc Natl Acad Sci USA.97(4)1444-9，2000)。該酶在2458個氨基酸的大單個多肽鏈(約280 kDa)上具有3個功能結構域，用于協同實現上述的部分反應。
已知ACC1受聚合、解聚合和磷酸化的短期調節。認為檸檬酸鹽是ACC的生理變構激活劑，且已經證實，它會誘導ACC1原聚體向絲狀結構的多步聚合。檸檬酸鹽結合造成無活性的ACC1原聚體的最初的構象變化，這觸發隨后的二聚體形成(“二聚體”由4個ACC1肽構成)。認為該最初的復合物形成，是所有ACC聚合的限速步驟。還已經證實，ACC2會被檸檬酸鹽激活。但是，機理尚不清楚，因為預期ACC2單體/原聚體向線粒體外膜的附著限制酶如何聚合。提出新發現的缺少膜結合序列的ACC2剪接變體ACC2(1b)，是與ACC2形成檸檬酸鹽誘導的多聚體復合物的胞質配偶體。
但是，羧化酶反應的檸檬酸鹽激活似乎在出現二聚體和多聚體形式的酶之前。該發現暗示著，酶周轉的啟動不依賴于酶復合物形成，且因而，在線粒體丙二酸單酰輔酶A形成中不需要假定的ACC2-ACC2(1b)配偶體關系。相反地，認為聚合的功能和重要性是對ACC周轉的結構保護，以免于激酶(例如，AMPK和/或cAMP PK)的滅活磷酸化。因而，ACC2原聚體盡管最初由檸檬酸鹽激活，但會迅速地變得可接近上述的激酶，并被同時的磷酸化關閉，除非與ACC2(1b)相結合。因此，阻止ACC2-ACC2(1b)復合物形成的化合物，不會阻止激活本身，而是通過細胞的能量調節機制，造成酶的下游抑制。因而，能以阻斷檸檬酸鹽誘導的復合物形成的方式與ACC2和/或ACC2(1b)相互作用的化合物，可以用于減緩線粒體表面上的丙二酸單酰輔酶A生成，并因此也用于增加線粒體中的脂肪酸氧化速度。在免疫沉淀研究中有ACC1和ACC2的異二聚體化的先例。在一項研究中(Dyck等Eur J Biochem 1999)，使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP，單獨地檢測到與大鼠心臟ACC2共沉淀的更低分子量產物，從而間接地鑒別出了具有ACC1大小但不是ACC1的生物素化的蛋白。當使用SDS-PAGE分離時，預期ACC2(1b)以與ACC1大約相同的速度遷移。但是，應當指出，相同的研究人員還表明，當使用針對ACC1的特異性的抗體時，ACC2會與ACC1共免疫沉淀。異二聚體形成的其它證明來自大鼠肝臟ACC1和ACC2的共免疫沉淀實驗(Winz等，JBC 269(20)14438-14445，1994)，其中報道了由2個同種型組成的1∶1復合物。另外證實，當進行非變性PAGE時，ACC1和ACC2會共遷移。ACC1在氧化組織(如骨骼肌和心臟)中的相對低豐度暗示著，在這些器官中存在可替代的調節配偶體，例如ACC2(1b)。
編碼ACC2的基因位于染色體12上，且在EMBL條目AC007637中公開了基因組序列。人ACC2 cDNA序列，見EMBL條目HSU89344。2個序列的比對表明，人ACC2基因由52個編碼外顯子組成。比對還鑒別出公布的ACC2的cDNA序列中的許多錯誤。因此，發明人已經克隆了ACC2 cDNA，并重新測序。校正的序列如SEQ IDNO2所示。
相關的蛋白。認為代表著ACC2基因的基因組小鼠序列證實了與人酶的最高同源性(約91％)。有錯誤的大鼠ACC2數據庫序列與人ACC2具有83％同一性。人ACC1和ACC2是76％相同的(相似性約82％)。
發明概述本發明源自ACC2的剪接變體的發現，所述變體在本文中稱作ACC2(1b)。已經在人骨骼肌、心臟、脂肪組織和肝臟中檢測到ACC2(1b)mRNA。剪接變體缺少膜錨定結構域，且被認為是ACC2的調節配偶體，從而與膜錨定的ACC2形成檸檬酸鹽誘導的聚合物。另外，ACC2(1b)是上游/下游激酶和磷酸酶的調節作用的潛在介質，所述激酶和磷酸酶構成脂肪酸氧化控制的丙二酸單酰輔酶A軸的部分。本發明的目的是提供一種蛋白，其在代謝疾病的理解中具有重要作用，所述代謝疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。已經實現了該目的，其中提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據SEQ ID NO1的氨基酸序列的乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQ ID NO1中公開的序列不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，該變體缺少膜結合能力。該剪接變體可以用于與野生型ACC2相同的篩選、診斷、治療等。
根據本發明的其它方面，提供了包含上述核酸的質粒。另外，提供了生產包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜錨定，該方法包含a)在適于表達多肽的條件下，培養含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼ACC2剪接變體多肽、或與其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，該多肽不能膜錨定；和b)從宿主細胞培養物中回收多肽。
根據本發明的另一個方面，提供了分離的多肽，其包含SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列，或與其具有至少85％相似性的序列，該多肽不能膜結合。
根據本發明的另一個方面，提供了純化的抗體，其能選擇性地結合ACC2剪接變體。
根據本發明的一個方面，提供了能調節ACC2剪接變體的活性或量的化合物在治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙中的用途。
根據本發明的另一個方面，提供了鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調節ACC2剪接變體蛋白的活性或量的能力。
根據本發明的另一個方面，提供了分離的ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物。因此，提供了鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調節包含ACC2和ACC2剪接變體的復合物的活性或量的能力。
而且，包含野生型ACC2和ACC2(1b)剪接變體的復合物構成了生產丙二酸單酰輔酶A的酶的生理形式。因此，使用重組技術，現在可以首次體外制備該復合物。因此，該復合物可以用于篩選中，以鑒別在治療代謝疾病中具有潛在的治療益處的化合物，所述代謝疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
另外，提供了對ACC2剪接變體核酸選擇性的抑制性核酸分子或針對ACC2剪接變體蛋白的選擇性抗體在生產用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的藥物中的用途。另外，提供了對ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物選擇性的抑制性核酸分子在生產用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的藥物中的用途。
附圖簡述

圖1是包含新外顯子1b的人ACC2基因結構的示意表示。該基因全長約130kb，且包含53個編碼外顯子，包括2個可替代地使用的含有起始ATG的起始外顯子，稱作外顯子1a和外顯子1b。
圖2顯示了人ACC2和人ACC2(1b)的氨基酸序列的比對。
圖3顯示了使用實時PCR測量的在人心臟、肝臟、骨骼肌、脾和脂肪組織中的ACC2(1b)RNA表達水平。
圖4顯示了檸檬酸鹽刺激的在轉染的HEK293細胞中表達的ACC2(1b)的活性。
圖5a至5b顯示了來自ACC2、ACC2(1b)和假轉染的HEK293細胞的細胞裂解物的SDS-PAGE和隨后的蛋白印跡分析的結果。
圖6a至6f顯示了人心臟和骨骼肌的免疫染色。
發明詳述因此，本發明提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據SEQ ID NO1的氨基酸序列的ACC2剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQ ID NO1中公開的序列不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，該變體不能膜錨定。本發明還提供了包含所述序列的互補體的核酸分子。本發明還提供了含有要求保護的核酸分子的表達載體，和用所述核酸轉化的宿主細胞。本發明還提供了用于表達ACC2的野生型(膜錨定)和剪接變體形式兩者的表達系統，以便形成ACC2-ACC2(1b)復合物。本發明還提供了該ACC2-ACC2(1b)復合物在篩選調節所述復合物的活性的化合物中的用途。本發明還提供了純化的ACC2剪接變體多肽，具體地，具有SEQ ID No1所示的氨基酸序列的那些，與其具有至少85％序列同一性的那些，或其C-或N-末端截短的版本，該變體不能膜錨定。本發明還提供了用于鑒別調節本發明的ACC2剪接變體的表達或活性的化合物的測定，該化合物可以具有治療價值，尤其是對于肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
根據本發明的第一個方面，提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據SEQ ID NO1的氨基酸序列的ACC2剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQID NO1不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，其中該變體缺少膜錨定能力。在一個實施方案中，ACC2剪接變體包含SEQ ID NO3公開的氨基酸序列。
根據本發明的另一個方面，提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO3公開的N-末端16氨基酸序列的ACC2多肽，或在該16氨基酸區域具有少于4氨基酸取代的多肽，該變體不能錨定于膜。根據本發明的另一個方面，提供了分離的核酸分子，其包含編碼ACC2多肽的核苷酸序列，其中缺少由位置1至8代表的信號肽/靶向肽結構域(SEQ ID NO4)。如本領域的技術人員會明白的，遺傳密碼的簡并性允許給定的編碼序列中的許多核苷酸取代，其不會影響編碼的蛋白的氨基酸序列。因而，本發明也提供了分離的核酸，其與序列表中公開的編碼ACC2剪接變體的核苷酸序列中的任一個的不同之處僅在于，這樣的同義密碼子的取代。實施例10的多態性分析提供了在個體之間發現的差異的細節。
在本發明的一個特定的實施方案中，核酸包含根據SEQ ID NO1的核苷酸序列，或與其具有至少85％序列同一性的核苷酸，其中所述核酸編碼具有SEQ ID NO3所示的N-末端的ACC2剪接變體多肽。在另一個實施方案中，本發明還包括能編碼SEQ ID NO3公開的多肽的變體的核苷酸序列，其中所述變體與其具有至少81％序列同一性。在一個實施方案中，核酸包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了分離的ACC2(1b)多肽。在一個實施方案中，多肽具有根據SEQ ID NO1的氨基酸序列；或與其具有至少95％氨基酸序列同一性的序列；或其C-末端截短的版本。特定的實施方案是具有SEQ ID NO3所示的N-末端序列的變體。
在另一個方面，本發明提供了ACC2剪接變體蛋白，其中已對某些殘基進行了保守的氨基酸取代，以生成非天然產生的剪接變體，其保留ACC2活性。保守的取代優選地位于尚未參與催化的區域。
術語“分離的”指，從它的原始環境(例如，如果它是天然產生的，則指天然環境)取出材料。例如，存在于活動物中的天然產生的多核苷酸或多肽是未分離的，但是與天然系統中的一些或所有共存材料分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽，是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的部分，且/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的部分，且仍然是分離的，因為該載體或組合物不是它的天然環境的部分。
在另一個方面，本發明提供了生產包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜錨定，該方法包含a)在適于表達多肽的條件下，培養含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼ACC2剪接變體多肽、或與其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，該多肽不能膜錨定；和b)從宿主細胞培養物中回收多肽。
可以從細胞本身回收這樣的蛋白，或者如果使用適當的異源分泌信號(例如來自SUC2或α-因子的)來確保多肽分泌進培養基中，則可以從培養基回收。
在另一個方面，本發明提供了生產包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少95％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽也包含SEQ ID NO3所示的序列。該方法包含a)在適于表達多肽的條件下，培養含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含核酸序列，所述核酸序列編碼ACC2剪接變體多肽，或與其具有至少95％序列同一性且包含SEQ ID NO3所示的N-末端16氨基酸的多肽，或其C-末端截短的版本；和b)從宿主細胞培養物中回收多肽。
因而，在另一個方面，本發明提供了用本發明的核酸轉化的細胞和細胞系。轉化的細胞可以是，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了制備ACC2-ACC2(1b)復合物的方法，其包含，(a)在適于表達多肽的條件下，培養能表達ACC2的野生型和剪接變體形式的宿主細胞，(b)允許多肽形成復合物；和，(c)回收復合物。
根據本發明的另一個方面，提供了分離的ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物。所述分離的蛋白復合物可以存在于膜制劑或級分上，或與其相結合。
根據本發明的另一個方面，提供了重組生產的ACC2-ACC2(1b)復合物在篩選具有治療潛力的化合物中的用途。
根據本發明的另一個方面，提供了分離的ACC2-ACC2(1b)復合物在篩選具有治療潛力的化合物中的用途。
在另一個方面，本發明提供了純化的能選擇性地結合ACC2剪接變體的抗體，和制備能選擇性地結合本發明的ACC2剪接變體蛋白的抗體的方法。選擇性地結合是指，基本上不能結合天然的全長ACC2或其任何部分，或ACC2剪接變體以外的任何其它蛋白或多肽。本領域的技術人員能鑒別野生型ACC2和用于針對其設計和制備選擇性抗體的各種剪接變體形式之間的氨基酸序列差異。關鍵差異在于N-末端區域。如本文所使用的，關于抗體結合，可互換地使用詞語“選擇性的”和“特異性的”。
在本發明的另一個方面，提供了能調節ACC2剪接變體的活性或量的化合物在治療疾病中的用途，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
通過例如改變的基因表達水平或信息穩定性，可以實現化合物對本發明的ACC2剪接變體的量的調節。通過例如結合ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)復合物的化合物，可以實現化合物對ACC2剪接變體的活性的調節。在一個實施方案中，ACC2剪接變體的調節包含能減少ACC2剪接變體的活性或量的化合物。在另一個實施方案中，ACC2剪接變體的調節包含能增加ACC2剪接變體的活性或量的化合物。在另一個實施方案中，通過能抑制ACC2-ACC2(1b)復合物的活性或量、或復合物形成本身的化合物，實現ACC2活性的調節。能調節ACC2剪接變體的活性的化合物的實例是抗體。使用任何合適的方法，可以制備抗體。例如，可以使用純化的多肽來制備特異性的抗體。術語“抗體”意在包括多克隆抗體、單克隆抗體和各種類型的抗體構建體，例如F(ab’)2、Fab和單鏈Fv。如果抗體以大于或等于約107M-1的Ka結合，則將其定義為特異性地結合。使用常規技術，例如Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，51660(1949)所述的那些，可以測定結合的親和力。
使用本領域眾所周知的操作，可以從許多來源容易地產生多克隆抗體，例如，馬、母牛、山羊、羊、狗、雞、兔、小鼠或大鼠。通常，一般通過腸胃外的注射，將抗原施用給宿主動物。通過使用佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑，可以增強抗原的免疫原性。加強免疫后，收集少量血清樣品，并測試對抗原的反應性。用于這樣的測定的各種測定的實例包括下述的那些AntibodiesALaboratory Manual，Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；以及下述操作，例如逆流免疫電泳(CIEP)、放射免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、斑點印跡測定和夾心測定，見美國專利號4,376,110和4,486,530。
使用眾所周知的操作，見例如美國專利號RE 32,011；4,902,614；4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies，HybridomasA NewDimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn和Bechtol(eds.)，(1980)所述的操作，可以容易地制備單克隆抗體。
使用替代技術，例如在本文引作參考的Alting-Mees等，“Monoclonal Antibody Expression LibrariesA Rapid Alternative toHybridomas”，Strategies in Molecular Biology31-9(1990)所述的那些，可以生產本發明的單克隆抗體。類似地，使用重組DNA技術來整合編碼特異性的結合抗體的基因的可變區，可以構建結合配偶體。這樣的技術記載在Larrick等(Biotechnology.7394，1989)。
一旦分離和純化，使用確立的測定方法，見例如D.M.Kemeny，Pergamon Press，Oxford，英國的“A Practical Guide to ELISA”，可以使用抗體來檢測抗原在樣品中的存在。
根據本發明的另一個方面，提供了能調節ACC2剪接變體的活性或量的化合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
因而，本發明也提供了用于鑒別能調節本發明的ACC2剪接變體基因或蛋白的表達或活性的小分子或其它化合物的測定。使用未轉化的細胞、確立的細胞系或本發明的轉化的細胞，可以體外地進行這樣的測定，或使用正常的非人動物或轉基因動物體內地進行。
具體地，測定可以檢測是否存在本發明的核酸的改變的(增強的或減弱的)表達、由這樣的核酸編碼的蛋白產物的升高的或降低的水平或這樣的蛋白的升高的或降低的活性。
根據本發明的另一個方面，提供了鑒別對疾病的治療潛在地有用的化合物的方法，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙，其包含測定化合物調節ACC2剪接變體的活性或量的能力。優選地，測定選自i)使用表達ACC2剪接變體的細胞系，或使用純化的ACC2剪接變體蛋白，測量ACC2剪接變體活性；ii)使用表達ACC2剪接變體和ACC2野生型的細胞系，或使用純化的ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物，測量ACC2活性；和iii)測量在表達ACC2剪接變體的細胞系中的ACC2剪接變體轉錄或翻譯。
該方法可以如下實現使用分離的ACC2和ACC2(1b)剪接變體的復合物，并測量所述復合物關于丙二酸單酰輔酶A生產的活性。使用由所述復合物形成的生成的無機磷酸鹽的孔雀綠檢測，或通過測量14CO2向14C-丙二酸單酰輔酶A中的整合，可以在無細胞的測定中進行測量。通過使用表達ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的細胞系，測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的活性，也可以在基于細胞的測定中進行該方法。使用表達ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的細胞系，可以測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的轉錄和/或翻譯。在一個實施方案中，疾病或障礙選自肥胖癥、2型糖尿病或血脂異常。
用于測定待測化合物對ACC2剪接變體的轉錄或翻譯的作用的測定，可以基于在表達ACC2剪接變體的細胞中，i)使用例如RNA印跡分析或定量實時PCR，測量形成的ACC2剪接變體mRNA的量，ii)使用例如蛋白印跡分析，或免疫化學分析例如ELISA，測量形成的ACC2剪接變體蛋白的量，或iii)測量如上所述的ACC2剪接變體活性。
在測定中使用的細胞可以是，天然地表達ACC2剪接變體的細胞，或表達重組的ACC2剪接變體的轉染的細胞。優選地，ACC2剪接變體是人重組ACC2剪接變體。
ACC2剪接變體，無論是單獨的還是與野生型ACC2共表達的，可以在許多宿主中表達，所述宿主例如細菌、植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞和人和動物細胞。真核重組宿主細胞是特別優選的。實例包括酵母，哺乳動物細胞，包括人、牛、豬、猴和嚙齒類動物來源的細胞系，和昆蟲細胞，包括果蠅(Drosophila)和蠶衍生的細胞系。源自可以使用的且可商業上得到的哺乳動物物種的細胞系包括，L細胞L-M(TK-)(ATCC CCL 1.3)、L細胞L-M(ATCC CCL 1.2)、HEK 293(ATCC CRL 1573)、Raji(ATCC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
通過許多技術中的任一種，包括磷酸鈣轉化、DEAE-葡聚糖轉化、陽離子脂質介導的脂轉染、電穿孔或感染，可以將包含編碼ACC2剪接變體(單獨的或與野生型ACC2共表達的)的核酸的表達載體導入宿主細胞，以表達多肽。
繁殖并克隆轉染的宿主細胞，例如通過有限稀釋，并分析，以測定重組ACC2剪接變體/野生型ACC2的表達水平。通過幾種方式，包括與抗體的免疫學反應性和/或使用本文所述的測定檢測生物學活性，可以鑒別表達ACC2剪接變體(單獨的或與野生型ACC2共表達的)的轉化的宿主細胞。
基因表達的轉錄調節由指導轉錄因子的結合的啟動子中的特定DNA元件介導，其從而介導該基因的轉錄。真核轉錄因子可以分成2大組i)基本轉錄因子，其與轉錄起始處近側的啟動子序列相互作用，從而在RNA聚合酶II的募集后啟動轉錄，和ii)轉錄因子，其結合特定的遠側啟動子元件，從而調節與基本轉錄機制接觸后的轉錄。真核生物中的基本生理過程是，細胞可以與它們的環境通訊，并通過信號傳導分子，例如激素和生長因子，對細胞外的刺激作出響應。這樣的信號傳導的最后事件是，轉錄因子與特定的遠側啟動子元件的結合，從而導致例如上調的或組織特異性的基因表達。因為它們的調節作用，所以啟動子元件是篩選治療劑的推定靶。
合適的宿主細胞是已知表達ACC2剪接變體的細胞，或已知表達可以影響ACC2剪接變體的轉錄的轉錄因子的細胞。優選地，可以使用用編碼特定的轉錄因子的DNA轉染的宿主細胞，以研究定義的轉錄因子和ACC2剪接變體啟動子的相互作用。
用于測定待測化合物對ACC2剪接變體的轉錄的作用的測定，可以基于，使用報告基因系統測量ACC2剪接變體啟動子的活性。報告基因系統是包含構成ACC2剪接變體啟動子的核酸分子、或其片段的表達系統，該表達系統還包含報告基因，啟動子和報告基因被這樣放置，從而報告基因的表達由ACC2剪接變體啟動子調節。形成的報告蛋白的量用作ACC2剪接變體啟動子的活性的指示。
可以用于構建報告基因系統的合適的報告基因是例如螢火蟲螢光素酶基因、細菌氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因、β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因和綠色熒光蛋白(GFP)。
根據本發明的另一個方面，提供了制備藥物組合物的方法，其包含i)根據本文所述的方法，鑒別可以用于治療疾病的化合物，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙；和ii)將化合物或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑相混合。
基于每種剪接變體形式的相對量的測定，可以存在診斷或預后應用。通過調節各種剪接變體形式的表達或量，可以得到治療應用的其它方法。
因而，根據本發明的另一個方面，提供了測定個體對發展疾病的易感性的方法，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙，其包含測量由個體表達的ACC2的野生型和剪接變體形式的相對量，和基于存在的相對量，測定個體對發展疾病的易感性，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
根據本發明的另一個方面，提供了診斷患者中疾病的嚴重性的方法，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙，其包含測量由個體表達的ACC2的野生型和剪接變體形式的相對量，和基于存在的相對量，測定疾病的嚴重性。
在一個實施方案中，從肌肉活組織檢查樣品測量ACC2形式的量。在另一個實施方案中，可以使用診斷方法來測量治療性治療的類型。在另一個實施方案中，可以通過監控治療性治療過程中由個體表達的全長和剪接變體形式的ACC2的相對量，使用該方法來評估個體的治療性治療的有效性。例如，通過在治療之前、過程中和之后進行監控。
在另一個方面，本發明也提供了診斷患有與受損的氧化脂肪酸的能力有關的障礙的個體的方法，其包含測定個體是否存在本發明的ACC2剪接變體，或其相對量。在一個特定的實施方案中，該障礙是肥胖癥。合適的測定包括基于核酸的測定(采用本發明的核酸或能特異性地鑒別本發明的核酸的那些)和基于蛋白的測定(采用本發明的抗體或多肽)。
在本發明的另一個方面，提供了診斷方法，其包含分析從患者得到的DNA樣品中的ACC2剪接變體基因的序列、或其選擇性的部分，以用于測定對發展疾病的易感性，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
根據本發明的基因知識還提供了，通過例如使用反義DNA或RNA，調節它的體內表達的能力。抑制或減弱特定基因或基因轉錄物(例如本文鑒別的ACC2剪接變體)的表達水平的一種治療方式是使用反義治療。反義治療利用反義核酸分子，后者是DNA或RNA(“寡核苷酸”)的合成片段，設計用于反映(mirror)特定的mRNA序列和阻斷蛋白生成。一旦形成，mRNA會結合核糖體，即細胞的蛋白生產“工廠”，其能有效地閱讀RNA序列，并生產基因指令的特定蛋白分子。如果將反義分子送遞給細胞(例如作為天然寡核苷酸或通過合適的反義表達載體)，它會結合信使RNA，因為它的序列被設計成靶堿基序列的互補體。兩條鏈一旦結合，則mRNA不再能指令核糖體對編碼的蛋白的生產，并被細胞的酶迅速破壞，從而釋放反義寡核苷酸，以尋找和破壞另一條相同的mRNA信使鏈。
利用本文教導的ACC2剪接變體基因和mRNA序列的知識，本領域的技術人員能設計合適的反義核酸治療分子，并根據需要施用它們。
使用充分確定的技術，可以實驗地測定具有治療潛力的反義寡核苷酸分子。為了使下調本發明的ACC2剪接變體基因在哺乳動物細胞中的表達的方法可行，可以容易地構建實例反義表達構建體，例如使用pREP10載體(Invitrogen Corporation)。預期轉錄物抑制該基因在用該類構建體轉染的細胞中的翻譯。反義轉錄物能有效地抑制天然基因轉錄物的翻譯，且能誘導本文所述的作用(例如，組織生理學的調節)。與ACC2剪接變體基因mRNA的任何部分互補的且可雜交的寡核苷酸被預期用于治療性應用。1997年6月17日授權的美國專利號5,639,595，“Identification of Novel Drugs and Reagents”，在本文中引作參考，其中充分描述了鑒別展示出體內活性的寡核苷酸序列的方法。將含有源自ACC2剪接變體基因序列的隨機的寡核苷酸序列的表達載體轉化進細胞中。然后，測定細胞中源自所需的寡核苷酸活性的表型。一旦已經鑒別出了具有所需的表型的細胞，就可以鑒別出具有所需的活性的寡核苷酸的序列。鑒別可以如下實現通過回收載體，或通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增，并對含有插入的核酸材料的區域測序。可以合成反義分子，以用于反義治療。這些反義分子可以是DNA、DNA的穩定衍生物例如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯、RNA、RNA的穩定衍生物例如2′-O-烷基RNA或其它寡核苷酸模仿物(mimetics)。1997年7月29日授權的美國專利號5,652,355，“HybridOligonucleotide Phosphorothioates”，和1997年7月29日授權的美國專利號5,652,356,“Inverted Chimeric and HybridOligonucleotides”，引作參考，其描述了生理上穩定的反義分子的合成和作用。通過顯微注射、脂質體被囊化或通過從攜帶反義序列的載體的表達，可以將反義分子導入細胞中。
如上所述，也可以將反義核酸分子提供為RNA，在本領域現在已知具有長半衰期的RNA的一些穩定形式，其可以直接施用，無需使用載體。另外，通過脂質體、受體介導的轉染和本領域已知的其它方法，可以將DNA構建體送遞給細胞。
通過標準的分子生物學和/或通過如上所述的化學合成，使用常規方法，可以生產用于與靶基因協同作用的反義DNA或RNA。如果需要，可以化學地修飾反義DNA或反義RNA，以便預防體內降解或促進穿過細胞膜的運輸，和/或可以與其連接能滅活mRNA的物質，例如核酶，且本發明延伸至這樣的構建體。
反義DNA或反義RNA可以用于治療人的疾病或障礙，其中已經涉及到ACC2剪接變體基因產物的過度調節或調節不足的生產。
或者，核酶分子可以被設計用于體內地切割和破壞ACC2剪接變體mRNA。核酶是具有高度特異性的內切核糖核酸酶活性的RNA分子。錘頭核酶包含雜交區，其核苷酸序列與靶RNA的至少部分互補，和催化區，其適用于識別和切割靶RNA。優選地，雜交區含有至少9個核苷酸。這樣的核酶的設計、構建和使用，是本領域眾所周知的，且更完整地記載在Haselhoff和Gerlach(Nature.334585-591，1988)。在另一個替代方案中，設計成與ACC2剪接變體基因的5’-區域雜交、以便形成三股螺旋結構的寡核苷酸，可以用于阻斷或減少ACC2剪接變體基因的轉錄。在另一個替代方案中，設計克隆進質粒載體中的RNA干擾(RNAi)寡核苷酸或短(18-25bp)RNAi ACC2剪接變體序列，以將雙鏈RNA導入哺乳動物細胞，來抑制和/或導致ACC2剪接變體信使RNA的降解。ACC2剪接變體RNAi分子可以從腺嘌呤/腺嘌呤(AA)或至少(任意的堿基-A、U、C或G)A....開始，且可以包含18或19或20或21或22或23或24或25堿基對雙鏈RNA分子，優選的長度是21堿基對，且對具有2核苷酸3’突出端的單個ACC2剪接變體序列或形成發夾結構的45-50聚體RNA分子是特異性的。這樣的小抑制RNA分子的設計、構建和使用，是本領域眾所周知的，且更完整地記載在下述文獻中Elbashir等，(Nature.411(6836)494-498，2001)；Elbashir等，(Genes&Dev.15188-200，2001)；Harborth，J.等(J.Cell Science 1144557-4565，2001)；Masters等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 988012-8017，2001)；和，Tuschl等，(Genes&Dev.133191-3197，1999)。
根據本發明的另一個方面，提供了治療人的方法，所述人需要用作用于ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物的小分子藥物、或針對ACC2剪接變體mRNA起作用的抑制性核酸分子進行治療，其中該方法包含i)測量從人得到的合適的樣品中的ACC2剪接變體mRNA的水平；ii)參考ACC2剪接變體mRNA的正常水平，確定人的狀態；和iii)施用有效量的藥物或抑制性核酸分子。
根據本發明的另一個方面，提供了治療人的方法，所述人需要用作用于ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物的小分子藥物、或針對ACC2剪接變體mRNA起作用的抑制性核酸分子進行治療，其中該方法包含i)測量從人得到的樣品中的ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物的水平；和ii)參考所述蛋白的正常水平，確定人的狀態；和iii)施用有效量的藥物或針對ACC2剪接變體mRNA起作用的抑制性核酸分子。
治療患有肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常或與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙的患者的方法，其包含給患者施用能減少ACC2剪接變體的轉錄或表達的化合物或核酸分子。
治療患有肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常或與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙的患者的方法，其包含給患者施用靶向ACC2剪接變體的mRNA的抑制性核酸分子。
針對ACC2剪接變體核酸的抑制性核酸分子或針對ACC2剪接變體蛋白的抗體在生產用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙。
在本發明的每一個上述方面，“抑制性核酸分子”選自反義、核酶、三股螺旋適體(aptemer)和RNAi分子。
除非另有定義，在本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。在本文中提及的所有出版物都在本文中引作參考。
實驗部分現在，將參考下面的非限制性實施例來闡明本發明。
使用AMPLITAQTM，其可從Perkin-Elmer Cetus得到，作為熱穩定的DNA聚合酶的來源。
除非另有說明，本發明的實踐采用屬于本領域技術范圍內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學和重組DNA技術的常規方法。在文獻中充分解釋了這樣的技術。見，例如，Sambrook等，編，MolecularCloningA Laboratory Manual(第3版)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel等，編，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NewYork，NY(2002)；Glover&Hames，編，DNA Cloning 3A PracticalApproach，Vols.I，II，&III，IRL Press，Oxford(1995)；Colowick&Kaplan，編，Methods in Enzymology，Academic Press；Weir等，編，Handbook of Experimental Immunology，第5版，Blackwell ScientificPublications，Ltd.，Edinburgh，(1997)；Fields，Knipe，&Howley，編，Fields Virology(第3版)Vols.I&II，Lippincott Williams&WilkinsPubs.(1996)；Flint，等，編，Principles of VirologyMolecular Biology，Pathogenesis，and Control，ASM Press，(1999)；Coligan等，編，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York，NY(2002)。
應當理解，本發明不限于所述的特定方法、規程、細胞系、載體和試劑，因為它們可以變化。
實施例1人乙酰輔酶A羧化酶2的新剪接變體ACC2(1b)的硅片上(insilico)預測使用新序列信息和硅片上預測方法的組合，鑒別了人ACC2的新剪接變體的序列。針對含有人基因組DNA的EMBL條目，blast人ACC2 EMBL條目HSU89344(Blast2 NCBI)。發現來自染色體12的人BAC克隆RCPI11-443D10含有編碼人ACC2的基因。在EMBL條目AC007637中發現了該克隆的基因組序列。
使用HSU89344和AC007637之間的比對，分析了人ACC2的基因結構。使用比對，預測外顯子，并使用內含子剪接共有位點，預測準確的外顯子邊界。比對表明，人ACC2基因由52個編碼外顯子組成。在HSU89344的序列和AC007637的基因組序列之間，發現了多個錯配。通過將52個編碼外顯子的序列拼貼到一起，生成人ACC2的校正的序列，以得到預測的ACC2的編碼序列。在一種情況下，預測HSU89344的序列的部分由側接不規則的剪接信號的內含子序列組成，并因此在預測的人ACC2的校正的編碼序列中缺失。
使用預測的針對EMBL的EST部分的人ACC2序列進行的Blast2(NCBI)分析表明，存在2個鼠EST序列，其具有剪接到基因的外顯子2的序列上的新5′末端(鼠EST BB854145和BB866065)。這2個EST的新5′末端和人基因組DNA之間的比對表明，該序列在人中是保守的。同樣，發現該保守序列含有可變的起始ATG，且在小鼠和人基因組DNA中，其后是5′共有剪接位點。因此，該序列似乎能編碼ACC2的可替代地使用的獨特起始外顯子。該外顯子稱作外顯子1b(相對于含有在HSU89344中使用的起始ATG的外顯子1a)，且圖1顯示了包含新外顯子的示意基因結構。
通過將外顯子1b的編碼序列剪接到預測的外顯子2-52的序列上，構建了人ACC2(1b)的新剪接變體的編碼部分(SEQ ID NO5和1分別顯示了新剪接形式的預測的核苷酸序列和氨基酸序列)。
在圖2中，顯示了人ACC2和人ACC2(1b)的氨基酸序列的比對。使用具有下述參數的GCG Gap(Wisconsin)，進行比對缺口權重8 平均匹配 2.912長度權重2 平均錯配 -2.003質量11665 長度 2461比率5.171 缺口1百分比相似性99.512 百分比同一性99.423
實施例2人ACC2的克隆為了開發用于生產重組ACC2的方法，通過RT-PCR從人骨骼肌mRNA，克隆了編碼人ACC2的cDNA。PCR擴增了覆蓋ACC2的7.5kb序列的共3個片段，并對多個克隆測序。
使用校正聚合酶pfu(Stratagene)，從人心臟cDNA文庫，PCR擴增了第一個片段1至3925。PCR使用的引物分別是作為正向引物的5’-ATGGTCTTGCTTCTTTGTCTATC-3’(SEQ ID NO6)和作為反向引物的5’-GGCTGTTTAACACATAGGCGA-3’(SEQ ID NO7)。將產物克隆進“TA”克隆載體pCR2.1，轉化進大腸桿菌(E.coli)XL-10 Gold細胞(Stratagene)，并進行完全雙鏈測序。
使用Taq-plus Precision(Stratagene)，從人骨骼肌cDNA，分別PCR擴增了第二個和第三個片段，3250至5356 bp和5335至7302bp。對于第二個PCR片段，將5’-CAGAGCATGGTGCAGTTGGT-3’(SEQ ID NO8)用作正向引物，并將5’-CCATGTCTTCCAGGAGAGGTCC-3’(SEQ ID NO9)用作反向引物。對于第三個PCR片段，將5’-TCGTCATCGGCAATGACATA-3’(SEQ ID NO10)用作正向引物，并將5’-GGTCCACCTCCGGCCC-3’(SEQ ID NO11)用作反向引物。將PCR產物克隆進pCR2.1-TOPO載體，并轉化進大腸桿菌Top 10細胞(Invitrogen)，并進行雙鏈測序。
結果表明，所有克隆的核苷酸序列都與公開的cDNA序列(登記號NM_001993)明顯不同，但是與來自人類基因組計劃的基因組序列以及在公開的數據庫中發現的EST相當好地匹配。
通過連接從pCR2.1-TOPO載體消化出的3個片段，將全長ACC2cDNA拼貼到一起。這些片段包括1至3288bp、3288至5323bp和5323至7302bp，并使用BamH1位點來將2個內部位點連接到一起。將全長cDNA連接進哺乳動物表達載體pcDNA3.1(+)。
如通過針對人ACC2的抗體所檢測的，pcDNA-ACC2向COS-7細胞和HEK293細胞中的瞬時轉染導致ACC2表達的高水平。
使用iPSORT預測軟件(Bannai等，Bioinformatics 18∶2,298-305，2002)，在人ACC2 N-末端區域進行N-末端分選信號的硅片上預測。分析了人ACC2(SEQ ID NO2)和人ACC2的硅片上N-末端截短，并通過iPSORT進行預測。預測全長人ACC2包含信號肽。序列MVLLL的截短，將iPSORT預測從“信號肽”變成“線粒體轉運肽”。其它N-末端截短，排除了序列MVLLLCL，導致人ACC2 N-末端的靶向標記的喪失。
實施例3人組織的TaqMan分析證實了ACC2(1b)轉錄物的存在使用Primer Express 1.5軟件(Applied Biosystems)，設計hACC2(1b)的寡核苷酸引物和探針。設計正向引物5′-AGTCCTGCCAAGTGCAAGATCT-3′(SEQ ID NO12)、反向引物5′-TCTGTGCAGGTCCAGCTTCTT-3′(SEQ ID NO13)和FAM-標記的探針5′-TGATCGCGAAGTAAAGCCGAGCATGT-3′(SEQ IDNO14)，以覆蓋外顯子1B和外顯子2。人酸性核糖體磷蛋白(h36B4)引物和VIC-標記的探針用作內源對照。
使用來自100ng聚腺苷酸+RNA(脂肪組織)和1μg總RNA(心肌、骨骼肌和肝臟)的SuperscriptIII(Invitrogen)和oligoDt引物，合成了第一鏈cDNA。為了測定ACC2(1b)在人心肌(Ambion)、骨骼肌(Ambion)、肝臟(BD Biosciences)和脂肪組織(BD Biosciences)中的表達，使用了實時PCR(ABI prism 7500檢測系統，AppliedBiosystems)。使用Taqman Universal PCR Mastermix(AppliedBiosystems)，向其中加入引物和探針，進行PCR，并在3％瓊脂糖凝膠上驗證預期大小的實時PCR產物。使用7500實時PCR系統序列檢測軟件(Applied Biosystems)進行分析。圖3中的結果表明ACC2(1b)轉錄水平是脂肪組織＞骨骼肌＞心肌＝肝臟，樣品(n＝3)之間幾乎沒有或沒有變化。
實施例4人ACC2(1b)的克隆為了制備ACC2(1b)克隆，我們利用了下述事實，即ACC2和剪接變體ACC2(1b)之間的差異僅僅是外顯子1。使用含有cDNA的載體作為原材料，所述cDNA編碼具有校正的序列的人ACC2(SEQ IDNO2)。使用2種限制酶Nhe1和Hind3的切割位點，切出ACC2 N-末端的序列，并用編碼獨特的ACC2(1b)N-末端的片段取代它。Nhe1識別序列存在于緊挨ACC2起始密碼子上游的載體的多克隆區域中，而Hind3位點存在于ACC2和ACC2(1b)共有的天然序列的下游。使用Taqplusprecision(Stratagene)，從人心臟cDNA，擴增編碼獨特的ACC2(1b)N-末端且也包含隨后共有的ACC2/ACC2(1b)序列的cDNA。含有Nhe1位點的正向PCR引物是5′-ATAAGCTAGCGCCACCATGAGTCCTGCCAAGTGCA-3′(SEQ ID NO15)在天然的Hind3位點的下游的反向引物是5′-TCCTCCGCACTCTCAGCCTTCCGGATT-3′(SEQ ID NO16).
用限制酶Nhe1和Hind3消化使用上述的PCR引物的、包含ACC2 cDNA和PCR產物的載體，凈化切割的產物，然后將插入片段(PCR產物)連接進載體。將得到的連接產物轉化進大腸桿菌TOP-10細胞，并通過雙脫氧測序，證實ACC2(1b)序列向載體中的插入。
實施例5ACC2(1b)在HEK293細胞中的功能表達使用包含實施例1和3所述的cDNA的載體pcDNA3.1(+)，瞬時轉染HEK(人胚腎)293細胞。使用親脂的轉染試劑，用5μg上述質粒/10cm培養皿轉染細胞。在轉染時(第1天)，細胞單層是約60％匯合的，且在收獲時(第4天)，完全匯合。使用14CO2-固定測定，監控來自這些轉染的HEK293細胞的細胞裂解物的乙酰輔酶A羧化酶活性。圖4所示的數據表明，檸檬酸鹽刺激表達的ACC2(1b)的活性。ACC2(1b)細胞裂解物和來自用ACC2轉染的細胞的裂解物的SDS-PAGE分析表明2種蛋白之間的預期的分子量差異，前者比全長ACC2遷移得略快(未顯示數據)。因而，ACC2剪接變體ACC2(1b)證實了檸檬酸鹽刺激的催化活性以及預期的凝膠電泳過程中更高的遷移速度。使用特異性地識別N-末端ACC2序列(表位＝氨基酸(a.a.)45-64)的抗體以及針對共有的ACC2/ACC2(1b)序列(表位＝氨基酸1335-1354)產生的抗體，進行對比性的蛋白印跡分析。前一種抗體僅僅鑒別ACC2肽，而后者可鑒別ACC2和ACC2(1b)肽，因而，證實了2種蛋白之間的N-末端序列差異。
實施例6ACC2(1b)抗體在兔的免疫接種中，使用與獨特的人ACC2(1b)N-末端相同的合成肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)。將相同的肽綴合到樹脂上，并在生成的血清的親和純化中使用，從而產生具有ACC2(1b)的特異性識別的IgG級分。將來自ACC2、ACC2(1b)和假轉染的HEK293細胞的細胞裂解物，進行SDS-PAGE，并將蛋白轉移到PVDF上，以用于使用1∶5000稀釋的生成的抗體(第二抗體＝山羊抗兔HRP綴合的，1∶25000稀釋的)，進行蛋白印跡。使用ECL Plus(化學發光)的檢測，并隨后曝光于膠卷，會鑒別出與ACC2(1b)相對應的特定條帶，而在假轉染的細胞裂解物或ACC2轉染的細胞裂解物中沒有任何識別，盡管經考馬斯染色證實存在ACC2肽(圖5)。
實施例7人心臟和骨骼肌的免疫染色圖6顯示了用實施例6所述的ACC2(1b)抗體(1∶100稀釋)和來自Ventana的山羊抗兔抗體(HRP-綴合物，1∶500稀釋)組合染色的人骨骼肌。在沒有(圖6A)或有(圖6B)10-倍過量的合成肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)存在的情況下，或在沒有第一抗體(圖6C)的情況下，進行染色。圖6A和6B的對比表明，用肽預吸附阻斷染色，并從而證實ACC2(1b)抗體和內源酶之間的特異性的相互作用。而且，圖6C證實，染色僅僅由第一抗體介導，因為在有單獨的第二抗體存在下，沒有顯色。但是，肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)的預吸附，沒有阻斷使用識別全長ACC2和剪接變體ACC2(1b)的抗體(ACC2-4，1∶100稀釋)的人骨骼肌免疫染色(圖6D)，這進一步支持了ACC2(1b)抗體和內源表位ACC2(1b)之間的相互作用的特異性。圖6E和F代表著使用1∶100稀釋的人心肌的(心房的)ACC2(1b)-Ab染色。因而，已經表明ACC2(1b)剪接變體蛋白天然地存在，因為通過天然的人氧化組織例如骨骼肌和心臟的免疫染色，可以檢測ACC2(1b)實施例8ACC2-ACC2(1b)復合物形成表達人ACC2，其具有融合到它的C-末端上的His-標記(hACC2-6xHis)。在沒有檸檬酸鹽存在的情況下，使含有表達的融合蛋白的細胞裂解物用鎳樹脂柱平衡，并與其結合。在含有適當量的檸檬酸鹽的介質中，使包含重組人ACC2(1b)的細胞裂解物穿過柱，以誘導ACC2構象轉移，和隨后的結合到鎳樹脂上的ACC2與添加的可溶的ACC2(1b)之間的復合物形成。使用平衡緩沖液洗掉任何過量的ACC2(1b)后，加入含有適當濃度的咪唑的洗脫緩沖液，并收集ACC2-ACC2(1b)產物，并用于測試化合物。可以確立轉化的細胞系，以表達生理上有關的水平的ACC2和ACC2(1b)。
實施例9篩選通過ACC2-ACC2(1b)復合物抑制丙二酸單酰輔酶A生產的化合物使用在催化過程中形成的生成的無機磷酸鹽的孔雀綠檢測，或通過直接測量14CO2向酸穩定的14C-丙二酸單酰輔酶A中的整合，可以監控無細胞的測定中ACC2-ACC2(1b)復合物的抑制。通過監控來自處理的相對于對照細胞的細胞裂解物中的丙二酸單酰輔酶A濃度，確定化合物在表達重組人ACC2-ACC2(1b)復合物的完整細胞中的作用。使用適于中間通量篩選的基于HPLC的規程，檢測丙二酸單酰輔酶A濃度。
實施例10ACC2基因的多態性的研究從14位歐洲來源的美國個體，得到肝臟RNA，并使用對ACC2(7336-7355)特異性的引物，從每個樣品制備ACC2 cDNA。為了得到最常見的ACC2序列，從單個cDNA，制備了11種重疊PCR產物。用M13F序列標記正向引物，并用M13R序列標記反向引物。還從來自5位無親屬關系的歐洲人的基因組DNA和來自60位無親屬關系的歐洲人的DNA庫，擴增了外顯子1、36、41和51。通過使用M13F和M13R引物的染料-終止子(dye-terminator)測序，在兩個方向對單個PCR產物測序。用polyphred/phrap/consed包進行裝配和質量調用(calling)后，分析序列痕跡的多態性。使用Seqman來比對與SEQ.ID 2公開的序列的共有序列。為了鑒別ACC2的最常見的單倍型，還從來自無親屬關系的歐洲人的28個類淋巴母細胞細胞系中的基因組DNA，對外顯子11、42和45測序。
表1在SEQ ID No.2上的指定位置的變體

在ACC2的編碼序列(SEQ ID No.2)中，觀察到11種多態性。除了這些多態性以外，在位置4506存在db SNP rs2241220，C-T。所有肝臟序列都是純合的C，而SEQ.ID No.2在該位置具有T。另外，SEQ.ID No.2在位置525和1791具有更低頻率的等位基因。但是，這3個位置不會影響氨基酸序列。我們還已經鑒別出在具有約50％等位基因頻率的3’UTR的第9個堿基處的A-G多態性(rs2075262)，和在等位基因頻率為7％的內含子10(rs7978168)和等位基因頻率為20％的內含子41(rs2075259)中的SNP。
表23種共有的改變氨基酸的SNP的單倍型分析指示著5種單倍型

Seq.ID 2所示的序列代表著最常見的單倍型1。
14位個體會產生檢測10％頻率的等位基因的95％概率。不太可能存在影響估計哪個序列是最常見的序列的其它SNP。單倍型分析證實了5種不同的蛋白序列，其中3種序列可能是群體內共有的。單倍型1是最常見的，但是僅僅代表著50％染色體。氨基酸取代是保守的。
序列表SEQ ID NO1人ACC2b多肽，2256個氨基酸，獨特的N-末端序列標有下劃線。
MSPAKCKICFPDREVKPSMSGLHLVKRGREHKKLDLHRDFTVASPAEFVTRFGGDRVIEKVLIANNGIAAVKCMRSIRRWAYEMFRNERAIRFVVMVTPEDLKANAEYIKMADHYVPVPGGPNNNNYANVELIVDIAKRIPVQAVWAGWGHASENPKLPELLCKNGVAFLGPPSEAMWALGDKIASTVVAQTLQVPTLPWSGSGLTVEWTEDDLQQGKRISVPEDVYDKGCVKDVDEGLEAAERIGFPLMIKASEGGGGKGIRKAESAEDFPILFRQVQSEIPGSPIFLMKLAQHARHLEVQILADQYGNAVSLFGRDCSIQRRHQKIVEEAPATIAPLAIFEFMEQCAIRLAKTVGYVSAGTVEYLYSQDGSFHFLELNPRLQVEHPCTEMIADVNLPAAQLQIAMGVPLHRLKDIRLLYGESPWGVTPISFETPSNPPLARGHVIAARITSENPDEGFKPSSGTVQELNFRSSKNVWGYFSVAATGGLHEFADSQFGHCFSWGENREEAISNMVVALKELSIRGDFRTTVEYLINLLETESFQNNDIDTGWLDYLIAEKVQAEKPDIMLGVVCGALNVADAMFRTCMTDFLHSLERGQVLPADSLLNLVDVELIYGGVKYILKVARQSLTMFVLIMNGCHIEIDAHRLNDGGLLLSYNGNSYTTYMKEEVDSYRITIGNKTCVFEKENDPTVLRSPSAGKLTQYTVEDGGHVEAGSSYAEMEVMKMIMTLNVQERGRVKYIKRPGAVLEAGCVVARLELDDPSKVHPAEPFTGELPAQQTLPILGEKLHQVFHSVLENLTNVMSGFCLPEPVFSIKLKEWVQKLMMTLRHPSLPLLELQEIMTSVAGRIPAPVEKSVRRVMAQYASNITSVLCQFPSQQIATILDCHAATLQRKADREVFFINTQSIVQLVQRYRSGIRGYMKTVVLDLLRRYLRVEHHFQQAHYDKCVINLREQFKPDMSQVLDCIFSHAQVAKKNQLVIMLIDELCGPDPSLSDELISILNELTQLSKSEHCKVALRARQILIASHLPSYELRHNQVESIFLSAIDMYGHQFCPENLKKLILSETTIFDVLPTFFYHANKVVCMASLEVYVRRGYIAYELNSLQHRQLPDGTCVVEFQFMLPSSHPNRMTVPISITNPDLLRHSTELFMDSGFSPLCQRMGAMVAFRRFEDFTRNFDEVISCFANVPKDTPLFSEARTSLYSEDDCKSLREEPIHILNVSIQCADHLEDEALVPILRTFVQSKKNILVDYGLRRITFLIAQEKEFPKFFTFRARDEFAEDRIYRHLEPALAFQLELNRMRNFDLTAVPCANHKMHLYLGAAKVKEGVEVTDHRFFIRAIIRHSDLITKEASFEYLQNEGERLLLEAMDELEVAFNNTSVRTDCNHIFLNFVPTVIMDPFKIEESVRYMVMRYGSRLWKLRVLQAEVKINIRQTTTGSAVPIRLFITNESGYYLDISLYKEVTDSRSGNIMFHSFGNKQGPQHGMLINTPYVTKDLLQAKRFQAQTLGTTYIYDFPEMFRQALFKLWGSPDKYPKDILTYTELVLDSQGQLVEMNRLPGGNEVGMVAFKMRFKTQEYPEGRDVIVIGNDITFRIGSFGPGEDLLYLRASEMARAEGIPKIYVAANSGARIGMAEEIKHMFHVAWVDPEDPHKGFKYLYLTPQDYTRISSL
NSVHCKHIEEGGESRYMITDIIGKDDGLGVENLRGSGMIAGESSLAYEEIVTISLVTCRAIGIGAYLVRLGQRVIQVENSHIILTGASALNKVLGREVYTSNNQLGGVQIMHYNGVSHITVPDDFEGVYTILEWLSYMPKDNHSPVPIITPTDPIDREIEFLPSRAPYDPRWMLAGRPHPTLKGTWQSGFFDHGSFKEIMAPWAQTVVTGRARLGGIPVGVIAVETRTVEVAVPADPANLDSEAKIIQQAGQVWFPDSAYKTAQAIKDFNREKLPLMIFANWRGFSGGMKDMYDQVLKFGAYIVDGLRQYKQPILIYIPPYAELRGGSWVVIDATINPLCIEMYADKESRGGVLEPEGTVEIKFRKKDLIKSMRRIDPAYKKLMEQLGEPDLSDKDRKDLEGRLKAREDLLLPIYHQVAVQFADFHDTPGRMLEKGVISDILEWKTARTFLYWRLRRLLLEDQVKQEILQASGELSHVHIQSMLRRWFVETEGAVKAYLWDNNQVVVQWLEQHWQAGDGPRSTIRENITYLKHDSVLKTIRGLVEENPEVAVDCVIYLSQHISPAERAQVVHLLSTMDSPASTXSEQ ID NO2人ACC2的核苷酸序列ATGGTCTTGCTTCTTTGTCTATCTTGTCTGATTTTCTCCTGTCTGACCTTTTCCTGGTTAAAAATCTGGGGGAAAATGACGGACTCCAAGCCGATCACCAAGAGTAAATCAGAAGCAAACCTCATCCCGAGCCAGGAGCCCTTTCCAGCCTCTGATAACTCAGGGGAGACACCGCAGAGAAATGGGGAGGGCCACACTCTGCCCAAGACACCCAGCCAGGCCGAGCCAGCCTCCCACAAAGGCCCCAAAGATGCCGGTCGGCGGAGAAACTCCCTACCACCCTCCCACCAGAAGCCCCCAAGAAACCCCCTTTCTTCCAGTGACGCAGCACCCTCCCCAGAGCTTCAAGCCAACGGGACTGGGACACAAGGTCTGGAGGCCACAGATACCAATGGCCTGTCCTCCTCAGCCAGGCCCCAGGGCCAGCAAGCTGGCTCCCCCTCCAAAGAAGACAAGAAGCAGGCAAACATCAAGAGGCAGCTGATGACCAACTTCATCCTGGGCTCTTTTGATGACTACTCCTCCGACGAGGACTCTGTTGCTGGCTCATCTCGTGAGTCTACCCGGAAGGGCAGCCGGGCCAGCTTGGGGGCCCTGTCCCTGGAGGCTTATCTGACCACAGGTGAAGCTGAGACCCGCGTCCCCACTATGAGGCCGAGCATGTCGGGACTCCACCTGGTGAAGAGGGGACGGGAACACAAGAAGCTGGACCTGCACAGAGACTTTACCGTGGCTTCTCCCGCTGAGTTTGTCACACGCTTTGGGGGGGATCGGGTCATCGAGAAGGTGCTTATTGCCAACAACGGGATTGCCGCCGTGAAGTGCATGCGCTCCATCCGCAGGTGGGCCTATGAGATGTTCCGCAACGAGCGGGCCATCCGGTTTGTTGTGATGGTGACCCCCGAGGACCTTAAGGCCAACGCAGAGTACATCAAGATGGCGGATCATTACGTCCCCGTCCCAGGAGGGCCCAATAACAACAACTATGCCAACGTGGAGCTGATTGTGGACATTGCCAAGAGAATCCCCGTGCAGGCGGTGT
GGGCTGGCTGGGGCCATGCTTCAGAAAACCCTAAACTTCCGGAGCTGCTGTGCAAGAATGGAGTTGCTTTCTTAGGCCCTCCCAGTGAGGCCATGTGGGCCTTAGGAGATAAGATCGCCTCCACCGTTGTCGCCCAGACGCTACAGGTCCCAACCCTGCCCTGGAGTGGAAGCGGCCTGACAGTGGAGTGGACAGAAGATGATCTGCAGCAGGGAAAAAGAATCAGTGTCCCAGAAGATGTTTATGACAAGGGTTGCGTGAAAGACGTAGATGAGGGCTTGGAGGCAGCAGAAAGAATTGGTTTTCCATTGATGATCAAAGCTTCTGAAGGTGGCGGAGGGAAGGGAATCCGGAAGGCTGAGAGTGCGGAGGACTTCCCGATCCTTTTCAGACAAGTACAGAGTGAGATCCCAGGCTCGCCCATCTTTCTCATGAAGCTGGCCCAGCACGCCCGTCACCTGGAAGTTCAGATCCTCGCTGACCAGTATGGGAATGCTGTGTCTCTGTTTGGTCGCGACTGCTCCATCCAGCGGCGGCATCAGAAGATCGTTGAGGAAGCACCGGCCACCATCGCCCCGCTGGCCATATTCGAGTTCATGGAGCAGTGTGCCATCCGCCTGGCCAAGACCGTGGGCTATGTGAGTGCAGGGACAGTGGAATACCTCTATAGTCAGGATGGCAGCTTCCACTTCTTGGAGCTGAATCCTCGCTTGCAGGTGGAACATCCCTGCACAGAAATGATTGCTGATGTTAATCTGCCGGCCGCCCAGCTACAGATCGCCATGGGCGTGCCACTGCACCGGCTGAAGGATATCCGGCTTCTGTATGGAGAGTCACCATGGGGAGTGACTCCCATTTCTTTTGAAACCCCCTCAAACCCTCCCCTCGCCCGAGGCCACGTCATTGCCGCCAGAATCACCAGCGAAAACCCAGACGAGGGTTTTAAGCCGAGCTCCGGGACTGTCCAGGAACTGAATTTCCGGAGCAGCAAGAACGTGTGGGGTTACTTCAGCGTGGCCGCTACTGGAGGCCTGCACGAGTTTGCGGATTCCCAATTTGGGCACTGCTTCTCCTGGGGAGAGAACCGGGAAGAGGCCATTTCGAACATGGTGGTGGCTTTGAAGGAACTGTCCATCCGAGGCGACTTTAGGACTACCGTGGAATACCTCATTAACCTCCTGGAGACCGAGAGCTTCCAGAACAACGACATCGACACCGGGTGGTTGGACTACCTCATTGCTGAGAAAGTGCAGGCGGAGAAACCGGATATCATGCTTGGGGTGGTATGCGGGGCCTTGAACGTGGCCGATGCGATGTTCAGAACGTGCATGACAGATTTCTTACACTCCCTGGAAAGGGGCCAGGTCCTCCCAGCGGATTCACTACTGAACCTCGTAGATGTGGAATTAATTTACGGAGGTGTTAAGTACATTCTCAAGGTGGCCCGGCAGTCTCTGACCATGTTCGTTCTCATCATGAATGGCTGCCACATCGAGATTGATGCCCACCGGCTGAATGATGGGGGGCTCCTGCTCTCCTACAATGGGAACAGCTACACCACCTACATGAAGGAAGAGGTTGACAGTTACCGAATTACCATCGGCAATAAGACGTGTGTGTTTGAGAAGGAGAACGATCCTACAGTCCTGAGATCCCCCTCGGCTGGGAAGCTGACACAGTACACAGTGGAGGATGGGGGCCACGTTGAGGCTGGGAGCAGCTACGCTGAGATGGAGGTGATGAAGATGATCATGACCCTGAACGTTCAGGAAAGAGGCCGGGTGAAGTACATCAAGCGTCCAGGTGCC
GTGCTGGAAGCAGGCTGCGTGGTGGCCAGGCTGGAGCTCGATGACCCTTCTAAAGTCCACCCGGCTGAACCGTTCACAGGAGAACTCCCTGCCCAGCAGACACTGCCCATCCTCGGAGAGAAACTGCACCAGGTCTTCCACAGCGTCCTGGAAAACCTCACCAACGTCATGAGTGGCTTTTGTCTGCCAGAGCCCGTTTTTAGCATAAAGCTGAAGGAGTGGGTGCAGAAGCTCATGATGACCCTCCGGCACCCGTCACTGCCGCTGCTGGAGCTGCAGGAGATCATGACCAGCGTGGCAGGCCGCATCCCCGCCCCTGTGGAGAAGTCTGTCCGCAGGGTGATGGCCCAGTATGCCAGCAACATCACCTCGGTGCTGTGCCAGTTCCCCAGCCAGCAGATAGCCACCATCCTGGACTGCCATGCAGCCACCCTGCAGCGGAAGGCTGATCGAGAGGTCTTCTTCATCAACACCCAGAGCATCGTGCAGTTGGTCCAGAGATACCGCAGCGGGATCCGCGGCTATATGAAAACAGTGGTGTTGGATCTCCTGAGAAGATACTTGCGTGTTGAGCACCATTTTCAGCAAGCCCACTACGACAAGTGTGTGATAAACCTCAGGGAGCAGTTCAAGCCAGACATGTCCCAGGTGCTGGACTGCATCTTCTCCCACGCACAGGTGGCCAAGAAGAACCAGCTGGTGATCATGTTGATCGATGAGCTGTGTGGCCCAGACCCTTCCCTGTCGGACGAGCTGATCTCCATCCTCAACGAGCTCACTCAGCTGAGCAAAAGCGAGCACTGCAAAGTGGCCCTCAGAGCCCGGCAGATCCTGATTGCCTCCCACCTCCCCTCCTACGAGCTGCGGCATAACCAGGTGGAGTCCATTTTCCTGTCTGCCATTGACATGTACGGCCACCAGTTCTGCCCCGAGAACCTCAAGAAATTAATACTTTCGGAAACAACCATCTTCGACGTCCTGCCTACTTTCTTCTATCACGCAAACAAAGTCGTGTGCATGGCGTCCTTGGAGGTTTACGTGCGGAGGGGCTACATCGCCTATGAGTTAAACAGCCTGCAGCACCGGCAGCTCCCGGACGGCACCTGCGTGGTAGAATTCCAGTTCATGCTGCCGTCCTCCCACCCAAACCGGATGACCGTGCCCATCAGCATCACCAACCCTGACCTGCTGAGGCACAGCACAGAGCTCTTCATGGACAGCGGCTTCTCCCCACTGTGCCAGCGCATGGGAGCCATGGTAGCCTTCAGGAGATTCGAGGACTTCACCAGAAATTTTGATGAAGTCATCTCTTGCTTCGCCAACGTGCCCAAAGACACCCCCCTCTTCAGCGAGGCCCGCACCTCCCTATACTCCGAGGATGACTGCAAGAGCCTCAGAGAAGAGCCCATCCACATTCTGAATGTGTCCATCCAGTGTGCAGACCACCTGGAGGATGAGGCACTGGTGCCGATTTTACGGACATTCGTACAGTCCAAGAAAAATATCCTTGTGGATTATGGACTCCGACGAATCACATTCTTGATTGCCCAAGAGAAAGAATTTCCCAAGTTTTTCACATTCAGAGCAAGAGATGAGTTTGCAGAAGATCGCATTTACCGTCACTTGGAACCTGCCCTGGCCTTCCAGCTGGAACTTAACCGGATGCGTAACTTCGATCTGACCGCCGTGCCCTGTGCCAACCACAAGATGCACCTTTACCTGGGTGCTGCCAAGGTGAAGGAAGGTGTGGAAGTGACGGACCATAGGTTCTTCATCCGCGCCATCATCAGGCACTCTGACCTGATCACAAAG
GAAGCCTCCTTCGAATACCTGCAGAACGAGGGTGAGCGGCTGCTCCTGGAGGCCATGGACGAGCTGGAGGTGGCGTTCAATAACACCAGCGTGCGCACCGACTGCAACCACATCTTCCTCAACTTCGTGCCCACTGTCATCATGGACCCCTTCAAGATCGAGGAGTCCGTGCGCTACATGGTTATGCGCTACGGCAGCCGGCTGTGGAAACTCCGTGTGCTACAGGCTGAGGTCAAGATCAACATCCGCCAGACCACCACCGGCAGTGCCGTTCCCATCCGCCTGTTCATCACCAATGAGTCGGGCTACTACCTGGACATCAGCCTCTACAAAGAAGTGACTGACTCCAGATCTGGAAATATCATGTTTCACTCCTTCGGCAACAAGCAAGGGCCCCAGCACGGGATGCTGATCAATACTCCCTACGTCACCAAGGATCTGCTCCAGGCCAAGCGATTCCAGGCCCAGACCCTGGGAACCACCTACATCTATGACTTCCCGGAAATGTTCAGGCAGGCTCTCTTTAAACTGTGGGGCTCCCCAGACAAGTATCCCAAAGACATCCTGACATACACTGAATTAGTGTTGGACTCTCAGGGCCAGCTGGTGGAGATGAACCGACTTCCTGGTGGAAATGAGGTGGGCATGGTGGCCTTCAAAATGAGGTTTAAGACCCAGGAGTACCCGGAAGGACGGGATGTGATCGTCATCGGCAATGACATCACCTTTCGCATTGGATCCTTTGGCCCTGGAGAGGACCTTCTGTACCTGCGGGCATCCGAGATGGCCCGGGCAGAGGGCATTCCCAAAATTTACGTGGCAGCCAACAGTGGCGCCCGTATTGGCATGGCAGAGGAGATCAAACACATGTTCCACGTGGCTTGGGTGGACCCAGAAGACCCCCACAAAGGATTTAAATACCTGTACCTGACTCCCCAAGACTACACCAGAATCAGCTCCCTGAACTCCGTCCACTGTAAACACATCGAGGAAGGAGGAGAGTCCAGATACATGATCACGGATATCATCGGGAAGGATGATGGCTTGGGCGTGGAGAATCTGAGGGGCTCAGGCATGATTGCTGGGGAGTCCTCTCTGGCTTACGAAGAGATCGTCACCATTAGCTTGGTGACCTGCCGAGCCATTGGGATTGGGGCCTACTTGGTGAGGCTGGGCCAGCGAGTGATCCAGGTGGAGAATTCCCACATCATCCTCACAGGAGCAAGTGCTCTCAACAAGGTCCTGGGAAGAGAGGTCTACACATCCAACAACCAGCTGGGTGGCGTTCAGATCATGCATTACAATGGTGTCTCCCACATCACCGTGCCAGATGACTTTGAGGGGGTTTATACCATCCTGGAGTGGCTGTCCTATATGCCAAAGGATAATCACAGCCCTGTCCCTATCATCACACCCACTGACCCCATTGACAGAGAAATTGAATTCCTCCCATCCAGAGCTCCCTACGACCCCCGGTGGATGCTTGCAGGAAGGCCTCACCCAACTCTGAAGGGAACGTGGCAGAGCGGATTCTTTGACCACGGCAGTTTCAAGGAAATCATGGCACCCTGGGCGCAGACCGTGGTGACAGGACGAGCAAGGCTTGGGGGGATTCCCGTGGGAGTGATTGCTGTGGAGACACGGACTGTGGAGGTGGCAGTCCCTGCAGACCCTGCCAACCTGGATTCTGAGGCCAAGATAATTCAGCAGGCAGGACAGGTGTGGTTCCCAGACTCAGCCTACAAAACCGCCCAGGCCATCAAGGACTTCAACCGGGAGAAGTTGCCCCTGATGATCTTTGCCAACTG
GAGGGGGTTCTCCGGTGGCATGAAAGACATGTATGACCAGGTGCTGAAGTTTGGAGCCTACATCGTGGACGGCCTTAGACAATACAAACAGCCCATCCTGATCTATATCCCGCCCTATGCGGAGCTCCGGGGAGGCTCCTGGGTGGTCATAGATGCCACCATCAACCCGCTGTGCATAGAAATGTATGCAGACAAAGAGAGCAGGGGTGGTGTTCTGGAACCAGAGGGGACAGTGGAGATTAAGTTCCGAAAGAAAGATCTGATAAAGTCCATGAGAAGGATCGATCCAGCTTACAAGAAGCTCATGGAACAGCTAGGGGAACCTGATCTCTCCGACAAGGACCGAAAGGACCTGGAGGGCCGGCTAAAGGCTCGCGAGGACCTGCTGCTCCCCATCTACCACCAGGTGGCGGTGCAGTTCGCCGACTTCCATGACACACCCGGCCGGATGCTGGAGAAGGGCGTCATATCTGACATCCTGGAGTGGAAGACCGCACGCACCTTCCTGTATTGGCGTCTGCGCCGCCTCCTCCTGGAGGACCAGGTCAAGCAGGAGATCCTGCAGGCCAGCGGGGAGCTGAGTCACGTGCATATCCAGTCCATGCTGCGTCGCTGGTTCGTGGAGACGGAGGGGGCTGTCAAGGCCTACTTGTGGGACAACAACCAGGTGGTTGTGCAGTGGCTGGAACAGCACTGGCAGGCAGGGGATGGCCCGCGCTCCACCATCCGTGAGAACATCACGTACCTGAAGCACGACTCTGTCCTCAAGACCATCCGAGGCCTGGTTGAAGAAAACCCCGAGGTGGCCGTGGACTGTGTGATATACCTGAGCCAGCACATCAGCCCAGCTGAGCGGGCGCAGGTCGTTCACCTGCTGTCTACCATGGACAGCCCGGCCTCCACCTGASEQ ID NO3ACC2(1b)N-末端MSPAKCKICFPDREVKPSEQ ID NO4如硅片上預測的人ACC2膜/線粒體靶向必需的序列MVLLLCLSSEQ ID NO5ACC2(1b)的核苷酸ATGAGTCCTGCCAAGTGCAAGATCTGTTTCCCTGATCGCGAAGTAAAGTCGGGACTCCACCTGGTGAAGAGGGGACGGGAACACAAGAAGCTGGACCTGCACAGAGACTTTACCGTGGCTTCTCCCGCTGAGTTTGTCACACGCTTTGGGGGGGATCGGGTCATC
GAGAAGGTGCTTATTGCCAACAACGGGATTGCCGCCGTGAAGTGCATGCGCTCCATCCGCAGGTGGGCCTATGAGATGTTCCGCAACGAGCGGGCCATCCGGTTTGTTGTGATGGTGACCCCCGAGGACCTTAAGGCCAACGCAGAGTACATCAAGATGGCGGATCATTACGTCCCCGTCCCAGGAGGGCCCAATAACAACAACTATGCCAACGTGGAGCTGATTGTGGACATTGCCAAGAGAATCCCCGTGCAGGCGGTGTGGGCTGGCTGGGGCCATGCTTCAGAAAACCCTAAACTTCCGGAGCTGCTGTGCAAGAATGGAGTTGCTTTCTTAGGCCCTCCCAGTGAGGCCATGTGGGCCTTAGGAGATAAGATCGCCTCCACCGTTGTCGCCCAGACGCTACAGGTCCCAACCCTGCCCTGGAGTGGAAGCGGCCTGACAGTGGAGTGGACAGAAGATGATCTGCAGCAGGGAAAAAGAATCAGTGTCCCAGAAGATGTTTATGACAAGGGTTGCGTGAAAGACGTAGATGAGGGCTTGGAGGCAGCAGAAAGAATTGGTTTTCCATTGATGATCAAAGCTTCTGAAGGTGGCGGAGGGAAGGGAATCCGGAAGGCTGAGAGTGCGGAGGACTTCCCGATCCTTTTCAGACAAGTACAGAGTGAGATCCCAGGCTCGCCCATCTTTCTCATGAAGCTGGCCCAGCACGCCCGTCACCTGGAAGTTCAGATCCTCGCTGACCAGTATGGGAATGCTGTGTCTCTGTTTGGTCGCGACTGCTCCATCCAGCGGCGGCATCAGAAGATCGTTGAGGAAGCACCGGCCACCATCGCCCCGCTGGCCATATTCGAGTTCATGGAGCAGTGTGCCATCCGCCTGGCCAAGACCGTGGGCTATGTGAGTGCAGGGACAGTGGAATACCTCTATAGTCAGGATGGCAGCTTCCACTTCTTGGAGCTGAATCCTCGCTTGCAGGTGGAACATCCCTGCACAGAAATGATTGCTGATGTTAATCTGCCGGCCGCCCAGCTACAGATCGCCATGGGCGTGCCACTGCACCGGCTGAAGGATATCCGGCTTCTGTATGGAGAGTCACCATGGGGAGTGACTCCCATTTCTTTTGAAACCCCCTCAAACCCTCCCCTCGCCCGAGGCCACGTCATTGCCGCCAGAATCACCAGCGAAAACCCAGACGAGGGTTTTAAGCCGAGCTCCGGGACTGTCCAGGAACTGAATTTCCGGAGCAGCAAGAACGTGTGGGGTTACTTCAGCGTGGCCGCTACTGGAGGCCTGCACGAGTTTGCGGATTCCCAATTTGGGCACTGCTTCTCCTGGGGAGAGAACCGGGAAGAGGCCATTTCGAACATGGTGGTGGCTTTGAAGGAACTGTCCATCCGAGGCGACTTTAGGACTACCGTGGAATACCTCATTAACCTCCTGGAGACCGAGAGCTTCCAGAACAACGACATCGACACCGGGTGGTTGGACTACCTCATTGCTGAGAAAGTGCAGGCGGAGAAACCGGATATCATGCTTGGGGTGGTATGCGGGGCCTTGAACGTGGCCGATGCGATGTTCAGAACGTGCATGACAGATTTCTTACACTCCCTGGAAAGGGGCCAGGTCCTCCCAGCGGATTCACTACTGAACCTCGTAGATGTGGAATTAATTTACGGAGGTGTTAAGTACATTCTCAAGGTGGCCCGGCAGTCTCTGACCATGTTCGTTCTCATCATGAATGGCTGCCACATCGAGATTGATGCCCACCGGCTGAATGATGGGGGGCTCCTGCTCTCCTACAATGGG
AACAGCTACACCACCTACATGAAGGAAGAGGTTGACAGTTACCGAATTACCATCGGCAATAAGACGTGTGTGTTTGAGAAGGAGAACGATCCTACAGTCCTGAGATCCCCCTCGGCTGGGAAGCTGACACAGTACACAGTGGAGGATGGGGGCCACGTTGAGGCTGGGAGCAGCTACGCTGAGATGGAGGTGATGAAGATGATCATGACCCTGAACGTTCAGGAAAGAGGCCGGGTGAAGTACATCAAGCGTCCAGGTGCCGTGCTGGAAGCAGGCTGCGTGGTGGCCAGGCTGGAGCTCGATGACCCTTCTAAAGTCCACCCGGCTGAACCGTTCACAGGAGAACTCCCTGCCCAGCAGACACTGCCCATCCTCGGAGAGAAACTGCACCAGGTCTTCCACAGCGTCCTGGAAAACCTCACCAACGTCATGAGTGGCTTTTGTCTGCCAGAGCCCGTTTTTAGCATAAAGCTGAAGGAGTGGGTGCAGAAGCTCATGATGACCCTCCGGCACCCGTCACTGCCGCTGCTGGAGCTGCAGGAGATCATGACCAGCGTGGCAGGCCGCATCCCCGCCCCTGTGGAGAAGTCTGTCCGCAGGGTGATGGCCCAGTATGCCAGCAACATCACCTCGGTGCTGTGCCAGTTCCCCAGCCAGCAGATAGCCACCATCCTGGACTGCCATGCAGCCACCCTGCAGCGGAAGGCTGATCGAGAGGTCTTCTTCATCAACACCCAGAGCATCGTGCAGTTGGTCCAGAGATACCGCAGCGGGATCCGCGGCTATATGAAAACAGTGGTGTTGGATCTCCTGAGAAGATACTTGCGTGTTGAGCACCATTTTCAGCAAGCCCACTACGACAAGTGTGTGATAAACCTCAGGGAGCAGTTCAAGCCAGACATGTCCCAGGTGCTGGACTGCATCTTCTCCCACGCACAGGTGGCCAAGAAGAACCAGCTGGTGATCATGTTGATCGATGAGCTGTGTGGCCCAGACCCTTCCCTGTCGGACGAGCTGATCTCCATCCTCAACGAGCTCACTCAGCTGAGCAAAAGCGAGCACTGCAAAGTGGCCCTCAGAGCCCGGCAGATCCTGATTGCCTCCCACCTCCCCTCCTACGAGCTGCGGCATAACCAGGTGGAGTCCATTTTCCTGTCTGCCATTGACATGTACGGCCACCAGTTCTGCCCCGAGAACCTCAAGAAATTAATACTTTCGGAAACAACCATCTTCGACGTCCTGCCTACTTTCTTCTATCACGCAAACAAAGTCGTGTGCATGGCGTCCTTGGAGGTTTACGTGCGGAGGGGCTACATCGCCTATGAGTTAAACAGCCTGCAGCACCGGCAGCTCCCGGACGGCACCTGCGTGGTAGAATTCCAGTTCATGCTGCCGTCCTCCCACCCAAACCGGATGACCGTGCCCATCAGCATCACCAACCCTGACCTGCTGAGGCACAGCACAGAGCTCTTCATGGACAGCGGCTTCTCCCCACTGTGCCAGCGCATGGGAGCCATGGTAGCCTTCAGGAGATTCGAGGACTTCACCAGAAATTTTGATGAAGTCATCTCTTGCTTCGCCAACGTGCCCAAAGACACCCCCCTCTTCAGCGAGGCCCGCACCTCCCTATACTCCGAGGATGACTGCAAGAGCCTCAGAGAAGAGCCCATCCACATTCTGAATGTGTCCATCCAGTGTGCAGACCACCTGGAGGATGAGGCACTGGTGCCGATTTTACGGACATTCGTACAGTCCAAGAAAAATATCCTTGTGGATTATGGACTCCGACGAATCACATTCTTGATTGCCC
AAGAGAAAGAATTTCCCAAGTTTTTCACATTCAGAGCAAGAGATGAGTTTGCAGAAGATCGCATTTACCGTCACTTGGAACCTGCCCTGGCCTTCCAGCTGGAACTTAACCGGATGCGTAACTTCGATCTGACCGCCGTGCCCTGTGCCAACCACAAGATGCACCTTTACCTGGGTGCTGCCAAGGTGAAGGAAGGTGTGGAAGTGACGGACCATAGGTTCTTCATCCGCGCCATCATCAGGCACTCTGACCTGATCACAAAGGAAGCCTCCTTCGAATACCTGCAGAACGAGGGTGAGCGGCTGCTCCTGGAGGCCATGGACGAGCTGGAGGTGGCGTTCAATAACACCAGCGTGCGCACCGACTGCAACCACATCTTCCTCAACTTCGTGCCCACTGTCATCATGGACCCCTTCAAGATCGAGGAGTCCGTGCGCTACATGGTTATGCGCTACGGCAGCCGGCTGTGGAAACTCCGTGTGCTACAGGCTGAGGTCAAGATCAACATCCGCCAGACCACCACCGGCAGTGCCGTTCCCATCCGCCTGTTCATCACCAATGAGTCGGGCTACTACCTGGACATCAGCCTCTACAAAGAAGTGACTGACTCCAGATCTGGAAATATCATGTTTCACTCCTTCGGCAACAAGCAAGGGCCCCAGCACGGGATGCTGATCAATACTCCCTACGTCACCAAGGATCTGCTCCAGGCCAAGCGATTCCAGGCCCAGACCCTGGGAACCACCTACATCTATGACTTCCCGGAAATGTTCAGGCAGGCTCTCTTTAAACTGTGGGGCTCCCCAGACAAGTATCCCAAAGACATCCTGACATACACTGAATTAGTGTTGGACTCTCAGGGCCAGCTGGTGGAGATGAACCGACTTCCTGGTGGAAATGAGGTGGGCATGGTGGCCTTCAAAATGAGGTTTAAGACCCAGGAGTACCCGGAAGGACGGGATGTGATCGTCATCGGCAATGACATCACCTTTCGCATTGGATCCTTTGGCCCTGGAGAGGACCTTCTGTACCTGCGGGCATCCGAGATGGCCCGGGCAGAGGGCATTCCCAAAATTTACGTGGCAGCCAACAGTGGCGCCCGTATTGGCATGGCAGAGGAGATCAAACACATGTTCCACGTGGCTTGGGTGGACCCAGAAGACCCCCACAAAGGATTTAAATACCTGTACCTGACTCCCCAAGACTACACCAGAATCAGCTCCCTGAACTCCGTCCACTGTAAACACATCGAGGAAGGAGGAGAGTCCAGATACATGATCACGGATATCATCGGGAAGGATGATGGCTTGGGCGTGGAGAATCTGAGGGGCTCAGGCATGATTGCTGGGGAGTCCTCTCTGGCTTACGAAGAGATCGTCACCATTAGCTTGGTGACCTGCCGAGCCATTGGGATTGGGGCCTACTTGGTGAGGCTGGGCCAGCGAGTGATCCAGGTGGAGAATTCCCACATCATCCTCACAGGAGCAAGTGCTCTCAACAAGGTCCTGGGAAGAGAGGTCTACACATCCAACAACCAGCTGGGTGGCGTTCAGATCATGCATTACAATGGTGTCTCCCACATCACCGTGCCAGATGACTTTGAGGGGGTTTATACCATCCTGGAGTGGCTGTCCTATATGCCAAAGGATAATCACAGCCCTGTCCCTATCATCACACCCACTGACCCCATTGACAGAGAAATTGAATTCCTCCCATCCAGAGCTCCCTACGACCCCCGGTGGATGCTTGCAGGAAGGCCTCACCCAACTCTGAAGGGAACGTGGCAGAGCGGATTCTTTGACCACGGC
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權利要求
1.分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據SEQ ID NO1的氨基酸序列的乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQ IDNO1中公開的序列不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，該變體缺少膜結合能力。
2.根據權利要求1的分離的核酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO3的多肽。
3.根據權利要求2的分離的核酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼SEQ ID NO3公開的多肽的變體，其中所述變體與其具有至少85％序列同一性。
4.根據權利要求1或2的分離的核酸，其包含SEQ ID NO5所述的核苷酸序列。
5.質粒，其包含權利要求1至4中的任一項的核酸。
6.分離的細胞或細胞系，其包含權利要求1至4中的任一項的核酸。
7.用權利要求1至4中的任一項的核酸轉化或轉染的分離的細胞或細胞系。
8.根據權利要求6或7中的任一項的細胞或細胞系，其是哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞或細胞系。
9.生產包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜錨定，該方法包含a)在適于表達多肽的條件下，培養含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼ACC2剪接變體多肽、或與其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，該多肽不能膜錨定；和b)從宿主細胞培養物中回收多肽。
10.分離的多肽，其包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或與其具有至少85％相似性的序列，該多肽不能膜結合。
11.根據權利要求10的分離的多肽，其包含SEQ ID No1所示的氨基酸序列。
12.分離的ACC2-ACC2(1b)蛋白復合物。
13.純化的抗體，其能選擇性地結合ACC2剪接變體。
14.根據權利要求的抗體，其能選擇性地結合ACC2(1b)剪接變體。
15.權利要求10或11的多肽在鑒別調節所述多肽的化合物的測定中的用途。
16.能調節ACC2剪接變體的活性或量的化合物在治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙中的用途。
17.如權利要求16要求保護的用途，其中與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙選自肥胖癥、2型糖尿病和血脂異常。
18.鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調節ACC2剪接變體蛋白的活性或量的能力。
19.根據權利要求18的方法，其中所述測定選自i)使用表達ACC2剪接變體的細胞系，或使用純化的ACC2剪接變體蛋白，測量ACC2剪接變體活性；和ii)在表達ACC2剪接變體的細胞系中，測量ACC2剪接變體轉錄或翻譯。
20.通過權利要求18或19中的任一項的方法鑒別出的化合物。
21.鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調節包含ACC2和ACC2剪接變體的復合物的活性或量的能力。
22.根據權利要求21的方法，其中使用分離的ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物，并測量所述復合物關于丙二酸單酰輔酶A生產的活性。
23.根據權利要求22的方法，其中所述方法包含測量由所述復合物形成的生成的無機磷酸鹽的孔雀綠檢測。
24.根據權利要求22的方法，其中所述方法包含測量14CO2向14C-丙二酸單酰輔酶A中的整合。
25.根據權利要求21的方法，其包含使用表達ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的細胞系，測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的活性。
26.根據權利要求21的方法，其包含使用表達ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的細胞系，測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物的轉錄和/或翻譯。
27.根據權利要求18-19或21-26中的任一項的方法，其中所述疾病或障礙選自肥胖癥、2型糖尿病或血脂異常。
28.通過權利要求21-27中的任一項的方法鑒別出的化合物。
29.制備藥物組合物的方法，其包含(i)根據權利要求18-19或21-27中的任一項的方法，鑒別可以用于治療疾病的化合物，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關的其它障礙；和(ii)將化合物或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑相混合。
30.對ACC2剪接變體核酸選擇性的抑制性核酸分子或針對ACC2剪接變體蛋白的選擇性抗體在生產用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的藥物中的用途。
31.對ACC2和ACC2(1b)剪接變體復合物選擇性的抑制性核酸分子在生產用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體。還涉及由所述核酸編碼的對應多肽，和鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調節ACC2剪接變體復合物或其復合物的活性或量的能力。
文檔編號C07K16/40GK1981034SQ200580022746
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月6日 優先權日2004年7月7日
發明者J·克拉法姆, B·科尼利厄森, S·哈倫 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司