專利名稱：一種Bt Cry1A抗體及其制備方法與專用抗原及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及Bt Cry1A抗體及其制備方法與專用抗原及應用，特別是涉及一種BtCry1A抗體及其制備方法與專用抗原及其在制備Bt免疫檢測試劑盒中的應用。
背景技術：
轉Bt植物(棉花、玉米、水稻、煙草)的殺蟲機理是由于植物體內表達了毒蛋白。Bt免疫檢測試劑盒主要用于大規模準確檢測Bt植物毒蛋白的有無及含量的高低，轉Bt植物的檢測方法主要有三種(1)生物試法；(2)DNA檢測；(3)蛋白的免疫檢測。在這三種方法中，生物試法比較繁瑣，測定結果變異大，且難以進行橫向和縱向的比較。DNA檢測只是檢測基因，并不代表蛋白水平，對于抗性的高低并無指導意義。免疫檢測方法方便、實用、快速、經濟。
Bt免疫檢測試劑盒已廣泛應用于轉基因抗蟲棉花、玉米種子質量檢測，真偽鑒定，食品中轉基因成分分析，生物安全性的研究。Bt試劑盒的好壞完全取決于Bt殺蟲晶體蛋白Cry1A抗體的好壞。國內外文獻報道中的Cry1A抗體，都是通過蘇云金芽孢桿菌發酵、提取、純化的蛋白作為抗原免疫動物得到的。由于蛋白的分離和純化非常困難，在純化的過程中不可避免會摻入一些雜蛋白，即使是非常純化的蛋白，由于多個抗原決定簇的存在，所制備的抗體往往也會有交叉反應，因此抗體的特異性受到影響。為解決抗體的特異性問題，目前國外Bt試劑盒中的Cry1A抗體是通過合成多肽的方法來制備的，但所利用的是何種多肽大多沒有公開或者已申請專利。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種用于制備Bt Cry1A抗體的專用抗原。
本發明所提供的制備Bt Cry1A抗體的專用抗原，是將具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的多肽與載體蛋白聯結得到。
序列表中的SEQ ID №1由16個氨基酸殘基組成。肽的合成通常用固相合成法，多采用叔丁氧(酰)羰基(t-BOC)化學法和9-氟甲氧羰基(FMOC)化學法。
所述載體蛋白聯結于所述多肽的氨基端(N端)。
載體蛋白可為任意一種常用的載體蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)等。
將多肽與載體蛋白進行聯結的方法也是常規的戊二醛法。
本發明的第二個目的是提供一種Bt Cry1A抗體。
本發明所提供的Bt Cry1A抗體，是用上述專用抗原免疫動物，再從所免疫的動物中分離、純化血清得到的抗體。
所述用于制備Bt Cry1A抗體的免疫動物可為雞、兔、鼠、羊或馬等常用的免疫動物。
本發明的另一個目的是提供一種Bt Cry1A抗體的制備方法。
本發明所提供的Bt Cry1A抗體的制備方法，包括以下步驟1)用上述專用抗原免疫動物；2)從步驟1)經免疫的動物中分離、純化血清，得到Bt Cry1A抗體。
在上述制備方法中，步驟3)中用于制備Bt Cry1A抗體的免疫動物可為雞、兔、鼠、羊或馬等常用的免疫動物。
本發明的第四個目的是提供一種Bt免疫檢測試劑盒。
本發明所提供的Bt免疫檢測試劑盒，其活性成分為上述Bt Cry1A抗體。
在實際應用中，為方便檢測，可將陰性血清對照、血清稀釋液、洗滌劑、終止劑、顯色劑、Bt標樣和HRP-羊抗兔IgG抗體等檢測試劑也包裝入上述試劑盒。
本發明提供了一種Bt Cry1A抗體。該抗體具有下述優點1)具有較高的特異性，檢測靈敏度可達52.7ng.mL-1，可用于轉Bt植物(如棉花、玉米、水稻、煙草等)中毒蛋白的定性、定量分析；2)制備方法簡單，具有工業化生產的可行性。本發明將在轉Bt植物的生物檢測領域發揮重要作用，具有廣闊的市場前景。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
圖1為Bt Cry1A蛋白濃度標準曲線具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、Bt Cry1A抗體的制備一、Bt殺蟲晶體蛋白Cry1A多肽片斷的選擇和合成對GenBank數據庫中Bt殺蟲晶體蛋白Cry1A(包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac)基因(GenBank號分別為D17518，X54939，U87397)所編碼的氨基酸序列進行理化分析，從中選擇一段特定的由16個氨基酸殘基(序列表中的SEQ ID №1)組成的多肽片段，用固相合成法進行合成，分子量為1943.14。
二、免疫抗原的制備將步驟一合成的多肽片段與牛血清白蛋白(BSA)采用戊二醛方法進行聯結，具體方法包括以下步驟(1)取10mg BSA，完全溶解于5mL 0.01mol/L PBS中，再加入4mg步驟一的合成多肽，使其完全溶解。
(2)緩慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，與步驟(1)獲得的溶液混合，并在室溫下，攪拌反應2小時。
(3)加入0.2mL 1M甘氨酸，在室溫下攪拌1小時，以終止反應。
(4)將步驟(3)獲得的溶液裝入透析袋中，用PBS透析4天進行純化，每天換三次透析液。將透析后得到的多肽-BSA聯結物進行分裝，經-40℃冷凍后，真空濃縮干燥，保存于-20℃冰箱中。
三、制備Bt Cry1A抗體免疫動物采用新西蘭大耳白兔，兔齡三個月左右，體重2kg以上。以步驟二制備的多肽-BSA的聯結物作為抗原，免疫動物，制備Bt Cry1A抗體，免疫方法及劑量為共免疫注射六次，將抗原用PBS稀釋至2mg·mL-1(以載體蛋白計算)，然后與等體積的福氏完全佐劑(第一次免疫)或福氏不完全佐劑(第二次至第五次免疫)混合后乳化，最后一次用免疫抗原直接免疫，免疫劑量均為1mL/兔。第三次免疫后耳緣靜脈取血，檢測抗血清效價，檢測結果表明抗血清效價達1/50000。最后一次免疫后的第七天頸動脈放血，分離、純化后得到抗血清，檢測抗血清效價，檢測結果表明抗血清效價達1/50000，可用于Bt Cry1A含量的檢測。
實施例2、Bt Cry1A抗體的鑒定及Bt蛋白濃度標準曲線的建立用ELISA方法對Bt Cry1A抗體進行鑒定，并繪制出Bt蛋白濃度標準曲線，具體過程包括以下步驟(1)包被Bt標準蛋白將Bt Cry1A標準蛋白用包被緩沖液(1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，0.2g NaN3，加1000mL蒸餾水，pH為9.6)稀釋成五個濃度，依次為2640，880，293，97，32ng·mL-1，以包被緩沖液為空白對照(即為0ng·mL-1)，加入96孔酶標板中，每孔100μl，每個濃度三次重復，于37℃溫箱中溫育3h。棄去孔內液體，用洗滌液(8.0g NaCl，0.2gKH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，1mL Tween-20，加1000mL蒸餾水)洗板四次后甩干。
(2)與Bt Cry1A抗體反應將實施例1制備的Bt Cry1A抗體用樣品稀釋液(8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96gNa2HPO4·12H2O，1mL Tween-20，1g明膠，加1000mL蒸餾水，pH為7.5)按1∶500的比例稀釋，酶標板每孔中加入100μl，放入37℃溫箱中溫育30min。棄去孔內液體，用洗滌液洗板四次后甩干。
(3)與酶標二抗反應將HRP-羊抗兔IgG抗體(sigma公司)用樣品稀釋液按1∶1000的比例進行稀釋，每孔加100μl，放入37℃溫箱中溫育30min。棄去孔內液體，用洗滌液洗板四次，甩干。
(4)顯色于酶標板每孔中加入100μl鄰苯二胺(ortho-phenylene diamine，OPD)溶液，常溫下顯色，顯色充分后用2N硫酸終止反應，用酶標儀測定各孔492nm處的OD值。
檢測結果表明實施例1制備的Bt Cry1A抗體可與Bt Cry1A標準蛋白特異反應，依據Bt Cry1A標準蛋白的濃度梯度及其相應的OD值繪制標準曲線，如圖1所示(y軸為Bt Cry1A標準蛋白各濃度的自然對數值，x軸為其相應的OD值)，標準曲線的回歸方程為y＝3.9016x+3.185，相關系數R2＝0.982，IC50為169.9ng.mL-1，檢測范圍為52.7ng.mL-1到547.8ng.mL-1。
實施例3、轉Bt棉花殺蟲晶體蛋白Cry1A的檢測用ELISA方法對轉Bt抗蟲棉花中的殺蟲晶體蛋白Cry1A進行檢測，所用的抗蟲棉花品種包括中41、中45、中29、GK36、GK12、33B，以常規棉中12、中43為對照(中國農科院棉花研究所購買)具體過程包括以下步驟(1)稱取Bt轉基因棉花樣品0.3g，加入3mL PBS提取液后充分研磨，提取4h后3000rpm離心10min，取上清液用于分析。
(2)向酶標板每孔中加入步驟(1)獲得的上清液100μl，于37℃溫箱中溫育3h。棄去孔內液體，用洗滌液洗板四次，甩干。
(3)將實施例1制備的Bt Cry1A抗體用樣品稀釋液按1∶500的比例進行稀釋，向酶標板每孔中加入100μl，放入37℃溫箱中溫育30min。棄去孔內液體，用洗滌液洗板四次后甩干。
(4)將HRP-羊抗兔IgG抗體用樣品稀釋液按1∶1000的比例進行稀釋，向酶標板每孔中加入100μl，置于37℃溫箱中溫育30min。棄去孔內液體，用洗滌液洗板四次，甩干。
(5)向酶標板每孔中加入100μl OPD溶液，常溫下顯色，用2N硫酸終止反應，在酶標儀上測定各孔492nm處的OD值。
實驗結果顯示，轉基因棉品種中41，中45，中29，GK36，GK12，33B明顯比常規棉品種中12和中43顯色深。根據實施例2繪制的Bt Cry1A蛋白濃度標準曲線計算出上述棉花樣品中Bt Cry1A蛋白的濃度的，結果如表1所示，表明轉基因棉中BtCry1A殺蟲晶體蛋白含量明顯高于上述兩種常規棉品種，與顯色結果一致。證明用本發明的Bt Cry1A抗體及ELISA方法能夠有效地區別常規棉和抗蟲棉，并且能對其中的Bt Cry1A殺蟲晶體蛋白含量進行較為準確的測定。
表1常規棉和抗蟲棉中Bt毒蛋白含量
序列表<160>1<210>1<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Arg Glu Try Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met1 5 10 1權利要求
1.制備Bt CrylA抗體的專用抗原，是將具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的多肽與載體蛋白聯結得到。
2.根據權利要求1所述的專用抗原，其特征在于所述多肽的合成方法為固相合成法，包括叔丁氧羰基化學法和9-氟甲氧羰基化學法。
3.根據權利要求1所述的專用抗原，其特征在于所述載體蛋白聯結于所述多肽的氨基端。
4.根據權利要求1或2或3所述的專用抗原，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蛋白匙孔血藍蛋白或卵清白蛋白。
5.根據權利要求1或2或3所述的專用抗原，其特征在于所述將多肽與載體蛋白進行聯結的方法為戊二醛法。
6.Bt CrylA抗體，是用權利要求1所述的專用抗原免疫動物，再從所免疫的動物中分離、純化血清得到的抗體。
7.根據權利要求6所述的Bt CrylA抗體，其特征在于所述用于制備Bt CrylA抗體的免疫動物為雞、兔、鼠、羊或馬。
8.一種制備權利要求6所述的Bt CrylA抗體的方法，包括以下步驟1)用權利要求1所述的專用抗原免疫動物；2)從步驟1)經免疫的動物中分離、純化血清，得到Bt CrylA抗體。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中用于制備Bt CrylA抗體的免疫動物為雞、兔、鼠、羊或馬。
10.Bt免疫檢測試劑盒，其活性成分為要求6所述的Bt CrylA抗體。
全文摘要
本發明公開了一種Bt Cry1A抗體及其制備方法與專用抗原及應用，其目的是提供一種Bt Cry1A抗體及其制備方法與專用抗原及其在制備Bt免疫檢測試劑盒中的應用。制備Bt Cry1A抗體的專用抗原，是將具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的多肽與載體蛋白聯結得到。Bt Cry1A抗體，是用所述專用抗原免疫動物，再從所免疫的動物中分離、純化血清得到Bt Cry1A抗體。該抗體具有下述優點1)具有較高的特異性，檢測靈敏度可達52.7ng·mL
文檔編號C07K16/18GK1775809SQ200510130058
公開日2006年5月24日 申請日期2005年12月12日 優先權日2005年12月12日
發明者王保民, 俞彩霞, 趙靜, 李召虎, 何鐘佩, 何素平, 劉威, 鄧艾興 申請人:中國農業大學