抗p型選凝素抗體的制作方法

專利名稱：抗p型選凝素抗體的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及抗P型選凝素抗體并且特別是不結合補體因子C1q的抗P型選凝素抗體。優選地，這些抗體是人抗體或人源化抗體。
P型選凝素(CD62P、GMP-140、PADGEM、LECAM-3)是對凝血酶和其它激動劑反應時在活化的血小板和活化的內皮細胞表面表達的140kDa鈣依賴性結合糖的蛋白質(McEver等，J Biol Chem 27011025(1995)；Varki，Proc Natl Acad Sci USA 917390(1994)；Springer TA，Annu RevPhysiol 57827(1995))。在這兩種細胞類型中，P型選凝素貯藏于分泌性顆粒內，即血小板的α-顆粒和內皮細胞的Weibel-Palade體內(McEver等，J Clin Invest 8492(1984))。P型選凝素是由氨基端的凝集素結構域、緊隨其后的EGF樣結構域、九個與補體調節蛋白同源的短共有重復序列、跨膜結構域和短胞質尾區構成的I型跨膜糖蛋白(Johnston等，Cell 561033(1989))。P型選凝素的結構類似于選凝素家族的另外兩個成員E型選凝素及L型選凝素，它們在細胞因子活化的內皮細胞上表達(E型選凝素)或在絕大部分類型的白細胞上組成型表達(L型選凝素)。
已知全部選凝素以低親和性結合至唾液酰化、巖藻糖基化的小寡糖，例如唾液酰路易斯x(sLex；Foxall等，J Cell Biol 117895(1992)；Varki，Curr OpinCell Biol 257257(1992))。P型選凝素和L型選凝素還結合特定的硫酸化多糖如硫酸肝素，但E型選凝素不結合(綜述參見McEver和Cummings，J Clin Invest 100S97(1997))。對P型選凝素的高親和性配體是由附帶唾液酰化O-聚糖簇的多肽骨架組成的粘蛋白樣糖蛋白(McEver等，J Biol Chem 27011025(1995))。與P型選凝素偏嗜性結合的一種唾酸粘蛋白配體是由循環白細胞正常表達為帶兩個由二硫鍵連接的亞基的同型二聚體的P型選凝素糖蛋白配體-1(PSGL-1，CD162)，其相對分子量接近120kDa。P型選凝素的結合位點位于PSGL-1的氨基最末端部分。P型選凝素通過與其配體的結合介導白細胞在活化的血小板和活化的內皮細胞上滾動。這種滾動過程有效地降低了白細胞運動的速度，這不僅是白細胞牢固粘著于內皮以及隨后變移進入內皮下的前提條件，也是白細胞在血栓內聚集的前提條件。
利用P型選凝素缺陷性小鼠和P型選凝素特異性阻斷抗體開展的研究已證實P型選凝素參與多種急性和慢性炎性疾病的病理生理學，包括局部缺血/再灌注損傷(Winn等，J Clin Invest 922042(1993)；Massberg等，Blood 92507(1998))。此外，P型選凝素在涉及炎性成分的心血管疾病如動脈粥樣硬化癥(Collins等，J Exp Med 191189(2000)；Johnson等，JClin Invest 991037(1997))、再狹窄(Manka等，Circulation 1031000(2001)；Bienvenu等，Circulation 1031128(2001))和血栓癥(Kumar等，Circulation 991363(1999)；Andre等，Proc Natl Acad Sci USA 9713835(2000)；Blann等，Br.J.Haematol 108191(2000)；Myers等，ThrombHaemostasis 85423(2001)中也有明確作用。顯而易見，對P型選凝素功能抑制作為一種療法將在涉及白細胞對血管內皮或血小板粘著的多種疾病中有效(參見例如WO 93/06863)。
抗P型選凝素抗體已在本領域內描述并已對它們的抗炎效果和抗血栓效果進行了研究。美國專利4,783,399和WO 93/06863描述了與活化的血小板反應的小鼠抗P型選凝素單克隆抗體。Geng J.G.等(J.Biol.Chem.，266(1991)22313-22318)描述了結合P型選凝素的氫基酸(aa)片段aa60-75(Cys至Glu，根據包含信號序列的Swiss-Prot序列P16109編號)的小鼠單克隆抗體。WO 93/21956涉及與一種明確的抗體競爭、可以在P型選凝素片段(aa 60-75)存在及無鈣離子時結合的小鼠抗P型選凝素單克隆抗體和人源化抗體IgG1亞類。沒有一種所提及的抗人P型選凝素小鼠單克隆抗體用于治療人類患者。在WO 93/21956中所提及的人源化的抗P型選凝素人抗體IgG1亞類正處在臨床前開發階段(www.mrctechnology.org)。
發明概述本發明涉及特征如下的抗體該抗體結合P型選凝素并且不結合人補體因子C1q。優選地，該抗體還不結合NK細胞表面的人Fcγ受體。本發明的抗體含有人源衍生的Fc部分。優選地，這些抗體是人源化抗體或人抗體。這些抗體具有新穎性和創造性特性，對患有炎性疾病和血栓性疾病、尤其患有周圍動脈硬化閉塞癥(PAOD)和重度肢體局部缺血(CLI)的患者有益處。
附圖簡述

圖1顯示本發明的抗體抑制白細胞樣HL60細胞對包被于微量滴定板上的純化的P型選凝素的粘著。突變的抗體比未突變親本抗體更有效。
圖2顯示本發明的抗體在測量凝血酶活化的血小板對HL60細胞粘著的玫瑰花結鑒定法中的抑制活性。
圖3a和3b描述本發明的抗體與大鼠P型選凝素和食蟹猴P型選凝素的交叉反應性。圖3a抗P型選凝素抗體不影響凝血酶活化的大鼠血小板對HL60細胞的粘著，而可商業性獲得的抗P型選凝素多克隆抗體(Pharmingen 09361A)抑制這種相互作用。圖3b本發明的抗體抑制活化的食蟹猴血小板對HL60細胞的粘著。
圖4a-c通過在P型選凝素轉化子、E型選凝素轉化子和L型選凝素轉化子上的代表性結合曲線證實抗體對P型選凝素、E型選凝素和L型選凝素的選擇性。本發明的抗體以0.01-0.07μg/ml范圍的EC50值結合P型選凝素CHO細胞。在E型選凝素CHO細胞和L型選凝素300.19細胞上的EC50值優選地高于100μg/ml。
圖5描述本發明的抗體在完全人流式系統中的抑制活性。本發明抗體以65次/秒的剪切速率(shear rate)以濃度依賴性方式抑制人白細胞對血小板單層的粘著。
圖6描述本發明的抗體對白細胞粘著于表達P型選凝素的人內皮細胞的抑制效果。圖6a以對照的％顯示對白細胞粘著的總抑制，圖6b代表性地表現多種抗體中的一種抗體對不同白細胞亞群的絕對數的抑制效果。
發明詳述I.定義術語“P型選凝素”指如Hsu-Lin等，J Biol Chem 2599121(1984)和Mc Ever等，J Clin Invest 8492(1989)所描述的由人血小板和內皮細胞表達的140kDa蛋白質。這種I型跨膜糖蛋白由氨基端的凝集素結構域、緊隨其后的表皮生長因子(EGF)樣結構域和九個共有重復序列結構域組成。該糖蛋白通過一個單跨膜結構域錨定于膜并且含有一個短胞質尾區。本發明提供能夠抑制一種或多種由P型選凝素介導的活性例如其炎性活性或血栓性活性的抗體。這類抗體結合P型選凝素并通過干擾P型選凝素對其配體的結合發揮作用。
術語“P型選凝素配體”優選地涉及P型選凝素的高親和性配體和與生物學相關性配體，如由Moore等；J.Cell Biol 1182445(1992)，Sako等，Cell 751179(1993)描述的粘蛋白樣糖蛋白P型選凝素配體糖蛋白-1(PSGL-1)。PSGL-1是帶胞外結構域富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的I型膜蛋白質，該蛋白質包含一系列與唾液酰化O-聚糖簇連接的十聚體重復區。PSGL-1通常由循環白細胞表達為帶兩個由二硫鍵連接的亞基并且相對分子量接近120kDa的同型二聚體。P型選凝素的結合位點位于PSGL-1的氨基最末端部分。最近證實由血小板表達并與PSGL-1具有結構相似性的唾酸粘蛋白GPIbα是P型選凝素的血小板配體(Romo等，J Exp Med190803(1999)。GPIbα結合P型選凝素的生理結果仍處于研究中，不過這種相互作用似乎對血小板的滾動和其粘著于活化的內皮細胞有貢獻(Berndt等，Thromb Haemost 86178(2001)。P型選凝素還以低親和性結合唾酰化、巖藻糖基化的小寡糖如唾酰基路易斯x(Foxall等，JCell Biol117895(1992)，Varki，Curr OpinCell Biol 257(1992)和特定的硫酸化多糖，如硫酸肝素(McEver等，J Biol Chem 27011025(1995)。
術語“抗體”包括多種形式的抗體，優選地是單克隆抗體，包括但不限于完整抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和基因工程抗體(變異抗體或突變抗體)，只要其保留本發明的特征性特性即可。特別優選的是人單克隆抗體或人源化的單克隆抗體，尤其是作為重組人抗體。
如本文中所用，術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指的是具有一種氨基酸組成的抗體分子的制品。
術語“嵌合抗體”指的是通常由重組DNA技術制備的單克隆抗體，其包含來自一個來源或一個種屬的可變區即結合區和衍生自不同來源或不同種屬的恒定區的至少一部分。特別優選的是包含鼠可變區和人恒定區的嵌合抗體。此類鼠/人嵌合抗體是包含編碼鼠免疫球蛋白可變區的DNA片段和編碼人免疫球蛋白恒定區的DNA片段的免疫球蛋白基因的表達產物。本發明所包含的“嵌合抗體”的其它形式是其中恒定區相對原始抗體的恒定區已進行修飾或改變以產生根據本發明的特性，尤其關于C1q結合和/或Fc受體(FcR)結合特性改變的嵌合抗體。此類“嵌合抗體”也稱作“類別轉換抗體”。產生嵌合抗體的方法包括目前在本領域內眾所周知的常規重組DNA技術和基因轉染技術。參見例如Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美國專利號5,202,238和5,204,244。
術語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中構架或“互補決定區”(CDR)已被修飾以便包含與親本免疫球蛋白特異性相比具有不同特異性的免疫球蛋白CDR。在一個優選的實施方案中，將鼠CDR向人抗體的構架區內移植以產生“人源化抗體”。參見例如Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327以及Neuberger，M.S.等，Nature 314(1985)268-270。特別優選的CDR對應于這樣的CDR，其代表識別以上提及的針對嵌合抗體和雙功能性抗體的抗原的序列。本發明所包括的“人源化抗體”的其他形式是其中恒定區相對于原始抗體的恒定區已進行修飾或改變以產生根據本發明的特性、尤其關于C1q結合和/或Fc受體(FcR)結合特性的那些人源化抗體。
如本文中所用，術語“人抗體”旨在包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。人抗體在本領域內是眾所周知的(vanDijk和van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5368(2001))。還可在免疫后能產生完整的人抗體庫而不產生內源性免疫球蛋白的轉基因動物(例如小鼠)中產生人抗體。人種系免疫球蛋白基因陣列轉入此類種系突變的小鼠中將導致在以抗原攻擊后產生人抗體(參見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-2555(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，733(1993))。還可以在噬菌體展示文庫(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1992)；Marks等，J.Mol.Biol，222581(19991))中產生人抗體。Cole等和Boerner等的技術也可用于制備人單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第77頁(1985)以及Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。如對本發明的嵌合抗體和人源化抗體提及，如本文中所用的術語“人抗體”還包含在恒定區中已進行修飾以產生本發明的特性、尤其關于C1q結合和/或Fc受體(FcR)結合特性的抗體。此外，本發明包括結合C1q和/或FcR的人抗體。此類人抗體特征在于對P型選凝素的選擇性高于對E型選凝素和L型選凝素的選擇性。此類本發明的抗體以0.01-0.07μg/ml范圍內的EC50結合于表達P型選凝素的細胞。在表達E型選凝素和L型選凝素的細胞上的EC50值優選地高于100μg/ml。此類抗體優選地作為制備具有本發明特點的人抗體的中間體使用。
如本文中所用，術語“重組人抗體”旨在包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的全部人抗體，例如從宿主細胞如NS0或CHO細胞或從人免疫球蛋白基因的轉基因動物(例如小鼠)分離的抗體，或利用宿主細胞內已轉染的重組表達載體表達的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變區和恒定區。本發明的重組人抗體已經歷體內(in vivo)的體細胞高變作用。因此，重組抗體中的VH和VL區的氨基酸序列是這樣的序列，它們雖然衍生自人種系VH和VL序列并與之相關，但是可以不在體內的人抗體種系庫中天然存在。
如本文中所用，“可變區”(輕鏈(VL)可變區、重鏈(VH)可變區)指的是重鏈和輕鏈對中直接參與使抗體結合抗原的每一可變區。人可變輕鏈和重鏈的結構域具有相同的一般結構并且每個結構域包含序列大部分為保守的四個構架(FR)區，其由三個“高變區”(或互補決定區，CDR)連接。構架區為β片層構象并且CDR可以形成連接β片層結構的環。每條鏈中的CDR通過構架區穩定它們的三維結構并且與來自另一條鏈的CDR共同形成抗原結合位點。抗體重鏈CDR3區和輕鏈CDR3區在本發明抗體的結合特異性/親和性中發揮特別重要的作用并且因此作為本發明的另一個目的。
當在本文中使用時，術語“高變區”或“抗體的抗原結合部分”指在抗體中負責結合抗原的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基。“構架”或“FR”區是那些除如本文中所定義的高變區殘基以外的可變結構域區域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N-末端至C-末端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是對抗原結合貢獻最大的區域。CDR和FR區根據Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的標準定義來確定和/或是那些來自“高變環”的殘基。
如本文中所用，術語“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以呈單鏈或呈雙鏈，但是優選地是雙鏈DNA。
當核酸與另一個核酸序列處于功能性聯系時，該核酸為“有效地連接”。例如，若前序列或分泌性前導區的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白，則其與這種多肽的DNA有效連接；若啟動子或增強子影響某編碼序列的轉錄，則其與該編碼序列有效地連接；或者若核糖體結合位點如此安置以至于促進翻譯，則其與編碼序列有效地連接。通常，“有效地連接”意指所連接的DNA序列是鄰接的，而且在分泌性前導區的情形中是鄰接的并且處在可讀相。然而，增強子沒有必要呈鄰接。在方便的限制性位點內，通過連接作用完成連接。若此類限制性位點不存在，則根據常規習慣使用合成性寡核苷酸銜接體或接頭。
如本文中所用，互換使用詞語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養”并且這些命名均包含子代。因此，表述“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代的受試細胞以及因此所衍生的培養物而不論轉移的次數。還應當理解的是因有意突變或無意突變，全部子代可以在DNA內容上不嚴格地相同。包括作為從最初所轉化細胞中篩選出的具有相同功能或生物學活性的變異子代。在打算明確指示時，從上下文將顯而易見。
雖然“恒定結構域”不直接參與抗體結合抗原，但是表現出多種效應子功能。抗體或免疫球蛋白根據它們重鏈恒定區的氨基酸序列劃分為如下類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可將這些類別中的幾個類別進一步劃分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。將對應于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區分別稱作α、δ、ε、γ和μ。本發明的抗體優選地是IgG型。
抗體的Fc部分直接參與補體活化、C1q結合及Fc受體結合。盡管抗體對補體系統的影響依賴某些條件，但是對C1q的結合是由Fc部分中明確的結合位點引起。此類結合位點在本領域內為已知并且例如由Boakle等，Nature 282(1975)742-743、Lukas等，J.Immunol.127(1981)2555-2560、Brunhouse和Cebra，Mol.Immunol.16(1979)907-917、Burton等，Nature 288(1980)338-344、Thommesen等，Mol.Immunol.37(2000)995-1004、Idusogie等，J.Immunol.164(2000)4178-4184、Hezareh等，J.Virology 75(2001)12161-12168、Morgan等，Immunology 86(1995)319-324、EP 0307434描述。此類結合位點例如是L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根據Kabat的EU指數編號，見以下)。IgG1、IgG2和IgG3亞類的抗體通常表現出補體活化作用以及結合C1q和C3，而IgG4不活化補體系統并且不結合C1q和C3。如本文中所用，術語“人源衍生的Fc部分”指這樣的Fc部分，其是人抗體IgG4亞類的Fc部分或者是以如此方式受到修飾以至于不能檢測到如下所定義的C1q結合和/或FcR結合的人抗體IgG1、IgG2或IgG3亞類的Fc部分。“抗體的Fc部分”是本領域技術人員眾所周知的術語并且基于木瓜蛋白酶對抗體的切割來定義。本發明的抗體含有人源衍生的Fc部分作為Fc部分并且優選地含有人恒定區的所有其他部分。優選地，Fc部分是人Fc部分，并且尤其優選地是來自人IgG4亞類或是來自人IgG1亞類的已突變的Fc部分。最優選的是示于SEQ ID NO25-28中或不帶PVA236突變的SEQ ID NO25中的Fc部分和重鏈恒定區。
II.本發明的優選實施方案本發明包含結合P型選凝素的表征如下的抗體該抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR3選自重鏈CDR3序列SEQ ID NO38、39、40、41或42。
本發明優選地提供結合P型選凝素的包含可變重鏈和可變輕鏈的表征如下的抗體可變重鏈包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1選自SEQ ID NO29、30、31、32，CDR2選自SEQ ID NO33、34、35、36、37，CDR3選自SEQ ID NO38、39、40、41、42、其中相互獨立地選擇所述的CDR。
本發明抗體優選地特征在于可變輕鏈包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1選自SEQ ID NO43、44，CDR2選自SEQ ID NO45、46以及CDR3選自SEQ ID NO47、48、49、50、51、52，其中相互獨立地選擇所述的CDR。
抗體優選地特征在于含有作為重鏈CDR的SEQ ID NO2的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO1的CDR；作為重鏈CDR的SEQ IDNO4的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO3的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO6的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO5的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO8的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ IDNO7的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO10的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO9的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO12的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO11的CDR；作為重鏈CDR的SEQ IDNO14的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO13的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO16的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO15的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO18的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO17的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO20的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO19的CDR；作為重鏈CDR的SEQ ID NO22的CDR以及作為輕鏈CDR的SEQ ID NO21的CDR。
CDR序列可根據Kabat等《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的標準定義來確定。每條鏈中的CDR通過構架氨基酸分隔。SEQ ID NO1-22的CDR示于SEQ ID NO29-52。
本發明抗體優選地特征在于該抗體結合P型選凝素并且包含獨立選自如下的可變重鏈區和可變輕鏈區a)由氨基酸序列SEQ ID NO2定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO1定義的輕鏈可變結構域；b)由氨基酸序列SEQ ID NO4定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO3定義的輕鏈可變結構域；c)由氨基酸序列SEQ ID NO6定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO5定義的輕鏈可變結構域；d)由氫基酸序列SEQ ID NO8定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO7定義的輕鏈可變結構域；e)由氨基酸序列SEQ ID NO10定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO9定義的輕鏈可變結構域；f)由氨基酸序列SEQ ID NO12定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO11定義的輕鏈可變結構域；g)由氨基酸序列SEQ ID NO14定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO13定義的輕鏈可變結構域；h)由氫基酸序列SEQ ID NO16定義的重鏈可變結構域和由氨基酸序列SEQ ID NO15定義的輕鏈可變結構域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO18定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO17定義的輕鏈可變結構域；j)由氨基酸序列SEQ ID NO20定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO19定義的輕鏈可變結構域；k)由氨基酸序列SEQ ID NO22定義的重鏈可變結構域和由SEQ IDNO21定義的輕鏈可變結構域。
本發明抗體優選地特征在于重鏈可變區包含獨立選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22的氨基酸序列。
本發明抗體優選地特征在于輕鏈可變區包含獨立選自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的氨基酸序列。
本發明涉及結合P型選凝素并且不結合補體因子C1q和/或Fc受體的抗體。這些抗體不引起依賴補體的細胞毒性(CDC)和/或抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。優選地，抗體特征在于它結合P型選凝素、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子C1q。更優選地，抗體是人抗體或人源化抗體。
本發明抗體優選地特征在于恒定鏈為人類來源。此類恒定鏈在本領域內是眾所周知的并且例如由Kabat描述(參見例如Johnson，G.以及Wu，T.T.，Nucleic Acid Res.28(2000)214-218)。例如，有用的人重鏈恒定區包含獨立選自SEQ ID NO24、25、26、27和28的氨基酸序列。例如，有用的人輕鏈恒定區包含κ-輕鏈恒定區SEQ ID NO23的氨基酸序列。
抗體Fc區中的Fc部分所介導的效應子功能指的是在抗體結合抗原后起作用的效應子功能(這些功能涉及活化補體級聯系統和/或通過Fc受體(FcR)活化細胞)。
可通過CH50鑒定法評估補體級聯系統的功能。向試驗血清中添加用抗紅細胞抗體(EA)致敏的綿羊紅細胞以便活化可引起溶血的經典途徑。裂解50％紅細胞所需的血清體積決定CH50單位。AP-CH50測量旁路途徑和終末途徑。此方法除使用兔紅細胞以外與CH50鑒定法相似。在添加試驗血清后即活化旁路途徑。
C1q和兩種絲氨酸蛋白酶C1r及C1s形成依賴補體的細胞毒性(CDC)途徑中的第一種成分即C1復合體。為了活化補體級聯系統，C1q結合于已結合靶抗原的至少兩個分子的IgG1或一個分子的IgM(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 277-94(1995))。Burton描述了(Molec.Immunol.，22(3)161-206(1985))包含第318至337位氨基酸殘基的重鏈區參與補體固定。Duncan和Winter(Nature 332738-40(1988))使用定點誘變，報道Glu318、Lys320和Lys322形成C1q的結合位點。通過含有Glu318、Lys320和Lys 322殘基的合成短肽抑制補體介導性裂解的能力證實這些殘基在結合C1q中的作用。
術語“依賴補體的細胞毒性(CDC)”指本發明抗體在補體存在時裂解表達P型選凝素的人內皮細胞和血小板。CDC優選地通過在補體存在時用本發明的抗體處理表達P型選凝素的人內皮細胞和血小板來測量。這些細胞優選地用鈣熒光素標記。若抗體在30μg/ml濃度時誘導20％或更多靶細胞的裂解則出現CDC。然而本發明人發現對于本發明抗體的特點而言，在ELISA鑒定法中對補體因子C1q減少的結合是必需的。在該鑒定法中，ELISA板原則上用濃度范圍的抗體包被，隨后向平板添加純化的人C1q或人血清。通過抗C1q的抗體和隨后通過過氧化物酶標記的綴合物檢測C1q結合。將檢測結合(最大結合Bmax)測量為過氧化物酶底物ABTS(2，2′-連氮基-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(6)]在405nm(OD405)處的光密度。因此，本發明涉及表征如下的抗體抗體對補體因子C1q的不結合指的是這種ELISA鑒定法測定，其中C1q對抗體濃度為10μg/ml時的抗體的最大結合(Bmax)小于等于對hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)細胞系的LC 1004-002抗體的Bmax的30％，優選地小于等于20％或更低。
更優選地，本發明的抗體在ELISA鑒定法中顯示出對補體因子C3減弱的結合。此鑒定法按照如C1q鑒定法相同的方式進行。在該鑒定法中，ELISA板原則上以濃度范圍的抗體包被，隨后向平板添加純化的人C3或人血清。通過抗C3的抗體，隨后通過過氧化物酶標記的綴合物檢測C3的結合。將檢測結合(最大結合Bmax)測量為過氧化物酶底物ABTS(2，2′-連氮基-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(6)]在405nm(OD405)處的光密度。因此，本發明涉及表征如下的抗體抗體對補體因子C3的不結合指的是這種ELISA鑒定法測定，其中C3對抗體濃度為10μg/ml時的抗體的最大結合(Bmax)是對hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSM ACC2641)細胞系的LC 1004-002抗體的Bmax的10％，優選地是5％或更低。
術語“抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)”是由Fc受體結合介導的功能，并且指的是在效應細胞存在時裂解表達P型選凝素的靶細胞。ADCC優選地通過在效應細胞存在時，如新鮮分離的PBMC(外周血單核細胞)或從暗黃覆蓋層(buffy coats)純化的效應細胞如單核細胞或NK(天然殺傷)細胞，用本發明抗體處理表達P型選凝素的內皮細胞的制備物來測量。靶細胞用51Cr標記，隨后與抗體溫育。將標記的細胞與效應細胞溫育并且分析上清液中所釋放的51Cr。對照包括將靶標內皮細胞與效應細胞溫育但不與抗體溫育。通過測量抗體對表達Fcγ受體的細胞如粒細胞(表達FcγRII和FcγRIII)、NK細胞(表達FcγRIII)和單核細胞(表達FcγRI和FcγRII)的結合測定抗體誘導介導ADCC的初始步驟的能力。
可通過抗體Fc區域與造血細胞上的特化細胞表面受體Fc受體(FcR)的相互作用來介導Fc受體結合的效應子功能。Fc受體屬于免疫球蛋白超家族并已證實Fc受體既介導通過吞噬免疫復合物清除包被抗體的病原體，也介導通過依賴抗體的細胞毒性(ADCC)裂解包被有相應抗體的紅細胞和多種其它細胞性靶標(例如腫瘤細胞)(Van de Winkel和Anderson，J.Leuk.Biol.49511-24(1991))。FcR通過它們對免疫球蛋白同種型的特異性來定義；對IgG抗體的Fc受體稱作FcγR，對IgE抗體的Fc受體稱作FcεR，對IgA抗體的Fc受體稱作FcαR等。Fc受體的結合在例如Ravetch和Kinet，Ann.Rev.Immunol.9(1991)457-492、Capel等，Immunomethods4(1994)32-34、de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341以及Gessner等，Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。本發明抗體優選地顯示出對Fcγ受體、優選地對FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的減弱結合。
本發明的抗體優選地不引起任何效應子功能并且不結合存在于NK細胞上的FcγR。因此，術語“不結合FcγR”意指在抗體濃度為10μg/ml時，本發明抗體對NK細胞的結合是已發現的對hu-Mab<P型選凝素>LC1004-002(DSM ACC2641)細胞系的LC 1004-002抗體結合的1％或更低。
雖然IgG4顯示出減弱的FcR結合，但其它IgG亞類的抗體顯示出強結合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(丟失Fc糖)、Pro329和234、235、236和237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434以及His435是在改變后也引起減弱的FcR結合的殘基(Shields等，J.Biol.Chem.276(2001)，6591-6604、Lund等，FASEB J.9(1995)，115-119、Morgan等，Immunology 86(1995)319-324、EP 0307434)。本發明的抗體優選地涉及在S228、L234、L235和/或D265具有突變、和/或含有PVA236或GLPSS331突變的IgG4亞類的FcR結合或者IgG1或IgG2亞類的FcR結合。突變S228P(IgG4)、L234A(IgG1)、L235A(IgG1)、L235E(IgG4)、GLPSS331(IgG1)和/或PVA236(IgG1)為特別地優選。優選的突變組合還示于表1中。一個額外優選的組合是D265A/N297A。
如本文中所用，術語“結合P型選凝素”意指在BIAcore鑒定法(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)或在ELISA中抗體對P型選凝素的結合，其中純化的P型選凝素或者P型選凝素CHO轉化子包被于微量滴定板上。
在BIAcore鑒定法中，抗體結合于表面上并且通過表面胞質共振(SPR)測定P型選凝素的結合。結合的親和性由術語ka(來自抗體/抗原復合物中的抗體的結合速率常數)、kd(解離常數)以及KD(kd/ka)來定義。本發明的抗體顯示10-8M或更低、優選地是大約10-11-10-9M的KD(參見實施例)。因此，本發明涉及如上述的抗體，其中抗體在BIAcore鑒定法中以小于10-8M的KD值結合P型選凝素，優選地其中KD范圍在10-11-10-9M。
優選地，抗體是IgG1或IgG4人亞型。
更優選地，抗體特征在于抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或在L235和S228中含有至少一個突變的人抗體IgG4亞類(根據EU指數編號)。
在P型選凝素特異性ELISA中，在微量滴定板內包被純化的P型選凝素并且以生物素化的抗人IgG和ELISA的常規步驟測定抗體對P型選凝素的結合。此鑒定法中的EC50值范圍在P型選凝素CHO細胞上優選地在0.002-0.03μg/ml之間，即本發明涉及這樣的抗體，其中對于P型選凝素結合的EC50值范圍在ELISA鑒定法中在存在P型選凝素的CHO細胞上是0.002-0.03μg/ml。在其中表達P型選凝素的CHO轉化子包被于在微量滴定板內的鑒定法中，EC50值范圍在0.01-0.08μg/ml間，優選地在0.01-0.04μg/ml間。
在E型選凝素轉化子和L型選凝素轉化子上的EC50值優選地高于100μg/ml。本發明的抗體特征在于如在其中P型選凝素以及E型選凝素和/或L型選凝素包被于微量滴定板內的ELISA鑒定法中所測定的EC50值，抗體結合P型選凝素的特異性比結合E型選凝素和/或L型選凝素的特異性高至少1000倍。
如本文中所用，術語“抑制P型選凝素配體對P型選凝素的結合”指純化的或由細胞表達的P型選凝素對其在HL60細胞表面的配體的結合。P型選凝素對其配體的結合被本發明的抗體抑制。該抑制可在分析抗體抑制P型選凝素對配體結合的能力的體外鑒定法中測量為IC50。在實施例中描述了此類鑒定法。將這類鑒定法中使用親和純化的P型選凝素和活化血小板作為P型選凝素的合適來源，并將白細胞樣細胞如HL60細胞用作配體的合適來源。在此類鑒定法中，不用升高濃度的抗體或使用升高濃度的抗體測量了表達為P型選凝素生理相關性配體的PSGL-1的HL60細胞對P型選凝素或活化血小板的粘著。將IC50值測量為至少三次獨立測量值的平均值。抑制意指不超過1μg/ml、優選地是0.5-0.08μg/ml的IC50值。
本發明抗體在0.08-0.5μg/ml、優選地在0.08-0.11μg/ml的IC50值范圍內抑制白細胞樣HL60細胞對純化的P型選凝素的粘著。在0.05-0.3μg/ml的IC50值范圍內抑制白細胞樣HL60細胞對活化的血小板的粘著。
因此，本發明的另一個實施方案涉及表征如下的抗體結合P型選凝素的EC50值在表達P型選凝素的CHO轉化子包被于微量滴定板內的ELISA鑒定法中是在0.01-0.08μg/ml范圍內。優選的范圍是0.01-0.04μg/ml。在E型選凝素轉化子和L型選凝素轉化子上的EC50值高于100μg/ml。在另一個實施方案中，本發明的抗體以0.08-0.5μg/ml間的IC50值抑制白細胞樣HL60細胞對純化的P型選凝素的粘著。優選的范圍是0.08-0.11μg/ml。
本發明的抗體在完全人流式系統(以10μg/ml的濃度)中抑制白細胞與血小板單層的相互作用優選地大于70％。此外，這些抗體在濃度為3μg/ml時在人流式系統中以60-90％的范圍抑制白細胞對活化的內皮細胞的粘著(對不同白細胞亞型具有不同影響)。
本發明的抗體優選地能夠在P型選凝素氨基酸片段aa60-75(Swiss-Prot序列P16109)存在時結合P型選凝素和/或非競爭性地抑制由命名為ATCC登錄號HB11041細胞系分泌的抗體對P型選凝素的結合。
本發明抗體優選地在ELISA鑒定法方式中不抑制P型選凝素與血小板膜糖蛋白GPIbα的相互作用。在ELISA糖萼蛋白中，在微量滴定板的孔內如(Romo等，J Exp Med 190803(1999)所述固定GPIbα的可溶性細胞外部分，并且在用P型選凝素HuMab預溫育后，用抗P型選凝素多克隆抗體檢測純化的P型選凝素的結合。
在本發明另一個優選的實施方案中，抗體的特征在于不結合C3蛋白質，更優選地特征在于它不引起依賴補體的細胞毒性(CDC)。此外，抗體可以表征為它不結合NK效應細胞表面的Fcγ受體。優選地，抗體的特征在于它是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是在L235和S228中含有至少一個突變的人抗體IgG4亞類(根據EU指數編號)。在另一個優選的實施方案中，抗體的特征在于它不引起抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。
在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體特征在于它們結合P型選凝素并且它們包含獨立選自如下的可變區a)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO2定義的重鏈可變結構域；b)由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO4定義的重鏈可變結構域；c)由氨基酸序列SEQ ID NO5定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO6定義的重鏈可變結構域；
d)由氨基酸序列SEQ ID NO7定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO8定義的重鏈可變結構域；e)由氨基酸序列SEQ ID NO9定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO10定義的重鏈可變結構域；f)由氨基酸序列SEQ ID NO11定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO12定義的重鏈可變結構域；g)由氨基酸序列SEQ ID NO13定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO14定義的重鏈可變結構域；h)由氨基酸序列SEQ ID NO15定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO16定義的重鏈可變結構域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO17定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO18定義的重鏈可變結構域；j)由氨基酸序列SEQ ID NO19定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO20定義的重鏈可變結構域；和k)由氨基酸序列SEQ ID NO21定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO22定義的重鏈可變結構域。
優選地，抗體包含由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結構域和由SEQ ID NO4定義的重鏈可變結構域。
優選的抗體特征在于抗體是人IgG4亞類或包含至少一種導致不結合補體因子C1q的氨基酸突變。這些變體抗體包含例如獨立選自SEQ IDNO25或SEQ ID NO26以及SEQ ID NO28的氨基酸序列。
在本文中，抗P型選凝素“變體”抗體指這樣的分子，其因在抗P型選凝素“親本”抗體氨基酸序列內添加、缺失和/或替換一個或多個氫基酸殘基而在氨基酸序列上與親本抗體序列不同。在一個優選的實施方案中，變體在親本抗體的一個或多個恒定區或可變區、優選地在恒定區內包含一個或多個氨基酸替換。例如，變體可以在親本抗體的一個或多個可變區內包含至少1個，例如大約1個至大約10個，并且優選地大約2個至大約5個替換。通常，變體具有與親本抗體的恒定結構域序列和/或可變結構域序列至少90％、更優選至少95％并且最優選至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在本文中，將對這種序列的同一性或同源性定義為在比對和根據需要導入缺口以獲得最大序列同一性百分數后，候選序列中與親本抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分數。抗體序列的N末端、C末端或內部延伸、缺失或插入均不構成影響序列同一性或同源性。變體保留了結合人P型選凝素的能力并且優選地具有優于親本抗體特性的特性。例如，變體可具有較強的結合親和性、增強的治療重度肢體局部缺血或周圍動脈硬化閉塞癥(CLI/PAOD)相關性疾病的能力。
本文中特別感興趣的變體抗體是當與親本抗體相比時，因消除對Fcγ受體的結合而在粘著鑒定法中在抑制活性上表現出至少大約4倍增強的變體抗體。
在本文中，“親本”抗體是由制備變體的氨基酸序列編碼的抗體。優選地，親本抗體具有人構架區并且根據需要具有人抗體恒定區。例如，親本抗體可以是人源化抗體或人抗體。
此外，本發明的抗體包括了具有不影響或不改變以上提及的本發明抗體特征的“保守序列修飾”、核苷酸序列修飾和氨基酸序列修飾的抗體。可以通過本領域內已知的標準技術如定點誘變和PCR-介導性誘變導入修飾。保守氨基酸替換包括其中用具有相似側鏈的另一種氨基酸殘基替換某氨基酸殘基的保守氨基酸替換。在本領域中已經定義了具有相似氨基酸側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，可以優選地用來自相同側鏈家族的另一種氨基酸殘基替代在人抗P型選凝素抗體中被預測為非必需的氨基酸殘基。
可基于如由Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的分子模建，通過誘變實施氨基酸替換。
在另一個優選的實施方案中，抗體包含如由SEQ ID NO23定義的κ-輕鏈恒定區。
本發明優選的抗體是定義為IgG1v1(PVA-236；GLPSS331，由E233P；L234V；L235A；AG236；A327G；A330S；P331S具體描述)、IgG1v2(L234A；L235A)和IgG4v1(S228P；L235E)的抗體。
在另一個優選的實施方案中，這些抗體還包含選自Fab、F(ab’)2和單鏈片段的抗體片段。
本發明還包括用于產生本發明抗體的方法，包括步驟a)用編碼本發明親本人抗體輕鏈的第一核酸序列和編碼該親本人抗體重鏈的第二DNA序列轉化宿主細胞，其中Fc部分已進行修飾以至該Fc部分不結合補體因子C1q和/或Fc受體；b)表達所述第一DNA序列和第二DNA序列以便產生抗體的重鏈和輕鏈和c)從宿主細胞或宿主細胞培養物獲得抗體。
本發明還涉及表征如下的中間抗體即抗P型選凝素抗體這些抗體是人抗體或人源化抗體并且如在其中P型選凝素和E型選凝素和/或L型選凝素包被于微量滴定板內的ELISA鑒定法中所測定，這些抗體結合P型選凝素的特異性比結合E型選凝素或L型選凝素的特異性高至少1000倍。優選地，這些抗體是IgG1或IgG4抗體。這些抗體還可以包含如由SEQ IDNO24γ1重鏈恒定區或SEQ ID NO27γ4重鏈恒定區定義的氨基酸序列。特別地，這些抗體指由選自細胞系hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-001(DSM ACC2640)、hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSM ACC2641)和hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-017(DSM ACC2642)產生的抗體。
此外，本發明的抗體包括了具有不影響或不改變以上提及的本發明抗體特征的“保守性序列修飾”、核苷酸序列修飾和氨基酸序列修飾的一類抗體。可以通過本領域內所知的標準技術如定點誘變和PCR-介導性誘變導入修飾。保守性氨基酸替換包括其中用具有相似側鏈的另一種氨基酸殘基替換某氨基酸殘基保守性氨基酸替換。在本領域中已經定義了具有相似氨基酸側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，可以優選地用來自相同側鏈家族的另一種氨基酸殘基替代在人抗P型選凝素抗體中被預測為非必需的氨基酸殘基。
可基于如由Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的分子模建，通過誘變實施氨基酸替換。
本發明還包括編碼如上提及的抗體的核酸分子、包含這些核酸的相應載體和這些載體的相應宿主細胞。本發明包括用于制備抗體的方法，其包括在允許合成所述抗體分子的條件下培養相應的宿主細胞以及從該培養物中獲得此抗體，例如通過在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達編碼重鏈的核酸以及編碼輕鏈的核酸并從所述的細胞中回收此多肽。
也考慮了抗體的診斷用途和治療用途。在一個診斷應用中，本發明提供用于確定P型選凝素蛋白質存在的方法，其包括將懷疑含有P型選凝素的樣品與抗P型選凝素抗體接觸并測定抗體對樣品的結合。為此用途，本發明提供包含該抗體和使用抗體檢測P型選凝素蛋白質的說明書的試劑盒。
本發明的抗體用于治療炎性疾病和血栓性疾病。此類疾病包括血管疾病如動脈粥樣硬化、動脈和深部靜脈血栓形成、血管成形術或支架放置后再狹窄。優選的應用是周圍動脈硬化閉塞癥(PAOD)和重度肢體局部缺血(CLI)。另一些應用是治療因心急梗死引起的缺血后白細胞介導性組織損傷、腦缺血事件(例如中風)、腎梗死等。此類抗體還適用于治療敗血癥、急性白細胞介導性肺損傷和過敏反應如哮喘。其他應用是預防器官移植排斥和包括類風濕性關節炎在內的自身免疫性疾病。此外，可以通過抑制循環癌細胞的粘著預防腫瘤轉移。
本發明還提供用于治療患有以上提及的炎性疾病和血栓性疾病、特別是PAOD和CLI(周圍動脈硬化閉塞癥或重度肢體局部缺血)的哺乳動物的方法。
本發明還提供以上抗體用于治療的用途，例如用于制造治療這類疾病的藥物的用途。
本發明還涉及如上定義的抗體用于制備藥物組合物的用途，并且包括含有藥用有效量的本發明抗體，任選地含有對于因藥用目的而配制抗體有用的緩沖劑和/或輔助劑的藥物組合物。
本發明還提供了包含于可藥用載體中的此類抗體的藥物組合物。在一個實施方案中，可以在制品或試劑盒內包含藥物組合物。
本發明還提供可產生本發明的此類拮抗性單克隆抗體例如親本抗體的雜交瘤細胞系。
在國際認可用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約下，將本發明優選的雜交瘤細胞系hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-001(HuMab001抗體)、hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(HuMab002抗體)和hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-017(HuMab017抗體)保藏在德國的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH；DSMZ)
可從所述的細胞系得到的抗體是本發明優選的實施方案。
優選地通過重組方法產生本發明的抗體。此類方法在本領域內是眾所周知的并且包括在原核細胞和真核細胞中表達蛋白質，隨后分離抗體多肽并且通常純化至可藥用的純度。為了表達蛋白質，通過標準方法將編碼重鏈和輕鏈的核酸或其片段插至表達載體內。在適宜的原核宿主細胞或真核宿主細胞如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞內進行表達，并且從細胞(上清液或裂解后的細胞)回收抗體。
抗體的重組性生產在本領域內是眾所周知的并且在例如Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的綜述中進行描述。
抗體可以在完整細胞、細胞裂解物中以部分純化或基本純化的形式存在。為了消除其它細胞性成分或污染物，如其它的細胞核酸或蛋白質，通過包括本領域內眾所周知的堿處理/SDS處理、柱層析和其它等在內的標準技術純化。參見Ausubel，F.等編輯《Current Protocols in MolecularBiology》，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
在NS0細胞中的表達由例如Barnes，L.M.等，Cytotechnology 32(2000)109-123；和Barnes，L.M.等，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬時表達由例如Durocher，Y.等，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可變結構域的克隆由Orlandi，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289和Norderhaug，L.等，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。優選的瞬時表達系統(HEK 293)由Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.在Cytotechnology 30(1999)71-83中和由Schlaeger，E.-J.在J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中描述。
適用于原核生物的控制序列包括例如啟動子，任選地包括操縱子序列，以及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、增強子和聚腺苷酸化作用信號。
當核酸與另一個核酸序列處于功能性聯系時，該核酸為“有效地連接”。例如，若前序列或分泌性前導區的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白，則其與這種多肽的DNA有效連接；若啟動子或增強子影響某編碼序列的轉錄，則其與此編碼序列有效地連接；或者若核糖體結合位點如此安置以至于促進翻譯，則其與編碼序列有效地連接。通常，“有效地連接”意指所連接的DNA序列是鄰接的，而且在分泌性前導區的情形中是鄰接的并且處于可讀框內。然而，增強子沒有必要呈鄰接。在方便的限制性位點內，通過連接作用完成連接。若此類限制性位點不存在，則根據常規習慣使用合成性寡核苷酸銜接體或接頭。
通過常規的免疫球蛋白純化方法例如蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養基中合適地分離單克隆抗體。使用常規方法易于分離編碼單克隆抗體的DNA和RNA并對其測序。雜交瘤細胞可作為此類DNA和RNA的來源。可將分離后的DNA插至表達載體內，隨后將該表達載體轉染至本不產生免疫球蛋白的宿主細胞如HEK293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞內，以便在宿主細胞內合成重組單克隆抗體。
通過向抗體DNA中導入適宜的核苷酸變化或者通過核苷酸的合成制備人P型選凝素抗體的氨基酸序列變體(或突變體)。然而例如如上所述，僅在極其有限范圍內進行此類修飾。例如，修飾不改變以上提及的抗體特性如IgG同種型和表位結合，但可以提高重組生產的產率、蛋白質穩定性或促進純化。
也可以替換任何不參與維持抗P型選凝素抗體正確構象的半胱氨酸殘基，以便提高分子的氧化穩定性和阻止異常交聯，通常使用絲氨酸進行替換。反之，可以向抗體中引入半胱氨酸鍵，以便提高抗體的穩定性(特別是當抗體是抗體片段例如Fv片段時)。
抗體的另一類型氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化模式。改變意味刪除一個或多個在抗體中存在的糖部分和/或添加一個或多個在抗體中不存在的糖基化位點。抗體的糖基化一般是N型連接。N型連接指糖部分連接于天冬酰胺殘基的側鏈。天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸三肽序列是糖部分與天冬酰胺側鏈發生酶連接的識別序列，其中X是除脯氨酸以外的任一氨基酸。因此，在多肽中出現這類三肽中的任何一個將產生潛在的糖基化位點。向抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列以使其含有一個或多個上述的三肽序列(對于N型連接的糖基化位點)而方便地實現。
通過本領域內所知的多種方法制備了編碼抗P型選凝素抗體氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括，但不限于(在天然存在的氨基酸序列變體情況下)從天然來源分離或通過對較早制備的人源化抗P型選凝素抗體的變異或非變異形式進行寡核苷酸介導的(或位點定向的)誘變、PCR誘變以及盒式誘變。
本發明還涉及免疫連接物，其包含綴合的本發明抗體，其中抗體綴合至細胞毒性劑如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)、放射性同位素(即放射綴合物)或用于預防或治療炎性疾病和血栓性疾病、特別是PAOD和CLI的炎性疾病和血栓性疾病的藥劑的前體藥物。使用雙功能蛋白質偶聯劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酯的雙功能衍生物(如二甲基己二酰亞胺酯HCL)、活性酯(如二琥珀酰亞氨基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮復合物(如雙-(對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙-重氮衍生物(如雙-(對重氮苯甲酰基)-亞乙基二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制備抗體和細胞毒性劑的綴合物。例如，可如Vitetta，E.S.等，Science 238(1987)1098-1104)所描述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酰芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸綴合至抗體的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。
共價修飾的另一個類型涉及以化學方式或酶方式向抗體偶聯糖苷。這些方法的有利之處在于它們不需要在具有N連接或O連接糖基化作用能力的宿主細胞內產生抗體。根據所用的偶聯模式，可以將糖連接于(a)精氨酸和組氨酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基如半胱氨酸的巰基、(d)游離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸中的游離羥基、(e)芳香族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳香族殘基或(f)谷氨酰胺中的酰胺基。這些方法在WO 87/05330以及Aplin，J.D.和Wriston，J.C.Jr.，CRC Crit.Rev.Biochem.(1981)259-306中描述。
可以通過化學方式或酶方式除去存在于抗體中的任何糖部分。化學性去糖基化需要使抗體暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。這種處理引起除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大部分糖或全部糖的切除，同時保留完整的抗體。化學性去糖基化由Sojahr，H.T.，and Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和Edge，A.S.，等Anal.Biochem.118(1981)131-137描述。可以如Thotakura，N.R.和Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359所述，通過使用多種的外切糖苷酶和內切糖苷酶完成抗體中糖部分的酶切除。
抗體共價修飾的另一個類型包括以如美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式使抗體連接于多種非蛋白聚合物中的一種，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
在另一個方面，本發明提供了來自非人轉基因動物例如轉基因小鼠的經分離B-細胞，其表達本發明的人抗P型選凝素抗體(例如由選自hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-001(DSM ACC2640)、hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSM ACC2641)和hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-017(DSMACC2642)的細胞系產生的親本抗體)。KM小鼠是合適的轉染色體小鼠。KM小鼠含有人重鏈轉染色體和人κ輕鏈轉基因。在KM小鼠中，內源的小鼠重鏈基因和輕鏈基因也被破壞，以至對小鼠的免疫引起產生人免疫球蛋白而不是小鼠免疫球蛋白。在WO 02/43478中詳述了KM小鼠的構建和它們用于產生人免疫球蛋白的用途。
優選地，分離的B細胞從用純化或重組形式的P型選凝素抗原和/或表達P型選凝素的細胞免疫的轉基因非人類動物例如轉基因小鼠得到。優選地，轉基因的非人類動物例如轉基因小鼠具有在其中包含編碼本發明的完整或部分抗體的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。隨后，將分離的B-細胞永生化以作為人抗P型選凝素抗體的來源(例如雜交瘤)。因此，本發明還提供能夠產生本發明的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個實施方案中，雜交瘤包括從轉基因非人類動物例如轉基因小鼠得到的并且已與永生化細胞融合的B細胞，其中所述轉基因非人類動物具有在其中包含編碼本發明的完整或部分抗體的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。
在一個具體的實施方案中，轉基因非人類動物是具有在其中包含編碼本發明完整或部分抗體的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組的轉基因小鼠。轉基因非人類動物可用已純化或富集的P型選凝素抗原制品和/或表達P型選凝素的細胞來免疫。優選地，轉基因非人類動物例如轉基因小鼠能夠產生抗P型選凝素的人單克隆抗體的P型選凝素同種型。
通過用已純化或富集的P型選凝素抗原制品和/或表達P型選凝素的細胞免疫轉基因非人類動物例如轉基因小鼠可產生本發明的人單克隆抗體，其中所述轉基因非人類動物具有在其中包含編碼本發明的完整或部分抗體的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。隨后得到動物的B細胞(例如脾B細胞)并且使之與骨髓瘤細胞融合以便形成分泌抗P型選凝素的人單克隆抗體的永生雜交瘤細胞。
在一個優選的實施方案中，抗P型選凝素的人單克隆抗體可使用攜帶部分人免疫系統而非小鼠系統的轉基因小鼠生成。這些文中稱作“HuMab”小鼠的轉基因小鼠含有編碼未重排的包含重鏈(μ和γ)和κ輕鏈(恒定區基因)的人免疫球蛋白基因的微基因座，并含有使內源性μ鏈和κ鏈基因座失活的靶向性突變(Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859)。因此，該小鼠表現出降低的小鼠IgM或IgK表達并且在免疫后，所導入的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因發生類型轉換和體細胞突變以便產生高親和性的人IgG單克隆抗體(Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859；綜述見于Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93以及Harding，F.和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci 764(1995)536-546)。在Taylor，L.等，Neucleic Acids Research 20(1992)6287-6295；Chen，J.等，InternationalImmunology 5(1993)647-656；Tuaillon，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90(1993)3720-3724；Choi，T.K.等，Nature Genetics 4(1993)117-123；Chen，J.等，EMBO J.12(1993)821-830；Tuaillon，N.等，Immunol.152(1994)2912-2920；Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101；Taylor，L.等，Int.Immunol.6(1994)579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；Harding，F.和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546；Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述了HuMab小鼠的產生，所有文章此處完整引用作為參考。更詳細參見美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,545,807；5,770,429；WO 98/24884；WO 94/25585；WO 93/1227；WO 92/22645和WO 92/03918。
為了產生完全的抗P型選凝素人單克隆抗體，可以如Lonberg，N.等，Nature 368(1994)856-859；Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884所述，根據常用方法，用已純化或富集的P型選凝素抗原制品和/或表達P型選凝素的細胞免疫HuMab小鼠。優選地，小鼠在首次免疫時為6-16周齡。例如，可用已純化或富集(例如從表達P型選凝素的細胞中純化)的可溶性P型選凝素抗原制品在腹膜內免疫HuMab小鼠。在用已純化或富集的P型選凝素抗原制品免疫不產生抗體時，還可以使用表達P型選凝素的細胞例如腫瘤細胞系免疫小鼠以促進免疫反應。對于多種抗原的累積經驗證實首次用在完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內(i.p.)免疫，隨后以不完全弗氏佐劑中的抗原每隔一星期(例如總計為6個星期)i.p.免疫，HuMab轉基因小鼠產生最佳的反應。可以在免疫方案實施期間用眶后采血得到的血漿樣品監測免疫反應。可通過ELISA篩查血漿，并且可將具有足夠高滴度抗P型選凝素人免疫球蛋白的小鼠用于相應B細胞的永生化。小鼠可以在處死并取出脾臟和淋巴結前3至4天以靜脈內用抗原加強免疫。對于每種抗原，預期需要進行2-3次融合。對于每種抗原，將免疫數只小鼠。例如可免疫總共12只HCo7和HCo12系HuMab小鼠。
HCo7小鼠具有在其內源性輕鏈(κ)基因中的JKD破壞(如Chen，J.等，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其內源性重鏈基因中的CMD破壞(如WO 01/14424的實施例1中所述)、KCo5人κ輕鏈轉基因(如在Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechaol.14(1996)845-851中所述)以及HCo7人重鏈轉基因(如在美國專利號5,770,429中所述)。
HCo12小鼠具有在其內源性輕鏈(κ)基因中的JKD破壞(如在Chen，J.等，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其內源性重鏈基因中的CMD破壞(如在WO 01/14424的實施例1中所述)、KCo5人κ輕鏈轉基因(如在Fishwild，D.M.等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)以及HCo12人重鏈轉基因(如在WO 01/14424的實施例2中所述)。可分離小鼠淋巴細胞并且基于標準方案使用PEG使之與小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生雜交瘤。隨后篩選得到的產生抗原特異性抗體的雜交瘤。例如，將來自免疫小鼠的脾源或淋巴結源的淋巴細胞單細胞懸液與六分之一量的非分泌性SP2/0小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)和50％PEG融合。在平底微量滴定板內接種大約2×105個細胞，隨后在選擇性培養基內培育大約2星期。
隨后通過ELISA篩選各孔的抗P型選凝素人IgM和IgG單克隆抗體。一旦出現大量的雜交瘤生長，則分析培養基，通常在10-14天后。將分泌抗體的雜交瘤再次接種，再次篩選，并且若仍顯示人IgG的抗P型選凝素單克隆抗體陽性，則可通過有限稀釋法進行至少兩次亞克隆。隨后在體外培養穩定的亞克隆以便在組織培養中產生用于表征的抗體。
因為CDR序列負責抗體-抗原的相互作用，故可以通過構建將本發明CDR序列在源自不同人抗體構架序列中包含的表達載體來表達本發明的重組抗體(參見例如Riechmann，L.等，Nature 332(1998)323-327；Jones，P.等，Nature 321(1986)522-525；和Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989)10029-10033)。此類構架序列可從包含人抗體種系基因序列的公共DNA數據庫得到。這些種系序列之所以與成熟抗體基因序列不同，在于它們不包含在B細胞成熟期間由V(D)J連接形成的已完全組裝的可變基因。種系基因序列還與高親和性的二級庫抗體的序列均勻地在可變區內的個別地方不同。
本發明還包括本發明的抗體用于體外診斷P型選凝素的用途，優選地通過測定樣品的P型選凝素與本發明抗體間結合的免疫學鑒定法體外診斷。
在另一個方面，本發明提供了組合物例如藥物組合物，其含有與可藥用載體共同配制的本發明的一種或組合的人單克隆抗體或其抗原結合部分。更具體地，組合物是藥物組合物或診斷用組合物，并且藥物組合物甚至更具體地包含如上定義的抗體和至少一種可藥用的賦形劑。
本發明的藥物組合物還可以以聯合療法即與其它藥劑聯合施用。例如，聯合療法可包含本發明的組合物和至少一種用于預防或治療重度肢體局部缺血(CLI/PAOD)相關性疾病或其它常規療法中的藥劑。
如本文中所用，“可藥用的載體”包括生理上可兼容的任何以及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。優選地，載體適用于靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如通過注射或輸注)。
“可藥用鹽”指保持抗體的目的生物學活性并且不產生任何非目的毒性效果的鹽(參見例如Berge，S.M.等，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。在本發明中包括此類鹽。此類鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些衍生自無毒無機酸的酸加成鹽，如鹽酸鹽。
可以通過本領域內所知的多種方法施用本發明的組合物。如技術人員可理解，施用的途徑和/或方式將根據目的結果變化。
為通過某些施用途徑施用本發明的化合物，需要將化合物用某材料包被或與該材料共同施用以防止化合物失活。例如，化合物可在適宜的載體如脂質體或稀釋劑中向受試者施用。可藥用的稀釋劑包括鹽水和緩沖水溶液。
可藥用的賦形劑或載體包括滅菌的水溶液或分散劑以及用于臨用前制備的滅菌可注射溶液或分散劑的滅菌粉末。在本領域內已知此類介質和藥劑作為藥用活性物質的用途。
如本文中所用，短語“腸胃外施用”和“經腸胃外施用”意指除腸道施用和局部施用以外的施用模式，一般通過注射，并且包括且不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、被膜下、蛛網膜下、椎內、硬膜外和胸骨內的注射和輸注。
這些組合物還可以包含賦形劑或輔料如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過預先的滅菌方法以及通過包含多種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚\山梨酸等確保阻止微生物的存在。在組合物中包含等滲劑如糖、氯化鈉等也是受歡迎的。此外，可通過包含延緩吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠延長可注射形式藥物的吸收。
無論選擇何種施用途徑，通過本領域技術人員所知的常規方法將本發明的可以以合適水化形式使用的化合物和/或本發明藥物組合物配制為可藥用的劑型。
本發明藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以變動，以便得到可有效實現對特定患者、組合物和施用模式所需要的治療反應而對患者無毒的活性成分量。所選擇的劑量水平取決于多種藥物動力學因素，包括所應用的本發明的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、所應用的特定化合物的排泄速率、治療持續期、與所應用的特定化合物聯合使用的其它藥物、化合物和/或材料、受治療患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和先前醫療史和其它在醫學領域內眾所周知的因素。代表性的每周劑量范圍可以是大約0.1mg/kg-大約20mg/kg或更高，這取決于如上提及的因素。
組合物必須是無菌的并且具有如此程度的流動性以至可通過注射器送遞該組合物。除水以外，載體還可以是等滲的緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。
可例如通過使用包衣劑如卵磷脂、通過在分散劑中維持目的粒徑、通過使用表面活性劑來維持適度的流動性。在許多情況下，優選在組合物中包含等滲劑例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇以及氯化鈉。可通過在組合物中包含延緩吸收的試劑如單硬脂酸鋁或明膠實現可注射組合物的長期吸收。
本發明包括用于治療需治療患者的方法，其特征在于通過向患者施用治療有效量的結合P型選凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子C1q的抗體。
本發明包括結合P型選凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子C1q的抗體用于治療的用途。
本發明包括結合P型選凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子C1q的抗體用于制備預防和治療炎性疾病和血栓性疾病的藥物的用途。
本發明包括結合P型選凝素的、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子C1q的抗體用于治療PAOD和CLI的用途。
因此，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類。在一個實施方案中，抗體是人抗體。在另一個實施方案中，抗體是人源化抗體。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中抗體不結合補體因子C1q指的是ELISA鑒定法測定，其中在抗體的濃度為10μg/ml時C1q對抗體的最大結合(Bmax)小于等于對細胞系hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)的抗體LC 1004-002的Bmax的30％。在另一個實施方案中，最大結合小于等于對細胞系hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)的抗體LC 1004-002的Bmax的20％。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中抗體在BIAcore鑒定法以低于10-8M的KD值結合P型選凝素。在另一個實施方案中，KD范圍是10-11-10-9M。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中如在P型選凝素以及E型選凝素和/或L型選凝素包被于微量滴定板的ELISA鑒定法中所測定的EC50值，抗體結合P型選凝素的特異性比結合E型選凝素和/或L型選凝素的特異性高至少1000倍。在另一個實施方案中，E型選凝素轉化子和L型選凝素轉化子的EC50值高于100μg/ml。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中抗體以不超過1μg/ml的IC50值抑制白細胞樣HL60細胞對純化的P型選凝素的粘著。在另一個實施方案中，IC50值的范圍是0.08-0.5μg/ml。仍在另一個實施方案中，IC50值的范圍是0.08-0.11μg/ml。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中(a)以0.05-0.3μg/ml的IC50值抑制白細胞樣HL60細胞對活化的血小板的粘著；(b)抗體對白細胞與血小板單層的相互作用的抑制大于70％；(c)抗體在3μg/ml濃度時在人流式系統中對白細胞粘著于活化的內皮細胞的抑制在60-90％范圍間；(d)抗體不結合C3蛋白；(e)抗體不引起依賴補體的細胞毒性(CDC)；(f)抗體不結合NK效應細胞上的Fcγ受體；或(g)抗體不引起抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。
在另一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素的特征如下的抗體該抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR3選自SEQ ID NO38、39、40、41或42的重鏈CDR3序列。
在一個實施方案中，本發明提供了包含可變重鏈和可變輕鏈的結合P型選凝素的特征如下的抗體可變重鏈包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1選自SEQ ID NO29、30、31、32，CDR2選自SEQ IDNO33、34、35、36、37，CDR3選自SEQ ID NO38、39、40、41、42，其中彼此獨立地選擇所述的CDR。
在一個實施方案中，本發明提供特征如下的抗體可變輕鏈包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，并且CDR1選自SEQ ID NO43、44，CDR2選自SEQ ID NO45、46以及CDR3選自SEQ ID NO47、48、49、50、51、52，其中彼此獨立地選擇所述的CDR。
在一個實施方案中，本發明提供特征如下的抗體該抗體結合P型選凝素并且抗體包含獨立選自如下的可變區a)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO2定義的重鏈可變結構域；b)由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO4定義的重鏈可變結構域；c)由氨基酸序列SEQ ID NO5定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO6定義的重鏈可變結構域；d)由氨基酸序列SEQ ID NO7定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO8定義的重鏈可變結構域；e)由氨基酸序列SEQ ID NO9定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO10定義的重鏈可變結構域；f)由氨基酸序列SEQ ID NO11定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO12定義的重鏈可變結構域；g)由氨基酸序列SEQ ID NO13定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO14定義的重鏈可變結構域；h)由氨基酸序列SEQ ID NO15定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO16定義的重鏈可變結構域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO17定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO18定義的重鏈可變結構域；j)由氨基酸序列SEQ ID NO19定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO20定義的重鏈可變結構域；和k)由氨基酸序列SEQ ID NO21定義的輕鏈可變結構域和由SEQ IDNO22定義的重鏈可變結構域。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中抗體包含由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結構域中的CDR1、CDR2和CDR3區域以及由SEQ ID NO4定義的重鏈可變結構域中的CDR1、CDR2和CDR3區域。在另一個實施方案中，抗體包含由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結構域和由SEQ ID NO4定義的重鏈可變結構域。
在一個實施方案中，本發明提供了結合P型選凝素、不結合補體因子C1q、含有人源衍生的Fc部分的抗體，并且特征在于該抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類，其中(a)抗體包含至少一個在Fc部分中的導致不結合補體因子C1q的氨基酸突變；(b)人重鏈恒定區包含獨立選自SEQ ID NO25、SEQ ID NO26和28的氫基酸序列；(c)抗體包含如SEQ ID NO23所定義的κ輕鏈恒定區；(d)抗體包含至少一個導致不結合補體C1q的氨基酸突變；(e)抗體包含選自IgG1v1、IgG1v2和IgG4v1的重鏈恒定區；或(f)抗體是Fab、F(ab′)2或單鏈片段。
在一個實施方案中，本發明提供特征如下的抗P型選凝素抗體該抗體a)是人抗體或人源化抗體，以及b)如在其中P型選凝素以及E型選凝素和/或L型選凝素包被于微量滴定板的ELISA鑒定法中所測定的EC50值，抗體結合P型選凝素的特異性比結合E型選凝素和/或L型選凝素的特異性高至少1000倍。在一個實施方案中，抗體包含如SEQ ID NO24、25或26γ1重鏈恒定區或SEQ ID NO27或28γ4重鏈恒定區所定義的氨基酸序列。仍在另一個實施方案中，抗體由選自hu-Mab<P型選凝素>LC1004-001(DSM ACC2640)、hu-Mab<P型選凝素>LC 1004-002(DSMACC2641)和hu-+Mab<P型選凝素>LC 1004-017(DSM ACC2642)的細胞系產生。
可以理解本發明提供了具有如段落
至
中所述定義的實施方案及其組合。
提供如下實施例、參考文獻、序列表和附圖以便輔助理解本發明、后附權利要求書中所述的本發明的實際范圍。可以理解在不脫離本發明的精神下可對如前所述的方法進行改變。
序列表的描述SEQ ID NO1 LC1004-001輕鏈，HuMab1004-001的可變結構域SEQ ID NO2 LC1004-001重鏈，HuMab1004-001的可變結構域SEQ ID NO3 LC 1004-002輕鏈，HuMab002可變結構域SEQ ID NO4 LC 1004-002重鏈，HuMab002可變結構域SEQ ID NO5 LC 1004-003輕鏈，的可變結構域HuMab003SEQ ID NO6 LC 1004-003重鏈，HuMab003的可變結構域SEQ ID NO7 LC 1004-004輕鏈(I)，HuMab004(I)的可變結構域SEQ ID NO8 LC 1004-004重鏈(I)，HuMab004(I)的可變結構域SEQ ID NO9 LC 1004-004輕鏈(II)，HuMab004(II)的可變結構域SEQ ID NO10 LC 1004-004重鏈(II)，HuMab004(II)的可變結構域SEQ ID NO11輕鏈，HuMab005的可變結構域SEQ ID NO12重鏈，HuMab005的可變結構域SEQ ID NO13輕鏈，HuMab010(I)的可變結構域SEQ ID NO14重鏈，HuMab010(I)的可變結構域SEQ ID NO15輕鏈，HuMab010(II)的可變結構域SEQ ID NO16重鏈，HuMab010(II)的可變結構域SEQ ID NO17輕鏈，HuMab010(III)的可變結構域SEQ ID NO18重鏈，HuMab010(III)的可變結構域SEQ ID NO19輕鏈，HuMab011的可變結構域SEQ ID NO20重鏈，HuMab011的可變結構域SEQ ID NO21輕鏈，HuMab017的可變結構域SEQ ID NO22重鏈，HuMab017的可變結構域SEQ ID NO23κ輕鏈恒定區SEQ ID NO24γ1重鏈恒定區SEQ ID NO25γ1重鏈恒定區PVA236/GLPSS331(IgG1v1)SEQ ID NO26γ1重鏈恒定區L234A/L235A(IgG1v2)SEQ ID NO27γ4重鏈恒定區
SEQ ID NO28γ4重鏈恒定區S228/L235E(IgG4v1)SEQ ID NO29-32重鏈CDR1SEQ ID NO33-37重鏈CDR2SEQ ID NO38-42重鏈CDR3SEQ ID NO43-44輕鏈CDR1SEQ ID NO45-46輕鏈CDR2SEQ ID NO47-52輕鏈CDR3縮寫將氨基酸縮寫為三字母代碼(Leu)或單字母代碼(L)還將抗體HuMab00X稱作抗體00XL234指根據EU編號(Kabat)在234位置處的亮氨酸L234A指將234位置處的亮氨酸變成丙氨酸PVA236指將IgG1中236區ELLG或IgG4中的EFLG修改為PVAGLPSS331指將IgG1中的331區ALPAP或IgG2中的GLPAP變為GLPSS在其它IgG亞類中進行類似修改實施例產生抗P型選凝素抗體的雜交瘤細胞系的生成雜交瘤的培養將HuMab雜交瘤在37℃和5％CO2于IMDM(Cambrex)、胎克隆1牛血清(Perbio Science)、原始雜交瘤克隆因子(Igen)、丙酮酸鈉、青霉素/鏈霉素、2-巰基乙醇、HAT(Sigma-Aldrich)和卡那霉素(Invitrogen)內培養。
產生抗P型選凝素抗體的雜交瘤細胞系的生成轉基因小鼠的免疫程序方案A將10只HCo7轉基因小鼠(5只雄性和5只雌性)、GG2201系(Medarex，San José，CA，美國)用購買自R&D System的缺乏P型選凝素跨膜結構域和胞內結構域的截短形式的重組P型選凝素免疫。對于首次免疫，將溶解于100μl PBS的50μg重組P型選凝素與100μl弗氏完全佐劑混和。對于余下的免疫，使用與KLH偶聯的重組P型選凝素。對于第二次免疫，將50μg與KLH偶聯的重組P型選凝素溶解于100μl PBS并與100μl弗氏不完全佐劑混和。對于其它的免疫，將20μg與KLH偶聯的重組P型選凝素溶解于100μl PBS并與100μl弗氏不完全佐劑混和。輪流以腹膜內免疫和皮下免疫實施免疫，并首先進行腹膜內免疫。
方案B將3只HCo7轉基因小鼠(全為雌性)、3KM(全為雄性)轉基因小鼠、GG2489系(Medarex，San José，CA，美國)用來自人衰老血小板的通過免疫親和層析(見以下)所純化的全長P型選凝素免疫。對于首次免疫，將溶解于100μl PBS的純化的50μg P型選凝素與100μl弗氏完全佐劑(CFA；Difco Laboratories，Detroit，美國)混和。對于第二次免疫，將溶解于100μl PBS的純化的50μg P型選凝素與100μl弗氏不完全佐劑(ICFA；Difco)混和。
對于所有其它免疫，使用20μg純化的P型選凝素并且使之與100μl弗氏不完全佐劑混和。
抗原特異性ELISA通過抗原特異性ELISA測定已免疫小鼠血清中的抗P型選凝素滴度。將平板(96孔平底ELISA板，Greiner)以溶解于PBS的0.1μg/ml的純化P型選凝素包被并且在室溫下包被過夜。此后，以PBSTC(含有0.05％Tween20(Sigma-Aldrich Chemie BV)和2％雞血清(Gibco)的PBS)在室溫下封閉各孔1小時。
受試的血清樣品按1∶100在PBSTC中稀釋并且加入各孔內。將自免疫前小鼠得到的血清按1∶100在PBSTC中溶解并用作陰性對照。將小鼠抗人P型選凝素抗體(1/7，由Roche Basel自行生產)按1∶100在PBSTC中溶解并用作陽性對照。將平板在室溫下溫育1小時。隨后平板用PBST(含有0.05％Tween 20的PBS)洗滌兩次。將Gt-α-huIgG-HRP(Jaekson)按1∶5000在PBSTC中稀釋并加入含有受試的樣品和陰性對照的孔內。將Rb-α-mIgG(Jackson)按1∶3000在PBSTC中稀釋并加入含有陽性對照的孔內。將平板在室溫下溫育1小時。最后平板用PBST洗滌兩次并用新鮮制備的ABTS溶液(1mg/ml)(ABTS2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))在室溫下黑暗中顯色30分鐘。在405nm測定吸收值。
小鼠的加強免疫當抗P型選凝素的血清滴度足夠高時，在融合前3天和4天用100μl在PBS中的20μg重組人P型選凝素對小鼠進行兩次靜脈內額外強化免疫。
雜交瘤生成處死小鼠并且收集脾臟和分布在腹主動脈和腔靜脈兩側的淋巴結。根據標準操作方法進行脾細胞和淋巴結細胞與融合細胞SP 2.0細胞的融合。
通過本免疫程序獲得了具有SEQ ID NO 1-22的可變重鏈序列和可變輕鏈序列的人單克隆抗體。
κ-ELISA為確定從融合得到的雜交瘤是否生成人抗體，進行了κ-ELISA。ELISA板以PBS中按1/10000稀釋的大鼠抗人IgGκ-輕鏈抗體(DAKO)通過在4℃溫育過夜包被。在傾盡各孔后，將平板與PBSTC在室溫下溫育1小時封閉。此后，各孔與PBSTC中按1/2稀釋的雜交瘤培養上清液溫育。將PBSTC中按1/2稀釋的培養基用作陰性對照，PBSTC中按1/2稀釋的κ-輕鏈陽性小鼠血清作為陽性對照。隨后，將各孔洗滌兩次并且與PBSTC中按1/2000稀釋的HRP-綴合的大鼠抗人IgG F(ab’)2(DAKO)在37℃溫育1小時。將各孔洗滌三次并且分析平板以新鮮制備的ABTS溶液(1mg/ml)在室溫(RT)下黑暗中顯色30分鐘。用ELISA板讀數儀于405nm處測定吸收值。
抗P型選凝素HuMab的可變結構域的克隆和序列分析(κ-輕鏈和γ1-重鏈)通過標準的cDNA合成/PCR方法分離了編碼P型選凝素HuMab的輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH的核苷酸序列。
使用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)從1×106-1×107個雜交瘤細胞制備總RNA。使用來自雜交瘤的RNA作為根據常規方法利用寡脫氧胸苷(dT)引物進行的第一鏈cDNA合成的模板。分別用互補于κ-輕鏈恒定區核苷酸序列和γ1-重鏈恒定區核苷酸序列的反向輕鏈引物和反向重鏈引物以及5’-特異性輕鏈引物和5’-特異性重鏈引物進行第二鏈cDNA合成以及進一步PCR擴增編碼VL和VH的cDNA片段。使用來自InvitrogenTMLifeTechnologies的TOPO TA克隆試劑盒和作為克隆載體的pCR4-TOPO對PCR產物克隆。使用EcoRI消化，通過適宜質粒的限制酶切作圖鑒定已克隆的PCR產物并且所預期/計算的VL和VHDNA片段的大小分別是大約740bp和790bp。
通過雙鏈測序測定已克隆的PCR片段的DNA序列。
使用10.2版GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)軟件包進行常規數據處理。使用GCG modul CLUSTALW比對DNA序列和蛋白質序列。對于序列比對，使用程序GENEDOC(2.1版)制表、編輯和標記顏色。
抗P型選凝素IgG1 HuMab表達質粒的構建在哺乳動物細胞表達載體中分別組裝抗P型選凝素HuMab輕鏈編碼基因和重鏈編碼基因。
為此，將編碼抗P型選凝素HuMab輕鏈可變區(VL)和人κ-輕鏈恒定區(CL)的基因片段連接，將編碼抗P型選凝素HuMab重鏈可變區(VH)和人γ1-重鏈恒定區(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的基因片段連接。
在Kabat，E.A.，Wu，T.T.、Perry，H.M.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.(1991)SEQuence of Proteins of Immunology Interest，第五版，NIHPublication No 91-3242中描述了關于人輕鏈和重鏈核苷酸序列的一般信息，從中可以推斷出密碼子的用途。
抗P型選凝素HuMabκ-輕鏈的轉錄單位包含如下元件·來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，·包含Kozak序列的合成的5’-UT，·包含信號序列內含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，·在其5’端安置單一BsmI限制性位點以及剪接供體位點并在3’端帶單一NotI限制性位點的克隆的抗P型選凝素HuMab可變輕鏈cDNA，·包含小鼠內含子2Ig-κ增強子[Picard，D.和Schaffner，W.(1984)Nature 307，80-82]的人基因組κ-基因恒定區和·人免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化(“poly A”)信號序列。
抗P型選凝素HuMabγ1-重鏈的轉錄單位包含如下元件·來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，·包含Kozak序列的合成的5’-UT，·包含信號序列內含子的已修飾的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，·在其5’端安置單一BsmI限制性位點以及剪接供體位點并在3’端帶單一NotI限制性位點的已克隆的抗P型選凝素HuMab可變重鏈cDNA，·包含小鼠Igμ-增強子(Neuberger，M.S.(1983)Embo J 2，1373-1378)的人基因組γ1-重鏈基因恒定區，·人γ1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“poly A”)信號序列。
抗P型選凝素HuMabκ-輕鏈和γ1-重鏈表達質粒的功能元件除抗P型選凝素HuMabκ-輕鏈或γ1-重鏈表達盒以外，這些質粒還包含·潮霉素抗性基因，·Epstein-Barr病毒(EBV)的復制起點oriP，·允許此質粒在大腸桿菌中復制的來自載體pUC18的復制起點，和·賦予大腸桿菌氨芐青霉素抗性的β-內酰胺酶基因。
抗P型選凝素IgG4 HuMab表達質粒的構建通過將人基因組γ1-恒定區和γ1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“poly A”)信號序列替換為人基因組γ4-恒定區和γ4-免疫球蛋白聚腺苷酸化信號序列，從抗P型選凝素γ1-重鏈表達質粒衍生抗P型選凝素γ4-重鏈的原型表達質粒。
為了表達抗P型選凝素HuMabκ-輕鏈，使用如對IgG1所描述的相同表達質粒(見上文)。
突變的(變異的)抗P型選凝素IgG1和IgG4表達質粒的構建通過使用QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)對野生型表達質粒進行定點誘變，產生了編碼突變抗P型選凝素γ1-重鏈和γ4-重鏈的表達質粒。
對于LC1004-002產生如下突變體。氨基酸根據EU編號[Edelman，G.M.、Cunningham，B.A.、Gall，W.E.、Gottlieb，P.D.、Rutishauser，U.和Waxdal，M.J.(1969)Proc Natl Acad Sci U S A 63，78-85；Kabat，E.A.、Wu，T.T.、Perry，H.M.、Gottesman，K.S.和Foeller，C.(1991)SEQuence ofProteins of Immunology Interest，第五版，No 91-3242]進行編號。
重組抗P型選凝素HuMab的產生通過瞬時轉染在補加10％超低IgG FCS(Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％體積比非必需氨基酸(Gibco)和250μg/ml G418(Roche)的DMEM(Gibco)中培養的貼壁HEK293-EBNA細胞(ATTC#CRL-10852)產生重組HuMab。為了轉染，在試劑(μl)對DNA(μg)比例3∶1-6∶1時使用轉染試劑FugeneTM6(Roche)。使用1∶2-2∶1輕鏈編碼質粒對重鏈編碼質粒的摩爾比，從兩個不同質粒表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈。在轉染后第4天至第11天收獲含有HuMab的細胞培養上清液。將上清液貯存于-20℃直至純化。
在Meissner，P.，Pick，H.，Kulangara，A.，Chatellard，P.，Friedrich，K.和Wurm，F.M.(2001)Biotechnol Bioeng 75，197-203中描述了有關例如在HEK293中重組表達人抗體的一般信息。
抗P型選凝素HuMab親和性的測定設備儀器BIACORE2000芯片CM5偶聯法胺偶聯法緩沖液HBS(HEPES，NaCl)，pH 7.4，25℃為了測量親和性，通過胺偶聯法將兔抗人Fcγ抗體(Dianova)偶聯于用來呈現抗P型選凝素抗體的芯片表面。結合大致400RU抗P型選凝素抗體。以0-50nM間的多個濃度加入重組P型選凝素(R&D Systems)。通過注入P型選凝素120秒測量結合，通過以緩沖液洗滌芯片表面180秒測量解離。不同的抗P型選凝素抗體的親和性數據示于表2。使用Biaevaluation軟件將動力學數據擬合為P型選凝素對所呈遞的單克隆抗體的1∶1朗繆爾結合模型。
P型選凝素抗體在基于細胞的粘著鑒定法和玫瑰花結鑒定法中的抑制活性材料和方法細胞粘著鑒定法在此粘著鑒定法中評估HuMab對白細胞樣HL60細胞(ATCC CCL 240)粘著于微量滴定板上包被的P型選凝素的作用。HL60細胞用BCECF-AM(2’，7’-雙-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光黃乙酰氧甲基酯；目錄號216254，Calbiochem)標記。全長的純化P型選凝素(純化方法如上)在含有150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM Tris(pH 7.4)和0.0005％T×100緩沖液中以1μg/ml的濃度在96孔板(NuncImmuno Plate Maxisorp F96)中4℃包被過夜。此后，各孔用含3.5％牛血清白蛋白(BSA，Fluka)的如上提及的緩沖液在室溫(RT)封閉2小時。各孔用50μl在含1％BSA的如上提及的緩沖液中作不同稀釋的P型選凝素HuMab或小鼠P型選凝素參考抗體(WAPS 12.2，各雜交瘤細胞系由ATCC提供)在室溫下預溫育20分鐘。加入標記的HL60細胞(50μl，70,000個細胞/孔)并允許在室溫下結合45分鐘。在某些實驗中，HL60細胞在加入各孔前與20μg/ml人IgG1預溫育30分鐘以封閉Fc受體。通過(用以上提及的緩沖液4次)溫和洗滌除去未結合的HL60細胞后，用120μl NP-40(Fluka；在H2O中1％)裂解粘著的細胞。將100μl上清液轉移至平板內以使用熒光分光光度計LS 50B(Perkin Elmer)在485nm激發波長和538nm發射波長處測量相應的熒光。
玫瑰花結鑒定法為評估抗體對活化的血小板與HL60細胞相互作用的影響，使用結合雙色細胞熒光測量分析(Evangelista等，Blood 884183(1996))的玫瑰花結鑒定法(Jungi等，Blood 67629(1986))。如(Fox等，Methods Enzymol 21545(1992))所述制備洗滌的人血小板。洗滌的人血小板用凝血酶(終濃度1U/ml)活化5分鐘并用FITC-綴合的抗人GPIIb抗體pl-36(Kouns等，J Biol Chem 26718844(1992))標記。隨后將70μl蒂羅德溶液中的1.4-2×106個血小板與不同稀釋度的HuMab(100μl)在室溫下黑暗中溫育30分鐘。加入50μl調整為20×106個/ml的HL60細胞懸液(在蒂羅德溶液中)。HL60細胞通過與20μl綴合PE(藻紅蛋白)的抗人CD45Ab(目錄編號555483，Pharmingen)溫育來標記。將標記的HL60細胞與血小板和HuMab在FACS管(Becton Dickinson)中室溫下溫育30分鐘后，使用FACScan(Becton Dickinson)通過測量血小板標記熒光和HL60細胞標記熒光，對混和的聚集物或玫瑰花結的形成進行分析。通過對數放大作用，以488nm激發波長和分別為530nm(FITC)和570nm(PE)發射波長獲得前向角散射和側向角散射以及綠色(FITC)信號和紅色(PE)信號。使用電子補償消除波譜重疊。HL60細胞基于前向角散射和側向角散射進行鑒定。對鑒定為HL60細胞的事件設門以排除單個血小板。對于每個樣品測量五千個已設門的HL60細胞事件。將在EDTA(10mmol/l)存在時混和了非活化血小板和HL60細胞或由凝血酶活化的血小板和HL60細胞的樣品用來設置綠色熒光的閾值。高于該閾值的HL60細胞百分數代表結合血小板的HL60細胞的百分數。血小板標記熒光向較低熒光值的移動表明具有較高數量粘著性血小板的混和聚集物數量的降低有利于具有小量粘著性血小板的混和聚集物數量的增加。
結果在HL60細胞粘著鑒定法中，P型選凝素抗體以0.08-0.5μg/ml范圍的IC50值抑制HL60細胞對純化P型選凝素的粘著。雖然在抗體的Fc部分中導入突變，但是如圖1中0.08-0.11μg/ml的IC50值所示，HuMab的IgG4和IgG1變體均比親本抗體更有效。當將HL60細胞與人IgG1預溫育時，如圖1中對HuMab002所顯示，未突變親本抗體的效力也以大約3至4倍IC50值降低的方式得到提高。這個發現表明突變體在粘著鑒定法中增加的效力主要歸因于消除了HL60細胞通過抗Fcγ受體的抗體Fc部分對P型選凝素的粘著。
在對表達P型選凝素的活化人血小板粘著至HL60細胞進行評價的瑰花環鑒定法中，HuMab的IC50值因為本鑒定法中較少的P型選凝素受體數目均低于粘著鑒定法中的IC50(IC500.05-0.3μg/ml、優選地在0.05-0.2μg/ml之間)。與未突變的親本抗體相比，相應HuMab的Fc變體的功效傾向增加(圖2)。在與活化的血小板溫育前，HL60細胞與IgG1和與IgG4預溫育沒有顯著影響突變體和親本抗體的抑制活性，這表明與粘著鑒定法相比，在玫瑰花結鑒定法中Fcγ受體介導的結合不起明顯作用。
P型選凝素抗體與動物物種來源的P型選凝素的交叉反應性材料和方法通過(i)使用FACS分析測量P型選凝素HuMab對來自大鼠和食蟹猴的活化血小板的結合以及測量(ii)在評估大鼠血小板和食蟹猴血小板對HL60細胞粘著的玫瑰花結鑒定法中P型選凝素HuMab的抑制活性評價該抗體的交叉反應性。
為測量HuMab對活化的大鼠血小板和食蟹猴血小板的結合，與制備洗滌的人血小板(參見以上)類似，制備洗滌的大鼠血小板和食蟹猴血小板。它們用凝血酶(終濃度1U/ml)活化5分鐘，活化的血小板與不同稀釋度的HuMab(20μl)在室溫下溫育30分鐘。在結合HuMab后，血小板用2％的PFA在室溫下固定15分鐘。將樣品用蒂羅德緩沖液洗滌并且重懸于300ml蒂羅德緩沖液內。用FITC-綴合的兔抗人IgG F(ab’)2片段(目錄編號F0056，Dako)檢測HuMab結合。使用兔抗人P型選凝素多克隆抗體(目錄編號09361A，Pharmingen)作為抑制大鼠P型選凝素的對照抗體。
如以上對人血小板所述制備洗滌的大鼠血小板和食蟹猴血小板。如對人血小板所述開展玫瑰花結鑒定法。為標記食蟹猴血小板，使用FITC-綴合的抗人GPIIb抗體pl-36，而用FITC-綴合的小鼠抗大鼠CD61抗體(目錄編號554952，Pharmingen)標記大鼠血小板。
結果如圖3a中的某些實施例所示，證實可抑制人P型選凝素所介導功能的本發明P型選凝素特異性抗體均不結合大鼠P型選凝素或均不抑制由大鼠血小板和HL60細胞組成的混合聚集物的形成。然而P型選凝素HuMab結合并抑制食蟹猴血小板P型選凝素(圖3b)。
P型選凝素抗體對E型選凝素和L型選凝素的選擇性材料和方法P型選凝素HuMab對E型選凝素和L型選凝素(ADP1和ADP2，R&D Systems)的選擇性在測量抗體對重組E型選凝素和L型選凝素結合的無細胞ELISA中測定以及測量抗體對E型選凝素-CHO轉化子和L型選凝素-300.19轉化子(如Goetz等，J.Cell Biol 137509(1997)；Ley等，Blood 821632(1993)中所述生成轉化子)結合的基于細胞的ELISA中測定。
在無細胞ELISA中，將溶于含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2、20mM Tris(pH 7.4)和0.0005％T×100緩沖液中的1μg/ml濃度的重組P型選凝素、E型選凝素或L型選凝素在96孔板(Nunc ImmunoplateMaxisorp F96)中4℃包被過夜。各孔以含有3.5％牛血清白蛋白(BSA，Fluka)的如上提及的緩沖液在室溫下封閉2小時。各孔用50μl在含有1％BSA的如上提及緩沖液中作不同稀釋的P型選凝素HuMab或小鼠P型選凝素、E型選凝素參考抗體(BBA26；R&D Systems)和山羊L型選凝素參考抗體(AF728；R&D Systems)于室溫預溫育過夜。使用生物素化的抗人IgG(Amersham，RPN1003，終濃度1∶1000)或對于對照抗體，以生物素化的抗小鼠IgG或抗山羊IgG檢測HuMab的結合。溫育1小時后，以如上提及的緩沖液洗滌各孔(3次)，并加入0.1ml在含有0.1％BSA的所提及緩沖液中按1∶750稀釋的鏈霉親合素生物素化過氧化物酶復合體(Amersham，RPN1051)作用30分鐘。隨后洗滌各孔并加入0.2ml含有ABTS(2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Boehringer，Mannheim)的過氧化物酶底物溶液(ABTS貯液1ml 40mM ABTS、5μl 30％H2O2和20ml 0.1M乙酸鈉、0.05NaH2PO4)。大約10分鐘后，使用50μl 0.1M檸檬酸和0.01％NaN3終止反應。在405nm處對顏色反應讀數。
在基于細胞的ELISA中，用細胞解離溶液(Sigma C5914)使細胞脫離壁后，將P型選凝素-CHO-轉化子和E型選凝素-CHO-轉化子接種至96孔板(TC Microwell F96 Nunc 167008)的各孔內并調節至100,000個細胞/孔，在各自的培養基內于37℃培養過夜(用于P-CHO-轉化子的培養基DMEM+10％FCS+2mM谷氨酰胺+青霉素100U/ml/鏈霉素100μg/ml；用于E型選凝素轉化子的培養基HAM F-12+10％FCS+2mM谷氨酰胺+青霉素100U/ml/鏈霉素100μg/ml+0.1％兩性霉素+100μg/ml新霉素)。在除去培養基并且以含有3％TopBlock(目錄編號TB232010；Juro)的A-T緩沖液(150mM NaCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2，20mM Tris(pH 7.4))封閉各孔1小時后，加入50μl溶于含1％TopBlock和0.1％疊氮化合物的以上提及緩沖液中的P型選凝素HuMab或小鼠P型選凝素參考抗體和小鼠E型選凝素參考抗體(參見如上)并在室溫下溫育60分鐘。在洗滌各孔(4次)后，使用如上提及的用于無細胞ELISA的相同步驟檢測結合的抗體。
因為L型選凝素300.19細胞是懸浮的細胞，必需將L型選凝素-300.19轉化子在96孔聚苯乙烯過濾平板(Corning 3510)中的各孔內接種，從而對基于細胞的ELISA方法加以調整。使用濾器平板封閉和溫育后，將溶液通過平板底部過濾除去，但除此之外本方案與使用P型選凝素-CHO細胞和E型選凝素-CHO細胞的方案相似。使用未轉染的CHO和未轉染的300.19作為對照。
結果本發明抗體相對E型選凝素和L型選凝素而言對P型選凝素呈高度選擇性。它們以0.01-0.08μg/ml、優選地以0.01-0.04μg/ml范圍的EC50值結合P型選凝素-CHO細胞，其中在E型選凝素-CHO細胞和L型選凝素-300.19上的EC50值明顯高于50μg/ml、優選地高于100μg/ml。HuMab002在基于細胞的ELISA中具有對E型選凝素和L型選凝素超過4,000倍選擇因子指數的最高選擇性。此外，HuMab002在高于基線水平直至濃度為100μg/ml時仍不與E型選凝素和L型選凝素轉化子結合。HuMab002的Fc變體IgG4v1和IgG1v1的選擇性與親本HuMab002的選擇性類似(圖4a-c)。
P型選凝素抗體在完全人血液流式系統中的離體(ex vivo)抑制活性P型選凝素HuMab對白細胞粘著血小板單層的影響材料和方法為說明P型選凝素抗體對將白細胞招募至血管壁損傷和血小板血栓形成位置處的作用，基本上如(Kirchhofer等，Blood 891270(1997))所描述，使用允許測量人白細胞與人血小板以不同剪切速率相互作用的人血液流式系統。在平行的平板灌注裝置中，將抽取自健康供體肘前靜脈的人全血在模擬受損的裸露血管壁的膠原表面撒布。如(Kirchhofer等，Blood 891270(1997))所描述制備已包被膠原的蓋玻片。將它們在三個平行的平板灌注室內放置。為了允許測量不同剪切速率(65次/秒和280次/秒)，使用不同大小的灌注室，并且以受到安裝于灌注裝置遠端的滾柱泵控制的1ml/分鐘的恒定血流灌注血液至包被膠原的蓋玻片上。從靜脈中抽取血液后并分成三個管后，立即加入GPIIb/IIIa抑制劑(0.5μmol/拉米非班)以阻止血小板聚集和產生血小板單層。與此同時施以不同濃度的P型選凝素抗體(HuMab、突變體、作為對照的各自參考抗體或人IgG1和IgG4)，隨后使血液抑制劑混合物進入包含了包被膠原的蓋玻片的灌注室內。在5.5分鐘灌注期后，使PBS通過灌注室灌注3分鐘而不中斷液流。在短暫中斷液流后，在1ml/分鐘時用PBS中的3％多聚甲醛固定灌注室2分鐘。隨后將蓋玻片從灌注室內取出，再次用PBS中的3％多聚甲醛于4℃下固定1小時并在含0.03％疊氮鈉的PBS中貯存。為評估粘著于血小板單層的白細胞的數目，蓋玻片在空氣干燥后以Diff-Quick溶液(Dade Behring AG)染色并包埋入Merckoglas(Merck，德國)。使用圖像分析系統(MCID，Imaging ResearchInc.)以確定粘著于對血流方向垂直且離蓋玻片開始處1mm遠的標準區內的白細胞數目。在65次/秒和280次/秒的剪切速率時，在其表面計數白細胞的面積分別是3.1mm2和2.1mm2。
結果P型選凝素HuMab以濃度依賴方式抑制白細胞對血小板單層的粘著，在65次/秒的剪切速率和10μg/ml濃度時，HuMab抑制60-99％、優選地70-99％的白細胞粘著。與65次/秒的靜脈剪切速率相比，HuMab的抑制效果在較高的280次/秒剪切速率(接近于動脈的情形)下更明顯。總之，在280次/秒剪切速率時，粘著的白細胞數目比在65次/秒時低。當Fc變體與分別的親本抗體相比時，它們在離體灌注室內具有類似于HuMab002及其變體IgG4v1和IgG1v1所顯示出的抑制活性(圖5)。在體外鑒定法中已發現的突變體較親本抗體增強的抑制活性在離體的灌注室內未觀察到，其可能歸咎于在人全血中的白細胞Fcγ受體的飽和。
P型選凝素HuMab對白細胞粘著內皮細胞的影響材料和方法為說明P型選凝素在剪切條件下的抗炎效力，在蓋玻片上已包被內皮細胞的情形下中使用以上提及的人血液流式系統。來自臍帶的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)根據Jaffe等，1993的方法，通過膠原酶II型(Roche瑞士)消化分離。將它們在包被1％明膠的組織培養容器內于補加20％胎牛血清(Gibco，Auckland)，100IU/ml青霉素(Gibco，Auckland)、0.1mg/ml鏈霉素(Gibco，Auckland)、2mmol/l L-谷氨酰胺(Gibco，Auckland)、10U/ml肝素(Sigma)和50μg/ml EC生長補充物(Sigma，德國)的培養基199(M199，Sigma，德國)中培養。HUVEC生長至匯合(大約4天)，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Gibco，Auckland)傳代并且在事先用1％明膠(Fluka，德國)包被的Thermanox塑料蓋玻片(大約200,000個EC/蓋玻片)上接種。可允許HUVEC定植并經過1-2天變成匯合。在開始灌注前24小時用20ng/mlIL-4(R&D Systems)刺激HUVEC并在灌注前5-10分鐘用10-4M組胺(Fluka，德國)刺激HUVEC。每次實驗使用第一次傳代的HUVEC進行。如以上所述，將具有已刺激的HUVEC匯合單層的蓋玻片置于平行平板灌注室內。與如上所述的灌注實驗相似，從健康供體中抽取全血。不過在這些實驗中，血液用凝血酶抑制劑Ro-46-6240(10μM)抗凝并在向活化的內皮細胞上灌注前即刻，與不同濃度的P型選凝素抗體(HuMab、突變體、各自的參考抗體)或作為對照的人IgG1和IgG4預溫育5分鐘。將血流調節至1ml/分鐘，剪切速率為65次/秒并且灌注時間是5.5分鐘。在用PBS洗滌3分鐘后，將具粘著性白細胞的HUVEC用3％多聚甲醛在如已描述的相同流動條件下固定2分鐘。隨后，將蓋玻片從室內取出，在新鮮固定劑中浸沒1小時，并在含0.02％疊氮鈉的PBS中保存。對于形態學分析，白細胞用小鼠抗白細胞共同抗原CD45抗體染色，其中該抗體事先使用修飾的生物素化抗小鼠免疫球蛋白(Animal Research Kits，Dako，美國)標記。細胞核用蘇木精(J.T Baker，荷蘭)進行復染。
結果用IL-4和組胺組合刺激HUVEC，引起P型選凝素的表達和不同類型白細胞的粘著，其中構成粘著性白細胞的主要部分為粒細胞(包括PMN和嗜酸性粒細胞)。本發明的HuMab在3μg/ml時抑制總白細胞群體60-90％的粘著。Fc變體的總體抑制活性與未突變的HuMab的總體抑制活性相比較，沒有顯著差異。
P型選凝素HuMab對不同的白細胞亞型表現出差異性影響。與單核白細胞相比，對粒細胞的影響更顯著。本發明的抗體抑制90-99％的粒細胞(包括PMN和嗜酸性粒細胞)粘著、50-88％的單核細胞粘著以及5-40％的淋巴細胞粘著。在圖6中代表性顯示IgG4v1對不同白細胞亞型的絕對數目分別的下降。
P型選凝素HuMab活化補體系統的潛力C1q和C3c結合ELISA使用ELISA方法測定本發明抗體誘導C1q結合和C3a活化的能力。C1q是適應性免疫的部分并且在結合免疫復合物后啟動數個酶原依次活化。這些酶反過來引起C3分子切割，這可導致發生炎癥反應、調理外來或異常顆粒和裂解細胞膜。
原則上，ELISA板以濃度范圍內的抗體包被，將人C1q或作為C3來源的人合并血清加入該平板內。通過抗C1q或C3ε抗體及隨后的過氧化物酶標記的綴合物檢測C1q或C3ε的結合。
HuMab002(雜交瘤來源的材料和瞬時轉染瘤來源的材料)、其突變變體及對照抗體在濃度為0.16-20μg/ml進行測試。使用極微弱結合C1q的人IgG4(CLB，荷蘭，0.5μg/ml貯存)作為陰性對照。包含人IgG1(Sigma，2μg/ml貯存)作為陽性對照。為檢測C1q，使用兔抗C1q抗體(Dako)和綴合辣根過氧化物酶的豬抗兔IgG抗體(Sigma)。為檢測C3ε，使用小鼠抗人C3抗體和綴合辣根過氧化物酶的兔抗小鼠IgG抗體(Sigma)。
使用Graphpad Prism軟件以非線性回歸曲線擬合(單位點結合)計算在10μg/ml HuMab時的EC50值或最大結合(Bmax)。
結果如由來自雜交瘤的材料和來自瞬時轉染瘤的材料的EC50值0.946μg/ml和1.159μg/ml，以及Bmax(OD405)值0.987和0.711分別顯示，本發明的HuMab002能夠有效地結合C1q。如所預期，由OD405的Bmax值0.222顯示，人IgG4陰性對照不結合C1q。然而分別如OD405的Bmax值0.132、0.119和0.132所示(表3)，全部三種受試的Fc-變體(IgG4v1、IgG1v1、IgG1v2)均喪失結合C1q的能力。與C1q結合能力一致，C3對(來自雜交瘤和來自轉染瘤)HuMab002的沉積以抗體濃度依賴方式發生，并且EC50值范圍在2.7μg/ml-8.3μg/ml間。然而如由OD405Bmax值0.104、0.156和0.133分別顯示(表3)，全部三種Fc-變體均不能啟動C3沉積。
因為HuMab002與補體成分相互作用，所以該抗體具有內在的誘導體內(in vivo)CDC的潛力。因此，根據本發明修飾了該抗體的Fc部分。
P型選凝素HuMab結合Fcγ受體的潛力IgG抗體依賴的細胞毒性效應由效應細胞上的Fcγ受體介導。通過FACS分析研究了來自雜交瘤和來自轉染瘤的HuMab002以及突變變體和對照抗體對來自人血液的表達FcγR的效應細胞的結合。
材料和方法將FcγRI IIA1.6轉化子或新鮮分離的效應細胞與抗體溫育，并且用FITC標記的兔抗人IgG F(ab)2(DAKO)或FITC標記的兔抗人IgG F(ab)2(BD/Pharmingen)檢測抗體結合。HuMab002(瞬時的來自轉染瘤的和/或來自雜交瘤的材料以及突變變體)在濃度為1μg/ml(IIA1.6轉化子)或10μg/ml(效應細胞)時進行測試。用一級抗體或人IgG4(10μg/ml)缺乏作為陰性對照。為檢測IIA1.6細胞上的FcγRI表達，使用FITC標記的小鼠抗人CD64(BD/Pharmingen)。在使用已富集NK細胞的外周血單核細胞的實驗中，通過使用PE標記的小鼠抗人CD56(BD/Pharmingen)的雙染色鑒定NK細胞。基于FSC/SSC圖譜鑒定粒細胞和單核細胞。
將IIA1.6細胞、IIA1.6-FcγRI轉化子和新鮮分離的效應細胞與抗體溫育。用FITC標記的Rb-α-huIgG F(ab)2(DAKO)或FITC標記的Rb-α-huIgG F(ab)2(BD/Pharmingen)檢測抗體結合。
HuMab002(瞬時的來自轉染瘤的材料、來自雜交瘤的材料和突變變體材料)在IIA1.6-FcγRI轉化子結合鑒定法中以1μg/ml的濃度進行測試。使用IIA1.6野生型細胞作為陰性對照。使用m-α-huCD64-FITC(BD/Pharmingen)作為FcγRI表達的對照。
HuMab002(瞬時的來自轉染瘤的材料、來自雜交瘤的材料和突變變體材料)在效應細胞結合鑒定法中以10μg/ml的濃度進行測試。在粒細胞結合鑒定法中不測試瞬時的轉染瘤材料。使用IgG4(10μg/ml)作為在除了粒細胞結合鑒定法以外的所有其它效應細胞結合鑒定法中的陰性對照。
使用NK分離試劑盒(Dynal Biotech ASA，Oslo，挪威)富集全血中的NK細胞，通過m-α-huCD56-FITC染色鑒定NK細胞。
如NK分離試劑盒(Dynal Biotech ASA，Oslo，挪威)中包含的手冊所描述，使用Ficoll方法從全血分離PBMC(外周血單核細胞)。基于FSC/SSC圖譜鑒定單核細胞。使用FACS裂解緩沖液從全血分離粒細胞并且基于FSC/SSC圖譜進行鑒定。
將新鮮分離的效應細胞與抗體溫育，并且用FITC標記的兔抗人IgGF(ab)2(DAKO)或FITC標記的兔抗人IgG F(ab)2(BD/Pharmingen)檢測抗體結合。HuMab002(瞬時的來自轉染瘤的和/或來自雜交瘤的材料以及突變變體)在10μg/ml濃度下進行測試。用一級抗體或人IgG4(10μg/ml)缺乏作為陰性對照。通過NK分離試劑盒(Miltenyi Biotec，美國)從MNC樣品分離NK細胞。在使用富集NK細胞的外周血單核細胞的實驗中，通過使用PE標記的小鼠抗人CD56(BD/Pharmingen)的雙染色鑒定NK細胞。根據本領域現有技術從PBMC(例如單核細胞分離試劑盒(參見以上Miltenyi))分離粒細胞和單核細胞。基于FSC/SSC圖譜鑒定粒細胞和單核細胞。
結果如通過對粒細胞、單核細胞和NK細胞的結合所顯示，本發明的HuMab002能夠結合FcR。全部三種受試的Fc變體(IgG4v1、IgG1v1和IgG1v2)完全喪失結合NK細胞的能力(表4)。此外，HuMab002有效地結合粒細胞和單核細胞，同時如表5和表6中結合細胞的抗體的百分數所顯示，該突變變體表現出與在一級抗體或人IgG4缺乏時可比的結合水平。這表明該突變變體喪失與效應細胞上的FcR相互作用的能力。
因為HuMab002可有效地與FcR相互作用，故這種抗體具有內在的誘導體內(in vivo)抗體依賴細胞毒性的潛力。本發明Fc-變體與FcR相互作用的喪失以有效方式防止了ADCC。

序列表序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司<120>抗P型選凝素抗體<130>22354WO<160>52<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ash Asn Trp Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>2<211>124<212>PRT<213>人<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
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<400>37Ala Ile Ser Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys Gly1 5 10 15<210>38<211>16<212>PRT<213>人<400>38Gly Arg Ile Ser Met Asp Arg Gly Val Lys Asn Asn Trp Phe Asp Pro1 5 10 15<210>39<211>16<212>PRT<213>人<400>39Gly Arg Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Asp Trp Phe Asp Pro1 5 10 15<210>40<211>19<212>PRT<213>人<400>40Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly1 5 10 15Met Asp Val<210>41<211>8<212>PRT<213>人<400>41Asp Asp Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5<210>42<211>16
<212>PRT<213>人<400>42Gly Arg Phe Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Asp Trp Phe Asp Pro1 5 10 15<210>43<211>11<212>PRT<213>人<400>43Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>44<211>11<212>PRT<213>人<400>44Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10<210>45<211>7<212>PRT<213>人<400>45Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>46<211>7<212>PRT<213>人<400>46Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>47<211>9<212>PRT
<213>人<400>47Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Leu Thr1 5<210>48<211>9<212>PRT<213>人<400>48Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr1 5<210>49<211>9<212>PRT<213>人<400>49Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>50<211>10<212>PRT<213>人<400>50Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Val Thr1 5 10<210>51<211>9<212>PRT<213>人<400>51Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>52<211>9<212>PRT<213>人
<400>52Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Pro Leu Thr1 權利要求
1.一種抗體，其結合P型選凝素、不結合補體因子Clq、含有人源衍生的Fc部分，并且特征在于所述的抗體是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中含有至少一個突變的人抗體IgG1亞類或者是其中S228替換為P并且L235替換為E的人抗體IgG4亞類。
2.雜交瘤細胞系DSM ACC2640、DSM ACC2641或DSM ACC2642。
3.抗P型選凝素抗體，其可獲自雜交瘤細胞系DSM ACC2640、DSMACC2641或DSM ACC2642。
4.抗P型選凝素抗體，其特征在于a)所述抗體是人抗體或人源化抗體，以及b)如在其中P型選凝素以及E型選凝素和/或L型選凝素包被于微量滴定板的ELISA鑒定法所測定的EC50值所示，所述抗體結合P型選凝素的特異性比結合E型選凝素和/或L型選凝素的特異性高至少1000倍。
5.核酸分子，其編碼權利要求1、3或4的抗體分子。
6.載體，其包含權利要求5的核酸分子。
7.宿主細胞，其包含權利要求6的載體。
8.用于制備權利要求1、3或4的抗體分子的方法，其包括在允許合成所述抗體分子的條件下培養權利要求7的宿主細胞以及從所述培養物回收所述抗體分子。
9.組合物，其包含權利要求1、3或4的抗體分子或通過權利要求8的方法產生的抗體分子。
10.權利要求9的組合物，其是藥物組合物或診斷用組合物。
11.藥物組合物，其包含權利要求1、3或4的抗體和至少一種可藥用賦形劑。
12.用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向患者施用治療有效量的根據權利要求1、3或4的抗體。
13.如權利要求1、3或4中所述抗體的用途，用于治療。
14.如權利要求1、3或4中所述抗體的用途，用于制備預防和治療炎性疾病和血栓性疾病的藥物。
15.權利要求14的用途，用于治療PAOD或CLI。
16.試劑盒，其包含權利要求1、3或4的抗體分子、權利要求5的核酸分子、權利要求6的載體或權利要求7的宿主細胞。
17.包含抗體的組合物，其特征在于所述抗體結合P型選凝素、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子Clq。
18.權利要求17的組合物，其是藥物組合物或診斷用組合物。
19.用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向患者施用治療有效量的結合P型選凝素、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子Clq的抗體。
20.結合P型選凝素、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子Clq的抗體的用途，用于治療。
21.結合P型選凝素、含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子Clq的抗體的用途，用于制備預防和治療炎性疾病和血栓性疾病的藥物。
22.權利要求21的用途，用于治療PAOD和CLI。
23.如本文中所述的本發明。
全文摘要
本發明涉及抗P型選凝素抗體，并且特別是涉及含有人源衍生的Fc部分并且不結合補體因子C1q的抗P型選凝素抗體及其變體。這些抗體具有新穎性和創造性特性，對患有重度肢體局部缺血或周圍動脈硬化閉塞癥(CLI/PAOD)的患者有益處。
文檔編號C07K16/46GK1942483SQ200580011205
公開日2007年4月4日 申請日期2005年4月5日 優先權日2004年4月13日
發明者Y·格勞斯, J·海姆伯, M·賈森-莫倫納爾, D·克林, E·科佩茨基, P·帕倫, F·雷伯斯, B·斯坦納, A·施特恩, P·施特賴因, K-G·施圖本拉赫, J·范德溫克爾, M·范武格特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司