Dr5抗體及其用途的制作方法

專利名稱：Dr5抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及結合DR5受體的抗體。這類抗體可用于例如期望調節Apo-2L和/或Apo-2L受體的生物學活性的方法中。
背景技術：
多種分子已經鑒定為細胞因子中的腫瘤壞死因子(“TNF”)家族的成員，諸如腫瘤壞死因子-α(“TNF-α”)、腫瘤壞死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX-40配體、4-1BB配體、Apo-1配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、APRIL、OPG配體(也稱作RANK配體、ODF或TRANCE)和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)(參見例如Gruss和Dower，Blood，853378-3404(1995)；Schmid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，831881(1986)；Dealtry等人，Eur.J.Immunol.，17689(1987)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996)；Wiley等人，Immunity，3673-682(1995)；Browning等人，Cell，72847-856(1993)；Armitage等人，Nature，35780-82(1992)；1997年1月16日公開的WO 97/01633；1997年7月17日公開的WO 97/25428；Marsters等人，Curr.Biol.，8525-528(1998)；Chicheportiche等人，Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Hahne等人，J.Exp.Med.，1881185-1190(1998)；1998年7月2日公開的WO 98/28426；1998年10月22日公開的WO 98/46751；1998年5月7日公開的WO 98/18921；Moore等人，Science，285260-263(1999)；Shu等人，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；Schneider等人，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay等人，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999))。在這些分子中，TNF-α、TNF-β、CD30配體、4-1BB配體、Apo-1配體、Apo-2配體(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配體(TWEAK)已有報道與凋亡性細胞死亡有關。
數年前，Apo2L/TRAIL被鑒定為細胞因子中的TNF家族的成員(參見例如Wiley等人，Immunity，3673-682(1995)；Piti等人，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996))。全長的人Apo2L/TRAIL多肽是281個氨基酸的II型跨膜蛋白。一些細胞能夠通過酶促切割多肽的胞外區來生成天然的可溶形式的多肽(Mariani等人，J.Cell.Biol.，137221-229(1997))。對可溶形式的Apo2L/TRAIL的晶體學研究揭示了與TNF和其它相關蛋白質的結構相類似的同三聚體結構(Hymowitz等人，Molec.Cell，4563-571(1999)；Hymowitz等人，Biochemistry，39633-644(2000))。但是，與其它TNF家族成員不同的是，發現Apo2L/TRAIL具有獨特的結構特征，其三個半胱氨酸殘基(同三聚體中各個亞基的第230位)一起與鋅原子配位，且鋅原子結合對于三聚體穩定性和生物學活性來說是重要的(Hymowitz等人，同上文；Bodmer等人，J.Biol.Chem.，27520632-20637(2000))。
文獻中已有報道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系統的調節中，包括自體免疫疾病諸如類風濕性關節炎，及在HIV的治療中起作用(參見例如Thomas等人，J.Immunol.，1612195-2200(1998)；Johnsen等人，Cytokine，11664-672(1999)；Griffith等人，J.Exp.Med.，1891343-1353(1999)；Song等人，J.Exp.Med.，1911095-1103(2000)；Jeremias等人，Eur.J.Immunol.，28143-152(1998)；Katsikis等人，J.Exp.Med.，1861365-1372(1997)；Miura等人，J.Exp.Med.，193651-660(2001))。
還有報道，可溶形式的Apo2L/TRAIL在體外誘導多種癌細胞凋亡，包括結腸、肺、乳房、前列腺、膀胱、腎、卵巢和腦的腫瘤，以及黑素瘤、白血病和多發性骨髓瘤(參見例如Wiley等人，同上文；Pitti等人，同上文；Rieger等人，FEBS Letters，427124-128(1998)；Ashkenazi等人，J.Clin.Invest.，104155-162(1999)；Walczak等人，Nature Med.，5157-163(1999)；Keane等人，Cancer Research，59734-741(1999)；Mizutani等人，Clin.CancerRes.，52605-2612(1999)；Gazitt，Leukemia，131817-1824(1999)；Yu等人，Cancer Res.，602384-2389(2000)；Chinnaiyan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，971754-1759(2000))。鼠腫瘤模型的體內研究還表明，單獨使用Apo2L/TRAIL或者與化療或放療結合能夠發揮實質性的抗腫瘤作用(參見例如Ashkenazi等人，同上文；Walzcak等人，同上文；Gliniak等人，Cancer Res.，596153-6158(1999)；Chinnaiyan等人，同上文；Roth等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2651999(1999))。與許多類型的癌細胞相反，大多數正常的人細胞類型表現出對某些重組形式Apo2L/TRAIL誘導凋亡具有抵抗性(Ashkenazi等人，同上文；Walzcak等人，同上文)。Jo等人已經報道，多聚組氨酸標記的可溶形式的Apo2L/TRAIL在體外誘導分離的正常人肝細胞凋亡，非人源的則不然(Jo等人，Nature Med.，6564-567(2000)；還可參見Nagata，Nature Med.，6502-503(2000))。認為，某些重組Apo2L/TRAIL制備物對患病細胞與正常細胞相比在生物化學特性和生物學活性方面可能是不同的，這取決于例如標簽分子(tag molecule)的存在與否、鋅含量和三聚體的百分比含量(參見Lawrence等人，Nature Med.，Letter to the Editor，7383-385(2001)；Qin等人，Nature，Med.，Letter tothe Editor，7385-386(2001))。
認為，由這類TNF家族細胞因子介導的各種細胞應答的誘導是由它們結合特異的細胞受體啟動的。先前鑒定了約55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)的兩種截然不同的TNF受體(Hohman等人，J.Biol.Chem.，26414927-14934(1989)；Brockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，873127-3131(1990)；1991年3月20日公開的EP 417,563；Loetscher等人，Cell，61351(1990)；Schall等人，Cell，61361(1990)；Smith等人，Science，2481019-1023(1990)；Lewis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，882830-2834(1991)；Goodwin等人，Mol.Cell.Biol.，113020-3026(1991))。發現那些TNFR共有典型的細胞表面受體結構，包括胞外區、跨膜區和胞內區。自然地，發現這兩種受體的胞外部分也是可溶性TNF結合蛋白(Nophar，Y.等人，EMBO J.，93269(1990)；Kohno，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，878331(1990)；Hale等人，J.Cell.Biochem.增刊15F，1991，第113頁(P424))。
1型和2型TNFR(TNFR1和TNFR2)的胞外部分含有4個富含半胱氨酸結構域(CRD)的重復氨基酸序列模式，從NH2末端開始，稱作1-4(Schall等人，同上文；Loetscher等人，同上文；Smith等人，同上文；Nophar等人，同上文；Kohno等人，同上文；Banner等人，Cell，73431-435(1993))。類似的CRD重復模式存在于幾種其它細胞表面蛋白中，包括p75神經生長因子受體(NGFR)(Johnson等人，Cell，47545(1986)；Radeke等人，Nature，325593(1987))、B細胞抗原CD40(Stamenkovic等人，EMBOJ.，81403(1989))、T細胞抗原OX40(Mallet等人，EMBO J.，91063(1990))和Fas抗原(Yonehara等人，同上文及Itoh等人，Cell，66233-243(1991))。CRD還發現于Shope和粘液瘤痘病毒的可溶性TNFR(sTNFR)樣T2蛋白中(Upton等人，Virology，16020-29(1987)；Smith等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，176335(1991)；Upton等人，Virology，184370(1991))。這些序列的最佳排列表明半胱氨酸殘基的位置非常保守。這些受體有時集體稱作TNF/NGF受體超家族的成員。
除了淋巴毒素-β之外，迄今鑒定的TNF家族配體通常為II型跨膜蛋白，其C-末端位于細胞外。相反，至今鑒定的TNF受體(TNFR)家族的大多數受體通常為I型跨膜蛋白。然而，在TNF配體和受體兩個家族中，發現家族成員間鑒定的同源性主要存在于胞外域(“ECD”)中。幾種TNF家族細胞因子，包括TNF-α、Apo-1配體和CD40配體，在細胞表面受到蛋白水解切割；在各種情形下生成的蛋白質通常形成同三聚體分子，作為可溶性細胞因子起作用。TNF受體家族蛋白質通常也受到蛋白水解切割來釋放可溶性受體ECD，能作為同源細胞因子的抑制劑起作用。
Pan等人揭示了另一種TNF受體家族成員，稱作“DR4”(Pan等人，Science，276111-113(1997)；還可參見1998年7月30日公開的WO98/32856；1999年7月29日公開的WO 99/37684；2000年12月7日公開的WO 00/73349；2002年8月13日公布的US 6,433,147；2002年10月8日公布的US 6,461,823；及2002年1月29日公布的US 6,342,383)。DR4報道含有胞質死亡結構域，它能引入細胞自殺機制。Pan等人揭示，認為DR4是稱為Apo2L/TRAIL的配體的受體。
在Sheridan等人，Science，277818-821(1997)和Pan等人，Science，277815-818(1997)中描述了認為是Apo2L/TRAIL的受體的另一種分子(還可參見1998年11月19日公開的WO 98/51793；1998年9月24日公開的WO 98/41629)。該分子稱作DR5(也可選擇性地稱作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER(參見例如Screaton等人，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17141-143(1997)；1998年8月20日公開的WO 98/35986；1998年10月14日公開的EP 870,827；1998年10月22日公開的WO 98/46643；1999年1月21日公開的WO 99/02653；1999年2月25日公開的WO 99/09165；1999年3月11日公開的WO 99/11791；2002年8月13日公開的US 2002/0072091；2001年12月7日公開的US2002/0098550；2001年12月6日公布的US 6,313,269；2001年8月2日公開的US 2001/0010924；2003年7月3日公開的US 2003/01255540；2002年10月31日公開的US 2002/0160446；2002年4月25日公開的US2002/0048785；2003年5月27日公布的US 6,569,642；2000年6月6日公布的US 6,072,047；2003年11月4日公布的US 6,642,358)。與DR4一樣，報道DR5含有胞質死亡結構域且能夠發出信號誘導凋亡。Hymowitz等人，Molecular Cell，4563-571(1999)中描述了Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復合物的晶體結構。
還有一組最近鑒定的受體稱作“誘捕受體”(decoy receptors)，認為其作為信號傳導的抑制物而非轉導物起作用。該組包括DCR1(也稱作TRID、LIT或TRAIL-R3)(Pan等人，Science，276111-113(1997)；Sheridan等人，Science，277818-821(1997)；McFarlane等人，J.Biol.Chem.，27225417-25420(1997)；Schneider等人，FEBS Letters，416329-334(1997)；Degli-Esposti等人，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；及Mongkolsapaya等人，J.Immunol.，1603-6(1998))和DCR2(也稱作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等人，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Pan等人，FEBS Letters，42441-45(1998)；Degli-Esposti等人，Immunity，7813-820(1997))，二者都是細胞表面分子，以及OPG(Simonet等人，同上文；Emery等人，見下文)和DCR3(Pitti等人，Nature，396699-703(1998))，二者都是分泌的、可溶性蛋白質。有報道，Apo2L/TRAIL結合那些稱作DcR1、DcR2和OPG的受體。
認為，Apo2L/TRAIL通過細胞表面“死亡受體”DR4和DR5激活胱天蛋白酶或執行細胞死亡程序的酶來起作用。在配體結合后，DR4和DR5都能通過稱作FADD/Mortl的含死亡結構域的連接物分子，募集和激活凋亡起始物胱天蛋白酶-8，獨立引發凋亡(Kischkel等人，Immunity，12611-620(2000)；Sprick等人，Immunity，12599-609(2000)；Bodmer等人，NatureCell Biol.，2241-243(2000))。與DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受體不發出信號誘導凋亡。
關于細胞因子的TNF家族及其受體的綜述參見Ashkenazi和Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi和Dixit，Curr. Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)；Gruss和Dower，同上文；Nagata，Cell，88355-365(1997)；Locksley等人，Cell，104487-501(2001)；Wallach，“TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families”，Cytokine Reference，Academic Press，2000，第377-411頁。
發明概述本發明提供了結合DR5受體的抗體。可選擇地，該抗體為單體、二聚體、三聚體、四聚體或者更高級的寡聚物形式。可選擇地，該抗體是嵌合分子或者融合蛋白，包括與促進寡聚復合物形成的異源肽序列融合的抗體。在一個實施方案中，該抗體抑制Apo-2L與DR5受體的相互作用。可選擇地，該抗體是至少一種Apo-2L相關生物學活性的激動劑，例如通過DR5受體誘導凋亡。
在某些實施方案中，抗DR5抗體包含圖6、7或8中作為CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3提供的一種或多種氨基酸殘基或序列。可選擇地，抗DR5抗體包含與圖6、7或8中稱作CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的那些序列具有至少80％同一性的一種或多種氨基酸序列。在另一些實施方案中，抗DR5抗體可包含與圖6、7或8中稱作CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的那些序列具有至少90％或至少95％同一性的一種或多種氨基酸序列。可選擇地，正如BIAcore結合測定法的測量(諸如下文實施例中所公開的)，本發明的DR5抗體在約0.1nM到約20mM的濃度范圍內結合DR5受體。可選擇地，正如BIAcore結合測定法的測量(諸如下文實施例中所公開的)，本發明的DR5抗體展現約0.6nM到約18mM的Ic50值。
本發明的相關實施方案包括編碼包含一種或多種這類氨基酸序列的抗體的核酸分子。本發明的另一些實施方案包括包含編碼這類抗體的核酸分子的載體以及包含這些載體的宿主細胞(如大腸桿菌)。本發明的其它實施方案包括制備DR5受體抗體的方法，包括如下步驟(a)提供具有如下載體的宿主細胞，該載體包含編碼本發明抗體的核酸序列；(b)提供培養基；(c)在足以表達該抗體的條件下在所述培養基中培養所述宿主細胞；(d)從宿主細胞或培養基回收抗體；并(e)純化該抗體。
本發明的DR5受體抗體可以用本領域知曉的極其多種方法之一修飾。在本發明的優選實施方案中，本發明的抗體與異源分子或多肽序列相連。可選擇地，異源多肽序列是亮氨酸拉鏈結構域。可選擇地，該異源序列包含氨基酸序列甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸。可選擇地，該抗體可與一種或多種接頭分子或多羥基化合物基團(polyol groups)偶聯或連接。
在本發明的某些實施方案中，該抗體阻斷或抑制Apo-2L和DR5之間的相互作用。可選擇地，該抗體在一種或多種哺乳動物細胞中誘導凋亡。
在此還提供了在載體中包含至少一種上述抗體的組合物。優選地，該組合物是無菌的。此外，本發明提供了用于制備上述組合物的方法。在特別期望的實施方案中，所得組合物是藥學上可接受的制劑。
還提供了編碼在此描述的抗體的分離核酸，該核酸可用于如體內或離體基因療法。
本發明的其它實施方案為調節哺乳動物細胞中Apo-2L和/或Apo-2L受體的生物學活性的方法。本發明的一個優選實施方案是在哺乳動物細胞中誘導凋亡的方法，包括將哺乳動物細胞暴露于有效量的在此描述的DR5受體抗體。哺乳動物細胞可以是如癌細胞。在還有一個方面，本發明提供了用于治療哺乳動物中病癥的方法，諸如癌癥或免疫相關病癥，包括可選擇地通過注射或灌注，對哺乳動物施用有效量的本發明提供的DR5受體抗體。可選擇地，所述病癥為癌癥，更具體地為乳房、肺、結腸(或結腸直腸)或神經膠質瘤的癌癥。在此描述的抗體可以單獨或者與另外的試劑聯合施用。
在其它實施方案中，本發明提供了一種試劑盒，其包括裝有在此描述的抗體的容器和使用該抗體的說明書；諸如用該抗體來治療該抗體對其有效的病癥。可選擇地，該病癥是癌癥，更具體地為乳房、肺、結腸(結腸直腸)或神經膠質瘤的癌癥。
本發明的還有一個實施方案是一種產品，其包括裝有在此描述的抗體的容器和使用該抗體的印刷說明書。可選擇地，所述容器是瓶、小瓶、注射器或試管。可選擇地，該產品包括裝有注射用水、鹽水、Ringer氏溶液或右旋糖溶液的第二容器。
具體而言，提供了以權利要求形式列舉的如下實施方案1.分離的抗DR5抗體，包含圖6、7或8所列一種或多種氨基酸序列。
2.分離的抗DR5抗體，包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含可變區，該可變區包含圖6、7或8所列一種或多種氨基酸序列。
3.權利要求2的抗體，其中所述重鏈和輕鏈通過柔性接頭連接形成單鏈抗體。
4.權利要求3的抗體，其是單鏈Fv抗體。
5.權利要求2的抗體，其是Fab抗體。
6.權利要求2的抗體，其完全是人源的。
7.權利要求1或2的抗體，其特異性結合DR5受體而不結合DR4受體、DcR1受體或DcR2受體。
8.權利要求1或2的抗體，其在至少一類哺乳動物癌細胞中誘導凋亡。
9.權利要求1或2的抗體，其阻斷或抑制Apo-2配體結合DR5受體。
10.一種組合物，其包含權利要求1-9任一項的抗體和載體。
11.治療哺乳動物中病癥的方法，包括施用權利要求10的組合物。
12.權利要求11的方法，其中所述病癥是免疫相關病癥。
13.權利要求11的方法，其中所述病癥是癌癥。
附圖簡介

圖1顯示了人Apo-2配體cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO2)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。核苷酸位置447上的“N”用于指示該核苷酸堿基可以是“T”或“G”。
圖2A和2B顯示了全長的人DR4的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。Pan等人，Science，276111(1997)中也報道了人DR4的核苷酸序列和氨基酸序列。
圖3A顯示了1998年11月19日的WO 98/51793中所公開的人DR5的411個氨基酸的序列(SEQ ID NO5)。人DR5的轉錄剪接變體是本領域已知的。這種DR5剪接變體編碼圖3B和3C中所示的人DR5的440個氨基酸的序列(SEQ ID NO6)，如1998年8月20的WO 98/35986中所公開的。
圖4A-F顯示了編碼實施例1中提到的載體pS2072的多核苷酸序列(SEQ ID NO7)。輕鏈和重鏈的各個CDR的編碼序列標有下劃線。
圖5A-G顯示了編碼實施例3中提到的載體pV-0350-2的多核苷酸序列(SEQ ID NO8)。輕鏈和重鏈的各個CDR的編碼序列標有下劃線。
圖6A-C顯示了為從scFv文庫選得的各個克隆指派的I.D.(標識符)(實施例1)以及重鏈CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的各個氨基酸序列(SEQ ID NO9-77)。
圖7顯示了為從scFv文庫選得的各個克隆指派的I.D.(標識符)(實施例2)以及重鏈CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的各個氨基酸序列(SEQID NO78-110)。
圖8顯示了為從Fab文庫選得的各個克隆指派的I.D.(標識符)(實施例3)以及重鏈CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的各個氨基酸序列(SEQID NO111-115)。
圖9圖解了測試Fab抗體BdF2結合人DR5-ECD多肽的ELISA的結果。
圖10顯示了測試Apo2L和Fab抗體BdF2在體外誘導Colo205腫瘤細胞凋亡的能力的AlamarBlue生物測定的結果。
發明詳述A.定義“TNF家族成員”以廣義使用，指在結構或功能上與腫瘤壞死因子(TNF)共享一定相似性的各種多肽。與TNF家族多肽相關的某些結構和功能特征在本領域是已知的，并在例如上面的發明背景中有描述。這類多肽包括但不限于在本領域中稱作TNF-α、TNF-β、CD40配體、CD30配體、CD27配體、OX-40配體、4-1BB配體、Apo-1配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2L/TRAIL(也稱作TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、APRIL、OPG配體(也稱作RANK配體、ODF或TRANCE)、和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)的那些(參見例如Gruss和Dower，Blood 1995，853378-3404；Pitti等人，J.Biol.Chem.1996，27112687-12690；Wiley等人，Immunity 1995，3673-682；Browning等人，Cell1993，72847-856；Armitage等人，Nature 1992，35780-82；PCT公開號WO 97/01633；和WO 97/25428；Marsters等人，Curr.Biol.1998，8525-528；Chicheportiche等人，Biol.Chem.1997，27232401-32410；Hahne等人，J.Exp.Med.1998，1881185-1190；PCT公開號WO 98/28426；WO 98/46751；和WO 98/18921；Moore等人，Science 1999，285260-263；Shu等人，J.Leukocyte Biol.1999，65680；Schneider等人，J.Exp.Med.1999，1891747-1756；Mukhopadhyay等人，J.Biol.Chem.1999，27415978-15981)。
“DR5受體抗體”、“DR5抗體”或“抗DR5抗體”以廣義使用，指結合至少一種形式的DR5受體的抗體。可選擇地，DR5抗體與異源序列或分子融合或連接。優選地，異源序列容許或輔助抗體形成更高等級或寡聚復合物。可選擇地，DR5抗體結合DR5受體但不結合任何其它Apo-2L受體(例如DR4、DcR1或DcR2)或者不與其發生交叉反應。可選擇地，該抗體是DR5信號傳導活性的激動劑。
可選擇地，根據BIAcore結合分析(諸如例如下面的實施例中所公開的)的測量，本發明的DR5抗體在約0.1nM到約20mM的濃度范圍內結合DR5受體。可選擇地，根據BIAcore結合分析(諸如例如下面的實施例中所公開的)的測量，本發明的DR5抗體展示約0.6nM到約18mM的Ic50值。
術語“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”在此用于指包含圖1所示氨基酸序列的氨基酸殘基114-281(含)、殘基95-281(含)、殘基92-281(含)、殘基91-281(含)、殘基41-281(含)、殘基15-281(含)或殘基1-281(含)的多肽序列，以及上述序列的生物學活性片段、刪除、插入或替代變體。在一個實施方案中，多肽序列包含圖1的殘基114-281，且可選擇地，由圖1的殘基114-281組成。可選擇地，多肽序列包括圖1的殘基92-281或殘基91-281。Apo-2L多肽可以由圖1所示天然核苷酸序列所編碼。可選擇地，編碼圖1殘基Pro119的密碼子可以是“CCT”或“CCG”。在其它實施方案中，片段或變體具有生物學活性，且與任一上述Apo2L/TRAIL序列具有至少80％氨基酸序列同一性，更優選至少約90％序列同一性，甚至更優選至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。可選擇地，Apo2L/TRAIL多肽由在嚴格條件下與圖1中所提供的編碼多核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼。該定義涵蓋Apo2L/TRAIL的替代變體，其中其至少一個天然氨基酸用丙氨酸殘基替代。具體的Apo2L/TRAIL替代變體包括其中至少一個氨基酸用丙氨酸殘基替代的那些。這些替代變體包括鑒定為例如“D203A”、“D218A”和“D269A”的那些。此命名法用于鑒別Apo2L/TRAIL變體，其中位置203、218和/或269(采用圖1所示的編號)上的天冬氨酸殘基用丙氨酸殘基替代。可選擇地，Apo2L變體可包含已公開的PCT申請WO 01/00832的表I中描述的一個或多個丙氨酸替代。替代變體包含2001年1月4日公開的WO 01/00832的表I中鑒定的一個或多個殘基替代。該定義還涵蓋從Apo2L/TRAIL來源分離的或者通過重組或合成方法制備的天然序列Apo2L/TRAIL。本發明的Apo2L/TRAIL包括在PCT公開號WO 97/01633和WO 97/25428中揭示的稱作Apo2L/TRAIL或TRAIL的多肽。術語“Apo2L/TRAIL”或“Apo2L”一般用于指Apo2L/TRAIL的形式，包括多肽的單體、二聚體或三聚體形式。除非特別指出，Apo2L序列中提及的所有氨基酸殘基編號采用按照圖1的編號。例如，“D203”或“Asp203”指在圖1提供的序列中位置203上的天冬氨酸殘基。
術語“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”指Apo2L/TRAIL的形式，基本上不含跨膜域和胞質域。通常，ECD具有少于1％的所述跨膜域和胞質域，且優選具有少于0.5％的所述結構域。應當理解，所鑒定的本發明多肽的任何跨膜域是按照本領域常規用來鑒定那種類型的疏水結構域的標準而鑒定的。跨膜域的精確邊界可以變化，但最可能在最初鑒定的結構域的任一末端不超過約5個氨基酸。在優選的實施方案中，ECD由該多肽的可溶性胞外域序列組成，不含跨膜域和胞質或胞內域(且不與膜結合)。具體的Apo-2L/TRAIL胞外域序列公開在PCT公開號WO 97/01633和WO97/25428中。
術語“Apo2L/TRAIL單體”或“Apo2L單體”指Apo2L的胞外域的共價鏈。
術語“Apo2L/TRAIL二聚體”或“Apo2L二聚體”指通過二硫鍵以共價連接相連的兩個Apo-2L單體。在此所用的術語包括游離存在的Apo2L二聚體和存在于Apo2L三聚體形式中的Apo2L二聚體(即與另一個、第三個Apo2L單體結合)。
術語“Apo2L/TRAIL三聚體”或“Apo2L三聚體”指非共價結合的三個Apo2L單體。
術語“Apo2L/TRAIL集合物(aggregate)”用于指自我結合的較高寡聚物形式的Apo2L/TRAIL，諸如Apo2L/TRAIL三聚體，其形成例如六聚體和九聚體形式的Apo2L/TRAIL。可以采用本領域知曉的方法和分析(并使用可購買到的材料)，諸如天然大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸鈉的變性大小排阻(“SDS-SEC”)、反相HPLC和毛細管電泳，測定Apo2L/TRAIL單體、二聚體或三聚體(或其它集合物)的存在與數量。
“Apo-2配體受體”包括本領域稱為“DR4”和“DR5”的受體，其多核苷酸和多肽序列分別示于圖2和3。Pan等人描述了稱作“DR4”的TNF受體家族成員(Pan等人，Science，276111-113(1997)；還可參見1998年7月30日公開的WO 98/32856；1999年7月29日公開的WO 99/37684；2000年12月7日公開的WO 00/73349；2002年8月13日公布的US 6,433,147；2002年10月8日公布的US 6,461,823；和2002年1月29日公布的US 6,342,383)。有報道，DR4受體含有胞質死亡結構域，它能啟動使細胞自殺的裝置。Pan等人揭示，認為DR4是稱作Apo2L/TRAIL的配體的受體。Sheridan等人，Science，277818-821(1997)和Pan等人，Science，277815-818(1997)描述了Apo2L/TRAIL的另一種受體。(還可參見1998年11月19日公開的WO 98/51793；1998年9月24日公開的WO 98/41629)。此受體稱作DR5(該受體還選擇性地稱作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER；Screaton等人，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17141-143(1997)；1998年8月20日公開的WO 98/35986；1998年10月14日公開的EP 870,827；1998年10月22日公開的WO 98/46643；1999年1月21日公開的WO 99/02653；1999年2月25日公開的WO 99/09165；1999年3月11日公開的WO 99/11791；2002年8月13日公開的US 2002/0072091；2001年12月7日公開的US 2002/0098550；2001年12月6日公布的US 6,313,269；2001年8月2日公開的US 2001/0010924；2003年7月3日公開的US2003/01255540；2002年10月31日公開的US 2002/0160446；2002年4月25日公開的US 2002/0048785；2003年5月27日公布的US 6,569,642；2000年6月6日公布的US 6,072,047；2003年11月4日公布的US 6,642358)。與DR4一樣，報道DR5含有胞質死亡結構域且能夠發出信號誘導凋亡。如上所述，Apo-2L的其它受體包括DcR1、DcR2和OPG(參見Sheridan等人，同上文；Marsters等人，同上文；和Simonet等人，同上文)。在此所用時術語“Apo-2L受體”涵蓋天然序列受體和受體變體。這些術語涵蓋在多種哺乳動物中表達的Apo-2L受體，包括人。Apo-2L受體可以是內源表達的，如在多種人組織譜系中天然發生，或者可以是通過重組或合成方法表達的。“天然序列Apo-2L受體”包括與衍生自自然界的Apo-2L受體具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列Apo-2L受體可以具有來自任何哺乳動物的天然存在Apo-2L受體的氨基酸序列。這類天然序列Apo-2L受體可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段生產。術語“天然序列Apo-2L受體”具體涵蓋天然存在的截短或分泌形式的受體(例如含有例如胞外域序列的可溶形式)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位基因變體。受體變體可以包括天然序列Apo-2L受體的片段或刪除突變體。圖3A顯示了1998年11月19日的WO 98/51793中公開的人DR5的411個氨基酸的序列。人DR5的轉錄剪接變體在本領域是已知的。此DR5剪接變體編碼圖3B和3C所示人DR5的440個氨基酸的序列，如1998年8月20日的WO 98/35986中所公開的。下面的表9也提供了DR5和DR5融合蛋白的多肽序列。
術語“拮抗劑”以廣義使用，包括在體外、原位或在體內部分或完全阻斷、抑制或中和Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一種或多種生物學活性的任何分子。Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的這類生物學活性的例子包括Apo2L/TRAIL結合DR4或DR5，誘導凋亡，以及文獻中報道的其它活性。拮抗劑可以直接或間接方式起作用。例如，拮抗劑可以在體外、原位或在體內由于其直接結合DR4或DR5的結果起作用而部分或完全阻斷、抑制或中和Apo2L/TRAIL的一種或多種生物學活性。拮抗劑還可以在體外、原位或在體內由于例如阻斷或抑制另一種效應分子的結果間接起作用而部分或完全阻斷、抑制或中和Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一種或多種生物學活性。拮抗劑分子可包括“雙重”拮抗劑活性，其中該分子能夠部分或完全阻斷、抑制或中和Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的生物學活性。
術語“激動劑”以廣義使用，包括在體外、原位或在體內部分或完全增強、刺激或激活Apo2L/TRAIL、DR4或DRS的一種或多種生物學活性的任何分子。這類生物學活性的例子包括Apo2L/TRAIL結合DR4或DR5，凋亡，以及文獻中報道的其它活性。激動劑可以直接或間接方式起作用。例如，激動劑可以在體外、原位或在體內由于其直接結合DR4或DR5從而引起受體活化或信號轉導的結果起作用而部分或完全增強、刺激或激活DR4或DR5的一種或多種生物學活性。激動劑還可以在體外、原位或在體內由于例如刺激另一種效應分子繼而引起DR4或DR5活化或信號轉導的結果間接起作用而部分或完全增強、刺激或激活DR4或DR5的一種或多種生物學活性。設想激動劑可作為間接起作用來增強或提高DR4或DR5活化或活性的增強分子。例如，激動劑可以增強哺乳動物中內源Apo-2L的活性。這可通過例如預復合DR4或DR5或者通過穩定各自配體與DR4或DR5受體的復合物(諸如穩定Apo-2L與DR4或DR5之間形成的天然復合物)來完成。
術語“標記的(tagged)”用于此時指包含與“標簽多肽(tag polypeptide)”融合的抗體或多肽的嵌合分子。該標記多肽具有足夠殘基以提供針對其可制備抗體的表位，或者提供一些其它功能，諸如寡聚化能力(例如具有亮氨酸拉鏈結構域的肽所產生的)，但又足夠短，使得其通常不干擾抗體或多肽的活性。標記多肽優選還是相當獨特的(unique)，使得標簽特異性抗體基本上不與其它表位發生交叉作用。合適的標簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基且通常在約8個到約50個氨基酸殘基之間(優選在約10個到約20個殘基之間)。
術語“二價金屬離子”指具有兩個正電荷的金屬離子。二價金屬離子的例子包括但不限于鋅、鈷、鎳、鎘、鎂和錳。可采用的這類金屬的具體形式包括鹽形式(例如藥學上可接受的鹽形式)，諸如氯化物、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽形式的上面提及的二價金屬離子。可選擇地，用于本發明的二價金屬離子為鋅，且優選鹽形式、硫酸鋅或氯化鋅。
在用于描述在此公開的各種肽或蛋白質時，“分離的”指已經鑒定且與其天然環境的一種成分分開和/或回收的肽或蛋白質。其天然環境的雜質成分是通常會干擾該肽或蛋白質的診斷或治療用途的物質，包括酶、激素和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，肽或蛋白質將純化至(1)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，(2)通過使用考馬斯藍或優選銀染的非還原或還原條件下的SDS-PAGE達到同質，或(3)通過質譜或肽作圖技術達到同質。既然其天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的材料包括重組細胞內的原位肽或蛋白質。然而，通常，分離的肽或蛋白質將通過至少一個純化步驟來制備。
至于在此鑒定的序列的“氨基酸序列同一性百分率(％)”定義為根據需要在進行序列對比和導入缺口以獲得最大序列同一性百分率后，且不將任何保守替代視為部分序列同一性時，候選序列中與參比序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為了測定氨基酸序列同一性百分率而進行的對比可以本領域技術范圍內的、能夠確定用于測量對比的合適參數的多種方式來實現，包括獲得所比較全長序列的最大對比所需要的賦值算法。為此，可以采用序列比較計算機程序ALIGN-2來獲得氨基酸同一性百分率，ALIGN-2由Genentech有限公司編寫，源代碼已經與用戶文件一起以美國版權登記號TXU510087提交給美國版權局(華盛頓特區，20559)。公眾可以通過Genentech有限公司(South San Francisco，CA)來獲得ALIGN-2程序。ALIGN-2程序設定了所有的序列比較參數且不再改變。
雜交反應的“嚴格性”很容易由本領域普通技術人員確定，且通常根據探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經驗計算。通常，較長的探針需要較高的溫度以恰當退火，而較短的探針要求較低的溫度。雜交通常依賴于當互補鏈存在于解鏈溫度以下的環境中時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同一性程度越高，可采用的相對溫度也越高。結果，由此推斷較高的相對溫度將趨向于使反應條件更為嚴格，而較低的溫度也就較不嚴格。對于雜交反應嚴格性的其它細節和解釋，參見Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
在此定義的“高嚴格條件”如下確定(1)使用低離子強度和高溫進行洗滌；在50℃使用0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交過程中使用變性劑；在42℃使用含0.1％牛血清清蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉的pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液；或(3)在42℃使用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5x Denhardt氏溶液、超聲波處理的鮭魚精DNA(50ug/ml)、0.1％SDS和10％硫酸右旋糖苷，在42℃在0.2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中和在55℃在50％甲酰胺中洗滌，接著在55℃用含EDTA的0.1x SSC進行高嚴格性洗滌。
“中等嚴格條件”可以如Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989所述確定，包括在37℃在含20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)，5x Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過夜，接著在約37-50℃在1x SSC中洗滌濾膜。熟練技術人員將認識到如何根據需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度等因素。
術語“調控序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱子序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。
當一條核酸與另一條核酸序列處于功能性相互關系中時，則它是“可操作連接的”。例如，若前序列或分泌前導序列的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接”指DNA序列鄰近相連，且在分泌前導序列的情況中指鄰近且以讀碼狀態相連。然而，增強子不必鄰近。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接反應來完成。如果沒有這些位點，那么使用與常規實踐一致的合成寡核苷酸銜接頭或接頭。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”指由細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上的結合抗體，隨后促使靶細胞溶解。介導ADCC的初級細胞NK細胞只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92，1991第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC分析，諸如美國專利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于這類分析的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，PNAS(USA)95652-656，1998中所公開的。
“人效應細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應物功能的白細胞。優選地，該細胞至少表達FcγRIII并執行ADCC效應物功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；優選PBMC和NK細胞。
術語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區結合的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是與IgG抗體結合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括Fcγ則IA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區別主要在于它們的胞質域。激活受體FcγRIIA在其胞質域中包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見Daёron，Annu.Rev.Immunol.15203-234，1997)。FcR的綜述參見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92，1991；Capel等人，Immunomethods425-34，1994；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126330-41，1995。)術語“FcR”在此涵蓋其它FcR，包括未來將會鑒定的那些。該術語還包括新生兒受體FcRn，它負責將母體的IgG轉移給胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117587，1976和Kim等人，J.Immunol.24249，1994)。FcR在此包括多態性，諸如編碼FcγRIIIa的基因中導致氨基酸位置158或為苯丙氨酸(F)或為纈氨酸(V)的遺傳二態性，該位置位于受體中結合IgG1的區域。已經證明，純合的纈氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)相對于純合的苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或雜合的FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F/V)受體，在體外對人IgG1具有較高的親和力并介導升高的ADCC。
“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指在存在補體時分子溶解靶的能力。補體激活途徑是由補體系統第一組分(Clq)結合與關聯抗原復合的分子(如抗體)起始的。為了評估補體激活，可進行CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202163，1996中所描述的。
術語“抗體”在此以最廣義使用，具體覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展示所需生物學活性。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優選包含其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變區(VH)，接著是多個恒定區。每條輕鏈在一端具有一個可變區(VL)，而另一端是一個恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一個恒定區排列在一起，而輕鏈的可變區與重鏈的可變區排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區之間形成界面。
術語“可變的”指可變區中的某些部分在不同抗體的序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變區。它集中于輕鏈和重鏈可變區中稱作高變區或互補決定區的三個區段。可變區中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區都包含四個FR，它們大多采取β-折疊構象，通過形成環狀連接且在某些情況中形成β-折疊結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定區不直接涉及抗體與抗原的結合，但展示多種效應物功能，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱作“Fab”片段，各自具有一個抗原結合位點，和一個殘余“Fc”片段，其名稱反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F(ab′)2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能使抗原交聯。
“Fv”是包含完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區域由緊密、非共價結合的一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的二聚體組成。正是在這種構造中，每個可變區的三個高變區相互作用而在VH-VL二聚體的表面上確定了一個抗原結合位點。六個高變區共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單一可變區(或只包含對抗原特異的三個高變區的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，盡管親和力低于完整的結合位點。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區和重鏈的第一恒定區(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結構域的羧基末端增加了少數殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。在此Fab’-SH是其中恒定區的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學偶聯。
來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據其恒定區的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作κ和λ。
根據其重鏈恒定區的氨基酸序列，可將抗體歸入不同的類別。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。將與不同抗體類別對應的重鏈恒定區分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在于一條多肽鏈上。優選地，該Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結合所需的結構。關于scFv的綜述參見Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。
術語“雙抗體(diabodies)”指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對，并產生兩個抗原結合位點。雙抗體更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993。
術語“單克隆抗體”在用于此時指由基本上同質的抗體群獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了通常以極少量存在的可能的天然存在突變以外。單克隆抗體是高度特異的，即針對單一抗原位點。另外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體制品不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優越性體現在可以通過雜交瘤培養合成它們而不受其它抗體的污染。修飾語“單克隆”指示抗體由基本上同質的抗體群獲得的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產抗體。例如，依照本發明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等人，Nature 256495，1975描述的雜交瘤法來制備，或者可通過重組DNA法來制備(參見例如美國專利4,816,567)。“單克隆抗體”還可使用例如Clackson等人，Nature 352624-628，1991和Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597，1991中描述的技術由噬菌體抗體庫分離。
在此的單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們展示所需生物學活性(美國專利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855，1984)。在此感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變區抗原結合序列及人恒定區序列的“靈長類化(primatized)”抗體(美國專利5,693,780)。
非人源(如鼠源)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人源免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區殘基替代的免疫球蛋白。在有些情況中，將人源免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人源殘基替代。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個、通常兩個如下可變區，其中所有或基本上所有的高變環對應于非人源免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常是人源免疫球蛋白的恒定區。更多細節參見Jones等人，Nature 321522-525，1986；Riechmann等人，Nature 332323-329，1988；及Presta，Curr Op.Struct.Biol.2593-596，1992。
術語“高變區”在用于此時指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重鏈可變區中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或來自“高變環”的殘基(例如輕鏈可變區中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重鏈可變區中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917，1987)。“框架”或“FR”殘基指在此定義的高變區殘基以外的可變區殘基。
“結合”目的抗原如DR5受體的抗體指能夠以足夠親和力和/或親合力結合抗原的抗體，使得該抗體可用作治療劑或診斷劑，用于靶向表達該抗原的細胞。
為了本發明的目的，“免疫療法”指用抗體處理哺乳動物(優選人類患者)的方法，其中抗體可以是未偶聯的或“裸露的”抗體，或者抗體可以與異源分子或試劑偶聯或融合，諸如一種或多種胞毒劑，從而產生“免疫偶聯物”。
“分離的”抗體指已經鑒別并由其天然環境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環境的雜質成分指將會干擾抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據Lowry法的測定，抗體重量超過95％，最優選重量超過99％，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)通過使用考馬斯藍或優選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達到同質。既然抗體的天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，通常，分離的抗體將通過至少一個純化步驟來制備。
表述“治療有效量”指有效預防、改善或治療所研究疾病或疾患的DR5抗體數量。
術語“細胞因子”指由一種細胞群釋放的、作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白質的通稱。這類細胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；Mullerian氏抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-1 3、IL-17；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于此時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質和天然序列細胞因子的生物學活性等效物。
術語“胞毒劑”在用于此時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意欲包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化療劑、和毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，或其片段。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑，諸如噻替哌(thiotepa)和環膦酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物拓撲替康(topotecan))、苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素I1(參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186，1994))；蒽環類(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸鹽(bisphosphonate)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉霉素、放線菌素、氨茴霉素、氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(Adriamycin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素諸如絲裂霉素C、霉酚酸、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine、)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡內酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美坦西醇(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoids))，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE， -Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)(Gemzar)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿(vincristine)；長春瑞賓(vinorelbine)(Navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質的制藥學可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括承擔調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括Nolvadex)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTONTM)；抑制調節腎上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MegaseTM)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RivisorTM)、來曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿納托唑(anastrozole)(ArimidexTM)；及抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何物質的制藥學可接受的鹽、酸或衍生物。
“生長抑制劑”在用于此時指在體外或在體內抑制細胞，尤其是過表達在此鑒定的任何基因的癌細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期過表達這類基因的細胞百分比的試劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的試劑，諸如誘導G1停滯和M期停滯的試劑。經典的M期阻斷劑包括長春花生物堿類(長春新堿和長春堿)、紫杉醇、和拓撲異構酶II抑制劑諸如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素。那些阻滯G1的試劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑諸如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、雙氯乙基甲胺、順鉑、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可參見Mendelsohn和Israel編的《The Molecular Basis of Cancer》中，Murakami等人著的第1章，題為“Cellcycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，W B Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13頁。
“有生物學活性的”或“生物學活性”用于在此的目的時指(a)單獨作為單一試劑或者與另一種試劑諸如化療劑組合，具有在至少一類哺乳動物癌細胞或受病毒感染的細胞中，在體內或者離體誘導或刺激或抑制凋亡的能力，(b)能夠結合和/或刺激DR5受體；或(c)具有天然或天然存在Apo2L/TRAIL多肽的有些活性。用于測定生物學活性的分析可以用本領域知曉的方法進行，諸如DNA片段化(參見例如Marsters等人，Curr.Biology，61669(1996))、胱天蛋白酶滅活、DR5結合(參見例如1998年11月19日公開的WO 98/51793)以及PCT公開號WO 97/01633、WO 97/25428、WO01/00832和WO 01/22987中描述的分析方法。
術語“凋亡”和“凋亡活性”以廣義使用，指哺乳動物中有序或受控形式的細胞死亡，通常伴隨著一種或多種特征性細胞變化，包括細胞質濃縮、質膜微絨毛喪失、細胞核節段化、染色體DNA降解或線粒體功能喪失。例如可以通過本領域知曉的細胞活力分析(例如Alamar藍分析或MTT分析)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA片段化(參見例如Nicoletti等人，J.Immunol.Methods，139271-279(1991))，以及多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、分裂分析來測定和測量這種活性。
如用于此，術語“紊亂”一般指將會從在此描述的組合物處理中獲益的任何疾患，包括可用有效量的DR5抗體處理的任何疾病或紊亂。這包括慢性和急性病癥，以及那些使哺乳動物趨向于所討論紊亂的病理狀況。待治療紊亂的非限制性例子包括良性和惡性癌癥；炎性、血管發生性和免疫學紊亂、自身免疫性紊亂、關節炎(包括類風濕性關節炎)、多發性硬化及HIV/AIDS。
術語“癌癥”、“癌性”或“惡性”指或描述哺乳動物中通常特征在于細胞生長失調的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、白血病、母細胞瘤和肉瘤。這類癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜瘤、腎癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲狀腺癌、成神經細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌和頭頸癌。
術語“免疫相關疾病”指哺乳動物中哺乳動物免疫系統成分引起、介導、或以其它方式促成發病的疾病。還包括刺激或干預免疫應答對疾病發展具有改善作用的疾病。該術語包括自身免疫病、免疫介導的炎性疾病、非免疫介導的炎性疾病、傳染病和免疫缺陷病。可依照本發明處理的免疫相關和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T細胞介導的，包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、脊椎關節病、系統性硬化病(硬皮病)、特發性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏綜合征、系統性血管炎、結節病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細胞減少癥、陣發性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少癥(特發性血小板減少性紫癜、免疫介導的血小板減少癥)、甲狀腺炎(格雷夫斯氏病、橋本氏甲狀腺炎、幼年型淋巴細胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質性腎炎)、中樞和周圍神經系統的脫髓鞘病諸如多發性硬化病、特發性脫髓鞘多神經病或格-巴二氏綜合征、和慢性炎性脫髓鞘多神經病、肝膽病諸如傳染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病諸如炎性腸病(潰瘍性結腸炎克羅恩氏病)、麩膠敏感性腸病、和惠普爾氏病、自身免疫性或免疫介導的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、銀屑病、變應性疾病諸如哮喘、變應性鼻炎、特應性皮炎、食物超敏反應和蕁麻疹、肺的免疫學疾病諸如嗜曙紅細胞性肺炎、特發性肺纖維化和超敏感性肺炎、移植相關疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。傳染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、細菌感染、真菌感染、原生動物感染和寄生蟲感染。
“自身免疫病”在此以廣泛的、一般的含義使用，指哺乳動物中因個別哺乳動物對其自身組織成分的體液或細胞免疫應答而發生破壞正常或健康組織的紊亂或疾患。例子包括但不限于紅斑狼瘡、甲狀腺炎、類風濕性關節炎、銀屑病、多發性硬化病、自身免疫性糖尿病和炎性腸病(IBD)。
術語“治療”和“療法”在用于此時指治療性療法、預防性療法和防止性療法。連續處理或施藥指在至少一天基礎上進行一天或數天而無間斷的處理。間歇處理或施藥，或間歇方式的處理或施藥指不連續的處理，但是實質上是循環的。
術語“哺乳動物”在用于此時指歸入哺乳類的任何哺乳動物，包括人、牛、馬、犬和貓。在本發明的一個優選實施方案中，哺乳動物是人。
在本申請中，除非另外特別指出，單數的使用包括復數。
B.本發明的例示性材料和方法在此描述的本發明涉及結合DR5受體的抗體。可選擇地，該抗體是抑制Apo-2L與DR5相互作用的拮抗劑。可替代地，該抗體是DR5信號傳導活性的激動劑。
在此描述了用于生成本發明DR5抗體的方法。用于生產或篩選抗體的抗原可以是如可溶形式的抗原或其含有期望表位的部分。可替代地，或者另外地，在細胞表面表達抗原的細胞可用于生成或篩選抗體。可用于生成抗體的其它形式的抗原對于本領域技術人員來說是顯然的。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優選通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑來生成。使用雙功能劑或衍生劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關抗原與在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白質偶聯可能是有用的，如匙孔戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過將例如100μg或5μg蛋白質或偶聯物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將溶液皮內注射于多個部位，由此將動物針對抗原、免疫原性偶聯物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯物初始量的1/5-1/10對動物進行強化。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體效價。對動物進行強化直到效價達到穩定。優選的是，將動物用相同抗原的但與不同蛋白質和/或通過不同交聯劑偶聯得到的偶聯物進行強化。偶聯物還可在重組細胞培養物中作為蛋白質融合物來制備。此外，適當使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫反應。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由基本上同質的抗體群獲得的，即構成群體的各個抗體相同，除了通常以極少量存在的可能的天然存在突變以外。如此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征即不是分立的抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature 256495，1975描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引發生成或能夠生成特異結合用于免疫的蛋白質的抗體的淋巴細胞。或者，可在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，《MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。
將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，該培養基優選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，那么雜交瘤培養基通常將含有阻止缺乏HGPRT的細胞生長的次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)。
優選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持選擇的抗體生成細胞穩定的高水平生成抗體、并對諸如HAT培養基等培養基敏感的骨髓瘤細胞。在這些細胞中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如可從Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California USA)獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，及可從American Type Culture Collection(Manassas，Virginia USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞。用于生成人源單克隆抗體的人源骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.1333001，1984；Brodeur等人，《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》，51-63，Marcel Dekker Inc.，New York，1987)。
可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優選的是，通過免疫沉淀或通過體外結合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。
單克隆抗體的結合親和力可通過例如Munson等人，Anal.Biochem.107220，1980的Scatchard分析來測定。
在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，該克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，并使用標準方法進行培養(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。適于這一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內培養。
可通過常規免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水或血清適當分離。
編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規流程分離并測序(例如使用能夠特異結合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞用作這類DNA的優選來源。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉染到宿主細胞中，諸如不另外產生免疫球蛋白的大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.5256-262，1993和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188，1992。
在另一個實施方案中，可從使用McCafferty等人，Nature 348552-554，1990中描述的技術構建的噬菌體抗體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature 352624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.222581-597，1991分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。后續出版物描述了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology 10779-783，1992)，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.212265-2266，1993)，生成高親和力(nM范圍)的人源抗體。如此，這些技術是用于分離單克隆抗體的常規單克隆抗體雜交瘤技術的可行替換方法。下面的實施例部分更加詳細地描述了用于鑒定本發明DR5抗體的其它噬菌體展示技術。
在某些實施方案中，可以將輕鏈和重鏈可變區的互補決定區(CDR)移植到來自相同或另一物種的框架區(FR)中。在某些實施方案中，可以將輕鏈和重鏈可變區的CDR移植到共有的人FR中。在某些實施方案中，為了產生共有的人FR，將來自多種人源重鏈或輕鏈氨基酸序列的FR進行比對以鑒定共有氨基酸序列。在某些實施方案中，所移植可變區可以與來源抗體的恒定區不同的恒定區一同使用。在某些實施方案中，所移植的可變區是單鏈Fv抗體的一部分。美國專利6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中描述了CDR移植。
還可以修飾DNA，例如通過替代即用人源重鏈和輕鏈恒定區的編碼序列代替同源鼠源序列(美國專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 816851，1984)，或通過共價接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列。
通常，用這類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變區，以產生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點及對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。
(iii)人源化抗體本領域已經描述了用于將非人源抗體人源化的方法。優選的是，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人源氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區。人源化可本質上依照Winter及其同事的方法進行(Jones等，Nature 321522-525，1986；Riechmann等，Nature 332323-327，1988；Verhoeyen等，Science 2391534-1536，1988)，通過用高變區序列替代人源抗體的相應序列。因此，這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中基本上少于整個人源可變區用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些高變區殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基所替代的人源抗體。
用于制備人源化抗體的人源可變區的選擇，包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性非常重要。根據所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區序列對已知的人源可變區序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人源序列作為人源化抗體的人源框架區(FR)(Sims等，J.Immunol.1512296，1993；Chothia等，J.Mol.Biol.196901，1987)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞群的所有人源抗體的共有序列衍生的特定框架區。同一框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 894285，1992；Presta等，J.Immunol.1512623，1993)。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力以及其它有利的生物學特性。為了實現這一目的，依照一種優選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的方法來制備人源化抗體。通常可獲得三維免疫球蛋白模型，且為本領域熟練技術人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。通常，高變區殘基直接且最實質的涉及對抗原結合的影響。
(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人源抗體。例如，現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況中能夠在免疫后生成人源抗體完整全集的轉基因動物(如小鼠)。例如，已經描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在這類種系突變小鼠中轉移大量人源種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊后生成人源抗體。參見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551，1993；Jakobovits等，Nature 362255-258，1993；Bruggermann等，Year in Immuno.733，1993；和美國專利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(McCafferty等，Nature 348552-553，1990)可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區基因全集生成人源抗體和抗體片段。根據這一技術，將抗體V區基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼顯示那些特性的抗體基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；有關綜述參見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3564-571，1993。V基因區段的數種來源可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352624-628，1991從衍生自免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體。可本質上依照Marks等，J.Mol.Biol.222581-597，1991或Griffith等，EMBOJ.12725-734，1993描述的技術，由未免疫人供體構建V基因全集，并分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利5,565,332和5,573,905。
(v)抗體片段已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto等，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24107-117，1992和Brennan等，Science 22981，1985)。然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體文庫分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段，并通過化學偶聯形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10163-167，1992)。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab′)2片段。用于生成抗體片段的其它技術對熟練技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如美國專利5,641,870中描述的抗體。這類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。可將雙特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
用于制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生成是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature 305537-539，1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤quadromas)生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化非常麻煩，且產量低。WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.103655-3659，1991中公開了類似的方法。
根據一種不同的方法，將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恒定區序列融合。融合優選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恒定區。優選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恒定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉染到合適的宿主生物體中。在用于構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達導致高產量時或在該比率沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在本方法的一個優選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發現這種不對稱結構促進所需雙特異性復合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法公開于WO94/04690。關于制備雙特異性抗體的其它細節參見例如Suresh等，Methods inEnzymology 121210，1986。
根據美國專利5,731,168中描述的另一種方法，可改造抗體分子對之間的界面，將從重組細胞培養物中回收的異型二聚體的百分比最大化。優選的界面包含至少部分CH3抗體恒定區。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側鏈，在第二抗體分子的界面上產生針對大側鏈的相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產物諸如同型二聚體提高異型二聚體產量的機制。
雙特異性抗體包括交聯或“異源偶聯”抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，這類抗體建議用于將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利4,676,980)，及用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交聯方法制備異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域所熟知的，且連同許多交聯技術一起公開于美國專利4,676,980。
文獻中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學鍵合制備雙特異性抗體。Brennan等，Science 22981，1985；Shalaby等人，J.Exp.Med.175217-225，1992。
還描述了從重組細胞培養物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生產出雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553，1992。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接。抗體同型二聚體在鉸鏈區還原，形成單體，然后重新氧化，形成抗體異型二聚體。該方法還可用于生產抗體同型二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993描述的“雙抗體”技術提供了制備雙特異性抗體片段的替換機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結構域不得不與另一個片段上的互補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J.Immunol.1525368，1994。
設想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760，1991。WO 01/77342(Miller和Presta)中描述了具有三個或更多抗原結合位點的抗體，在此明確引入作為參考。
任選將在此方法中所使用的或產品中所包含的抗體與胞毒劑偶聯。
上文已經描述了可用于生成這類抗體-胞毒劑偶聯物的化療劑。
在此還設想了抗體與一種或多種小分子毒素形成的偶聯物，諸如加利車霉素、美登素(美國專利5,208,020)、單端孢菌素和CC1065。在本發明的一個實施方案中，將抗體與一個和多個美登素分子偶聯(如每個抗體分子偶聯約1個至約10個美登素分子)。例如可將美登素轉化為May-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經修飾抗體反應(Chari等，Cancer Research 52127-131，1992)產生美登木素生物堿-抗體偶聯物。
或者，將抗體與一個或多個加利車霉素分子偶聯。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素的結構類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等，Cancer Research 533336-3342，1993和Lode等，Cancer Research 582925-2928，1998)。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白質(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin)和單端孢菌毒素類(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日出版的WO 93/21232。
本發明還設想了與具有核酸水解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)偶聯的拮抗劑。
有多種放射性同位素可用于生成放射性偶聯拮抗劑或抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體和胞毒劑的偶聯物，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等，Science 2381098，1987中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與拮抗劑或抗體偶聯的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52127-131，1992)。
或者，可通過例如重組技術或肽合成法來制備包含抗體和胞毒劑的融合蛋白。
還可將本發明的抗體與前體藥物活化酶偶聯，后者將前體藥物(如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉化為活性抗癌藥。參見例如WO 88/07378和美國專利4,975,278。
這類偶聯物的酶成分包括能夠以這樣一種方式作用于前體藥物從而將其轉化為更具有活性的細胞毒性形式的任何酶。
可用于本發明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽的前體藥物轉化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽的前體藥物轉化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可將無毒5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉化為游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可轉化含D-氨基酸替代的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉化為游離藥物的碳水化合物切割酶類，諸如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；可將β-內酰胺衍生的藥物轉化為游離藥物的β-內酰胺酶；及可將在其氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的藥物轉化為游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗體，本領域也稱作“抗體酶”，將本發明的前體藥物轉化為游離的活性藥物(參見例如Massey，Nature 328457-458，1987)。可如此處所述制備抗體-抗體酶偶聯物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細胞群。
可通過本領域眾所周知的技術將本發明的酶與抗體共價結合，諸如使用上文討論的異雙功能交聯劑。或者，可使用本領域眾所周知的重組DNA技術構建包含與本發明酶的至少功能活性部分連接的本發明抗體的至少抗原結合區的融合蛋白(參見例如Neuberger等，Nature 312604-608，1984)。
在此還設想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質聚合物中的一種連接，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5,739,277中所述將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于此處時，術語“補救受體結合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區中負責延長IgG分子體內血清半衰期的表位。或者/另外，可通過改變抗體Fc區的氨基酸序列，生成FcRn結合改變的變體，來延長或縮短血清半衰期。WO 00/42072(Presta，L.)中描述了FcRn結合和/或血清半衰期改變的抗體。
可通過聚合來穩定本發明的抗體。這可通過直接或間接地用多功能交聯劑使單體鏈交聯，經由多功能聚合物來實現。通常，用雙功能交聯劑使兩個基本上相同的多肽在其C-或N-末端交聯。該試劑用于使末端氨基和/或羧基交聯。一般，使兩個末端羧基或者兩個末端氨基彼此交聯，盡管通過選擇合適的交聯劑，將一條多肽的α氨基與另一條多肽的末端羧基交聯。優選的是，用半胱氨酸替代該多肽的C-末端。在本領域眾所周知的條件下，可在末端半胱氨酸之間形成二硫鍵，從而使多肽鏈交聯。例如，通過金屬催化的游離半胱氨酸的氧化，或者通過適當修飾的半胱氨酸殘基的親核替代，方便的形成二硫鍵。交聯劑的選擇取決于多肽中存在的氨基酸反應性側鏈的身份。例如，如果多肽中在C-末端之外的其它位置存在半胱氨酸，那么二硫鍵交聯將不是優選的。本發明的范圍還包括以亞甲基橋交聯的肽。
除了N-末端氨基和C-末端羧基以外，抗體上的合適交聯位點包括賴氨酸殘基上的ε氨基，以及肽內部殘基或導入側翼序列中的殘基的側鏈上的氨基、亞氨基、羧基、巰基和羥基。經由外部添加交聯劑的交聯可合適的使用例如本領域技術人員熟悉的許多試劑中的任何一種來實現，例如經由碳二亞胺(carbodiimide)處理多肽。合適的多功能(通常為雙功能)交聯劑的其它例子可以在文獻中找到。
C.本發明的典型制劑的制備應當注意，在本文的典型制劑的制備中，所用成分的推薦質量或“等級”將取決于該制劑的最終用途。對于治療用途，優選該成分具有作為藥用產品的添加劑的允許等級(諸如“GRAS”)。
在某些實施方案中，提供了包含DR5受體抗體和一種或多種賦形劑的組合物，所述賦形劑提供足夠的離子強度以提高抗體的可溶性和/或穩定性，其中組合物的pH為6(或約6)到9(或約9)。可通過實現期望蛋白質純度的任何合適方法，例如按照上述方法來制備抗體。在某些實施方案中，在宿主細胞中重組表達DR5抗體，或者通過化學合成來制備。制劑中抗體的濃度可隨著例如制劑的計劃用途而改變。本領域技術人員無需過度試驗就能夠確定DR5抗體的期望濃度。
制劑中提供足夠離子強度以提高DR5抗體的可溶性和/或穩定性的一種或多種賦形劑任選為多離子的有機或無機酸、天冬氨酸鹽/酯、硫酸鈉、琥珀酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉、CaptisolTM、Tris、精氨酸鹽或其它氨基酸、糖和多元醇諸如海藻糖和蔗糖。優選的是，制劑中提供足夠離子強度的一種或多種賦形劑是鹽。可使用的鹽包括但不限于鈉鹽和精氨酸鹽。所用鹽的類型和鹽的濃度優選使得該制劑具有相對高的離子強度，使得DR5抗體在制劑中穩定。可選擇地，該鹽在制劑中以約20mM到約0.5M的濃度存在。
組合物的pH優選為6(或約6)到9(或約9)，更優選約6.5到約8.5，甚至更優選約7到約7.5。在此實施方案的一個優選方面，組合物還將包含緩沖劑，以便將組合物的pH維持在至少約6到約8。可使用的緩沖劑的例子包括但不限于Tris、HEPES和組氨酸。在使用Tris時，可任選將pH調至約7到8.5。在使用HEPES或組氨酸時，可任選將pH調至約6.5到7。可選擇地，制劑中所用的緩沖劑的濃度在約5mM到約50mM。
特別對于液體制劑(或重建凍干制劑)來說，可能期望在組合物中包含一種或多種表面活性劑。這類表面活性劑可包括例如非離子表面活性劑，像TWEENTM或PLURONICSTM(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)。優選的是，表面活性劑包括聚山梨醇酯20(“吐溫20”)。表面活性劑將任選以約0.005％到約0.2％的濃度使用。
除了DR5抗體和上述那些成分之外，本發明的制劑還包含多種其它賦形劑或成分。可選擇地，用于腸胃外施用的制劑可包含藥學上或腸胃外可接受的載體，即在所用劑量和濃度對接受者無毒且與制劑中的其它成分相容的載體。可選擇地，載體是腸胃外載體，諸如與接受者的血液等滲的溶液。這類載體媒介的例子包括水、鹽水或緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。《Remington′s PharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.編，1980中進一步描述了各種任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。
本文的制劑還可含有一種或多種防腐劑。例子包括氯化十八烷基二甲基芐基銨、氯化己烷雙胺、苯扎氯銨(氯化烷芐基二甲基銨的混合物，其中烷基為長鏈化合物)和苯索氯銨。其它類型的防腐劑包括芳香醇、對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、和間甲酚。抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化乙烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；丁醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；或聚乙二醇(PEG)。
這類載體的其它例子包括卵磷脂、血清蛋白質諸如人血清清蛋白、緩沖物質諸如甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質諸如硫酸魚精蛋白、氯化鈉、聚乙烯吡咯烷酮和基于纖維素的物質。基于凝膠形式的載體包括多糖，諸如羧甲基纖維素或甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和木蠟醇(wood wax alcohol)。常規的存儲形式包括例如微膠囊、納米膠囊、脂質體、硬膏劑、吸入形式、鼻噴霧和持續釋放制劑。
本發明的組合物可包括液體制劑(液體溶液或液體懸浮液)和凍干制劑，以及其中DR5抗體為晶體或無定形沉淀物形式的懸浮制劑。
如果是液體，最終制劑優選冷凍存儲在≤20℃。或者，可凍干該制劑并作為與注射用水重建的粉劑提供，該粉劑任選可存儲在2-30℃。
用于治療性施用的制劑必須是無菌的。通過除菌濾膜(例如0.2微米濾膜)過濾可輕易實現滅菌。通常將治療性組合物置于具有滅菌存取口的容器中，例如具有可用皮下注射針頭刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶。
作為水溶液或用于重建的凍干制劑，通常將組合物存儲在單個單位或多劑量容器中，例如密封的安瓿或藥瓶。該容器可以是本領域可獲得的任何容器，并用常規方法填充。可選擇地，該制劑可裝入注射筆裝置(或裝入筆裝置的藥筒)，諸如那些本領域可獲得的裝置(參見例如美國專利5,370,629)，它們適合制劑的治療性投遞。例如，可使用注射用水重建凍干的DR5抗體制劑來制備注射液。
D.使用方法和其它應用在此描述的DR5抗體用于多種治療性和非治療性應用。在這些應用中，包括治療紊亂的方法，諸如癌癥、免疫相關疾患或病毒疾患。這類治療性和非治療性應用進一步描述于例如WO 97/25428、WO 97/01633和WO01/22987。
本發明設想了使用基因療法來治療哺乳動物，使用編碼DR5抗體的核酸。編碼DR5抗體的核酸可用于該目的。一旦知道氨基酸序列，就能采用遺傳密碼簡并性生成多種氨基酸分子，并選擇某種用于基因療法。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)為了基因療法的目的進入患者的細胞，即體內和回體(ex vivo)。對于體內投遞，通常在需要DR5抗體的部位將核酸直接注射到患者體內。對于回體治療，采集患者的細胞，將核酸導入這些分離的細胞，并將經過修飾的細胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內并植入患者體內。參見例如美國專利4,892,538和5,283,187。
有多種技術可用于將核酸導入活細胞。這些技術根據是將核酸轉移至體外培養細胞還是目的宿主的體內細胞而有所變化。適于在體外將核酸轉移到哺乳動物細胞中的技術包括使用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉錄病毒。
目前優選的體內核酸轉移技術包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質的系統(可用于脂質介導的基因轉移的脂質有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行的轉染。在有些情況中，希望與靶向靶細胞的試劑一起提供核酸源，諸如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異的抗體、靶細胞上受體的配體等。在采用脂質體時，與胞吞作用相關細胞表面膜蛋白結合的蛋白質可用于靶向和/或促進攝入，例如對特定細胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環中進行內在化的蛋白質的抗體、和靶向細胞內定位和增加細胞內半衰期的蛋白質。例如Wu等，J.Biol.Chem.，2624429-4432(1987)和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414(1990)中描述了受體介導的胞吞技術。關于目前已知的基因標記和基因療法方案的綜述參見Anderson等，Science，256808-813(1992)。還可參見WO 1993/25673及其引用的參考文獻。
在用于治療紊亂的本發明方法中，可通過任何合適技術，包括灌注或注射，將DR5抗體制劑直接施用于哺乳動物。具體的施用路徑將取決于例如患者的病史，包括任何使用DR5抗體察覺的或預料的副作用以及待矯正的具體紊亂。腸胃外施用的例子包括皮下、肌肉內、靜脈內、動脈內和腹膜內施用組合物。制劑優選作為重復靜脈內(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉內(i.m.)注射或灌注、顱內灌注，或者作為適于鼻內或肺內投遞的氣霧劑施用(關于肺內投遞參見例如EP 257,956)。
應當注意，在皮下和肌肉內注射中，注射劑的滲透壓可能是重要的。當注射溶液為低滲或高滲時，在灌注時會使患者感覺到疼痛。通常，對于本文的治療性注射制劑來說，優選注射液的相對滲透壓為約300mosm到約600mosm。
還可以口服或持續釋放制劑的形式來施用DR5抗體制劑。持續釋放制劑的合適例子包括含有蛋白質的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質以定型產品的形式存在，如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的例子包括纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素)、溶于非水性介質中的蔗糖-醋酸異丁酸酯(SABERTM)、聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.1981，15167-277；Langer，Chem.Tech.1982，1298-105或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 1983，22547-556)、不可降解的乙烯-乙酸乙烯(Langer等人，同上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。用于施用系統作用藥物的一種可選方法包括通過連續灌注(采用如緩慢釋放裝置或微型泵諸如滲透泵或皮膚貼片)或者通過注射(采用如靜脈內或皮下方式，包括單次推注施用)進行施用。
將以與良好醫療實踐一致的方式，考慮個體患者的臨床狀況、投遞組合物的部位、施用的方法、施藥的時程表和醫務人員所知道的其它因素，配制和施用將用于治療中的組合物。
設想了在該方法中還可以采用其它額外療法。一種或多種其它療法可包括但不限于施用放療、細胞因子、生長抑制劑、化療劑、胞毒劑、酪氨酸激酶抑制劑、ras法尼基轉移酶抑制劑、血管發生抑制劑和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，這些都是本領域已知的且進一步定義的特性如上，它們可以與DR5抗體聯合施用(例如同時地或順序地)。此外，還包括基于靶向腫瘤或其它細胞抗原的治療性抗體的療法，所述治療性抗體諸如CD20抗體(包括RituxanTM)或Her受體抗體(包括HerceptinTM)以及抗血管發生抗體諸如抗VEGF或靶向其它Apo2L受體諸如DR4的抗體。
可按照制造商的指示或由熟練技術人員憑經驗確定化療劑的制劑和服藥時程安排。這類化療的制劑和服藥時程安排還描述于《ChemotherapyService》，M.C.Perry編，Williams & Wilkins，Baltimore，MD，1992。在有些情形中，在施用DR5抗體之前，使細胞暴露于一種或多種化療劑可能是有益的。舉例來說，有些類型的癌細胞可能對DR5抗體誘導的凋亡有抗性，但是能在用化療劑預處理后變得對這種DR5抗體敏感。
可能期望還施用針對其它抗原的抗體，諸如結合CD20、CD11a、CD18、CD40、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管內皮因子(VEGF)或其它TNFR家族成員(諸如OPG、DR4、TNFR1、TNFR2)的抗體。或者/另外，可將在此公開的結合相同或兩種或多種不同抗原的兩種或多種抗體共施用于患者。有時，還對患者施用一種或多種細胞因子可能是有益的。
在本申請描述的任何治療方法中，DR5抗體制劑可例如同時或順序地與例如本申請上文定義部分明確提供的其它試劑、細胞因子、化療、抗體等聯合施用。例如，DR5抗體制劑可作為預處理施用(在施用任何這類其它試劑之前)，諸如預處理否則對其它化療劑的凋亡作用可能有抗性的細胞。
如上指出，本發明的DR5抗體具有多種用途。例如，DR5激動肽可用于治療哺乳動物中病理疾患的方法，例如癌癥或免疫相關疾病。熟練技術人員可以在哺乳動物中診斷在此描述的各種病理疾患。診斷技術在本領域是可獲得的，這使得可以例如在哺乳動物中診斷或檢測癌癥或免疫相關疾病。例如，可通過多種技術鑒定癌癥，包括但不限于觸診、血液分析、x-射線、NMR等等。免疫相關疾病也能容易的鑒定。在系統性紅斑狼瘡中，疾病的中樞介導物是生成對于自身蛋白質/組織的自身反應性抗體及隨后產生的免疫介導的炎癥。多種器官和系統在臨床上受到影響，包括腎臟、肺部、肌肉骨骼系統、粘膜與皮膚、眼睛、中樞神經系統、心血管系統、胃腸道、骨髓和血液。
醫務人員熟悉許多這樣的疾病，其中對免疫和/或炎性應答進行干涉是有益的。例如，類風濕性關節炎(RA)是主要涉及各處關節滑膜，導致關節軟骨損傷的慢性系統性自身免疫炎性疾病。發病機理依賴T淋巴細胞且與類風濕因子、針對自身IgG的自身抗體的生成有關，導致在關節液和血液中達到高水平的免疫復合物的形成。關節中的這些復合物可誘導顯著的淋巴細胞和單核細胞滲透到滑膜中，隨后導致顯著的滑液變化；關節腔/液體中滲透了類似細胞，還增加了大量嗜中性粒細胞。受侵害的組織主要是關節，通常是對稱樣式。然而，關節外疾病也以兩種主要形式發生。一種形式為發生關節外損傷，具有漸進性關節病和典型的肺纖維化、血管炎和皮膚潰瘍。關節外疾病的第二種形式是所謂的費爾提氏綜合征，它發生在RA疾病過程的晚期，有時在關節病已經遏制后，且牽涉出現嗜中性白血球減少癥、血小板減少癥和脾腫大。這可伴隨著多個器官中出現的血管炎，及梗塞形成、皮膚潰瘍和壞疽。患者還常常在受侵害關節上面的皮下組織中產生類風濕性節結；晚期的節結具有由混合的炎性細胞滲透物包圍的壞死中心。可在RA中出現的其它表現包括心包炎、胸膜炎、冠狀動脈炎、發生肺纖維化的間質性肺炎、角膜結膜炎和類風濕性結節。
青少年慢性關節炎是通常開始于16歲之前的慢性先天性炎性疾病。其表型與RA有些相似；類風濕因子陽性的某些患者歸入青少年類風濕性關節炎。該病細分為三種主要類別少數關節的、多關節的和系統性的。關節炎可以是嚴重的，通常是破壞性的，并導致關節僵硬和生長遲緩。其它表現可包括慢性前葡萄膜炎和系統性淀粉樣變。
脊椎關節病是具有一些普遍臨床特征且普遍與HLA-B27基因產物的表達相關的一組紊亂。這些紊亂包括強直性脊柱炎、萊特爾氏綜合征(反應性關節炎)、與炎性腸病相關的關節炎、與銀屑病相關的脊椎炎、青少年發作的脊椎關節病及無差別(undifferentiated)脊椎關節病。區別性特征包括具有或沒有脊椎炎的骶髂關節炎；炎性不對稱關節炎；與HLA-B27相關(血清學上定義的MHC I型HLA-B基因座的等位基因)；眼炎癥，與其它類風濕性疾病相關的自身抗體的缺乏。對于誘導疾病來說關鍵的最相關細胞是CD8+T淋巴細胞，靶向由MHC I型分子呈遞的抗原的細胞。CD8+T可與MHC I型等位基因HLA-B27反應，只要它是由MHC I型分子表達的外源肽。已有假設，HLA-B27的表位可能模擬細菌或其它微生物的抗原性表位，從而誘導CD8+T細胞應答。
系統性硬化(硬皮病)的病因學未知。該病的特點是皮膚硬化；這可能是由活性炎性過程誘導的。硬皮病可以是局部的或系統性的；血管損壞是普遍的，而且微血管系統中的內皮細胞損傷是系統性硬化癥發展中的早期而重要的事件；血管損傷可能由免疫介導。皮膚損傷中存在單核細胞滲透以及在許多患者中存在抗核抗體暗示免疫學基礎。ICAM-1通常在皮膚損傷的成纖維細胞的細胞表面上調，表明T細胞與這些細胞相互作用可能在疾病的發病機理中起作用。其它相關器官包括胃腸道平滑肌萎縮和纖維化導致異常蠕動/運動；腎臟同中心內皮下內膜增生影響小弓形和葉間動脈，從而降低腎皮質血流，導致蛋白尿、氮血癥和高血壓；骨骼肌萎縮、間質性纖維化、炎癥；肺間質性肺炎和間質性纖維化；及心臟收縮帶壞死、疤痕化/纖維化。
先天性炎性肌病包括皮肌炎、多肌炎和其它疾病，是導致肌肉軟弱的未知病因的慢性肌肉發炎紊亂。肌肉損傷/發炎通常是對稱的和漸進的。自身抗體與大多數形式相關。這些肌炎特異性自身抗體針對并抑制與蛋白質合成相關的成分、蛋白質和RNA的功能。
斯耶格倫氏綜合征是由免疫介導的炎癥及隨后淚腺和唾液腺功能破壞引起的。該病可能與炎性結締組織疾病相關或伴隨著炎性結締組織疾病。該病與針對Ro和La抗原的自身抗體生成相關，這兩種抗原都是小RNA-蛋白質復合物。損害導致干燥性角膜結膜炎、口干燥、及其它表現或關聯，包括膽汁性肝硬化、外周或感覺神經病和可觸知的紫癜。
系統性血管炎是這樣的疾病，其中原發性損害是炎癥，后續對血管的損傷導致由受侵害血管供應的組織缺血/壞死/變性，且在某些情形下最終導致終端器官功能障礙。血管炎病還可作為其它免疫-發炎介導疾病諸如類風濕性關節炎、系統性硬化等的繼發損害或后遺癥發生，特別是在還與免疫復合物形成相關的疾病中。原發性系統性血管炎組中的疾病包括系統性壞死性血管炎節結性多動脈炎、過敏性脈管炎和肉芽腫病、多脈管炎；韋格納氏肉芽腫病；淋巴瘤樣肉芽腫病；和巨細胞性動脈炎。各種各樣的血管炎病包括粘膜與皮膚淋巴結綜合征(MLNS或川畸氏病)、分離的CNS血管炎、貝切特氏病、閉塞性血栓性血管炎(伯格氏病)和皮膚壞死性小靜脈炎。所列大多數類型的血管炎的發病機理認為主要是由于免疫球蛋白復合物在血管壁上沉積，隨后通過ADCC、補體活化或者兩者誘導的炎癥應答。
節結病是病因學未知，特征在于幾乎機體任何組織中都存在上皮樣肉芽腫的疾患；最普遍的是涉及肺。發病機理包括患病部位持續存在活化的巨噬細胞和淋巴樣細胞，隨后由這些細胞類型釋放局部和系統性活性產物而導致慢性后遺癥。
自身免疫性溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性貧血、免疫性全血細胞減少癥和陣發性夜間血紅蛋白尿是由于生成與紅細胞(和在有些情形下其它血細胞，包括血小板等)表面表達的抗原反應的抗體的結果，是通過補體介導的溶解和/或ADCC/Fc受體介導的機制去除這些抗體包裹細胞的反映。
在包括血小板減少性紫癜的自身免疫性血小板減少癥，和其它臨床背景中的免疫介導的血小板減少癥中，由于抗體或補體附著到血小板上隨后通過補體溶解、ADCC或Fc受體介導的機制去除而發生血小板破壞/去除。
甲狀腺炎，包括格雷夫斯氏病、橋本氏甲狀腺炎、青少年淋巴細胞性甲狀腺炎和萎縮性甲狀腺炎是由于針對甲狀腺抗體的自身免疫反應及產生與存在于甲狀腺中且通常對甲狀腺特異的蛋白質反應的抗體。現有的實驗模型包括自發性模型大鼠(BUF和BB大鼠)和雞(肥胖雞品系)；可誘導模型用甲狀腺球蛋白、甲狀腺微粒體抗原(甲狀腺過氧化物酶)免疫動物。
I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病是胰島β細胞的自身免疫破壞；該破壞由自身抗體和自身反應性T細胞的介導。胰島素或胰島素受體的抗體也會產生胰島素不響應的表型。
免疫介導的腎病，包括腎小球腎炎和腎小管間質性腎炎是由于抗體或T淋巴細胞介導的對腎臟組織產生的損傷，可能是直接由于產生針對腎臟抗原的自身反應性抗體或T細胞，或者可能是間接由于對其它非腎臟抗原有反應性的抗體和/或免疫復合物在腎臟中沉積。因此，導致免疫復合物形成的其它免疫介導的疾病也可作為間接后遺癥誘導免疫介導的腎病。直接和間接的免疫機制都導致炎癥反應，它在腎臟組織中產生/誘導損害發生，結果器官功能受損，在某些情形下發展成腎衰竭。體液和細胞兩種免疫機制都可與損害的發病機理相關。
中樞和外周神經系統的脫髓鞘疾病，包括多發性硬化；先天性脫髓鞘多神經病或格巴二氏綜合征；和慢性炎性脫髓鞘多神經病認為具有自身免疫基礎，且由于對少突細胞或對髓鱗脂直接造成損害而導致神經脫髓鞘。在MS中，有證據表明該疾病的誘導和進展依賴T淋巴細胞。多發性硬化是依賴T淋巴細胞的炎性脫髓鞘病，且具有復發-緩和過程或漫長的漸進過程。病因未知；但是，病毒感染、遺傳易患病質、環境和自身免疫性都會起作用。損傷含有主要由T淋巴細胞介導的滲透物、微膠質細胞和滲透的巨噬細胞；CD4+T淋巴細胞是損傷處的主要細胞類型。少突細胞死亡和隨后脫髓鞘的機理未知，但是可能是由T淋巴細胞驅動的。
炎性和纖維化肺病，包括嗜曙紅細胞肺炎；特發性肺纖維化和超敏性肺炎，可能牽涉不受調控的免疫-發炎反應。抑制該反應將具有治療益處。
自身免疫或免疫介導的皮膚病，包括大皰性皮膚病、多形性紅斑和接觸性皮炎，由自身抗體介導，其發生依賴T淋巴細胞。
銀屑病是T淋巴細胞介導的炎性疾病。損傷中含有T淋巴細胞、巨噬細胞和抗原加工細胞的滲透物，以及一些嗜中性粒細胞。
變應性疾病，包括哮喘；變應性鼻炎；特異性皮炎；食物超敏性；和蕁麻疹，依賴T淋巴細胞。這些疾病主要由T淋巴細胞誘導的炎癥、IgE介導的炎癥或二者組合介導。
移植相關性疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)，依賴T淋巴細胞；抑制T淋巴細胞功能具有改善作用。
其中對免疫和/或發炎反應進行干涉具有益處的其它疾病為傳染病，包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS，甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎)、細菌感染、真菌感染、及原生動物和寄生蟲感染(刺激MLR的分子(或者衍生物/激動劑)在治療上可用于增強對感染因子的免疫應答)，免疫缺陷疾病(刺激MLR的分子/衍生物/激動劑在治療上可用于增強對遺傳性、獲得性、感染性誘導的(如HIV感染)或醫原性(即如由化療引起的)免疫缺陷疾患的免疫應答)，以及瘤形成。
在此還提供了診斷方法。例如，DR5抗體可用于在已知或懷疑具有Apo-2L或DR5相關病理疾患的哺乳動物中檢測對應DR5受體。結合肽可用于例如在測定法中檢測或者量化樣品中的DR5。可在存在經標記結合肽時將樣品諸如從哺乳動物獲得的細胞溫育，并檢測樣品中結合的經標記結合肽。這類測定法，包括各種臨床測定流程，在本領域是已知的，例如Voller等人，Immunoassays，University Park，1981中所描。
本發明還提供了包含在此描述的DR5抗體的試劑盒。典型的試劑盒將包括容器，優選小瓶，裝有一種或多種上述賦形劑中的DR5抗體；和說明書，諸如產品插頁或標簽，指導使用者如何使用DR5抗體制劑。這優選提供藥用制劑。優選的是，該藥用制劑用于治療癌癥或免疫相關疾患。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和試管。容器可以用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。該容器裝有有效用于診斷或治療紊亂的DR5抗體制劑，可具有無菌存取口(例如，該容器可以是帶有能用皮下注射針頭刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。容器上的或者與容器相關的標簽指示該制劑用于診斷或治療所選的紊亂。該產品還可包括第二容器，其中裝有注射用水、藥學上可接受的溶液、鹽水、Ringer氏溶液或右旋糖溶液。還可包括符合商業和使用者立場的其它想要的材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和具有使用說明的包裝插頁。
將本申請全文中引用的所有專利、專利申請、出版物、產品描述和方案的公開內容完整引入本文作為參考。在此所用的章節標題僅用于組織的目的，而不應解釋為限定所述主題。
實施例下述實施例只是為了例示的目的而提供，并非旨在以任何方式限定本發明的范圍。除非另外指出，實施例中提及的商品化試劑按照制造商的指示使用。在下述實施例和整篇說明書中用ATCC編號確定的那些細胞的來源是美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)。在下一組實施例中，當提及中間物和終產物時，用標準的一個或三個字母的氨基酸代碼描述常見的α-氨基酸。常見的α-氨基酸是指那些在mRNA引導下摻入蛋白質的氨基酸。標準縮寫列舉在Merck Index，第10版，pp Misc-2-Misc-3中。除非另外指定，常見的α-氨基酸在α-碳原子上具有天然的或“L”-構型。如果代碼前有“D”，這表示常見的α-氨基酸的相反對映體。經過修飾的或者不常見的α-氨基酸諸如正亮氨酸(Nle)和鳥氨酸(Orn)的指定描述在1990年5月15日的美國專利和商標局公報(U.S.Patent andTrademark Office Official Gazette)1114 TMOG中。
實施例1scFv文庫LSS-2331B的構建用噬菌粒載體構建稱作“LSS-2331B”的噬菌體展示scFv文庫，通過在scFv和基因3次要外殼蛋白(P3C)的C末端結構域之間插入亮氨酸拉鏈結構域而二聚化，導致雙價scFv模塊(moiety)的展示。該載體命名為“pS2072a”，且包含圖4所示序列。該載體包含人源化抗體4D5可變區，受堿性磷酸酶(phoA)啟動子控制。人源化抗體4D5是在重鏈和輕鏈中主要具有人共有序列框架區且具有來自對Her-2特異的小鼠單克隆抗體的CDR區的抗體。美國專利5,821,337和6,054,297提供了制備抗Her-2抗體和鑒定可變區序列的方法。
用全部三個重鏈CDR中的隨機化殘基構建LSS-2331B。隨機化的具體殘基如下CDR-H1中的殘基28、30、31、32和33；CDR-H2中的殘基50、52、53、54、56和58；CDR-H3中的殘基95、96、97、98、99和100。通過用不同數目(3-14個)的簡并密碼子替換位置95到100之間的6個野生型密碼子，將額外多樣性導入CDR-H3。
用Kunkel等人，Methods Enzymol.(1987)，154367-382)的方法以及前述方法(Sidhu，S.S.等人，Methods Enzymol.(2000)，328333-363)構建文庫LSS-2331B。通過用TAA終止密碼子替代重鏈位置30、31、32、33、53、54、56、98、99、100和100a的密碼子，構建獨特的“終止模板”型的pS2072a(命名為pS2072c)。使用在待多樣化位置上具有簡并密碼子的誘變寡核苷酸同時引入CDR多樣性并修復終止密碼子。所述寡核苷酸序列示于下面的表1。
表1用于文庫LSS-2331B構建的誘變寡核苷酸。IUB代碼代表等摩爾DNA簡并性(W＝A/T，R＝A/G，V＝G/A/C，N＝A/G/C/T，M＝A/C，Y＝C/T，D＝G/A/T，B＝G/T/C，K＝G/T，S＝G/C，H＝A/T/C)。
分別用寡核苷酸H1-1和H2-1將多樣性導入CDR-H1和CDR-H2。用寡核苷酸H3-1、H3-2、H3-3、H3-4、H3-5、H3-6、H3-7、H3-8、H3-9、H3-10、H3-11和H3-12的等摩爾混合物將多樣性導入CDR-H3。在一個誘變反應中，將用于所有待隨機化CDR的誘變寡核苷酸同時摻入pS2027c模板，因此所有誘變寡核苷酸的同時摻入導致在各個位置上引入設計的多樣性并同時修復所有TAA終止密碼子，從而生成編碼與同二聚化亮氨酸拉鏈和P3C融合的scFv文庫成員的可讀框。
將誘變反應物電穿孔到大腸桿菌SS320(Sidhu，S.S.等人，MethodsEnzymol.(2000)，328333-363)中，并將轉化細胞在存在M13-KO7輔助噬菌體(New England Biolabs，Beverly，MA)下培養過夜以生成噬菌體顆粒，它們包裹噬菌粒DNA并在其表面展示Fab片段。文庫LSS-2331B含有3×1010個獨特成員。
在構建文庫后，如下所述采用三步分選技術進行分選分選11.以2ug/ml、100ul/孔的人DR5-ECD(參見下文表9)包被Maxisorp免疫板的12個孔，并在4℃溫育過夜。
2.封閉平板添加200ul含酪蛋白的PBS，并在室溫溫育1小時。
3.封閉噬菌體以1∶1的比例將封閉緩沖液(酪蛋白)加到噬菌體溶液中，并在室溫溫育1小時。
4.用PT緩沖液(PBS+0.05％吐溫20)洗滌平板5次。
5.將100ul文庫噬菌體溶液(來自步驟4)加到孔中，在室溫溫育2小時并輕輕搖晃。
6.用PT緩沖液洗滌平板10次。
7.前12個孔用50ul 0.1M HCl，pH2洗脫20分鐘；用1.0M tris堿(約1/6體積)中和洗脫液。
8.用1.5ml噬菌體洗脫液感染5ml Xl1-blue細胞(OD600＝1.0)。在37℃培養20分鐘。在LB/carb平板上滴定并將培養液轉移到50ml 2YT/carbVCS中，并在37℃培養過夜。
9.旋轉離心細胞并保留上清液，該上清液可用于下一步分選。
分選21.用人DR5-ECD包被12個孔。
2.封閉平板添加200ul超級封閉液(super block)(Pierce Chemicals，產品號37515)，并在室溫溫育1小時。
3.封閉噬菌體以1∶1的比例將酪蛋白加到噬菌體上清液(來自分選1，步驟12)中，并在室溫溫育1小時。
4.用0.3ml噬菌體洗脫液感染1ml Xl1-blue細胞(OD600＝1.0)。在37℃培養20分鐘。在LB/carb平板上滴定并將培養液轉移到25ml 2YT/carbVCS中，并在37℃培養過夜。
5.旋轉離心細胞并保留上清液，該上清液可用于下一步分選。
分選31.用人DR5-ECD包被12個孔。
2.封閉平板添加200ul PBS/BSA，并在室溫溫育1小時。
3.封閉噬菌體以1∶1的比例將超級封閉液加到噬菌體上清液中，并在室溫溫育1小時。
4-5.同上。
實施例2scFv文庫LSS-2344F的構建除了如下不同之處，如實施例1中關于LSS-2331B所述構建稱作“LSS-2344F”的文庫。
終止模板(pG4503f)在一個密碼子上與pS2072c不同，導致重鏈中的一個點突變(H91S)。用于文庫構建的誘變寡核苷酸的序列示于下面的表2。
表2用于文庫LSS-2344F構建的誘變寡核苷酸。IUB代碼代表等摩爾DNA簡并性(W＝A/T，R＝A/G，V＝G/A/C，N＝A/G/C/T，M＝A/C，Y＝C/T，D＝G/A/T，B＝G/T/C，K＝G/T，S＝G/C，H＝A/T/C)。
用寡核苷酸H1-2、H1-3、H1-4和H1-5(2∶1∶2∶1的比例)將多樣性引入CDR-H1。用寡核苷酸H2-2、H2-3、H3-4和H4-5(2∶1∶2∶1的比例)將多樣性引入CDR-H2。用寡核苷酸H3-13、H3-14、H3-15、H3-16、H3-17、H3-18、H3-19、H3-20、H3-21、H3-22和H3-23的等摩爾混合物將多樣性引入CDR-H3。文庫LSS-2344F含有1.5×1010個獨特成員。
然后用實施例1中描述的三步分選方法來進行分選。
實施例3構建Fab文庫LSS-2369B用噬菌粒載體構建噬菌體展示Fab文庫“LSS-2369B”，導致與基因3次要外殼蛋白(P3C)的C-末端結構域融合的Fab模塊的展示。該載體命名為pV-0350-2，且包含圖5所示序列。該載體包含在輕鏈中具有三個突變(N30S、R66G和H91S)的人源化抗體4D5 Fab，受堿性磷酸酶(phoA)啟動子控制。人源化抗體4D5是在重鏈和輕鏈中主要具有人共有序列框架區且具有來自對Her-2特異的小鼠單克隆抗體的CDR區的抗體。美國專利5,821,337和6,054,297提供了制備抗Her-2抗體和鑒定可變區序列的方法。
用全部三個重鏈CDR中的隨機化殘基構建LSS-2369B。隨機化的具體殘基如下CDR-H1中的殘基28、30、31、32和33；CDR-H2中的殘基50、52、53、54、56和58；CDR-H3中的殘基95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c。通過用不同數目(7、8、9、10或12個)的簡并密碼子替換位置95到100之間的9個野生型密碼子，將額外多樣性引入CDR-H3。
用Kunkel等人，Methods Enzymol.(1987)，154367-382)的方法以及前述方法(Sidhu，S.S.等人，Methods Enzymol.(2000)，328333-363)構建文庫LSS-2369B。通過用TAA終止密碼子替代重鏈位置30、31、32、33、53、54、56、98、99、100和100a的密碼子，構建獨特的“終止模板”型的pV-0350-2(命名為pV-0350-2b)。使用在待多樣化位置上具有簡并密碼子的誘變寡核苷酸同時引入CDR多樣性并修復終止密碼子。分別用寡核苷酸H1-1和H2-1(示于上面的表1)將多樣性引入CDR-H1和CDR-H2。用寡核苷酸H3-24、H3-25、H3-26、H3-2和H3-28的等摩爾混合物(示于下面的表3)將多樣性引入CDR-H3。
表3用于文庫LSS-2369B構建的誘變寡核苷酸。IUB代碼代表等摩爾DNA簡并性(W＝A/T，R＝A/G，V＝G/A/C，N＝A/G/C/T，M＝A/C，Y＝C/T，D＝G/A/T，B＝G/T/C，K＝G/T，S＝G/C，H＝A/T/C)。
在一個誘變反應中，將用于所有待隨機化CDR的誘變寡核苷酸同時摻入pV-0350-2b模板，因此所有誘變寡核苷酸的同時摻入導致在各個位置上引入設計的多樣性并同時修復所有TAA終止密碼子，從而生成編碼與P3C融合的Fab文庫成員的可讀框。
將誘變反應物電穿孔到大腸桿菌SS320(Sidhu，S.S.等人，MethodsEnzyymol.(2000)，328333-363)，并將轉化細胞在存在M13-KO7輔助噬菌體(New England Biolabs，Beverly，MA)下培養過夜以生成噬菌體顆粒，它們包囊噬菌粒DNA并在其表面展示Fab片段。文庫LSS-2369B含有6.2×1010個獨特成員。
然后用實施例1中描述的三步分選方法進行分選。
實施例4從噬菌體文庫中選擇特異性抗體對來自上述各個文庫的噬菌體(實施例1、2和3)分別進行循環，通過數輪結合選擇來富集結合人DR5-ECD的克隆(參見下面的表9)。用先前描述的方法進行結合選擇(Sidhu等人，同上文)。
NUNC 96孔Maxisorp免疫板在4℃用捕獲靶(以5ug/ml溶于PBS的hDR5-ECD)包被過夜，并用牛血清清蛋白(BSA)(Sigma)封閉2小時。如先前所述(Sidhu等人，同上文)，噬菌體在37℃生長過夜后，用PEG/NaCl沉淀濃縮并重懸在PBS、0.5％BSA、0.1％吐溫20(Sigma)中。將噬菌體溶液(1012個噬菌體/ml)加到包被好的免疫板上。溫育2小時以便噬菌體結合后，用PBS、0.05％吐溫20洗滌10次。用0.1M HCl洗脫結合的噬菌體10分鐘，并用1.0M Tris堿中和洗脫液。在大腸桿菌XL1-blue中擴增洗脫的噬菌體，用于下一輪選擇。對文庫LSS-2344F和LSS-2331B分別進行3輪或4輪結合hDR5-ECD的選擇。文庫LSS-2369B進行2輪針對hDR5-ECD的選擇，接著進行一輪針對抗gD表位抗體的選擇(第2a輪)，以富集展示Fab(有一個gD表位融合到輕鏈C末端上)的克隆，接著進行第三輪針對hDR5-ECD的選擇。
對于各個文庫來說，將來自最后一輪選擇的各個克隆以96孔形式在500ul添加羧芐青霉素和M13-KO7的2YT肉湯中培養，并將培養物上清液直接用于噬菌體ELISA(Sidhu等人，同上文)來檢測結合用hDR5-ECD包被的平板但不結合用BSA包被的平板的噬菌體展示抗體。陽性結合克隆定義成是那些在包被hDR5-ECD的平板上呈現的ELISA信號比包被BSA(對照)的平板上的信號強至少10倍的克隆。還進行ELISA分析測試，以確定陽性結合克隆是對DR5受體特異的，且不展示與DR4、DcR1或DcR2受體(例如Apo-2配體結合的其它受體)的交叉反應性(數據未顯示)。使用標準方法，對來自各個文庫的陽性結合克隆進行DNA測序分析。對于LSS-2331B，對180個克隆進行的測序揭示了65個獨特序列(圖6)。對于LSS-2344F，對176個克隆進行的測序揭示了33個獨特序列(圖7)。對于LSS-2369B，對96個克隆進行的測序揭示了3個獨特序列(圖8)。
從文庫LSS-2331B中選擇的克隆(參見實施例1)的噬菌體ELISA的結果示于下面的表4。表4中的“標識符”是指指派給特定克隆抗體的名稱或代碼，而各個標識符對應于圖6中包括的那些。用于比較，這些抗體的每一個與人DR5-ECD和猿猴(cynomolgous)(“cyno”)DR5-IgG(參見下面的表9)的結合示于表4。
表4噬菌體scFv ELISA
從Fab文庫(參見實施例3)中選出的克隆的噬菌體ELISA結果示于下面的表5。表5中的“標識符”是指指派給特定克隆抗體的名稱或代碼，而各個標識符對應于圖8中包括的那些。用于比較，這些抗體的每一個與人DR5-ECD(“HDR5-ECD”)、人DR5-IgG(“HDR5-IgG”，表9)、鼠DR5-IgG(“MDR5-IgG”，表9)，以及與猿猴DR5-IgG(“CDR5-IgG”，表9)的結合示于表5。“N.D.”是指“未測定”。
表5
實施例5用大腸桿菌表達制備Fab蛋白質將菌落(在34B8中)挑到5ml 2YT+50ug/ml carb中，并將細胞在37℃培養到1.5-2.5 OD。將5ml培養物接種500ml完全C.R.A.P培養基+50ug/mlcarb，然后在30℃培養18-24小時。旋轉離心細胞并倒去上清液。將沉淀物在-20℃冷凍過夜。
在冰上解凍細胞沉淀物，并添加如下物質a)20ml TE(5ml/g)；20ulPMSH(5ul/g)；4ul1M苯甲脒(1ul/g)；2ml 250mM EDTA(0.4ml/g)。將細胞完全重懸并在冰上放置至少1小時。將休克細胞(shocked cell)以15Krpm旋轉離心60分鐘。純化上清液或者將細胞勻漿(ultraturex)5分鐘。用微型流化器(microfluidizer)破碎細胞，并以15K旋轉離心60分鐘。將上清液過濾通過0.45um濾器，并加載到蛋白質柱上(柱用TE緩沖液預先洗滌)。柱用TE緩沖液洗滌，然后用0.1M乙酸+1mM EDTA洗脫，用1MTris，pH8中和，隨后交換到PBS緩沖液中。然后在OD 280(濃度＝1OD/0.4＝mh/ml)進行測量。
然后在如下的ELISA中測試所表達的蛋白質。微量滴定板孔用80ul1ug/ml人DR5-ECD(表9)(在50mM碳酸鈉pH 9.6中)在4℃包被過夜。去除包被液，用200ul PBS/0.1％BSA/0.05％吐溫20封閉，并在室溫溫育1小時。制備競爭性受體溶液(100ul/樣品)，并以不同濃度用DR5受體制備適當不完全飽和生物素標記的抗體(由系列抗體稀釋液預先測定)。將混合液在室溫溫育2小時。搖晃用DR5-ECD包被的平板，并用PBS+0.05％吐溫20漂洗10次。將80ul競爭性受體和生物素標記的抗體的混合液從無粘性平板轉移到DR5包被的平板上，并在室溫溫育20分鐘。在結合緩沖液中進行HRP偶聯的鏈霉親合素(Zymed)的1∶5000稀釋。用PBS/吐溫20漂洗平板10次，加入80ul HRP-鏈霉親合素稀釋液并在室溫溫育1小時。將TMB過氧化物酶底物和過氧化物酶溶液B等體積混合。用PBS/吐溫20漂洗平板10次，加入80ul底物，然后按照顯色所需進行溫育，并用80ul 2.5M H2SO4終止反應。
測試抗體“BdF2”(參見圖8中的抗體I.D.)的此ELISA結果示于下面的表6。為了比較，抗體BdF2與人DR5-ECD、人DR5-IgG(參見表9)、人DR4-IgG(參見表9)、鼠DR5-IgG(表9)，以及與猿猴DR5-IgG(“猿猴DR5-IgG”，表9)的結合示于表6。“N.D.”指“未測定”。
表6Fab abs
分析結果顯示Bdf2結合人DR5-ECD，這也示于圖9。
實施例6結合分析用BIAcore分析進行結合分析。加熱CM5芯片(Biocare)到室溫至少半小時。開啟BIAcore儀器，并將芯片裝載到該儀器中。用工作緩沖液(PBS/0.05％吐溫20/0.01％疊氮化鈉)進行起動(prime)，然后用70％甘油進行標準化。按照制造商的指示運行傳感程序(sensogram)，制備固定蛋白質溶液(乙酸緩沖液pH5.5)并將蛋白質稀釋至20ug/mL。用ECD和NHS活化芯片。以20ul/分注入5-30ul蛋白質(人DR5-ECD、猿猴DR5-IgG、鼠DR5-ECD或人DR4-IgG，都描述在表9中)，直到固定的蛋白質達到100 RU。然后用1M乙醇胺封閉芯片。樣品以50nnM-500nM的濃度起始，然后1∶1稀釋。
用Biaevaluation軟件程序分析數據以測量蛋白質動力學。
從實施例1描述的文庫中選擇的scFv抗體的Biacore分析結果報道在下面的表7中表7
從實施例2描述的文庫中選擇的Fab抗體的Biacore分析結果報道在下面的表8中表8
*從CHO細胞純化的蛋白質**從大腸桿菌純化的蛋白質N.D.-指“未測定”對稱作“BdF1”的Fab抗體進行的X-射線晶體結構分析揭示了在其結合人DR5受體時，抗體的CDR-H3區與DR5受體中與Apo2L/TRAIL結合位點交疊的一個區域大面積接觸，而且該CDR-H3區中的殘基掩埋在界面中。(Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復合物的晶體結構描述在Hymowitz等人，Molecular Cell，4563-571(1999)中；還可參見2001年3月22日公開的WO 01/19861)。雖然尚未完全理解，認為這可能代表了DR5受體表面上用于結合的潛在熱點，它被Apo-2配體/TRAIL和實施例3中描述的噬菌體展示技術中鑒定的Fab抗體利用。
實施例7選定抗體的體外生物學分析在96孔組織培養板(Falcon)中對對照標準物和抗體“BdF2”進行兩倍連續稀釋(參見圖8)。測試Apo-2配體(氨基酸114-281，在PCT US00/17579中描述)，用作比較。將Colo-205(20000個細胞/孔)人結腸癌細胞(ATCC)接種到96孔板中。將平板在37℃溫育24小時。在24小時溫育時間的最后3小時，將AlamarBlue(Trek Diagnostic Systems，Inc.)加到孔中。用96孔熒光計讀取熒光，530nm激發和590nm發射。結果以相對熒光單位(RFU)表示。對于數據分析，使用4參數曲線擬合程序(Kaleidagraph)。
生物測定的結果示于圖10。
本發明不限于在此描述的具體實施方案的范圍。實際上，對本領域技術人員來說，根據前面的描述和附圖，除了在此描述的那些實施方案，對本發明的各種修改將是顯然的。這類修飾意圖落入所附權利要求書的范圍內。
表9實施例測定法中所使用的試劑的多肽序列1.人DR5-ECD多肽MSALLILALVGAAVADYKDDDDKLSALITQQDLAPQQRVAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPASPCSLS(SEQ ID NO154)2.人DR4-IgG融合多肽MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSERPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO155)3.人DR5-IgG融合多肽MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGLRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGLAFQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO156)4.獼猴DR4-IgG融合多肽MGQQGPSAQARAGRVVGPRSAQGASPGLRVHKTLKFVVVGVLLQVVPGSAATIKVHDQSVGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHSGACNQCTEGVGYTSASNNLFSCLPCTACKSDEEERSACTRTRNTACQCKPGTFRNDDSAEMCRKCSTGCPRGKVKVKDCTPWSDIECVHNESGNGHNVWAILIVTVVILVVLLLLVAVLMFCRRIGSGCGGNPKCMHRVFLWCLGLLRGPGAEDNAHNMILNHGDSLSTFISEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPA
EPEGSQRRRLLVPANGADPTETMMLFFDNFADIVPFNSWDQLMRQLGLTNNEIHMVRADTAGPGDALYAMLMKWVNKTGQDASIHTLLDALERIGERHAKERIQDLLVDSGKFIYVEDGTGSAVSLE (SEQ ID NO157)5.獼猴DR5-IgG融合多肽MGQLRQSAPAASVARKGRGPGPREARGARPGLRVLKTLVLVVAAARVLLSVSADCAPITRQSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRECISCKYGQDYSTHWNDFLFCLRCTKCDSGEVEVNSCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEICRKCRTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGIIIGVIVLVVIVVVTVIVWKTSLWKKVLPYLKGVCSGDGGDPEHVDSSSHSPQRPGAEDNALNEIVSIVQPSQVPEQEMEVQEPAEQTDVNTLSPGESEHLLEPAKAEGPQRRGQLVPVNENDPTETLRQCFDDFAAIVPFDAWEPLVRQLGLTNNEIKVAKAEAASSRDTLYVMLIKWVNKTGRAASVNTLLDALETLEERLAKQKIQDRLLSSGKFMYLEDNADSATS (SEQ ID NO158)
權利要求
1.分離的抗DR5抗體，包含圖6、7或8所列一種或多種氨基酸序列。
2.分離的抗DR5抗體，包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含可變區，該可變區包含圖6、7或8所列一種或多種氨基酸序列。
3.權利要求2的抗體，其中所述重鏈和輕鏈通過柔性接頭連接形成單鏈抗體。
4.權利要求3的抗體，其是單鏈Fv抗體。
5.權利要求2的抗體，其是Fab抗體。
6.權利要求2的抗體，其完全是人源的。
7.權利要求1或權利要求2的抗體，其特異性結合DR5受體而不結合DR4受體、DcR1受體或DcR2受體。
8.權利要求1或權利要求2的抗體，其在至少一類哺乳動物癌細胞中誘導凋亡。
9.權利要求1或權利要求2的抗體，其阻斷或抑制Apo-2配體結合DR5受體。
10.一種組合物，其包含權利要求1-9任一項的抗體和載體。
11.治療哺乳動物病癥的方法，包括施用權利要求10的組合物。
12.權利要求11的方法，其中所述病癥是免疫相關病癥。
13.權利要求11的方法，其中所述病癥是癌癥。
全文摘要
本發明提供了特異性結合DR5受體的抗體。抗DR5抗體可選擇地含有用噬菌體展示技術鑒定的CDR序列。DR5抗體可用于例如期望調節Apo－2L和/或Apo－2L受體的生物學活性的方法中，包括癌癥和免疫相關疾患。
文檔編號C07K16/32GK101014623SQ200580018426
公開日2007年8月8日 申請日期2005年4月4日 優先權日2004年4月6日
發明者李冰, 薩奇德夫·S·西杜 申請人:健泰科生物技術公司