專利名稱：一種抑制VEGF表達的siRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抑制VEGF表達的siRNA及其應用。
背景技術：
腫瘤的生長和轉移需要生成新的血管。在腫瘤形成的早期，腫瘤細胞主要通過擴散作用獲得營養和氧氣，但這樣僅能長至2～3mm3。為了進一步的生長和遷移，必須有新的血管的生成，新生成的血管把還在生長的腫瘤和循環系統直接連接起來，使其供腫瘤生長的物質得以交換。除此之外，腫瘤還利用新生血管通過血液循環將原發癌細胞輸送至轉移靶器官。因此，血管新生與腫瘤生長、轉移有著密切的關系。血管的生成是復雜的過程。它是由內皮細胞、細胞外基質以及正負調控因子相互作用的多步驟過程。其中血管內皮細胞生長因子(VEGF)作為血管生成的正性調控因子在血管生成過程中起到關鍵作用。VEGF具有增加微血管的通透性、促進不同來源的內皮細胞分裂增殖和血管構建、促使內皮細胞的遷移等多種作用，是已知的最強的血管生成因子。在許多腫瘤中VEGF的表達均上調，這使VEGF成為通過抑制腫瘤血管的生成來治療腫瘤的重要靶點。
RNA干擾技術的發展，提供了一種通過抑制病毒、癌基因等疾病相關基因的表達來治療疾病的新的基因治療方法。RNA干擾(RNAi)是植物以及其它一些生物使用的抵御病毒的古老防御機制，研究發現RNA干擾可能也存在于哺乳動物中。所謂的小干擾RNA(siRNA)，即用20多個核苷酸組成的短的雙鏈RNA(siRNA)代替傳統反義核酸進行特異性的轉錄后基因沉默，已經迅速而廣泛地應用到基因表達調控機制研究等熱門領域，和抗病毒、抗腫瘤等治療領域。
發明內容
本發明的目的是提供一種抑制VEGF表達的siRNA及其應用。
本發明所提供的抑制VEGF表達的siRNA，是下述VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA-2’-deoxy2；所述VEGF-siRNA-2’-deoxy1由正義鏈和反義鏈組成，它的正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列，序列3和序列4的自5′端的第1至19位核苷酸均為核糖核苷酸、自5′端的第20和21位核苷酸均為胸腺嘧啶脫氧核苷酸；所述VEGF-siRNA-2’-deoxy2由正義鏈和反義鏈組成，它的正義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列6的核苷酸序列，序列5和序列6的自5′端的第1至19位核苷酸均為核糖核苷酸、自5′端的第20和21位核苷酸均為胸腺嘧啶脫氧核苷酸。
序列表中的序列3、4、5和6均由21個核苷酸組成，序列的方向從左至右均為5′端→3′端。
VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2可化學合成。
所述VEGF-siRNA-2’-deoxy1的作用靶序列具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述VEGF-siRNA-2’-deoxy2的作用靶序列具有序列表中序列2核苷酸序列。
用VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2轉染宮頸癌細胞株Hela、肝癌細胞株HepG2、乳腺癌細胞株MCF7、肺癌等腫瘤細胞的實驗結果表明VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2能在mRNA和蛋白水平有效抑制VEGF的表達，抑制VEGF mRNA的表達和蛋白水平的表達達到60-90％以上。VEGF-siRNA-2’-deoxy1的效應半衰期的測試結果表明，與未去羥基修飾的VEGF-siRNA1相比，VEGF-siRNA-2’-deoxy1抑制VEGF表達的效應半衰期由去羥基修飾前的2.5天延長到5天。
本發明的另一個目的是提供一種抑制腫瘤的藥物。
本發明所提供的抑制腫瘤的藥物，它的活性成分為VEGF-siRNA-2’-deoxy1和/或VEGF-siRNA-2’-deoxy2。
VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2可與體內轉染試劑RNAi-mate混合后一起使用。
VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2通過抑制宮頸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤細胞的VEGF mRNA的表達和蛋白水平的表達，實現抑制宮頸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤的血管生成和腫瘤的生長。
將Hela細胞接種裸鼠，形成腫瘤后用VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2治療的實驗證明VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2能在體內有效抑制腫瘤生長。
作為和其他siRNA不同的一種新型的抗腫瘤藥物，VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2不易被降解，有較長的半衰期，能用于體外實驗，更能用于體內治療。能有效抑制腫瘤細胞VEGF的表達和阻止腫瘤血管的生成，抑制腫瘤，用于宮頸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤的治療。
圖1為ELISA方法檢測VEGF表達水平結果柱形圖。
圖2為RT-PCR方法檢測VEGF的mRNA表達水平結果電泳和柱形圖。
圖3為RT-PCR檢測化學修飾對siRNA效應半衰期的影響。
圖4為VEGF-siRNA-2’-deoxy1治療宮頸癌的效果圖。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy1的合成根據Reynolds的原則自己編寫了siRNA的預測程序。從http//www.ncbi.nlm.nih.gov/上獲得VEGF的cDNA序列(GenBANK號NM_003376.4)，然后使用預測程序預測siRNA。在對比預測的siRNA的結果之后選擇一些siRNAs。對這些選定的siRNAs的兩條鏈都進行一次Blast搜索(數據庫選用NBCI的nr數據庫)，這樣可以確保siRNA只對這一個靶基因起作用。最后選定VEGF的mRNA序列的第612-630位的19個核苷酸序列為VEGF-siRNA-2’-deoxy1所針對的靶序列，其針對的靶基因VEGF的mRNA序列為5’-CGAACGUACUUGCAGAUGU-3’(SEQ ID No.1)；VEGF的mRNA序列的第189-207位的19個核苷酸序列為VEGF-siRNA-2’-deoxy2所針對的靶序列，該針對的靶基因VEGF的mRNA序列為5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’(SEQ ID No.2)。其中VEGF-siRNA-2’-deoxy1的正義鏈為5’-CGAACGUACUUGCAGAUGUTT-3’(SEQ ID No.3)；反義鏈為3’-TTGCUUGCAUGAACGUCUACA 5′(SEQ ID No.4)。VEGF-siRNA-2’-deoxy2的正義鏈為5’-GGA GUA CCC UGA UGA GAU CTT-3’(SEQ ID No.5)；反義鏈為3’-TTCCU CAU GGG ACU ACU CUA G-5’(SEQ ID No.6)。選用一條隨機序列作為陰性對照(NC-deoxy)，NC-deoxy的正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。VEGF-siRNA-2’-deoxy1、VEGF-siRNA-2’-deoxy2和NC-deoxy序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核苷酸。
VEGF-siRNA-2’-deoxy1、VEGF-siRNA-2’-deoxy2和NC-deoxy均購自上海吉瑪(GenePharma)公司。
實施例2、VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2的體外轉染及抑制腫瘤細胞表達VEGF的效率檢測使用Invitrogen的lipofectamineTM2000脂質體進行轉染，轉染后的30小時進行RNA干擾效果的測定。所有操作均按Invitrogen提供的操作規程。具體步驟為將實施例1得到的VEGF-siRNA-2’-deoxy1、VEGF-siRNA-2’-deoxy2以及NC-deoxy粉末分別溶解于沒有RNA酶的無菌水中，配成終濃度為20μmol/L的溶液。將HeLa細胞接種到6孔板中(300,000個細胞/孔)，用含10％胎牛血清的RPMI1640或DMEM培養液培養16-24小時后，將細胞培養液換成含2.5％胎牛血清的無抗生素的RPMI1640或DMEM培養液。轉染時，分別將5μl siRNA溶液(20μM的VEGF-siRNA-2’-deoxy1或20μM的VEGF-siRNA-2’-deoxy2或20uM的NC-deoxy溶液)和5μl的lipofectamine 2000分別稀釋于250μl無血清培養培養液(Opti-MEM)中，并在室溫下孵育20分鐘，然后將上述s iRNA溶液與脂質體溶液混合，復合物于室溫靜置20分鐘后，把500μl的siRNA-脂質體復合物加到細胞培養板中(細胞生長融合率為50-70％)，然后37℃培養30小時，收集培養液和細胞進行ELISA和RT-PCR檢測。
用人VEGF的ELISA檢測試劑盒(R&D)(晶美生物)測試轉染VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA-2’-deoxy2或NC-deoxy的HeLa細胞的VEGF的蛋白含量。其具體做法是A、溶液準備(1)洗液按25倍稀釋洗液待用；(2)標準品用標準品稀釋液溶解標準品(VEGF)，對倍稀釋，從1000pg/ml至15.6pg/ml共做7個稀釋梯度；(3)顯色底物使用前15分鐘將顯色劑A和顯色劑B等量混合后用。B、操作(1)加樣測試前將微孔板恢復至室溫，加測試緩沖液50ul/孔，然后按200ul/孔上樣量將標準品和樣品(轉染VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA-2’-deoxy2或NC-deoxy的HeLa細胞培養液)加入，室溫放置2小時；(2)洗板用洗液洗板3次；(3)二抗每孔加二抗200ul，室溫置2小時；(4)洗板用洗液洗板3次；(5)顯色每孔加顯色底物200ul，室溫置20分鐘(避光)；(6)中止每孔加中止液50ul；(7)讀板30分鐘內以450nm(參考波長為540或570nm)。C、計算以標準品吸光度和濃度作標準曲線，根據樣品吸光度查標準曲線計算出樣品濃度。結果如圖1所示，圖1表明，轉染NC-deoxy的細胞VEGF含量比未轉染siRNA的沒有明顯降低，而轉染VEGF特異的VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA-2’-deoxy2處理的細胞VEGF含量明顯降低，說明VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2能明顯抑制腫瘤細胞的VEGF在蛋白水平的表達。圖1中，1，2，3，4分別表示NC-deoxy轉染的細胞，未轉染的細胞，VEGF-siRNA-2’-deoxy1轉染的細胞和VEGF-siRNA-2’-deoxy2轉染的細胞。
RT-PCR檢測的步驟為用1ml TRIzol(GIBCOL)裂解轉染VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA-2’-deoxy2或NC-deoxy的HeLa細胞，并按TRIzol產品說明的操作規程提取總RNA。由于RNA干擾的效果可能被潛在的少量的基因組DNA影響，實驗采用DNase I(RNase-free)(TaKaRa)來進一步消化降解總RNA中殘留的DNA。在用DNase I 37℃消化30分鐘后，按照DNase I產品說明重新提純總RNA并對RNA進行定量和質量鑒定。逆轉錄反應是使用Promega公司的M-MLV逆轉錄酶體系，將1ug的總RNA與0.5ug的Oligo dT混合，加熱5分鐘，迅速冷卻至0℃。按產品說明加入緩沖液，42℃孵育1小時。逆轉錄反應后的cDNA，作為PCR反應的模板進行擴增反應，上游引物為5’-GAGGGCAGAATCATCACGAA-3’，下游引物為5’-GGGAACGCTCCAGGACTTAT-3’。PCR反應溫度條件為先94度5分鐘；再94度1分鐘，60度1分鐘，72度1分鐘，共28個循環。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用軟件對其濃度進行計算。結果如圖2所示，圖2表明轉染NC-deoxy的細胞的PCR產物比未轉染siRNA的處理沒有明顯降低，而VEGF特異的VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2轉染處理的細胞PCR產物明顯降低，說明VEGF-siRNA-2’-deoxy1和VEGF-siRNA-2’-deoxy2能明顯抑制腫瘤細胞的VEGF在mRNA水平的表達。圖2中，1，2，3，4分別表示未轉染細胞，VEGF-siRNA-2’-deoxy1轉染的細胞，VEGF-siRNA-2’-deoxy2轉染的細胞和NC-deoxy轉染的細胞。
實施例3、VEGF-siRNA-2’-deoxy的效應半衰期測試用2ml含10％胎牛血清的RPMI1640或DMEM培養液在6孔板中培養Hela細胞。當細胞融合率達到50-70％時，按照實施例2的方法轉染VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA1(正義鏈為5’-CGAACGUACUUGCAGAUGU-3’；反義鏈為3’-GCUUGCAUGAACGUCUACA 5′；購自上海吉瑪(GenePharma)公司)或NC-deoxy。分別于轉染后24小時、2.5天后、5天和10天時，用1ml TRIzol(GIBCOL)裂解細胞，提取總RNA。用DNase I(RNase-free)(TaKaRa)來進一步消化降解總RNA中樣本殘留的DNA后，重新提純RNA并對RNA進行定量和質量鑒定。逆轉錄反應是使用Promega公司的M-MLV逆轉錄酶體系，將1微克的總RNA與0.5ug的Oligo dT混合，加熱5分鐘，迅速冷卻至0℃。按產品說明加入緩沖液，42℃孵育1小時。然后以逆轉錄反應后的cDNA作為模板進行PCR反應，PCR所用的引物和PCR反應溫度同實施例2。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用軟件對其濃度進行計算。結果如圖3所示，圖3表明，化學修飾使VEGF siRNAs干擾VEGF mRNA表達的效應半衰期從2.5天延長到5天。圖3中，1，2，3，4分別為VEGF-siRNA-2’-deoxy 1轉染后24小時、2.5天、5天和10天時的RT-PCR產物，5，6，7，8分別為VEGF-siRNA1轉染后24小時、2.5天、5天和10天時的RT-PCR產物，9，10，11分別為NC-deoxy轉染后24小時、2.5天、5天的RT-PCR產物。
實施例4、VEGF-siRNA-2’-deoxy對腫瘤生長的抑制作用用含10％胎牛血清的PRM 1640培養液培養Hela細胞，取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，調節細胞濃度4×107個細胞/ml。在8周齡的雄性裸鼠的背側翼部皮下注射0.1ml細胞懸液。當腫瘤長到50mm3開始用VEGF-siRNA-2’-deoxy1治療。將裸鼠腫瘤大小、體重等因素搭配后隨機分為三組，一組為生理鹽水對照組，一組為VEGF-siRNA-2’-deoxy1治療組，一組為NC-deoxy對照組。具體方法為用不含RNA酶的無菌水分別溶解VEGF-siRNA-2’-deoxy1、NC-deoxy(上海吉瑪制藥有限公司)和一種體內轉染劑RNAi-Mate(上海吉瑪制藥有限公司)，VEGF-siRNA-2’-deoxy1和NC-deoxy的濃度均為10μg/μl，而RNAi-Mate的濃度為44μg/μl，室溫孵育30分鐘后，將0.8ug/0.8ulVEGF-siRNA-2’-deoxy1或NC-deoxy，24ug/0.55ulRNAi-Mate和0.65ul不含RNA酶的無菌水混合起來，總體積2ul，再室溫孵育30分鐘進行腫瘤局部注射，每三天注射一次。當腫瘤的容積增大到200mm3時，治療劑量加倍。每三天用游標卡尺測量腫瘤最長徑(L)和橫徑(S)，計算腫瘤的近似體積。計算公式為V(mm3)＝0.5×L×S2。給藥6次后結束實驗，處死裸鼠，取出腫瘤稱重。結果如圖4所示，表明在宮頸癌移植腫瘤裸鼠模型上，VEGF-siRNA-2’-deoxy1治療的裸鼠腫瘤明顯比其他兩種對照處理小，說明VEGF-siRNA-2’-deoxy1能明顯抑制腫瘤的生長。圖4中A為生理鹽水治療的鼠；B為NC-deoxy治療的鼠；C為VEGF-siRNA-2’-deoxy 1治療的鼠；D為A、B、C中的腫瘤最后的重量比較。圖4D中的NC為NC-deoxy治療對照組；NS為生理鹽水治療對照組；siRNA為VEGF-siRNA-2’-deoxy 1治療組。
按照上述實驗方法，又進行了VEGF-siRNA-2’-deoxy2對腫瘤生長的抑制作用，結果表明VEGF-siRNA-2’-deoxy2對腫瘤的抑制效果與VEGF-siRNA-2’-deoxy1的抑制效果相同。
序列表<160>6<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgaacguacu ugcagaugu 19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggaguacccu gaugagauc 19<210>3<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cgaacguacu ugcagaugut t21<210>4<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4acaucugcaa guacguucgt t21<210>5<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ggaguacccu gaugagauct t21<210>6<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6gaucucauca ggguacucct t 2權利要求
1.一種抑制VEGF表達的siRNA，是下述VEGF-siRNA-2’-deoxy1或VEGF-siRNA-2’-deoxy2；所述VEGF-siRNA-2’-deoxy1由正義鏈和反義鏈組成，它的正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列，序列3和序列4的自5′端的第1至19位核苷酸均為核糖核苷酸、自5′端的第20和21位核苷酸均為胸腺嘧啶脫氧核苷酸；所述VEGF-siRNA-2’-deoxy2由正義鏈和反義鏈組成，它的正義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列6的核苷酸序列，序列5和序列6的自5′端的第1至19位核苷酸均為核糖核苷酸、自5′端的第20和21位核苷酸均為胸腺嘧啶脫氧核苷酸。。
2.一種抑制腫瘤的藥物，它的活性成分為權利要求1所述的VEGF-siRNA-2’-deoxy1和/或VEGF-siRNA-2’-deoxy2。
3.根據權利要求2所述的藥物，其特征在于所述腫瘤為宮頸癌、肝癌、乳腺癌和肺癌。
4.權利要求1所述的抑制VEGF表達的siRNA的作用靶序列，其特征在于所述VEGF-siRNA-2’-deoxy1的作用靶序列具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述VEGF-siRNA-2’-deoxy2的作用靶序列具有序列表中序列2核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種抑制VEGF的siRNA及其應用。該siRNA是下述VEGF－siRNA－2′－deoxy1或VEGF－siRNA－2′－deoxy2；所述VEGF－siRNA－2′－deoxy1由正義鏈和反義鏈組成，它的正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列；所述VEGF－siRNA－2′－deoxy2由正義鏈和反義鏈組成，它的正義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列6的核苷酸序列。VEGF－siRNA－2′－deoxy1和VEGF－siRNA－2′－deoxy2不易被降解，有較長的半衰期，能用于體外實驗，更能用于體內治療。能有效抑制腫瘤細胞VEGF的表達和阻止腫瘤血管的生成，抑制腫瘤，用于宮頸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤的治療。
文檔編號C07H21/00GK1804038SQ20051013009
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月12日 優先權日2005年12月12日
發明者張雅鷗, 蔡國平, 蔣宇揚, 何永紅 申請人:清華大學深圳研究生院