用作parp抑制劑的取代2－烷基喹唑啉酮衍生物的制作方法

專利名稱：用作parp抑制劑的取代2－烷基喹唑啉酮衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PARP抑制劑并提供了化合物以及含有所披露化合物的藥物組合物。另外，本發(fā)明提供了使用所披露的PARP抑制劑的方法，例如作為醫(yī)藥品。
背景技術(shù)：
核酶聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)是PARP酶家族的成員之一。這個增長中的酶家族由PARP類如PARP-1、PARP-2、PARP-3和Vault-PARP與端錨聚合酶(Tankyrases，TANKs)如TANK-1、TANK-2和TANK-3組成。PARP也指聚(腺苷5’-二磷酸-核糖)聚合酶或PARS(聚(ADP-核糖)合成酶)。
PARP-1是116kDa的一個主要核蛋白，116kDa由以下三個域組成含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)域的N-端DNA結(jié)合結(jié)合結(jié)合域、自動修飾結(jié)構(gòu)域和C-端催化結(jié)構(gòu)域。它存在于幾乎所有的真核細胞中。該酶合成了聚(ADP-核糖)，一種可包含超過200個ADP-核糖單元的支化聚合物。聚(ADP-核糖)的蛋白質(zhì)受體直接或間接地參與維持DNA的完整性。它們包括組織蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA和RNA聚合酶、DAN連接酶和依賴于Ca2+和Mg2+的核酸內(nèi)切酶。PARP蛋白質(zhì)在許多組織，最顯著的是在免疫系統(tǒng)、心臟、腦和胚種細胞(germ-line)中被高度表達。在正常生理狀況下，PARP處于最低的活性狀態(tài)。然而，當(dāng)DAN受損則立即引起高達500倍的PARP活化反應(yīng)。
端錨聚合酶(TANKs)被識別為人類端粒復(fù)合體的組分。它們還被提出在泡囊運輸過程中扮演某種角色，并有可能是蛋白質(zhì)參與各種細胞過程的平臺。端粒是維持和穩(wěn)定染色體的基本要素，它主要靠一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶來維持。端錨聚合酶是(ADP-核糖)轉(zhuǎn)錄酶，兼具發(fā)信號和細胞骨架蛋白質(zhì)兩種功能。它們含有催化基礎(chǔ)蛋白質(zhì)聚-ADP-核糖化的PARP域、與某些發(fā)信號分子共享的不育α基序以及含有24個與細胞骨架蛋白質(zhì)錨蛋白同源的錨蛋白重復(fù)單元的ANK域。ANK域與端粒蛋白質(zhì)(端粒重復(fù)結(jié)合因子-1(TRF-1))相互作用。這些蛋白質(zhì)因此被命名為TRF1-相互作用的、與錨蛋白相關(guān)的ADP-核糖聚合酶(TANKs)。
TANK更具體的功能之一是TRF-1的ADP-核糖化。人類端粒功能需要兩種端粒-特殊DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，TRF-1和TRF-2。TRF-2保護染色體末端，而TRF-1調(diào)節(jié)端粒的長度，ADP-核糖化抑制了TRF-1與端粒DNA的結(jié)合能力。TRF-1的此種ADP-核糖化作用使TRF-1從端粒中釋放出來，打開了端粒復(fù)合體并使其接近端粒酶。因此，TANK起到調(diào)節(jié)端粒長度的正作用，使端粒可以通過端粒酶而加長。
在PARP(特別是PARP-1)提供的眾多功能中，通過ADP-核糖化來促進DNA修復(fù)是其主要功能，并因此共同構(gòu)成了許多DNA修復(fù)蛋白。PARP活化后，NAD+水平明顯降低。大量PARP的活化導(dǎo)致DNA大規(guī)模受損細胞中NAD+水平的大幅滑落。聚(ADP-核糖)短暫的半衰期導(dǎo)致快速的逆轉(zhuǎn)速率。一旦聚(ADP-核糖)形成，它很快受到結(jié)構(gòu)活性聚(ADP-核糖)糖水解酶(PARG)、磷酸二酯酶和聚(ADP-核糖)蛋白質(zhì)裂解酶的作用而被降解。PARP與PARG形成一個循環(huán)，將大量的NAD+轉(zhuǎn)變成ADP-核糖。在少于1小時的時間內(nèi)，PARP的過渡刺激能導(dǎo)致NAD+滑落并使ATP下降到低于正常水平的20％。這樣的情形在局部缺血期間，氧氣剝奪已危及細胞能量輸出是時是極為不利。隨后再灌注時產(chǎn)生的自由基被認(rèn)為是引起組織傷害的主要原因。在局部缺血和再灌注期間，ATP的部分降落在很多器官中是典型反應(yīng)，可以認(rèn)為是由于聚(ADP-核糖)的逆轉(zhuǎn)而導(dǎo)致了NAD+的耗損。因此，期望通過抑制PARP或PARG來保存細胞的能量水平，從而增強損害后缺血組織的存活能力。
聚(ADP-核糖)的合成也涉及大量炎癥反應(yīng)本質(zhì)基因的誘導(dǎo)表達。PARP抑制劑壓制了巨噬細胞、P-型選擇素和內(nèi)皮細胞中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)中可誘導(dǎo)一氧化氮(iNOS)的產(chǎn)生。該活性使PARP抑制劑表現(xiàn)出強力的抗炎效果。PARP的抑制作用能通過防止嗜中性粒細胞易位和滲透到受損的組織中而減少組織壞死。
PARP被受損的DNA片斷激活，并且一旦其被激活，就能催化多達100個粘附的ADP-核糖至各種核蛋白質(zhì)，包括組織蛋白質(zhì)與PARP本身。在較大的細胞壓力之下，PARP的大量活化會通過儲存能量的耗盡而迅速導(dǎo)致細胞的損害或死亡。由于每個NAD+分子的再生需要消耗4個ATP分子，同時NAD+因PARP的大量活化而被耗盡，為了重新合成NAD+，ATP也被耗盡。
已有報道說，PARP的活化作用在NMDA和NO誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起關(guān)鍵作用。這已在皮層培養(yǎng)基和海馬神經(jīng)元片斷中得到證實，其中毒性的預(yù)防與PARP抑制作用的潛能直接相關(guān)。PARP抑制劑在治療神經(jīng)退化性疾病和頭部創(chuàng)傷方面的潛在作用因此而被認(rèn)知，即使其真正的作用機理還沒有被說明。
類似地，已證實，單純地注射PARP抑制劑可減少兔子心臟或骨骼肌因局部缺血與再灌注所造成的栓塞的尺寸。在這些研究中，單純注射3-氨基-苯甲酰胺(10mg/kg)，不管是栓塞前1分鐘還是再灌注前1分鐘，均有類似地減少心臟栓塞尺寸(32-42％)的結(jié)果，而使用另一種PARP抑制劑1，5-二羥基異喹啉(1mg/kg)，可減少栓塞尺寸的程度與前者相當(dāng)(38-48％)。由這些結(jié)果可以合理地假設(shè)，PARP抑制劑可用于事先搶救缺血性心臟或骨骼肌組織的再灌注損害。
也可用PARP的活化作用來度量由于暴露于下列誘發(fā)劑而造成的神經(jīng)毒性損害谷氨酸(經(jīng)由NMDA受體的刺激作用)、具有反應(yīng)性氧的中間體、淀粉樣β-蛋白質(zhì)、N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)或其活性代謝物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，其參與如中風(fēng)、阿耳茲海默氏癥和帕金森氏癥等病理狀況。其它研究已持續(xù)探索到PARP活化作用在試管小腦粒細胞和在MPTP神經(jīng)毒性中的作用。中風(fēng)或其它神經(jīng)退化過程中最常發(fā)生的后果是神經(jīng)過度暴露于谷氨酸，它起到控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)傳遞素的作用，并對N-甲基D-天門冬氨酸酯(NMDA)受體和其它亞型受體起作用。在缺血性腦損傷如中風(fēng)或心臟病期間，被奪走氧氣的神經(jīng)元釋放出相當(dāng)大量的谷氨酸。這些過量釋放的谷氨酸反過來導(dǎo)致N-甲基D-天門冬氨酸酯(NMDA)、AMPA、紅藻氨酸和MGR受體的過度刺激(興奮性毒性)，打開離子通道并允許不受管制的離子流動(如Ca2+和Na+進入細胞而K+流出細胞)，導(dǎo)致神經(jīng)元的過度刺激。被過度刺激的神經(jīng)元分泌出更多的谷氨酸，產(chǎn)生反饋環(huán)或多米諾骨牌效應(yīng)，最后通過產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和自由基而導(dǎo)致細胞的損害或死亡。谷氨酸的過度活化已被認(rèn)為牽涉到各種神經(jīng)性疾病和病情，包括癲癇、中風(fēng)、阿耳茲海默氏癥、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨丁頓氏癥、人格分裂癥、慢性疼痛、缺氧后的的局部缺血和神經(jīng)損耗、低血糖癥、缺血癥、外傷和神經(jīng)損傷。谷氨酸暴露和刺激作用已被暗示為強迫癥的原因，特別是藥物依賴性。證據(jù)包括在很多動物種類以及用谷氨酸或NMDA處理過的腦皮質(zhì)培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體拮抗劑(即阻斷谷氨酸與其受體結(jié)合或激活其受體的化合物)阻斷了血管沖擊后的神經(jīng)損傷。試圖通過阻斷NMDA、AMPA、紅藻氨酸和MGR受體來預(yù)防興奮性毒性的方法已被證明相當(dāng)困難，因為每個受體具有多個谷氨酸可結(jié)合的位置，因此想找到有效的拮抗劑混合物或萬能拮抗劑來防止谷氨酸與所有受體結(jié)合并使該理論得到檢驗也相當(dāng)困難。另外，很多能有效阻斷受體的組合物對動物也有毒性。因此，至今仍未獲知能有效治療谷氨酸異常的方法。被谷氨酸刺激的NMDA受體，例如酶神經(jīng)元一氧化氮合成酶(nNOS)的活化導(dǎo)致了一氧化氮(NO)的形成，它同時也引發(fā)了神經(jīng)毒性。用一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑處理或在生物體外進行nNOS的靶向基因破壞可防止NMDA神經(jīng)毒性。
PARP抑制劑的另一用途是治療末稍神經(jīng)損傷，以及由此導(dǎo)致的病理疼痛綜合癥，即所公知的神經(jīng)性疼痛，例如由一般坐骨神經(jīng)的慢性狹窄損傷(CCI)引起的神經(jīng)性疼痛和其中脊髓后角跨突觸的改變所引起的神經(jīng)性疼痛，其特征為出現(xiàn)細胞質(zhì)與核質(zhì)的色素過多(所謂的“深色”神經(jīng)元)。
證據(jù)還顯示出，PARP抑制劑可用于治療炎性腸紊亂如結(jié)腸炎。
具體做法是，對大鼠管腔施用溶解于50％乙醇的庚烯三硝基苯磺酸而使其得結(jié)腸炎，然后使被治療的大鼠接受3-氨基苯甲酰胺，這是一種特效PARP活性抑制劑。PARP活性的抑制減少了炎癥反應(yīng)并恢復(fù)末梢結(jié)腸的形態(tài)和能量狀態(tài)。
進一步的證據(jù)顯示，PARP抑制劑可用于關(guān)節(jié)炎。另外，PARP抑制劑似乎可用于糖尿病。已有證據(jù)顯示，PARP抑制劑可用于治療內(nèi)毒素休克和敗血性休克。
PARP抑制劑已被用于延長細胞的壽命和增殖能力，包括疾病如皮膚老化、阿耳茲海默氏癥、動脈硬化、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、肌肉營養(yǎng)不良、骨骼肌的退化性疾病包括復(fù)制衰老、與年齡相關(guān)的肌肉退化、免疫衰退、AIDS和其它免疫衰退疾病的治療；并用于改變衰老細胞的基因表達。
也已知，PARP抑制劑，例如3-氨基苯甲酰胺，可影響例如由過氧化氫或離子化照射而引起的全面DNA修復(fù)。
PARP在修復(fù)DNA鏈斷裂方面所起到的關(guān)鍵作用已被充分確立，特別是離子化照射所引起直接鏈斷裂，或間接地在受到甲基化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑和其它化學(xué)治療劑(如順氯氨鉑和博來霉素)作用所引起的DNA損傷的酶修復(fù)。許多使用“基因剔除”小鼠、反式顯性抑制模式(DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的過度表達)、反義和小分子量抑制劑的研究已經(jīng)證明，PARP在修復(fù)及誘導(dǎo)DAN損傷后細胞的存活方面起到作用。PARP酶活性的抑制將導(dǎo)致腫瘤細胞對DNA損傷治療的敏感性的增強。
已有報道說，PARP抑制劑對腫瘤細胞的放射增敏(缺氧)有影響，同時可防止放射治療后腫瘤細胞從潛在的致死和亞致死DNA損傷中恢復(fù)過來，推測機理為，PARP抑制劑具有防止DNA鏈斷裂再連接的能力，同時可以破壞一些DAN損傷信號通道。
PARP抑制劑已被用于治療癌癥。另外，美國專利5,177,075討論一些異喹啉，它們能增強離子放射或化療制劑對腫瘤細胞的致死效果。Weltin等人的“Effect of 6(5-Phenanthridione)，an Inhibitor of Poly(ADP-ribose)Polymerase，on Cultured Tumor Cells”，Oncol.Res.，69，399-403(1994)，討論了PARP活性的抑制，腫瘤細胞繁殖能力的降低，以及用烷基化劑共同治療腫瘤細胞時顯著的協(xié)同效果。
Li和Zhang在Idrugs 2001，4(7)804-812，Ame等人在Bioassays2004，26882-883和Nguewa等人在Progress in Biophysic & MolecularBiology 2005，88143-172公開了對本領(lǐng)域技術(shù)現(xiàn)狀的綜述。
對有效和強力的PARP抑制劑一直都有需求，特別是對產(chǎn)生副作用最小的PARP-1抑制劑更是需求強烈。本發(fā)明提供了抑制PARP活性的化合物、組合物和方法，用于治療癌癥和/或防止由于例如壞死或自我凋亡而造成細胞受損或死亡所導(dǎo)致的細胞、組織和/或器官的損傷。本發(fā)明化合物和組合物特別有利于增強化療和放療的效力，其主要治療作用是致使靶向細胞的DNA損傷。
1967年3月22日出版的GB 1062357披露了具有抗高血壓作用的喹唑酮衍生物。
1973年6月20日出版的DE 20,1973披露了具有抗高血壓作用的取代的吡啶酮衍生物。
1983年11月11日出版的EP 13612披露了取代哌啶基烷基喹唑啉衍生物。所述化合物為血清胺拮抗劑。特別是該發(fā)明所公開的第63號化合物。
1994年6月9日出版的EP 669919披露了作為5-HT3拮抗劑的二甲基苯并呋喃和二甲基苯并吡喃。
1994年12月20日出版的US 5374637披露了苯甲酰胺衍生物。所披露的化合物具有刺激胃腸蠕動的特性。
1998年12月23日出版的EP 885190披露了具有提高胃動力特性的1，4-二取代哌啶衍生物。
1999年6月12日出版的EP 1036073披露了取代的喹唑啉二酮衍生物。所述化合物具有緩解胃底的特性。
2002年6月20日出版的EP 1355888披露了作為PARP抑制劑的喹唑啉酮衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及式(I)化合物 其N-氧化物形式、藥用可接受加成鹽及其立體化學(xué)異構(gòu)形式，其中，虛線代表任選鍵；X為＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或當(dāng)X為＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)二價自由基-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羥基；R1是氫、鹵素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；
R3是氫或C1-6烷氧基；Z是選自下列的自由基 其中每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫、鹵素、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或者R7和R8一起可形成下式的二價自由基-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)其中，每個R9獨立地選自氫或C1-6烷基；且L是一個選自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的二價自由基；或當(dāng)X是＞CR2-或當(dāng)Z是式(b-11)的自由基時，L可以直接是一個鍵；其限定性條件是當(dāng)X是＞CH-，-NY-是-N-C(O)-時，第二條虛線不是一個鍵，Z是式(b-2)的一個自由基且L是-C(O)-，則-C1-6烷二基-不是-CH2-CH2-。
式(I)化合物也可按其互變異構(gòu)的形式存在。這些類型雖未明確地列示于上述化學(xué)式中，但也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此前及此后定義中所使用的大量術(shù)語將在以后的內(nèi)容中解釋。這些術(shù)語有時被單獨使用，有時以組合術(shù)語的方式被使用。
此前及此后所定義中，鹵素一般指氟、氯、溴和碘；C1-6烷基指含有1到6個碳原子的直鏈和支鏈的飽和烴基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、2-甲基-丁基、2-甲基戊基等；C1-6烷二基指含有1到6個碳原子的二價直鏈和支鏈的飽和烴基，例如亞甲基、1，2-乙二基、1，3-丙二基、1，4-丁二基、1，5-戊二基、1，6-己二基以及它們的支鏈異構(gòu)體，例如2-甲基戊二基、3-甲基戊二基、2，2-二甲基丁二基、2，3-二甲基丁二基等。
“藥用可接受鹽”意指藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽。上述藥用可接受的酸或堿加成鹽是指可由式(I)化合物形成的、具有治療活性的無毒酸和無毒堿加成鹽形式。具有堿性性質(zhì)的式(I)化合物，用合適的酸處理后可轉(zhuǎn)化為藥用可接受的酸加成鹽。合適的酸包括，例如無機酸類如氫鹵酸，如氫氯酸或氫溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸類；或有機酸類例如乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)拉酸(環(huán)己烷基氨基磺酸)、水楊酸、對氨基水楊酸、雙羥萘酸等酸類。
具有酸性性質(zhì)的式(I)化合物，用合適的有機或無機堿處理后可轉(zhuǎn)化為藥用可接受的堿加成鹽。合適的堿鹽包括，例如銨鹽、堿金屬和堿土金屬鹽類如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽等，與有機堿形成的鹽如芐星、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明鹽類以及與氨基酸如精氨酸、離氨酸等形成的鹽類。
術(shù)語“酸或堿加成鹽”也包括可由式(I)化合物形成的水合物和溶劑合物形式的加成鹽。此種形式的實例有水合物、醇合物等。
前面所用到的“式(I)化合物的立體化學(xué)異構(gòu)形式”是指式(I)化合物所擁有的所有可能的化合物，他們由相同的鍵合原子按照相同的順序連接而成，但具有不可互變的三維立體結(jié)構(gòu)。除非另外提及或指明，否則一個化合物的化學(xué)名稱涵蓋了所述化合物可能擁有的所有可能的立體化學(xué)異構(gòu)體的混合物。所述混合物包含了所述化合物基本分子結(jié)構(gòu)的所有非對映異構(gòu)體和/或?qū)τ钞悩?gòu)體的。式(I)化合物的所有立體化學(xué)異構(gòu)形式，無論是純態(tài)還是彼此的混合物，都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
式(I)化合物的N-氧化物形式是指式(I)化合物上的一個或幾個氮原子被氧化成所謂的N-氧化物，特別是指那些其中哌啶或哌嗪上的一個或多個氮被氧化的N-氧化物。
以后無論何時用到術(shù)語“式(I)化合物”，意指還包括其N-氧化物形式、藥用可接受的酸或堿加成鹽和所有的立體異構(gòu)形式。
GB 1062357披露了具有抗高血壓作用的喹唑酮衍生物。DE2258561披露了具有抗高血壓作用的取代吡啶酮衍生物。EP 13612披露了做為血清胺拮抗劑的取代哌啶基烷基喹唑啉衍生物。EP 669919披露了作為5-HT3拮抗劑的二甲基苯并呋喃和二甲基苯并吡喃。US5374637披露了具有刺激腸胃蠕動特性的苯甲酰胺衍生物。EP 885190披露了具有提高胃動力特性的1，4-二取代哌啶衍生物。EP 1036073披露了具有緩解胃底特性的取代喹唑啉二酮衍生物。EP 1355888披露了作為PRAP抑制劑的喹唑啉酮衍生物。
令人意外的是本發(fā)明化合物也具有抑制PRAP的功能。
第一組令人感興趣的化合物包括滿足以下一項或多項限制條件的那些式(I)化合物a)X為＞N-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；b)當(dāng)X為＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)二價自由基；c)-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羥基且第二條虛線是一個鍵；d)R1是鹵素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；e)R3是C1-6烷氧基；f)Z是一個選自(b-1)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)、(b-8)、(b-9)、(b-11)、(b-11)的自由基；g)每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；h)L是一個選自-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的二價自由基；
第二組令人感興趣的化合物包括滿足以下一項或多項限制條件的那些式(I)的化合物a)X為＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；b)當(dāng)X為＞CR2-時，R2則與-L-Z一起可形成式(a-1)二價自由基；c)R1是氫；d)R3是氫；e)Z是式(b-1)、(b-2)或(b-11)自由基；f)每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫或鹵素；g)L是一個選自-C(O)-、-C(O)-NH-或-C(O)-C1-6烷二基-的二價自由基；且，h)當(dāng)X為＞CR2-或當(dāng)Z是式(b-11)的自由基時，L可以直接是一個鍵。
第三組令人感興趣的化合物包括滿足以下一項或多項限制條件的那些式(I)的化合物a)X為＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；；b)R1是氫；c)R3是氫；d)Z是式(b-1)或(b-2)自由基；e)每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫或鹵素；f)L是一個選自-C(O)-或-C(O)-NH-的二價自由基；且，g)當(dāng)X為＞CR2-時，L可以直接是一個鍵。
優(yōu)選的式(I)化合物組為，其中X為＞N-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；當(dāng)X為＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)二價自由基；R1是氫；R3是氫；Z是式(b-1)、(b-2)或(b-11)自由基；每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫或鹵素；L是一個選自-C(O)-、-C(O)-NH-或-C(O)-C1-6烷二基-的二價自由基；且當(dāng)X為＞CR2-或Z是式(b-11)自由基時，L可以直接是一個鍵。
優(yōu)選的式(I)化合物組為，其中X為＞N-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；R1是氫；R3是氫；Z是式(b-1)或(b-2)自由基；每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫或鹵素；L是一個選自-C(O)-、或-C(O)-NH-的二價自由基；且當(dāng)X為＞CR2-，L可以直接是一個鍵。
最優(yōu)選的化合物是編號為No.4、No.5、No.11、No.12和No.14的化合物。
化合物4 化合物5 化合物11化合物12 化合物14可依據(jù)EP 13612所描述的一般方法來制備式(I)化合物。起始原料和一些中間體都是已知的化合物并可購買到，或者依據(jù)本領(lǐng)域通曉的慣用反應(yīng)工藝來制備。
一些制備方法將在下文中詳細描述。獲得最終式(I)化合物的其它方法將在實施例中描述。
其中-NY-是-N-C(O)-且第二條虛線是一個鍵的式(I)化合物，此處指式(I-a)化合物，可按照本領(lǐng)域公知的環(huán)化工藝，對適當(dāng)?shù)氖?II)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺進行環(huán)化而制得。
或者，其中C1-6烷二基-是-CH2-CH2-和-NY-是-N-C(O)-且第二條虛線是一個鍵的式(I)的化合物，此處指式(I-b)化合物，可按照本領(lǐng)域公知的環(huán)化工藝，用式(III)中間體對適當(dāng)?shù)氖?IV)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺進行環(huán)化而制得。
其中-NY-是-N-C(O)-且第二條虛線不是一個鍵的式(I)的化合物，此處指式(I-c)的化合物，可按照本領(lǐng)域公知的環(huán)化工藝，用適當(dāng)?shù)氖?VI)所示的取代中間體對適當(dāng)?shù)氖?V)所示的取代2-胺基苯甲酰胺進行環(huán)化而制得。在合適溶劑如醇類(甲醇、乙醇、丙醇等)的存在下，將各種反應(yīng)物放在一起攪拌即可方便地實施所述的環(huán)化反應(yīng)。略微提高溫度和加入一種合適的催化量的強酸如鹽酸等，可提高反應(yīng)速度。

通過本領(lǐng)域已知的反應(yīng)或官能團轉(zhuǎn)移，式(I)化合物也可彼此轉(zhuǎn)化。部分這類轉(zhuǎn)化已在前面描述過。其他的實例有羧酸酯水解成相應(yīng)的羧酸或醇；酰胺水解成相應(yīng)的羧酸或胺；腈水解成相應(yīng)的酰胺；通過本領(lǐng)域已知的重氮化反應(yīng)以及隨后用氫置換重氮基團，可使咪唑或苯基上的氨基被氫取代；醇可以轉(zhuǎn)化為酯和醚；伯胺可以轉(zhuǎn)化為仲胺或叔胺；雙鍵可以被氫化后變成相應(yīng)的單鍵；在合適的鈀催化劑存在下，通過插入一氧化碳可將苯基上的碘代自由基轉(zhuǎn)化成酯基。
本發(fā)明還涉及將上述所定義的式(I)化合物作為醫(yī)藥品來使用。
從下面的實例中，可看到本發(fā)明化合物具有PARP抑制作用。
此處所用的術(shù)語“PARP”意指一種具有聚-ADP-核糖化活性的蛋白質(zhì)。在此術(shù)語的涵義中，PARP涵蓋了所有由parp基因編碼的蛋白質(zhì)、其變種及其片段被替換的蛋白質(zhì)。另外，此處所用的術(shù)語“PARP”包括PARP的同系物、同族體以及其他動物的PARP同系物。
術(shù)語“PARP”包括但并不僅限于PARP-1。在此術(shù)語的定義中，也涵蓋了PARP-2、PARP-3、Vault-PARP(PARP-4)、PARP-7(TiPARP)、PARP-8、PARP-9(Bal)、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-13、PARP-14、PARP-15、TANK-I、TANK-2和TANK-3。
能夠同時抑制PARP-1和端錨聚合酶-2的化合物更有利于增強對癌細胞生長活性的抑制。
本發(fā)明還打算將所述化合物用于制備治療動物體疾病和功能紊亂的藥品，其中所述化合物為式(I)化合物。
它的N-氧化物形式、藥用可接受的加成鹽及其立體化學(xué)異構(gòu)形式，其中，虛線代表任選的鍵；X為＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或當(dāng)X為＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)二價自由基
-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羥基；R1是氫、鹵素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R3是氫或C1-6烷氧基；Z是選自下列基團的自由基 其中每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫、鹵基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或，R7和R8一起可形成下式的二價自由基。
-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)
其中每個R9獨立地選自氫或C1-6烷基；和L是一個選自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的二價自由基；或當(dāng)X是＞CR2或當(dāng)Z是式(b-11)自由基時，L可以直接是一個鍵。
鑒于本發(fā)明化合物的PARP結(jié)合特性，可將其用作參照化合物或示蹤化合物，此時分子上的一個原子可以被例如放射性同位素所取代。
為了制備本發(fā)明的藥用組成物，將有效劑量的一種作為活性組分的特定化合物，按照堿或酸加成鹽的形式，與一種藥用可接受的載體密切混合，根據(jù)預(yù)期的用藥方式和制備形式，可采用多種形式的載體。將這些藥用組成物制成人們愿意接受的的單位劑量形式，優(yōu)選適合于口服、直腸投藥、皮下或非腸道注射的形式。例如，制備口服劑型的組成物時，任何常用的藥物媒介都可使用，如制備懸浮液、糖漿、藥酒和溶液時，可使用水、乙二醇、油、醇等；或在制備粉劑、丸粒、膠囊和片劑時，可選用淀粉、糖、高領(lǐng)土、潤滑劑、粘結(jié)劑和消散劑等做固態(tài)載體。由于膠囊和片劑使用簡便，是最好的口服劑型，此時顯然優(yōu)選使用固態(tài)藥用載體。對于腸胃外給藥的組成物，載體通常包括無菌水，雖然也可以加入其他成分，例如助溶劑，但無菌水仍占大部分?？芍苽渥⑸淙芤?，此時載體可包括，例如鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽與葡萄糖的混合溶液。通過選用合適的液體載體、懸浮液等也可制備成可注射的懸浮液。在適合于皮下給藥的組合物中，載體任選包括滲透增強劑和/或合適的潤濕劑，任選混有少量合適的天然添加劑，這些添加劑不會對皮膚造成嚴(yán)重的傷害。所述的添加劑有助于皮膚給藥和/或便于制成所需的組成物。這些組成物可以按各種方式給藥，例如，做成膏藥、噴劑、藥膏。特別有利的是，將前述藥物組成物配制成方便用藥的劑量單位型式和統(tǒng)一用藥的劑量型式。在說明書和權(quán)利要求中所用的劑量單位型式指的是適于單獨使用、呈物理分離狀態(tài)的藥劑單位，每個單位的藥劑中包含預(yù)定量的活性組分，該預(yù)定量是依據(jù)與所需的藥物載體一起達到所要的治療效果來計算的。單位劑量型式的實例有片劑(刻痕片或糖衣片)、膠囊、丸劑、粉劑藥包、干膠片、可注射溶液劑或懸浮劑、一茶匙、一湯匙等，以及它們單獨劑型的若干份。
本發(fā)明化合物可以治療或預(yù)防由細胞受損或死亡而引起的組織損傷，這些細胞受損或死亡是由壞死或自我凋亡造成的；可以改善神經(jīng)或心血管的組織損傷，包括病灶缺血、心肌梗塞及再灌注后造成的損傷；可治療由PARP活性所引起或加劇的多種疾病與病況；可延長或增加細胞的壽命或繁殖能力；可改變衰老細胞的基因表達；可提高細胞放療和/或化療的敏感性；通常，PARP活性的抑制減少了細胞的能量損失，對于神經(jīng)細胞來說，可防止神經(jīng)元發(fā)生不可逆的去極化作用，從而對神經(jīng)提供保護作用。
基于前述原因，本發(fā)明進一步涉及使用足以抑制PARP活性的治療有效量的上述所定義的化合物，來治療或預(yù)防由于壞死和自我凋亡造成細胞受損或死亡而導(dǎo)致的組織損傷，不以NMDA毒性為媒介來影響神經(jīng)細胞的活性，以NMDA毒性為媒介來影響神經(jīng)細胞的活性，治療由于缺血和再灌注傷害所造成的神經(jīng)組織損傷、神經(jīng)失常和神經(jīng)退化性疾??；治療或預(yù)防血管栓塞；來治療或預(yù)防心血管疾病；治療其他病況和/或紊亂，例如，與年紀(jì)有關(guān)的肌肉退化，AIDS和其他免疫衰老疾病、炎癥、風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、動脈硬化、惡疾、癌癥、涉及復(fù)制衰老的骨骼肌肉退化癥，糖尿病、腦損傷、炎性腸炎(例如，結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎)、肌肉萎縮、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、慢性和/或急性疼痛(例如神經(jīng)痛)、腎衰竭、視網(wǎng)膜局部缺血、敗血性休克(例如內(nèi)毒素休克)和皮膚老化；延長細胞的壽命或或增加其繁殖能力；改變衰老細胞的基因表達，增加腫瘤細胞對化療和/或放療(組織缺氧)的敏感性。本發(fā)明還涉及動物體疾病和癥狀的治療，包括對所述的動物體施加治療有效量的上述所定義的化合物。
特別地，本發(fā)明涉及一種治療、預(yù)防或抑制動物體神經(jīng)性疾病的方法，包括對所述的動物體施加治療有效量的上述所定義的化合物。神經(jīng)性疾病選自下列一組疾病，包括因物理傷害或疾病癥狀而引起的末梢神經(jīng)病變、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓的物理傷害、與腦損傷相關(guān)的中風(fēng)、病灶性局部缺血、總體性局部缺血、再灌注損傷、髓鞘脫失疾病和由于神經(jīng)退化而引起的神經(jīng)性疾病。
本發(fā)明還打算使用式(I)的化合物來抑制PARP活性，治療、預(yù)防或抑制由于壞死和自我凋亡造成細胞受損或死亡而導(dǎo)致的組織損傷，治療、預(yù)防或抑制動物身上的神經(jīng)性疾病。
術(shù)語“預(yù)防神經(jīng)退化”包括新近被診斷出患有神經(jīng)退化疾病的患者、或有危險發(fā)展成為新的神經(jīng)退化疾病的患者有能力去預(yù)防神經(jīng)退化，以及已患有或已出現(xiàn)神經(jīng)退化病癥狀的患者有能力去預(yù)防神經(jīng)退化病情的惡化。
此處所用的術(shù)語“治療”涵蓋了對動物、特別是人類疾病和/或病況進行的任何治療，并包括(i)對于尚未診斷出具有疾病，但有傾向發(fā)生疾病和/或病況的對象進行疾病和/或病況的預(yù)防；(ii)抑制疾病和/或病況，即制止它的發(fā)展；(iii)減輕疾病和/或病況，即從疾病和/或病況中復(fù)原。
此處所用的術(shù)語“放射致敏劑”指一種分子，優(yōu)選低分子量分子，經(jīng)對動物施用治療有效量的該物質(zhì)，來增加細胞對離子輻射的敏感性和/或促進對可用離子輻射治療的疾病的治療效果?？捎秒x子輻射治療的疾病包括贅生瘤疾病、良性的和惡性的腫瘤以及癌細胞。其它未在此列出的可用離子輻射治療的疾病，也在本發(fā)明的涵蓋范圍之內(nèi)。
此處所用的術(shù)語“化學(xué)致敏劑”指一種分子，優(yōu)選低分子量分子，經(jīng)對動物施用治療有效量的該物質(zhì)，來增加細胞對化療的敏感性和/或促進對可用化療治療的疾病的治療效果?？捎没熤委煹募膊“ㄙ樕黾膊　⒘夹缘暮蛺盒缘哪[瘤以及癌細胞。其它未在此列出的可用離子輻射治療的疾病，也在本發(fā)明的涵蓋范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的化合物、組成物和方法，特別適用于治療或預(yù)防抑制由細胞受損或死亡而引起的組織損傷，這些細胞的受損或死亡是由于壞疽或自我凋亡而發(fā)生的。
本發(fā)明的化合物可以是“抗癌劑”，該術(shù)語也涵蓋了“抗腫瘤細胞生長劑”和“抗贅生瘤劑”。例如，本發(fā)明的方法可用于治療癌癥和癌癥中對放療和/或化療敏感的腫瘤細胞，如，ACTH-引起的腫瘤、急性淋巴性血癌、急性非淋巴性血癌、腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、頸部的癌癥、慢性淋巴癌、慢性髓母細胞血癌、直腸癌、皮下T-細胞淋巴癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、Ewing’s肉瘤膽囊癌、發(fā)細胞血癌、頭&頸癌、Hodgkin’s淋巴瘤、Kaposi’s肉瘤、腎癌、肝癌、肺癌(小型和/或非小型細胞)、惡性腹腔腹水、惡性胸腔腹水、黑色素瘤、中皮層瘤、多重骨髓瘤、神經(jīng)母細胞瘤、非Hodgkin’s淋巴瘤、骨癌、卵巢癌、卵(精)細胞癌、前列腺癌、胰臟癌、陰莖癌、視網(wǎng)膜細胞瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)性贅生癌、子宮癌、陰道癌、會陰癌和Wilm’s腫瘤。
因此，本發(fā)明的化合物可以用作“放療致敏劑”和/或“化療致敏劑”。
如人們所知，放療致敏劑可提高癌細胞對離子照射毒性作用的敏感性。有關(guān)放療致敏劑作用模式的一些機理已在以下文獻中提及，包括缺氧性細胞放療致敏劑(如2-硝基咪唑化合物和二氧化苯并三嗪物化合物)可在缺氧環(huán)境下，模仿氧或行為表現(xiàn)得像生物還原劑；非缺氧性細胞放療致敏劑(如鹵代嘧啶類)可作為DNA堿基的類似物并可優(yōu)先結(jié)合到癌細胞的DNA上，從而促進DNA分子的放射-誘發(fā)斷裂和/或抑制正常的DNA修復(fù)機制；以及其它各種關(guān)于放療致敏劑治病潛在機理的假設(shè)。
目前，許多癌癥治療方案都將放療致敏劑與X射線照射相結(jié)合。能活化X射線的放療致敏劑的實例包括但并不限于以下物質(zhì)滅滴靈、米索硝唑(misonidazole)、desmethylmisonidazole、哌迷清(pimondazole)、依他硝唑(etanidazole)、硝咪嗎啉(nimorazole)、絲裂霉素C、RUS 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、煙酰胺、5-溴去氧尿苷(BUdR)、5-碘去氧尿苷(IUdR)、溴去氧胞苷、氟去氧尿苷(FudR)、羥基尿素、順氯胺鉑，及其具有治療效果的類似物和衍生物。
癌癥的光動力治療(PDT)使用可見光作為致敏劑的放射活化劑。光動力學(xué)放療致敏劑的實例包括但并不限于以下物質(zhì)血卟啉衍生物、光敏素(Photofrin)、苯并卟啉衍生物、初卟啉合錫鹽(tinetioporphyrin)、pheoborbide-a、細菌葉綠素-a、萘酞菁、酞菁、鋅酞菁，及其具有治療效果的類似物和衍生物。
放療致敏劑可與治療有效量的一種或多種其他化合物一起使用，包括但并不限于以下物質(zhì)可促進放療致敏劑與目標(biāo)細胞結(jié)合的化合物；能控制治療劑、營養(yǎng)液和/或氧氣朝目標(biāo)細胞流動的化合物；無論有無其他照射都能作用于腫瘤的化學(xué)治療劑；或其他能有效治療癌癥或其他疾病的化合物。可與放療致敏劑一起使用的其它治療劑的實例包括但并不限于以下物質(zhì)5-氟尿嘧啶、亞葉酸、5’-氨基-5’去氧胸苷、氧氣、碳氧混合氣、輸血、全氟烴(如Fluosol 10 DA)、2，3-DPG、BW12C、鈣通道阻斷劑、己酮可可堿(pentoxyfylline)、抗脈管形成化合物、胼酞嗪和LBSO?？膳c放療致敏劑一起使用的化學(xué)治療劑的實例包括但并不限于以下物質(zhì)阿霉素、喜樹堿、卡鉑、順氯氨鉑、道諾霉素、多烯紫衫醇、亞德里亞霉素、干擾素(α、β、γ)、白細胞介素2、依立替康(irinotecan)、紫杉醇、羅卡，及其具有治療效果的類似物和衍生物。
化療致敏劑可與治療有效量的一種或多種其他化合物一起使用，包括但并不限于以下化合物可促進化療致敏劑與目標(biāo)細胞結(jié)合的化合物；能控制治療劑、營養(yǎng)液和/或氧氣朝目標(biāo)細胞流動的化合物；能作用于腫瘤的化學(xué)治療劑或其他能有效治療癌癥或其他疾病的化合物。可與化療致敏劑一起使用的其它治療劑的實例包括但并不限于以下物質(zhì)甲基化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑和其它化療劑，如順氯氨鉑和博來霉素。
式(I)化合物也可用來檢測和識別PARP，特別是PARP-1受體。在做此目的使用時，可對式(I)化合物進行標(biāo)記。所述的標(biāo)記可選自放射性同位素、自旋標(biāo)記物、抗原標(biāo)記物、酶標(biāo)記物、熒光基團或化學(xué)冷光基團。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從下面所列示的實驗結(jié)果中非常容易地確定出有效量。通常建議的有效量為0.001-100毫克/公斤體重，優(yōu)選0.005-10毫克/公斤體重?？蓪⒁惶焖璧膭┝窟m當(dāng)?shù)胤殖啥?、三、四或更多的小份，在適當(dāng)?shù)臅r間間隔下使用。所述的小份可制成單位藥劑型式，例如，每單位劑量含活性成分0.05-500毫克，優(yōu)選0.1-200毫克。
實驗部分下文中，“DCM”代表二氯甲烷、“DMF”代表N，N-二甲基甲酰胺、“MeOH”代表甲醇、“MIK”代表甲基異丁基酮、“MEK”代表甲基乙基酮、“TEA”代表三乙胺和“THF”代表四氫呋喃。
A.中間體化合物的制備實施例A1中間體1的制備
將溶于乙氰(150ml)中的2-[(4-氯-1-氧代丁基)氨基]-苯甲酰胺(0.03mol)、4-苯基-4-哌啶羧胺(0.03mol)和TEA(0.1mol)混合物攪拌并回流過夜，蒸發(fā)掉溶劑后，在殘留物中加入水。用三氯甲烷萃取油層，干燥，過濾并蒸發(fā)除去溶劑。用裝在玻璃過濾器里的硅膠來提純殘留物(洗提液三氯甲烷/MeOH 95/5)。收集產(chǎn)品級分并蒸除溶劑，得到5g(40.8％)中間體1。
實施例A2中間體6的制備 將溶于4-甲基-2-戊酮(250ml)的4-氯-1，1-二乙氧基-丁烷(0.05mol)、4-苯基-4-哌啶羧胺(0.03mol)、碳酸鈉(0.05mol)和碘化鉀(q.s.)混合物攪拌并回流過夜，冷卻反應(yīng)混合物，加水、分層。經(jīng)干燥有機層、過濾和蒸除溶劑，得到9g(86％)的中間體6。
B.最終化合物的制備實施例B1化合物3的制備 將溶于2-丙醇(150ml)的2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-苯甲酰胺(0.02mol)、1-(4-氟苯基)-2-(4-哌啶基)-乙酮(0.02mol)和碳酸氫鈉(4g)混合物攪拌并回流過夜，趁熱將反應(yīng)混合物過濾并蒸除溶劑。殘留物經(jīng)柱色譜法在硅膠上提純兩次(洗提液三氯甲烷/MeOH95/5)，收集產(chǎn)品級分并蒸除溶劑。殘留物在2-丙醇中再結(jié)晶，收集所得沉淀，得到2g(25％)的化合物3，熔點為159.1℃。
實施例B2化合物4的制備 將中間體1(0.012mol)溶于氫氧化鈉(60ml)和乙醇(100ml)，攪拌形成的混合物并回流1.5小時，然后蒸發(fā)除去溶劑并向殘留物中加入水。用三氯甲烷萃取油層，干燥，過濾并蒸發(fā)除去溶劑。殘留物在MIK/2-丙醇中再結(jié)晶，收集所要的產(chǎn)物并干燥，得到2g(41.7％)的化合物4，熔點為138.9℃。
實施例B3化合物5的制備
將溶于乙醇(100ml)的2-氨基-苯甲酰胺(0.027mol)與中間體6(0.027mol)的混合物加熱，并用化學(xué)純鹽酸(3ml)對混合物進行酸化。攪拌反應(yīng)混合物并回流過夜，然后蒸發(fā)除去溶劑，向殘留物中加入水和濃NH4OH溶液。過濾得到沉淀物再溶解于三氯甲烷，然后干燥、過濾。蒸發(fā)除去溶劑后，將殘留物在MeOH中再結(jié)晶，收集所得沉淀并干燥，得到3g(28％)的化合物5，熔點為216.1℃。
表F-1列出了按照上述實施例方法之一所制備的化合物。
藥用實施例用鄰近閃爍分析法(SPA)測定生物體外PARP-1抑制活性按照SPA技術(shù)(歸Amersham Pharmacia Biotech所有)，在生物體外測試本發(fā)明化合物。
原則上，本試驗依靠已充分建立起來的SPA技術(shù)來檢測生物素化的標(biāo)靶蛋白質(zhì)(即組織蛋白)上的聚(ADP-核糖基)化。用被PARP-1酶和[3H]-煙酰胺腺苷二核苷酸([3H]-NAD+)活化的帶切口DNA作為ADP-核糖基供體來誘導(dǎo)該核糖化反應(yīng)。
制備帶切口DNA，作為誘發(fā)PARP-1酶活性的誘導(dǎo)體。為此，將25mg的DNA(提供者Sigma)溶解于25ml DNAse緩沖液(10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH 7.4；0.5mg/ml的牛血清蛋白(BSA)；5mM MgCl2·6H2O和1mM KCl)中，加入50μl的DNAse溶液(在0.15M NaCl中的濃度為1mg/ml)。在37℃下培育90分鐘后，加入1.45g的NaCl中止反應(yīng)，接著在58℃下再培育15分鐘。將反應(yīng)混合物在冰浴上冷卻，并在4℃用0.2M的KCl 1.5L分別透析1.5小時和2小時，并接著用0.01M的KCl 1.5L分別透析1.5小時和2小時兩次將混合物分份并在-20℃下儲藏。用Amersham的生物素化反應(yīng)套組將組織蛋白(1mg/ml，II-A型，提供者Sigma)生物素化并分份、儲藏在-20℃下。在PBS中制備100mg/ml SPA聚(乙烯基甲苯)(PVT)珠粒(提供者Amersham)儲藏液。向6ml培育緩沖液(50mM三羥甲基氨基甲烷/HCl，pH 8；0.2mM DTT；4mM MgCl2)中加入120μl的[3H]-NAD+(0.1mCi/ml，提供者NEN)制成[3H]-NAD+儲藏液。在培育緩沖液(取自儲藏在-20℃下、水中的100mM儲藏液)中制備4mM NAD+(提供者Roche)的溶液。用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備PARP-1酶，即從人類肝臟cDNA開始進行無性繁殖和蛋白質(zhì)表達。有關(guān)使用的PARP-1酶的蛋白質(zhì)序列的相關(guān)信息，包括參考文獻，可自Swiss-Prot的資料庫中，按照主要登錄號P09874查到。將生物素化的組織蛋白和PVT-SPA珠?；旌希⒃谑覝叵骂A(yù)先培育30分鐘。將PARP-1酶(濃度依批次而定)與帶切口的DNA混合，并將混合物在4℃下預(yù)先培育30分鐘。將等份量的此種組織蛋白/PVT-SPA珠粒溶液與PARP-1酶/DNA溶液混合，并將75μl的此混合物與1μl溶于DMSO的本發(fā)明化合物和25μl的[3H]-NAD+一起加入到96槽微滴定板上的每個槽中。培育混合物中各種成分的最終濃度為生物素化的組織蛋白的濃度為2μg/ml、PVT-SPA珠粒的濃度為2mg/ml、帶切口DNA的濃度為2μg/ml和PARP-1酶的濃度為5～10μg/ml。在室溫下將混合物培養(yǎng)15分鐘后，向培養(yǎng)緩沖液(最終濃度為2mM)中加入100μl的4mM NAD+來中止反應(yīng)并將板子混合。
讓珠粒至少沉降15分鐘后，將板子移至ToppCountNXTTM(Packard)進行閃爍計數(shù)，所得數(shù)值以每分鐘閃爍次數(shù)(cpm)表示。對于每個實驗，平行測試對照組(含PARP-1酶和DMSO，不含化合物)、空白培養(yǎng)液(含DMSO，不含PARP-1酶和化合物)和樣品組(含PARP-1酶和溶于DMSO的化合物)。所有測試的化合物都溶解于DMSO，并最后用DMSO進一步稀釋。在第一個實例中，化合物在10-5M的濃度下進行測試。當(dāng)化合物在10-5M顯示出活性時，在化合物測試濃度范圍10-5-10-8M之間繪制劑量-響應(yīng)曲線。在每一次測試時，都從對照組和樣品組的測試值中減去空白樣的測試值。對照樣品代表最大的PARP-1酶活性。對各樣品，其cpm量用相對于對照樣平均cpm值的百分?jǐn)?shù)來表示。適當(dāng)?shù)?，在實驗點的上下50％，使用線性內(nèi)插法可用電腦計算出IC50值(藥品濃度，用來將PARP-1酶的活性減少到對比樣的50％)。此處，測試化合物的效果用pIC50(IC50值的負(fù)對數(shù)值)來表示。作為參比化合物，4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺也用來驗證SPA實驗。所測試的化合物在起始實驗濃度為10-5M下，表現(xiàn)出抑制活性(見表-2)。
用過濾分析來測定生物體外PARP-1抑制活性用[32P]-NAD作為ADP-核糖基供體，通過其組織蛋白的聚(ADP-核糖基)化活性，在生物體外進行過濾實驗來測試本發(fā)明化合物，評價PARP-1的活性(在帶切口DNA的存在下觸發(fā))。用三氯乙酸(TCA)將具有放射活性的核糖化組織蛋白沉淀在9696槽微滴定板上，用閃爍計數(shù)器測量加入的[32P]。
將組織蛋白(儲備液H2O中濃度5mg/ml)、NAD+(儲備液H2O中濃度100mM)和溶于培育緩沖液(50mM三羥甲基氨基甲烷/HCl，pH 8；0.2mM DTT；4mM MgCl2)的[32P]-NAD+制成混合物。同時制備PARP-1酶(5～10μg/ml)與帶切口DNA的混合物。按照SPA法測定生物體外PARP-1抑制活性中所描述的方法制備帶切口的DNA。將75μl的PARP-1酶/DNA混合物，與1μl溶于DMSO的本發(fā)明化合物和25μl的組織蛋白-NAD+/[32P]-NAD+混合物一起，加入到96槽過濾板(0.45μm，提供者Millipore)的每一個槽中。培養(yǎng)混合物中組織蛋白的最終濃度為2μg/ml，NAD+的最終濃度為0.1mM，[32P]-NAD+的最終濃度為200μM(0.5μC)和帶切口DNA的最終濃度為2μg/ml。在室溫下培育板子15分鐘，先加入10μl冰冷的100％TCA中止反應(yīng)，再加入10μl冰冷的BSA溶液(水中濃度1％)。在4℃下放置10分鐘讓蛋白質(zhì)級分沉淀，然后對板子進行抽真空過濾。在室溫下，對板子的每一個槽依次用1ml 10％的冰冷TCA、1ml 5％的冰冷TCA和1ml 5％的TCA洗滌。最后在每一個槽中加入100μl閃爍溶液(Microscint 40，Packard)，將板子移至TopCountNXTTM(Packard)進行閃爍計數(shù)，所得數(shù)值以每分鐘閃爍次數(shù)(cpm)表示。對于每個實驗，平行測試對照組(含PARP-1酶和DMSO，不含化合物)、空白培養(yǎng)液(含DMSO，不含PARP-1酶和化合物)和樣品組(含PARP-1酶和溶于DMSO的化合物)。所有測試的化合物都溶解于DMSO，并最后用DMSO進一步稀釋。在第一個實例中，化合物在10-5M的濃度下進行測試。當(dāng)化合物在10-5M顯示出活性時，在化合物測試濃度范圍10-5-10-8M之間繪制劑量-響應(yīng)曲線。在每一次測試時，都從對照組和樣品組的測試值中減去空白樣的測試值。對照樣品代表最大的PARP-1酶活性。對各樣品，其cpm量用相對于對照樣平均cpm值的百分?jǐn)?shù)來表示。適當(dāng)?shù)?，在實驗點的上下50％，使用線性內(nèi)插法可用電腦計算出IC50值(藥品濃度，用來將PARP-1酶的活性減少到對比樣的50％)。此處，測試化合物的效果用pIC50(IC50值的負(fù)對數(shù)值)來表示。作為參比化合物，4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺也用來驗證SPA實驗。所測試的化合物在起始實驗濃度為10-5M下，表現(xiàn)出抑制活性(見表-2)。
用鄰近閃爍分析法(SPA)測定生物體外TANK-2抑制活性用Ni Flash板子(96或384槽)，按照SPA技術(shù)(歸AmershamPharmacia Biotech所有)來測試本發(fā)明化合物。
原則上，本試驗依靠SPA技術(shù)，用[3H]-煙酰胺腺苷二核苷酸([3H]-NAD+)作ADP-核糖基供體來檢測TANK-2蛋白質(zhì)的自-聚(ADP-核糖基)化作用。
-NAD+/NAD儲藏液的制備將64.6μl的[3H]-NAD+(0.1mCi/ml，提供者Perkin Elmer)和46.7μl的NAD-儲藏液(10.7mM，儲藏在-20℃下，提供者Roche)加入到1888.7μl的分析緩沖液中(60mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH 7.4；0.9mM DTT，6mM MgCl2)。按照EP1238063中的方法生產(chǎn)TANK-2酶。96槽涂鎳閃爍板(PerkinElmer)的每個槽中，加入60μl的分析緩沖液、1μl的溶于DMSO的化合物、20μl的[3H]-NAD+/NAD和20μl的TANK-2酶(最終濃度為6mg/ml)。在室溫下培育120分鐘后，加入60μl中止溶液(溶于6ml水的42.6mg的NAD)，在閃爍板上蓋上封口板，并置于TopCountNXTTM(Packard)中進行閃爍計數(shù)，所得數(shù)值以每分鐘閃爍次數(shù)(cpm)表示。對于每個實驗，平行測試對照組(含TANK-2酶和DMSO，不含化合物)、空白培養(yǎng)液(含DMSO，不含TANK-2酶和化合物)和樣品組(含TANK-2酶和溶于DMSO的化合物)。所有測試的化合物都溶解于DMSO，并最后用DMSO進一步稀釋。在第一個實例中，化合物在10-5M的濃度下進行測試。當(dāng)化合物在10-5M顯示出活性時，在化合物測試濃度范圍10-5-10-8M之間繪制劑量-響應(yīng)曲線。在每一次測試時，都從對照組和樣品組的測試值中減去空白樣的測試值。對照樣品代表最大的TANK-2酶活性。對各樣品，其cpm量用相對于對照樣平均cpm值的百分?jǐn)?shù)來表示。適當(dāng)?shù)?，在實驗點的上下50％，使用線性內(nèi)插法可用電腦計算出IC50值(藥品濃度，用來將TANK-2酶的活性減少到對比樣的50％)。作為參比化合物，3-氨基苯甲酰胺和4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺也用來驗證SPA實驗。此處所描述的分析是在96-槽板中進行的。在使用384-槽板的分析中，使用相同的最終濃度和容積。若96-槽板實驗的結(jié)果有效，這些結(jié)果就合并在表-2中，否則，所列示的結(jié)果得自384-槽板實驗。
表-2

通過分析細胞內(nèi)的化學(xué)-和/或放射致敏性、分析測量癌細胞株中內(nèi)源PARP-1活性的抑制作用、以及最終在生物體內(nèi)進行的放射致敏性實驗，都可對這些化合物進行進一步的評價。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及式(I)化合物 其N-氧化物形式、藥用可接受加成鹽及其立體化學(xué)異構(gòu)形式，其中，虛線代表任選鍵；X是＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或當(dāng)X是＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)的一個二價自由基-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羥基；R1是氫、鹵素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R3是氫或C1-6烷氧基；Z是選自下列的一個自由基 其中每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫、鹵素、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或R7和R8一起可形成下式的一個二價自由基-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)其中，每個R9獨立地選自氫或C1-6烷基；且L是選自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的一個二價自由基；或當(dāng)X是＞CR2-或當(dāng)Z是式(b-11)的一個自由基時，L可以直接是一個鍵；限定性條件是當(dāng)X是＞CH-，-NY-是-N-C(O)-時，第二條虛線不是一個鍵，Z是式(b-2)的一個自由基且L是-C(O)-，則-C1-6烷二基-不是-CH2-CH2-。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中X是＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；當(dāng)X是＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)的一個二價自由基；R1是氫；R3是氫；Z是式(b-1)、(b-2)或(b-3)的一個自由基；每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫或鹵素；L是選自-C(O)-、-C(O)-NH-或-C(O)-C1-6烷二基-的一個二價自由基；且當(dāng)X是＞CR2-或當(dāng)Z是式(b-11)的一個自由基時，L可以直接是一個鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中X是＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；R1是氫；R3是氫；Z是式(b-1)或(b-2)的一個自由基；每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫或鹵素；L是選自-C(O)-或-C(O)-NH-的一個二價自由基且當(dāng)X是＞CR2-時，L可以直接是一個鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3所述的化合物，其中所述的化合物選自編號為No.4、No.5、No.11、No.12和No.14的化合物。 化合物4 化合物5 化合物11 化合物12 化合物14
5.權(quán)利要求1至4任一項所述的化合物作為藥品的用途。
6.一種藥物組合物，包括藥用可接受載體和作為活性成分的治療有效量的權(quán)利要求1至5所述的化合物。
7.一種制備權(quán)利要求6所述的藥物組合物的方法，其中將藥用可接受載體與權(quán)利要求1至4所述的化合物密切混合。
8.化合物在制造用于治療PARP媒介的疾病的藥品時的用途，其中所述的化合物是式(I)化合物， 其N-氧化物形式、藥用可接受加成鹽及其立體化學(xué)異構(gòu)形式，其中，虛線代表任選鍵；X是＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或當(dāng)X是＞CR2-時，則R2與-L-Z一起可形成式(a-1)的一個二價自由基-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羥基；R1是氫、鹵素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R3是氫或C1-6烷氧基；Z是選自下列的一個自由基 其中每個R5、R6、R7和R8獨立地選自氫、鹵素、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或R7和R8一起可形成下式的一個二價自由基-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)其中，每個R9獨立地選自氫或C1-6烷基；且L是選自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的一個二價自由基；或當(dāng)X是＞CR2-或當(dāng)Z是式(b-11)的一個自由基時，L可以直接是一個鍵。
9.權(quán)利要求8所述的式(I)PARP抑制劑在制造治療PARP-1媒介的疾病的藥品時的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求8和9所述的用途，其中所述的治療涉及化學(xué)致敏作用。
11.根據(jù)權(quán)利要求8和9所述的用途，其中所述的治療涉及放射致敏作用。
12.一種由式(I)化合物與化療藥劑復(fù)配而成的組合物。
13.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，特征在于a)將適當(dāng)?shù)氖?II)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺進行環(huán)化得到式(I-a)化合物，其中兩二條虛線均可以是一個鍵， b)用式(III)中間體對適當(dāng)?shù)氖?VI)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺進行環(huán)化得到式(I-b)化合物，其中-C1-6烷二基-是-CH2-CH2-且兩二條虛線均可以是一個鍵，或 c)用式(VI)中間體對適當(dāng)?shù)氖?V)所示的取代2-氨基苯甲酰胺進行環(huán)化得到式(I-c)化合物，其中只有一條虛線可以是一個鍵。
全文摘要
本發(fā)明提供了式(I)化合物，其作為PARP抑制劑的用途以及含有所述式(I)化合物的藥物組合物，其中，R
文檔編號C07D401/06GK1976906SQ200580021337
公開日2007年6月6日 申請日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者M·J·M·范德阿, A·H·M·T·范赫爾圖姆, J·A·J·范杜恩, M·V·F·索默斯, W·B·L·沃特斯 申請人:詹森藥業(yè)有限公司