專利名稱：遺傳純化的古蘭糖膠的制作方法
遺傳純化的古蘭糖膠本專利文件公開內容的一部分包括受到版權保護的內容。版權所有者不阻止任何人復制如專利商標局的專利文件或記錄上出現的該專利文件或專利公開內容，但仍 舊保留所有版權。發明領域本發明涉及食品添加劑領域。具體涉及乳制品添加劑領域。更具體涉及滅菌的奶 制品添加劑。發明背景古蘭糖膠(Gellan gum)是一種由伊樂藻鞘氨醇單胞菌(5^/"gomo"w e/o&a)產生 的胞外多糖。由伊樂藻鞘氨醇單胞菌(S.e/o^力制造的古蘭糖膠可從CP Kdco(San Diego， CA)作為KelcogelLT10(f購得。商業上，古蘭糖膠是通過需氧發酵形成的。 發酵結束后對肉湯巴氏滅菌以殺死活細胞，然后再從發酵肉湯中回收凝膠。古蘭糖膠包含葡萄糖、葡糖醛酸和鼠李糖，其摩爾比為2:1:1，它們連接形成四 糖重復單元。天然古蘭糖膠在同一葡萄糖殘基上被乙酰化和甘油基化(glycerylated)。 每個四糖重復單元平均有一個乙酰基和半個甘油基。古蘭糖膠的回收方法將影響凝膠的性質。直接回收得到柔軟有彈性的凝膠。古蘭 糖膠由于其結構和流變學特征，已被長期用于經培養、高壓殺菌(retorted)和冷凍的乳 制品。然而，含有古蘭糖膠的乳基產品雖然儲藏穩定，但仍會出現臭味和臭氣；這 種味道和氣味使食品味道變差。已知這種臭味和臭氣與奶中的底物如硫酸對甲酚酯 (para-cresyl sulfate)和對甲酚基葡糖醛酸(para-cresyl glucouronide)形成對甲酚有關。在 經過超高溫處理并室溫保存的含有古蘭糖膠的奶基產品中仍可檢測出對甲酚。在消除該問題的一種努力中，用熱堿處理使古蘭糖膠脫酰基。雖然能有效除去對 甲酚，但脫酰基處理使得古蘭糖膠更加易碎而不太適用于某些食品應用。消除該問 題的另一種方法是用變性劑如次氯酸鈉或氫氧化鉀預處理天然古蘭糖膠。這種方法 增加了材料和處理成本。本領域需要一種長期儲藏后不在滅菌乳制品中產生對甲酚
且不需要額外處理步驟的古蘭糖膠產品。 發明概述在第一個實施方式中，提供了一種基本上不含芳基硫酸酯酶蛋白的含有古蘭糖膠 的組合物。在第二個實施方式中，提供了一種基本上不含P-葡糖醛酸酶蛋白的含有古蘭糖膠 的組合物。在本發明的第三個實施方式中，提供了一種基本上不含芳基硫酸酯酶也不含P-葡糖醛酸酶蛋白的含有古蘭糖膠的組合物。在本發明的第四個實施方式中，提供了一種制造古蘭糖膠組合物的方法。在培養 基中培養伊樂藻鞘氨醇單胞菌。伊樂藻鞘氨醇單胞菌產生無催化活性的芳基硫酸酯酶、或無催化活性的(3-葡糖醛酸酶、或無催化活性的芳基硫酸酯酶和無催化活性的(3-葡糖醛酸酶。收集培養基。從所述培養基沉淀古蘭糖膠。本發明的第五個實施方式提供了一種伊樂藻鞘氨醇單胞菌的微生物純培養物。該 培養物是芳基硫酸酯酶缺陷型的。本發明的第六個實施方式提供了另一種伊樂藻鞘氨醇單胞菌的微生物純的培養 物。該培養物是P-葡糖醛酸酶缺陷型的。本發明的再一實施方式是一種伊樂藻鞘氨醇單胞菌的微生物純的培養物。所述培 養物同時為芳基硫酸酯酶和卩-葡糖醛酸酶缺陷型。本發明的第八個實施方式提供了一種編碼伊樂藻鞘氨醇單胞菌芳基硫酸酯酶的 分離并純化的多核苷酸。所述芳基硫酸酯酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發明的第九個實施方式提供了一種編碼伊樂藻鞘氨醇單胞菌卩-葡糖醛酸酶的 分離并純化的多核苷酸。所述p-葡糖醛酸酶具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。本發明的第十個實施方式是一種包含伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因組DNA的分離并 純化的多核苷酸。所述基因組DNA缺失其全部或部分芳基硫酸酯酶編碼序列。本發明的第十一個實施方式是一種包含伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因組DNA的分離 并純化的多核苷酸。所述基因組DNA缺失其全部或部分P-葡糖醛酸酶編碼序列。下面具體描述的本發明的這些和其它實施方式為本領域提供了一種制造更易為 消費者接受的滅菌的含有古蘭糖膠的乳制品的方法。附圖簡述
圖1:芳基硫酸酯酶基因(a^4)周圍基因組區域的遺傳圖和通過PCR擴增并克隆 入質粒pL02的區域的位置。然后通過同源重組用帶有克隆的PCR片段的質粒pL02 置換具有缺失的基因組的該區域。圖2:伊樂藻鞘氨醇單胞菌(3-葡糖醛酸酶基因(g^A)周圍基因組區域的限制性圖 譜。BG-6和BG-7克隆中轉座子插入的位置示于底部。發明詳述本發明者發現，如果伊樂藻鞘氨醇單胞菌中芳基硫酸酯酶和P-葡糖醛酸酶的編碼 基因之一或這兩個基因同時被突變滅活，則這種細菌將產生對于某些目的具有優良 特性的古蘭糖膠。具體地說，用這種突變體制得的古蘭糖膠賦予滅菌的奶制品更長 的保存期。如果所述酶之一或兩者未被滅活則它們將從在奶中發現的底物(硫酸對甲酚酯和 對甲酚基葡糖醛酸)產生對甲酚。對甲酚會造成消費者難以接受的氣味和味道。除去 這些酶將降低滅菌奶或奶制品在保存中產生甲酚的速度。可使所述酶之一或兩者突變以降低對甲酚的產生速度。突變宜為使蛋白質全部滅 活的類型，如插入、無義、移碼或缺失突變。可采用本領域已知的產生這種突變的 任何技術。申請人采用轉座子插入法來鑒定芳基硫酸酯酶和(3-葡糖醛酸酶編碼基因。 然后用連接在一起的該基因兩側的5'和3'DNA片段通過同源重組在各基因中構建缺 失突變。但是，也可采用其它方法在這些基因中得到突變。可直接在"產"古蘭糖 膠菌株中產生突變，或者可將突變從首先得到該突變的菌株轉移到"產"古蘭糖膠 菌株。定點誘變技術是本領域熟知的。參見，例如，"體外誘變法"(In Vitro Mutagenesis Protocols),第二版，Braman， Jeff編，Humana Press, 2002，和市售的QuikChange 試劑盒(Stratagene)。只要提供伊樂藻鞘氨醇單胞菌芳基硫酸酯酶和P-葡糖醛酸酶基 因的野生型序列，本領域的技術人員就能在這些基因中方便地制得各種所需突變。已經鑒定了編碼芳基硫酸酯酶和(3-葡糖醛酸酶的野生型和突變型基因序列。見 SEQ ID NO:l (野生型芳基硫酸酯酶)、SEQ ID NO:3 (芳基硫酸酯酶缺失)、SEQ ID NO:4 (野生型P-葡糖醛酸酶)和SEQIDNO:6 (P-葡糖醛酸酶缺失)。這些基因及其核苷 酸序列的鑒定使得本領域的技術人員能夠方便地制造在表達這些酶時具有所需無效 表型的其它突變。諸如插入、缺失、無義和移碼的突變更可能導致酶的無效表型(null phenotype)。也可制造錯義突變并按照常規測試了它們對酶活性的功效。可采用微生 物遺傳標準技術來制造合適的突變。參見，例如，戶n'w";p/" o/GeneMamjtwto/ow.-
/"frodwc"ow to (7ew"/c ￡"g/"eeW"g， R. W. Old, S. B. Primrose, Blackwell Publishing, 1994。可采用標準酶試驗來測試突變的酶的活性損失。參見，例如，Kim等，々少/ M'c油W說.她c/z"o/ 2004-2; 63(5):553-9。基本上不含芳基硫酸酯酶或P-葡糖醛酸酶的本發明的組合物中特定蛋白質的含 量比野生型菌株的含量低95%、 96%、 97%、 98%或99%。酶含量的降低將導致滅菌 乳組合物中對甲酚的含量比野生型菌株低90%、 93%、 95%、 97%或99%，所述對甲 酚是在含有古蘭糖膠的組合物中制造的。可采用容易測定的底物如Sigma的硫酸5-溴-4-氯-3』引哚(X-S04)(CAS號6578-07-0)或用Sigma或RPI Corp.的5-溴-4-氯-3』引 哚基-卩-D-葡糖醛酸(X-GlcA)(CAS號114162-64-0)或用對硝基兒茶酚，通過酶試驗 來測量產生的芳基硫酸酯酶或(3-葡糖醛酸酶蛋白的量。或者，也可用免疫技術如 Western印跡來測定蛋白質。古蘭糖膠通常被用于滅菌或超高溫(UHT)處理的乳制品或冷凍乳制品。這種產品 包括但不限于冰淇淋、冷凍酸奶、布丁、經攪打的乳制品、咖啡飲料用稀奶油、焦 糖奶油(citmebrulee)和含乳飲料。本發明的古蘭糖膠可象野生型菌株的典型古蘭糖膠 一樣，用于這些食品或者任何其它食品。古蘭糖膠通常用于懸浮細顆粒，但也可用 它來賦予良好口感。可按照本領域己知的用于野生型菌株的任何方法用本發明的突變型菌株來制造 古蘭糖膠。通常使細菌生長在液體培養基中。這種培養基通常含有碳源、磷酸鹽、 有機和無機氮源以及合適的痕量元素。發酵通常在無菌條件下進行，需要通風和攪 拌。發酵結束時收集培養基，通常不需要除去細胞。可對發酵肉湯進行巴氏滅菌以 殺死活細胞，然后回收古蘭糖膠。如本領域已知可沉淀古蘭糖膠。這通常用醇如異 丙醇進行。沉淀的古蘭糖膠在再水化之前可被干燥。可用本領域已知的任何方法測定對甲酚。 一種可使用的方法釆用二氯甲烷萃取、 濃縮和氣相色譜-質譜。盡管已經針對包括目前優選的進行本發明的模式在內的特定實施例描述了本發 明，但那些精通本領域的技術人員應該了解，上述體系和技術可有無數變化和排列， 且這些變化和排列都在附加的權利要求中所列的本發明精神和范圍之內。實施例 實施例1以下試劑用于篩選和表征突變菌株
硫酸5-溴4-氯-3-吲哚(X-S04); CAS號:6578-07-0;來源Sigma 5-溴-氯-3吲哚基-P-D-葡糖醛酸(X-GlcA); CAS號114162-64-0; Source: Sigma 或RPI Corp.實施例2采用市售的Epicentre (Madison, WI)的EZ::TNTM〈R6Kgamma-ori/KAN-2〉插入試劑盒，通過在伊樂藻鞘氨醇單胞菌的非粘液菌株Gps2中建立隨機轉座子突變體文庫 鑒定了芳基硫酸酯酶和(3-葡糖醛酸酶編碼基因。在含有特定顯色底物的選擇性培養 基上選擇缺乏(或顯著減少)藍色的卡那霉素抗性突變菌株。見實施例l。在含有規定 培養基和氯鹽的瓊脂上用發色團硫酸5-溴-4-氯-3-吲哚(X-S04)鑒定封閉芳基硫酸酯 酶產生或活性的突變體。在規定培養基上用發色團5-溴-4-氯-3-吲哚基-卩-D-葡糖醛酸 (X-GlcA)選擇P-葡糖醛酸酶突變體。然后用限制性酶從染色體上切除轉座子和毗鄰的基因組DNA。限制性酶切片段 用連接酶環化并轉化入大腸桿菌，由于轉座子中存在復制子因此含有轉座子的DNA 可在大腸桿菌內復制。純化質粒DNA并測序。帶有芳基硫酸酯酶基因的質粒被稱為 R6K-AS#14E。該質粒的一部分被測序(SEQ ID NO:l)。帶有(3-葡糖醛酸酶基因的質 粒被稱為R6K-BG#6S。該質粒的一部分也被測序(SEQ ID NO:4)。大腸桿菌菌株 EC100Dpir+內的這些質粒已于2004年6月21日保藏于弗吉尼亞州馬納薩斯的美國 典型培養物保藏中心。在含有滅活的芳基硫酸酯酶的細菌中，轉座子實際被插入毗鄰芳基硫酸酯酶基因 的假想蛋白的基因中。在含有滅活的P-葡糖醛酸酶的細菌中，轉座子被插入P-葡糖 酸酸酶基因的氨基部分。這些基因的DNA測序顯示，它們與全國生物技術信息中心 (NCBI， National Center for Biotechnology Information)數據庫中其它種類的已知基因 同源。對芳基硫酸酯酶和(3-葡糖醛酸酶的基因以及毗鄰的基因組DNA進行測序。在質 粒上構建基因缺失，然后轉移到伊樂藻鞘氨醇單胞菌菌株S-60wtc和PDG-l中。參 見WO01/64897。通過同源重組將缺失插入基因組。通過PCR擴增耙基因兩側的DNA 序列并克隆入質粒載體pL02。 (Lenz， O.， E. Schwartz, J. Demedde， M. Eitinger和 B. Friedrich， 1994，"真養產堿菌H16 hoxX基因參與氫化酶調節"(The Alcaligenes eutrophus H16 hoxX gene participates in hydrogenase regulation) / 176: 4385-4393。)通過接合將該構建物轉移到伊樂藻鞘氨醇單胞菌菌株。然后使所得卡那霉素抗性菌株在無抗生素時生長30-40代。由于pL02上丟失了^cB基因，因此可通過蔗糖耐受性選擇來檢測丟失質粒的分離物，并通過卡那霉素敏感性加以證實。 在非選擇性生長后丟失質粒的分離物為兩種類型，缺失型或野生型。通過合適的指 示劑瓊脂上缺乏藍色(見實施例l)及通過診斷型PCR鑒定所需缺失菌株。構建過程如 圖1所示。
為準確刪除芳基硫酸酯酶基因(a/")，必需確定最可能的"to」基因的起始密碼子 和毗鄰基因的起始和終止密碼子。根據DNA序列、與GenBank中其它基因的同源 性以及和第三堿基GC優勢，采用FramePlot-3程序確定了基因的位置和終點。 Ishikawa和Hotta， "FramePlot:預測細菌DNA中具有高G+C含量的蛋白質編碼區 的i賣t匡^j、豐斤新方法"(FramePlot: a new implementation of the Frame analysis for predicting protein-coding regions in bacterial DNA with a high G+C content) F￡MS M'cra6/o/ogy丄ete^ 174:251-253 (1999)。這種分析指出，芳基硫酸酯酶基因與保守性 假想蛋白基因翻譯相連，即，芳基硫酸酯酶基因的終止密碼子與保守性假想蛋白基 因的起始密碼子重疊。構建芳基硫酸酯酶缺失以留下完整的垸基硫酸酯酶基因和未 知蛋白的基因，盡管不知道最佳的細胞生長和古蘭糖膠產生是否需要這些蛋白質。
PCR引物AS5(CCGAGCTCAACGCCTTCGACTATGTCCA: SEQ ID NO:ll)和 AS6(CCTCTAGACTGGGGATTGTCCGGAAAAG; SEQ ID NO:12)被用來擴增正好位 于flfe4起始密碼子上游的512 bp片段，得到&cl-^al片段(總共528 bp)。引物AS3 (CGTCTAGATCCACCCCGGCGACCTTCCC ; SEQ ID NO: 13)禾卩 AS4 (TATAGCATGCGGCGACCACGGGCTCCTCCTCA: SEQ ID NO:14)被用來擴增包括 基因終點和保守性假想蛋白起點在內的479 bp片段，得到^d-印/zI片段(總共 497 bp)。因此，的終止密碼子被保留而起始密碼子被刪除，因此不能合成芳基 硫酸酯酶蛋白的任何部分。在引物末端加入克隆的限制性位點。將PCR片段依次連 接入質粒載體pL02的多接頭以形成flfe4基因的缺失。將上游^cl-力al片段克隆入 用&cKWfll切割的pL02。隨后克隆下游^al-5^zl片段(圖2)。將缺失a/W基因的 質粒通過接合轉移入伊樂藻鞘氨醇單胞菌菌株S60wtc和PDG-1，從而使該質粒重組 入染色體。純化卡那霉素抗性分離株，然后使其在不存在抗生素的條件下生長并鋪 在含有蔗糖和X-S04的培養基上以選擇由于丟失了質粒編碼的mcB基因具有蔗糖耐 性的分離株。篩選蔗糖耐性、卡那霉素敏感性的黃色集落。S60wtc和PDG-l的afe4 衍生物分別稱為GAS-1和PAS-1。在質粒pLO2上構建卩-葡糖醛酸酶基因(g^A)缺失并轉移入S60wtc、 GAS-1。通
過與其它蛋白質的同源性和核糖體結合位點的存在確定gusA基因最可能的起始密碼子。二級結構區域在起始密碼子上游。構建gusA基因缺失以維持gusA上游和下游 的二級結構。用引物Bgluc3(AACTGCAGACACGTGGCTTGTGCCGAAC: SEQ ID NO:7)禾口 Bgluc4 (GGCTCTAGACTTCTCCCTGTTCCTCCGGGAAA; SEQ ID NO:8) 擴增gusA基因上游的560 bp片段，得到PstI-XbaI片段(總共577 bp)。用引物Bglucl (TTTCTAGATGACTGTCCAGGCCCCTCTC ; SEQ ID NO:9)禾口 Bgluc2 (TCGAGCTCCAATGTCCTCGTAGCTGTTC: SEQ ID NO:10)擴增gusA下游的489 bp 片段，得到XbaI-SaCI片段(總共505 bp)。將PstI-XbaI片段克隆入PstI-XbaI切割的 pL02。隨后克隆下游XbaI-SaCI片段。將缺失gusA基因的質粒通過接合轉移入伊樂 藻鞘氨醇單胞菌菌株S60wtc、 GAS-1和PAS-1，從而使重組得以進行。純化卡那霉 素抗性分離株，然后使其在不存在抗生素的條件下生長并鋪在含有蔗糖和X-GlcA的 培養基上以選擇由于丟失了質粒編碼的MdB基因具有蔗糖耐性的分離株。得到藍綠 色(野生型)和淡綠色(突變型)集落的混合物。通過卡那霉素敏感性證實蔗糖耐性、淡 綠色分離物的質粒丟失。S60wtc、 GAS-1和PAS-1的g^A衍生物分別稱為GBG、 GBAD和PBAD。在菌株S60wtc和PDG-1中也完成了芳基硫酸酯酶基因(ats4)的缺失。p-葡糖醛酸 酶基因已被鑒定和測序。毗鄰DNA也被測序。在S60、 PDG-1和GAS-1中分別構建 了 (3-葡糖醛酸酶基因缺失。在超高溫乳應用測試中以月為間隔評價了從菌株GAS-1(缺失芳基硫酸酯酶基因) 和GBAD-1(同時缺失芳基硫酸酯酶和p-葡糖醛酸酶基因)制造的古蘭糖膠樣品的對 甲酚生成情況。來自野生型菌株的古蘭糖膠樣品在1個月后產生3-152(平均65)ppb 對甲酚，在2個月后產生4-212(平均96)ppb對甲酚。來自GAS-1的古蘭糖膠樣品在 1-5個月后產生l-3ppb對甲酚。來自GBAD-1的古蘭糖膠樣品在最多3個月的測試 中產生少于1 ppb(檢出限)對甲酚。10
權利要求
1. 一種基本上不含芳基硫酸酯酶蛋白的含有古蘭糖膠的組合物。
2. —種基本上不含p-葡糖醛酸酶蛋白的含有古蘭糖膠的組合物。
3. —種基本上不含芳基硫酸酯酶和(3-葡糖醛酸酶蛋白的含有古蘭糖膠的組合物。
4. 如權利要求1所述的組合物，其特征在于，它是伊樂藻鞘氨醇單胞菌的培養肉湯。
5. 如權利要求1所述的組合物，其特征在于，它是伊樂藻鞘氨醇單胞菌的沉淀培 養肉湯。
6. 如權利要求1所述的組合物，其特征在于，其為滅菌的奶制品。
7. —種制造古蘭糖膠組合物的方法，所述方法包括使伊樂藻鞘氨醇單胞菌在培養基中生長，其中伊樂藻鞘氨醇單胞菌產生無催化活 性的芳基硫酸酯酶或無催化活性的卩-葡糖醛酸酶或無催化活性的芳基硫酸酯酶和無 催化活性的P-葡糖醛酸酶；收集所述培養基；從所述培養基沉淀古蘭糖膠。
8. 如權利要求7所述的方法，還包括將所述古蘭糖膠加入乳制品。
9. 一種芳基硫酸酯酶缺陷型的伊樂藻鞘氨醇單胞菌的微生物純培養物。
10. —種含有用權利要求9所述的微生物純培養物制造的古蘭糖膠的組合物。
11. 一種編碼具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的伊樂藻鞘氨醇單胞菌芳基硫 酸酯酶的分離并純化的多核苷酸。
12. 如權利要求22所述的分離并純化的多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:l的核 苷酸521-2176所示的核苷酸序列。
13. —種包含伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因組DNA并缺失其全部或部分芳基硫酸酯 酶編碼序列的分離并純化的多核苷酸。
14. 如權利要求15所述的分離并純化的多核苷酸，其特征在于，所述基因組DNA 包含全部或部分編碼烷基硫酸酯酶的伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因組DNA。
15. —種包含伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因組DNA并缺失其全部或部分p-葡糖醛酸 酶編碼序列的分離并純化的多核苷酸。
16. 如權利要求15所述的分離并純化的多核苷酸，其特征在于，所述缺失是缺失 SEQ IDNO:4的核苷酸1588-3447。
17. 如權利要求15所述的分離并純化的多核苷酸，其特征在于，所述基因組DNA 包含全部或部分編碼(3-葡糖醛酸酶上游保守性假想蛋白的伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因 組DNA。
18. 如權利要求15所述的分離并純化的多核苷酸，其特征在于，所述基因組DNA 包含全部或部分編碼蘋果酸脫氫酶的伊樂藻鞘氨醇單胞菌基因組DNA。
19. 如權利要求9所述的微生物純的培養物，其特征在于，其芳基硫酸酯酶基因、 其(3-葡糖醛酸酶基因、或者其芳基硫酸酯酶基因和其|3-葡糖醛酸酶基因的全部或部 分缺失。
20. 如權利要求9所述的微生物純的培養物，其特征在于，在其芳基硫酸酯酶基 因、其(3-葡糖醛酸酶基因、或者其芳基硫酸酯酶基因和其P-葡糖醛酸酶基因中有插入。
21. 如權利要求9所述的微生物純的培養物，其特征在于，在其芳基硫酸酯酶基 因、其p-葡糖醛酸酶基因、或者其芳基硫酸酯酶基因和其P-葡糖醛酸酶基因中有滅活突變。
全文摘要
某些奶制品中與產生對甲酚有關的蛋白質的突變滅活能改善味道和氣味。不良的對甲酚是隨著時間流逝由制造古蘭糖膠的細菌產生的酶形成的。由于古蘭糖膠通常以相對未純化形式使用，因此酶與古蘭糖膠一起被加入奶中。將酶滅活是一種不需要任何額外純化或處理的除去酶的遺傳方法。
文檔編號C07G99/00GK101124329SQ200580020442
公開日2008年2月13日 申請日期2005年6月20日 優先權日2004年6月21日
發明者J·M·克利里, N·E·哈丁, R·J·科爾曼, Y·N·帕特爾 申請人:Cp覬爾科美國股份有限公司