專利名稱：胡楊PeDREB2基因及應用的制作方法
技術領域：
本發明設計胡楊(Populus euphratica)DREB類轉錄因子及其編碼基因與應用，特別是涉及胡楊DREB類耐寒和耐旱轉錄因子及其編碼基因與應用。
背景技術：
胡楊(Populus euphratica)是唯一能在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的干旱沙漠地區生長的喬木建群樹種。作為天然的抗逆性極強的典型植物，胡楊已引起國際學術界的重視。研究、開發和利用胡楊抗逆性基因資源，對于深入林木抗逆性機理以及定向培育抗逆林木新品種具有重要的價值。生物體的細胞能夠對外界環境條件的變化做出相應的反應，在植物中，AP2/DREB家族中的DREB類轉錄因子能夠接受環境脅迫信號，啟動一系列脅迫應答基因的表達，從而增強植物對逆境的耐受力。
發明內容
本發明的目的是提供胡楊中的一種與抗逆性相關的DREB類轉錄因子及其編碼基因，該轉錄因子首次在胡楊中克隆，在抗寒和抗旱反應中具有調控作用。本發明所提供的DREB類轉錄因子來源于胡楊，是DREB2家族中的一個，命名為PeDREB2，是具有與序列表2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列表2氨基酸殘基序列經過一個或者幾個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與序列的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質序列表中序列氨基酸殘基序列是由287個氨基酸殘基組成的蛋白質，序列表2下劃線為直線的序列為該基因核定位信號，其保守的AP2/DREB結構域序列為自氮端到碳端第78-135位氨基酸殘基，即序列表2中下劃線為虛線的部分。
抗逆轉錄因子PeDREB2的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列2)與序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由864個堿基組成，為該基因的開放讀碼框序列，含有保守的AP2/DREBP結構域序列，其表達受到低溫、干旱和高鹽的誘導。
本發明所提供的編碼轉錄因子PeDREB2的基因，使用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體(包括雙元農桿菌載體以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體)轉化植株，可獲得對低溫和干旱脅迫抗性增強的轉基因植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，可以使用增強子，但是必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。
為了便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定及篩選，可以在構建載體時對載體進行加工，例如加入可選擇性標記，通常使用的可選擇性標記可以是編碼對抗生素(包括慶大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因，也可以是GUS、GFP等可以產生顏色變化的酶或發光化合物的基因等。
攜帶有本發明的PeDREB2基因的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，以培育抗寒或抗旱的植物品種，例如Ti質粒、Ri質粒、電穿孔、微注射、植物病毒載體、直接DNA轉化或植物病毒載體等，所轉化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明
圖1是通過RT-PCR技術克隆得到的基因全長電泳圖，圖中M為markerD2000，1為基因PeDREB2；圖2為PeDREB2基因在低溫條件下RT-PCR檢測結果；圖3為PeDREB2基因在干旱條件下RT-PCR檢測結果；圖4為PeDREB2基因在高鹽條件下RT-PCR檢測結果。
具體實施例方式
實施例1，胡楊總DNA的提取用CTAB(薩姆布魯克，分子克隆實驗指南，第三版)的方法從干旱處理的胡楊中提取總DNA。
實施例2，PeDREB2開讀框的克隆總用引物PDR1(GGTCCTGAGATCGAGAATATG)和PDR2(AGAAAACGCTACAAAGATGTC)對提取的胡楊DNA進行PCR。PCR程序為(1)94℃，變性5分鐘。(2)PCR擴增，30個循環94℃，變性45秒；55℃退火45秒；72℃，延伸45秒；(3)72℃，延伸10分鐘。將PCR產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分離，然后用天為時代的瓊脂糖DNA分離試劑盒回收目的片斷并與TaKaRa公司的pMD18載體進行連接，連接的反應體系為目的片斷4μl，1μl pMD18 vector，5μlLigation Mix，(60ng/μl)，于16℃過夜連接，再將連接產物轉化感受態的大腸桿菌TOP10，用PCR的方法檢測陽性菌株，最后取轉化成功的菌株在奧科進行DNA序列測定。
實施例3，胡楊總RNA的提取及PeDREB2 cDNA序列的克隆用CTAB(薩姆布魯克，分子克隆實驗指南，第三版)的方法從干旱處理的胡楊中提取總RNA，總RNA用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA，然后用引物PDR1(GGTCCTGAGATCGAGAATATG)和PDR2(AGAAAACGCTACAAAGATGTC)對該cDNA進行PCR。PCR程序為(1)94℃，變性5分鐘。(2)PCR擴增，30個循環94℃，變性45秒；55℃退火45秒；72℃，延伸45秒；(3)72℃，延伸10分鐘。將PCR產物用瓊脂糖進行電泳分離，然后用天為時代的瓊脂糖 DNA分離試劑盒回收目的片斷并與pGM-T Easy載體進行連接，連接的反應體系為目的片斷7μl，1μl 10×連接酶緩沖液，1μl pGM-T Easy Vector(60ng/μl)，1μl的T4DNA連接酶，于16℃連接過夜。再將連接產物轉化進感受態的大腸桿菌Top10，最后取轉化成功的菌株在奧科公司進行序列測定，測定結果和其DNA序列相比得知PeDREB2不含內含子。
實施例4，胡楊PeDREB2基因在逆境中的表達特性對于從新疆取得的兩年生胡楊植株，分別進行低溫處理(4℃)或干旱處理、鹽處理，根據實驗設計的時間取葉片，經液氮速凍，提取RNA作RT-PCR分析，RT-PCR反應以胡楊的Actin2為對照，以控制PCR反應中模板cDNA的濃度一致，結果如圖2，3，4所示。
實施例5，胡楊PeDREB2基因表達載體的構建用兩頭加有Xbal酶切位點接頭的引物從含有其cDNA序列的克隆載體上進行PCR，得到的產物連接到克隆載體上，菌落鑒定后將得到的陽性克隆搖菌、提質粒，并用Xbal酶切3小時，同時提取pBI121質粒，也用Xbal酶切3小時將得到的酶切產物用天為時代的連接酶16℃過夜連接，分別轉化大腸桿菌Top10，得到的正向和反向的陽性產物進一步轉化農桿菌LBA4404。
序列表序列表1 ATGGGTACTCTTATTCAAGGTTCTAACGCCACTTCCATGTCCATGGATTCTACCAAGAAG序列表2 M G T L I Q G S N A T S M S M D S TK K61 AGGAAAAGGGCAAGTAATAAATCTGTAGCTGAGACCCTTCAAAAGTGGAAGGAATACAAT21R K RA S N K S V A E T L Q K W K E Y N121 GAGTATCTTGATGCTCAAGGTGATGAAGGTAACAAACCAGTTCGTAAAGTTCCTGCCAAG41E Y L D A Q G D E G N K P V R K V P A K181 GGCTCAAAGAAGGGGTGCATGAAAGGTAAAGGAGGCCCAGAGAATTCAGTCTGCAATTAC61G S K K G C M K G K G G P E N S VC N Y241 AGAGGTGTGAGACAGAGGACATGGGGGAAGTGGGTTGCTGAGATTCGGGAGCCAGACAGA81R G V R Q R T W G K W V A E I R E P D R301 GGGCCTAGGCTATGGCTTGGTACTTTTCCTACTGCCTATGAAGCTGCTCTTGCCTATGAT101G P R L W L G T F P T A Y E A A L A Y D361 AATGCTGCACGAACTATGTATGGTCCTCGTGCTCGTTTAAACATTCCAGATGTGGTGAAT121N A A R T M Y G P R A R L N IP D V V N421 TCAACAAGCTCATCGAAGGATAACTTCTCTGCTGTGACACCATCATACTATTATTCAGCT141 S T S S S K D N F S A V T P S Y Y Y S A481 GCAAGTTCTGCTGACTCCGTCACCACATCAACCCACTCTGAGGTTTGTGCGTACGAGGAT161 A S S A D S V T T S T H S E V C A Y E D541 CCTAACCAGAATGTATTAAGCCATGCTGAGGATTGGATGACAAATATATCAAGCCAAGCT181 P N Q N V L S H A E D W M T N I S S Q A601 GAGGTTTGCGAGCAGAATGCATCAAGCCAAACTGAGGTTTACGAGCAGAATGTATCAAGC201 E V C E Q N A S S Q T E V Y E Q N V S S661 CAGCATGTCGAGGATTGTTCTCGGGGAGTTGAAAAAAATAGCAAGCTGAGTCAAGATGAG221 Q H V E D C S R G V E K N S K L S Q D E721 CTGAAGATTCAACCAGAAAATCCTTCGTGGGCCAATGACTGTCACGACTACGGCTGGGAT241 L K I Q P E N P S W A N D C H D Y G W D781 GAGATCTTTAGCGTAGAAGAGCTGCTAGGGGATATCGATTCTGGGATGACAGGAGCAGAG261 E I F S V E E L L G D I D S G M T G A E841 GGGTACTTCAGCTTAGGATTTTGA281 G Y F S L G F *
權利要求
1.胡楊的DREB類轉錄因子PeDREB2，它具有與序列表中序列2的氨基酸殘基序列獲將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的轉錄因子，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.胡楊DREB類轉錄因子PeDREB2的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述胡楊DREB類轉錄因子PeDREB2的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.權利要求4所述的基因，其開放閱讀框是自5’端第1到第864位堿基。
6.含有權利要求3所述的基因的表達載體。
7.含有權利要求3所述的基因的細胞系
8.權利要求3所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了胡楊(Populus euphratica Olive)DREB類耐寒和耐旱轉錄因子及其編碼基因與應用，目的是提供胡楊的DREB類轉錄因子及其編碼基因，該轉錄因子在植物抗寒和抗旱中有調控作用，本發明提供的DREB類轉錄因子命名為PeDREB2，具有與序列表2的氨基酸序列或將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。抗逆轉錄因子PeDREB2的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的PeDREB2基因在培育抗寒和抗旱植物品種中具有重要作用。
文檔編號C07H21/04GK1982334SQ20051013045
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月13日 優先權日2005年12月13日
發明者尹偉倫, 夏新莉, 陳金煥 申請人:尹偉倫, 夏新莉, 陳金煥